TİP 1 DİYABET VE KÖK HÜCRE TEDAVİSİ: NEREDEYİZ? GELECEK NELER VAAT EDİYOR?

Transkript

1 TİP 1 DİYABET VE KÖK HÜCRE TEDAVİSİ: NEREDEYİZ? GELECEK NELER VAAT EDİYOR? Doç. Dr. Seda Kızılel Koç Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Kimya ve Biyoloji Mühendisliği 3 Kasım 2018 Koç Üniversitesi Hastanesi, İstanbul

2 DİYABET Islet of Langerhans İnsülin salgılayan hücreler MacDonald, P. E., & Rorsman, P. (2006). Oscillations, intercellular coupling, and insulin secretion in pancreatic β cells. PLoS biology, 4(2), e49. 2

3 DİYABET 3

4 TİP 1 DİYABET DÜNYADA HER 11 İNSANDAN BİRİNDE DİYABET GÖRÜLÜYOR Diyabetli insan sayısı, 1980 yılında 108 milyondan 2014 yılında 422 milyona yükselmiştir. 18 yaşın üzerindeki yetişkin bireylerde diyabet görülme oranı 1980 de % 4,7 iken 2014 te %8,5 olarak belirlenmiştir. World Health Organization. (2016). Global Report on Diabetes. 4

5 TİP 1 DİYABET 2017 Dünya Türkiye Toplam nüfus 7.5 milyar 80.8 milyar yaş arası yetişkin nüfusu 4.84 milyar 52.3 milyon YETİŞKİNLERDE DİYABET GÖRÜLME SIKLIĞI yaş arası 8.8% 12.8% yaş arası diyabetli yetişkin sayısı milyon 6.7 milyon ÇOCUKLARDA TİP 1 DİYABET GÖRÜLME SIKLIĞI 0-19 yaş arası diyabetli çocuk sayısı 1,106,500 25,669 Her yıl diyabet teşhisi konan çocuk sayısı 132, International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 8th edn. Brussels, Belgium: International Diabetes Federation,

6 TİP 1 DİYABET TEDAVİ SEÇENEKLERİ İnsülin enjeksiyonu İnsülin pompası Hastalarda glikoz kontrolü sağlayan tek tedavi yöntemi Düzenli insülin enjeksiyonu ile normal kan şekeri değerleri uzun yıllar sağlanabilir Hastalar için acı verici ve yorucu bir tedavi yöntemi Sürekli enjeksiyon sonucu ciltte yaralanma, kilo alma ve hipoglisemiye neden olur Enjekte edilen insülinin doğal insülini tam olarak taklit edemiyor olması Diyabet için kesin bir çözüm olmaması 6

7 TİP 1 DİYABET TEDAVİ SEÇENEKLERİ Pankreas nakli Adacık nakli Normal kan şekeri değerlerine ulaşılabilir Hastalarda insülin kullanma zorunluluğu ortadan kalkar Donör bulma zorluğu Ameliyat sürecinin zor olması ve ameliyat sonrası komplikasyon gelişme riskinin yüksek olması Ömür boyu immün sistem baskılayıcı ilaç kullanılması Normal kan şekeri değerlerine ulaşılabilir Hastalarda insülin kullanma zorunluluğu ortadan kalkar Pankreas nakline kıyasla daha kolay bir operasyon Donör bulma zorluğu Adacıkların elde edilmesi ve saflaştırılması aşamalarında yaşanan verim düşüklüğü Adacıklar donörden izole edildikten sonra canlılıklarını korumanın zor olması Ömür boyu immün sistem baskılayıcı ilaç kullanılması 7

8 KÖK HÜCRE TEDAVİSİ Kök Hücre: Belirli uyaranlar sağlandığında vücutta herhangi bir hücreye dönüşme kapasitesine sahip farklılaşmamış hücrelerdir. Bu hücreler sınırsız bölünme, kendini yenileme ve organ ya da dokulara dönüşebilme yeteneğine sahiptirler. İnsan Embriyonik Kök Hücresi (hesc) Blastosist aşamasındaki embriyodan elde edilir. Pluripotent hücrelerdir, vücuttaki her hücre tipine farklılaşabilir. Blastosist hesc İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (ipsc) Fibroblast gibi olgun vücut hücrelerinin tekrar programlanmasıyla oluşturulur Fibroblast ipsc Mesenchymal Stem Cells (MSC) Kemik iliği veya yağ dokusundan elde edilir Multipotent hücrelerdir, farklılaşma kabiliyetleri sınırlıdır. Onarma ve yenilenme süreçlerinde görev alır MSC Kemik iliği Dang, L. T. T., Phan, N. K., & Truong, K. D. (2017). Mesenchymal stem cells for diabetes mellitus treatment: new advances. Biomedical Research and Therapy, 4(1), Pellegrini, S., Piemonti, L., & Sordi, V. (2018). Pluripotent stem cell replacement approaches to treat type 1 diabetes. Current opinion in pharmacology, 43,

9 TİP 1 DİYABET İÇİN KÖK HÜCRE TEDAVİSİ YAKLAŞIMLARI Kök hücrelerin farklılaştırılarak beta hücrelerinin elde edilmesi ü Kök hücrelerin çeşitli uyaranlar varlığında yeniden programlanarak ya da farklılaştırılarak insülin salgılayan beta hücrelerinin oluşturulması Kök hücrelerin adacıklar veya beta hücreleri ile aynı kültür ortamında büyütülmesi (co-culture) ü Immunomodulation/Immunosuppression ü Beta hücrelerinin korunması ü İmmün sistem atağının önlenmesi ipsc hesc Reprogramming/ Differentiation MSC Co-culture Islet Stem cell derived β- cell 9

10 TİP 1 DİYABET İÇİN KÖK HÜCRE TEDAVİSİ YAKLAŞIMLARI Adacıkların MSC ler ile aynı ortamda büyütülmesi (Co-culture) 1 Adacık Adacıkların MSC ler ile direkt temas halinde büyütülmesi (direct co-culture) 2 Beta hücreler 3D hücre kültürü «Yalancı adacık (Pseudoislet)» ü MSC lerin çeşitli faktörler salgılayarak adacık hücrelerinin canlılığını koruması ü MSC lerin doku yenilenmesini artırıyor ve dokuyu destekliyor olması ü Adacıkların fonksiyonlarını geliştiriyor olması ü İmmün sistemi düzenlemesi ü İmplantasyon sonrası dokunu kabulünü hızlandırması Arzouni, A. A., Vargas-Seymour, A., Nardi, N., JF King, A., & Jones, P. M. (2018). Using Mesenchymal Stromal Cells in Islet Transplantation. Stem cells translational medicine. Bal, T., et al, & Kizilel, S. (2017). Mesenchymal stem cells and ligand incorporation in biomimetic poly (ethylene glycol) hydrogels significantly improve insulin secretion from pancreatic islets. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 11(3), Bal,T., et al. & Kizilel, S. Optimization for the Preparation of Insulin-Secreting Heterospheroids and their Protection Potential from Cytokine Attack, in preparation. 10

11 TİP 1 DİYABET İÇİN KÖK HÜCRE TEDAVİSİ YAKLAŞIMLARI Kök hücrelerin beta hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ü Differentiating stem cells into beta-like cells with functional characteristics of primary adult beta cells ü Unique surface markers and expression patterns of various proteins are important for the characterization ü Type, number and timing of the differentiation factors administrated on the stem cell culture are important Inductive signals ipsc or hesc Endoderm PDX1 NKX6.1 Pancreatic Endoderm PDX1 NKX6.1 Ngn3 Endocrine progenitor β-cell PDX1 and NKX6.1: Specific transcription factors that are co-expressed in multipotent pancreatic progenitor cells Millman, J. R., & Pagliuca, F. W. (2017). Autologous pluripotent stem cell derived β-like cells for diabetes cellular therapy. Diabetes, 66(5), Pagliuca, F. W., & Melton, D. A. (2013). How to make a functional β-cell. Development, 140(12),

12 KISITLAMALAR VE OLASI ÇÖZÜMLER İMMÜNOJENESİTE GÜVENLİK VERİM İmplante edilen dokunun immün sistem atağından korunması o İmmün sistem baskılayıcı ilaç kullanımı o İmplante edilecek hücrelerin doğal veya sentetik polimerlerle kaplanması o Genetik manipülasyon ile hücrenin immün sitem hücreleri tarafından tanınamayacak hale getirilmesi Kök hücrelerin tümör oluşturma potansiyelleri o İmplante edilecek hücrelerde farklılaşma aşamasını tamamlayamamış hücrelerin transferini azaltmak o Hücrelerin genetik stabilitelerini düzenli olarak kontrol etmek o Hücrelerin makro boyutta malzemelerle kaplanıp gerektiğinde geri alınması Kök hücrelerin farklılaşma kapasitelerinin arttırılması o Farklılaşmayı sağlayan faktörlerin çeşitleri, miktarları ve verildikleri zamanın optimize edilmesi Farklılaşmış hücrelerin spesifik olarak seçilmesi için yeni hücre yüzey belirleyicilerinin seçilmesi Pellegrini, S., Piemonti, L., & Sordi, V. (2018). Pluripotent stem cell replacement approaches to treat type 1 diabetes. Current opinion in pharmacology, 43,

13 KLİNİK ÖNCESİ ÇALIŞMALAR 2016 AMAÇ: T1D hastasından alınan kök hücrelerin laboratuvar ortamında beta hücrelerine farklılaştırılması ü Diyabetli ve sağlıklı insandan izole edilen ipsc kullanılmıştır. (T1D SC-β ve ND SC-β) ü İmmün sistemi olmayan sağlıklı farenin böbrek kapsülüne implantasyon yapılmıştır. ü İmplantasyon sonrası fare alloxan ile diyabet yapılmıştır. Yeşil: C-peptide Kırmızı: Glucagon SONUÇLAR: ü T1D SC-β ve ND SC-β arasında fizyolojik açıdan önemli bir fark yoktur. ü İmplantasyon sonrası farede insan insülin seviyesi yükselmiştir. ü Fare diyabet olduktan sonra da fareye implante edilmiş olan doku fonksiyonunu korumuştur. ü Glikoz seviyesi arttığında insan insülini salgılamaya 80 gün boyunca 13 devam etmiştir.

14 KLİNİK ÖNCESİ ÇALIŞMALAR Sadece adacık nakli Adacık+MSC nakli Kırmızı: Damarlaşma İmplantasyon sonrası 3. hafta AMAÇ: MSC lerin adacıklar üzerindelki etkisinin laboratuvar ortamında araştırılması ve adacık+msc nin diyabet fareye transplantasyonu SONUÇLAR: Adacık+MSC implante edilen diyabet farelerde; ü Normal kan şekeri değerlerine geçiş daha kısa sürmüştür. ü İmplantasyon bölgesinde tespit edilen insülin miktarı daha fazladır ü Dokunun damarlaşması daha kısa sürmüştür İmplantasyon sonrası 35. hafta Islet Islet+MSC Sadece adacık nakli Yeşil: Insulin Adacık+MSC nakli Islet and MSCs co-cultured in a tissueculture dish Islet+MSCs were transplanted into immunodeficient diabetic mice 14

15 KLİNİK ÖNCESİ ÇALIŞMALAR 2016 Differentiation Encapsulation Transplantation hesc AMAÇ: hesc lerin farklılaşmasıyla oluşturulmuş beta hücrelerinin immün ataktan korunması amacıyla alginate-tmdt ile enkapsüle edilmesi ü hesc ler beta hücrelere laboatuvar ortamında farklılaştırılmıştır ü TMDT-alginate ile kaplanan hesc-β hücreleri immün sistemi olan diyabetik model hayvana implante edilmiştir SC-β cell 174 day post-transplant SONUÇLAR: ü Nakil sonrası 174 gün boyunca diyabet farede normal glikoz seviyesi sağlanmıştır ü TMDT-alginate ile kaplanan hesc-β hücreleri kaplanmadan implante edilen hücrelere kıyasla T hücreleri ve makrofajları daha az uyarmıştır. SC-β cells encapsulated with TMTD alginate Immunocompetent diabetic mice 15

16 KLİNİK ÇALIŞMALAR ü Diyabet tedavisi için klinik denemelerine başlanmış embriyonik kök hücre kullanılan ilk çalışma. ü Çalışmaya yaş arası 69 kişi katılmıştır. ü Allojenik insan embriyonik kök hücre hattı olan CyT49 hücrelerinden elde edilen pankreatik endoderm hücreleri (PEC) Encaptra adı verilen cihazla makro boyutlarda kaplanmıştır. PEC hücrelerinin glikoza duyarlı insülin salgılayan hücrelere farklılaşması implantasyondan sonra da devam etmiştir. ü PEC hücreleri hastalara 250 ml hacmindeki cihazlar içinde deri altına implante edilmiştir. ü Hastalara aynı zamanda 20 ml boyutlarındaki cihazlar da nakledilmiştir ve belirli zaman aralıklarıyla bu cihazlar hücre fonksiyonlarını anlamak için vücuttan çıkarılıp incelenmiştir. ü Çalışmanın ilk adımında nakil sonrası hücrelerin damarlaşma geliştirerek canlılığını uzun süre korumaya devam etmesi ve adacık benzeri dokuya farklılaşmaya devam etmesi amaçlanmaktadır. PEC kaplama cihazı (Encaptra) Schulz, T. C. (2015). Concise review: manufacturing of pancreatic endoderm cells for clinical trials in type 1 diabetes. Stem cells translational medicine, 4(8),

17 İYİLEŞTİRİLMESİ GEREKEN HUSUSLAR Ø Kök hücreden farklılaştırılarak oluşturulmuş beta hücrelerinin doğal beta hücrelerini taklit edebilme kabiliyetlerinin standart hale gelmemiş olması Ø Laboratuvar ortamında kök hücrelerden oluşturulmuş beta hücreleri kullanılarak yapılan insülin salgılayan hücrelerin normal adacıklardaki hücre dağılımını ve özelliklerini sağlayamıyor olması Ø Laboratuvar ortamında kök hücrelerle oluşturulan insülin salgılayan hücrelerin tam olarak doğal adacıkların mimari özelliklerini sağlamıyor olması Ø İnsülin salgılayan hücrelerin bağışıklık atağına maruz kalması Ø İmplantasyon sonrası bağışıklık sistemi atağını önlemek ve hücrelerin işlevini korumak için geliştirilmiş klinikte uygulanabilir bir yöntem olmaması v Hücrelerin makro veya mikro boyutlarda kaplanması ve implantasyonu için cihaz geliştirilmesi v Makro veya mikro boyutlarda kaplanan hücrelerin damarlaşma ihtiyacının bulunması v Hücrelerin bu cihaz içinde canlılıklarını korumaya devam etmesi Ø Kök hücrelerin tümör oluşturma potansiyellerinin yüksek olması Ø Daha verimli ve düşük maliyetli yöntemlere ihtiyaç duyulması Ø Embriyonik kök hücre kullanımıyla ilgili etik problemler Ø En iyi implantasyon bölgesinin belirlenmemiş olması 17

18 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİYLE İLGİLİ YAKLAŞIMLAR The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2018 Cancer therapy by inhibition of negative immune regulation ü Bağışıklık sisteminin aktive edilmesi vücudun tümör hücreleriyle mücadelesi için kullanılan bir yöntemdir. ü Bağışıklık sisteminin fren mekanizmalarını engelleyen stratejiler kanser tedavisinde kullanılabilir. ü T hücrelerin yüzeylerinde bulunan bazı proteinler fren görevi görerek T hücrelerinin uyarılmasını engeller. ü Spesifik olarak bu proteinlere bağlanması için üretilmiş küçük moleküller fren mekanizmasını devre dışı bırakır ve böylece T hücreleri uyarılmış olur. ü SONUÇ: Bağışıklık sisteminin tümör hücrelerine atak etme veya nakil edilen hücrelerin korunması amacıyla ayarlanabilmesi 18

19 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİYLE İLGİLİ YAKLAŞIMLAR ü T1D bağışıklık sistemi hücrelerinden biri olan T hücrelerinin kişinin kendi insülin salgılayan beta hücrelerine saldırması sonucu oluşan otoimmün bir hastalıktır. ü Beta hücrelerini T hücre atağından nasıl koruyabiliriz? o Efektör T hücre ataklarının kontrol altına alınması o İmmün tolerans sağlayan regülatör T hücrelerinin (Treg) sayısının artırılması ü Treg ler efektör T hücrelerini baskılayarak immün sistemi düzenleyen hücrelerdir. ü Pankreatik adacıklar etrafındaki Treg popülasyonunun çoğaltılmasının diyabet patogenezini üzerinde olumlu etkileri tespit edilmiştir. Kopan, C., Tucker, T., Alexander, M., Mohammadi, R., Pone, E., & Lakey, J. R. T. (2018). Approaches in immunotherapy, regenerative medicine and bioengineering for type 1 diabetes. Frontiers in Immunology, 9,

20 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİYLE İLGİLİ YAKLAŞIMLAR 2011 AMAÇ: Adacıkların yüzeyine regülatör T hücrelerini(tregs) bağlayarak adacıkları bağışıklıksistemi atağından koruyan biryaklaşımın geliştirilmesi ü Adacığın işlevselliğini göstermek için dinamik perifüzyon cihazı kullanılmıştır. SONUÇLAR: ü Treg hücreleriyle kaplanmış adacıklar adacığın canlılığını veya insulin salgılama profilinietkilememiştir. ü Efektör T hücreleri(teff) ile inkübasyon sonrasında Treg ile kaplanmış adacıklarfonksiyonunu korumuştur. Human islet Blue: Tregs Blue: Naked islets Green: Islet+Treg Red: Islet+Treg exposed to Teff for 72h Orange: Naked islet exposed to Teff Pink: Naked islets exposed to Teff in the presence of Treg Black: Naked islet+teffexposed to Teff 20

21 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİYLE İLGİLİ YAKLAŞIMLAR AMAÇ: Laboratuvar ortamında oluşturulan yalancı adacıkların implantasyonu sonrası nakledilen dokuyu bağışıklık sistemi atağından korumak amacıyla bölgeye regülatör T hücrelerinin (Treg) çağrılması ü Tümor hücreleri bağışıklık sisteminden kaçmak için CCL22 salgılayarak Treg lerin bölgeye gelmesini sağlar ü Treg ler efektör T hücrelerini baskılar ve aynı zamanda damarlaşmayı destekler Oran, D. C., Lokumcu, T., Albayrak, O., Bal, T., Kurtoğlu, M., Erkan, M., Can, F., Bagcı-Onder, T., & Kizilel, S. Engineering Human Stellate Cells for the Recruitment of Regulatory T cells (Tregs) in Pseudoislet Transplantation, in preparation. 21

22 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİYLE İLGİLİ YAKLAŞIMLAR İnsülin salgılayan fare hücreleri İki farklı hücre tipinden oluşturulmuş yalancı adacıklar Diyabet model fare CCL22 salgılaması için transfekte edilmiş karaciğer yıldızsı hücreleri Adacık nakli ü Hepatik yıldızsı hücrelerinin transfeksiyon yöntemi ile CCL22 ligandını ifade etmesi sağlanmıştır. ü Bu hücreler ve farelerden elde edilen insülin salgılayan hücreler kullanılarak laboratuvar ortamında yalancı adacıklar oluşturulmuştur. ü Oluşturullan bu adacıklar diyabetik fareye implant edilmiş ve farelerin kan şekerleri takip edilip, 20 gün sonunda dokular geri alınmıştır. ü Dokunun diyabet hayvanın abdominal oblik kasına nakli sonrası bölgedeki Treg sayısında önemli bir artış görülmüştür Oran, D. C., Lokumcu, T., Albayrak, O., Bal, T., Kurtoğlu, M., Erkan, M., Can, F., Bagcı-Onder, T., & Kizilel, S. Engineering Human Stellate Cells for the Recruitment of Regulatory T cells (Tregs) in Pseudoislet Transplantation, in preparation. 22

23 Diyabeti Tedavi için Gelecekte Hani Yöntemler Üzerinde Çalışmalar Devam Edecek? Ø Kök hücreler ve kök hücrelerin farklılaşmaları önemli olmaya devam edecek Ø Bağışıklık atağından korumaya yönelik stratejiler öne çıkacak. Ø Bağışıklık atağından korumak için kanser hücrelerinin kullandıkları sinyalleşme mekanizmaları taklit edilecek. Ø İmplant edilen doku ile vücut dışında iletişim yolları oluşturulacak, gerektiği anda implant edilen dokuya Treg hücrelerinin göç etmesi sağlanmaya çalışılacak