Glukoz oksidaz ANALĐZ PRENSĐBĐ. Test kitinde gerçekleştirilen reaksiyonlar;

Transkript

1 GĐRĐŞ Gıda, serum ve benzeri örneklerde glukoz miktarının hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçümü için glukoz tayin kiti üretilmiştir. Glukoz serumda birincil karbonhidrat olmasına karşın bitki kaynaklı örneklerde sınırlı miktarda bulunmakta olup genelde diğer pek çok di, oligo ve/veya polisakkaritin bileşiminde yer almaktadır. Bu nedenle bitki kaynaklı örneklerde glukoz tayin edilirken glukoz içerikli yapıları parçalayabilecek enzimlerin (invertaz, β-galaktozidaz, amilaz vb.) bulunmamasına dikkat edilmelidir. Bulunması durumunda mümkünse enzimlerin biyokatalitik aktivitesi durdurulmalıdır. Glukoz tayininde kromojenik maddelerin kullanıldığı ilk enzimatik yöntem 1950 li yıllarda Keston tarafından o-dianisidin kullanılarak geliştirilmiş ve sonrasında farklı kromojenik maddelerin kullanılması ile modifiye edilmiştir [1]. O-dianisidinin kanserojen olması nedeniyle Trinder tarafından bu madde yerine fenol-4-aminoantipirin çifti kullanılarak yöntem iyileştirilmiştir [2]. Geliştirilen yöntemin daha önceki yöntemlere göre daha kararlı olduğu ve örnekten gelebilecek ve girişim yapabilecek maddelerden daha az etkilendiği ifade edilmektedir [3]. Biyozim Glukoz Analiz Kiti nde yüksek saflıkta glukoz oksidaz (GO) ve peroksidaz (PO) enzimleri kullanılmış olup bu sayede örnek içerisindeki glukozun spesifik ve doğru bir şekilde saptanması sağlanmıştır. Yöntem mümkün olduğunca basitleştirilmiş ve her aşamasında kullanıcı kolaylığı ön planda tutulmuştur. ANALĐZ PRENSĐBĐ Test kitinde gerçekleştirilen reaksiyonlar; Glukoz oksidaz D-Glukoz+O 2 +H 2 O Glukonat+H 2 O 2 Đlk aşamada D-glukoz glukoz oksidaz enzimi katalizörlüğünde, O 2 ve H 2 O varlığında glukonat a oksitlenmektedir. Bu reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksit, peroksidaz enzimi katalizörlüğünde

2 aminoantipirin ve fenol ile reaksiyona girerek, 505 nm de maksimum absorbans veren kırmızı renkli iminokuinon bileşiğini oluşturmaktadır. H 2 O Aminoantipirin + Fenol Peroksidaz Đminokuinon + H 2 O Oluşan renkli bileşiğin miktarı, glukoz miktarı ile doğru orantılı olup, fotometrik olarak saptanabilmektedir. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl, µl) Balon joje ( ml) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Su banyosu (37ºC) Spektrofotometre (505 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Glukoz analiz kiti; glukoz analiz reaktifi, glukoz analiz tamponu ve glukoz standardından oluşmaktadır. 1 nolu şişe (# ): Glukoz analiz reaktifi (50 analiz/şişe) Glukoz oksidaz 10,000 IU/şişe Peroksidaz 1,000 IU/şişe 4-Aminoantipirin 0.2 mm 2 nolu şişe (# ): Glukoz analiz tamponu (Derişik, 50 ml) 0.4 M Potasyum dihidrojen fosfat 0.2 mm fenol 2 3 nolu şişe (# ): Glukoz standardı Glukoz 0.5 g (MA= g/gmol) 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. 2 Fenol toksik bir madde olduğundan çözelti kullanılırken dikkatli olunmalıdır. -2-

3 ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Glukoz tayini ile ilgili tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilir. Glukoz analiz reaktifinin hazırlanması: 1 nolu şişe üzerine 2.5 ml glukoz analiz tamponu ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz reaktifiniz hazır olacaktır. Glukoz analiz reaktifi hazırlandıktan sonra 2-8 C de 1 ay süre ile saklanabilir. Çözelti hazırlandıktan sonra dondurulmamalıdır. 3 Glukoz analiz tamponu: Glukoz analiz tamponu kullanıma hazır halde sunulmuştur. Glukoz standart çözeltisinin hazırlanması: 3 nolu şişe içerisinde bulunan glukoz standardı kullanılarak 0.25 g/l, 0.50 g/l, 0.75 g/l ve 1 g/l derişimlerindeki glukoz çözeltilerini saf su kullanarak hazırlayınız. Dört farklı derişimdeki glukoz çözeltileri kalibrasyon grafiğinin oluşturulmasında kullanılacaktır. STABĐLĐTE Analiz kimyasalları belirtilen koşullarda saklandığı takdirde 12 ay içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. Analiz çözeltisi hazırlandıktan sonra 2-8ºC de muhafaza edildiğinde 1 ay saklanabilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin oluşturulması aşamasında kullanılmak üzere hazırlanan glukoz çözeltilerinin günlük olarak hazırlanması gerekmektedir. Hazırlanan çözeltilerin uzun süre kullanımı için koruyucu ilave edilmeli ve/veya 2-8ºC de muhafaza edilmelidir. Analiz sayısına göre gerekli miktarda analiz çözeltisini hazırlayınız. Bu sayede analiz kimyasalları daha verimli olarak kullanılabilecektir. Bir seferde 50 nin üzerinde analiz yapılması 3 Đhtiyacınıza göre 50 analizlik hacimler halinde hazırlayınız. Analiz reaktifinin muhafazası süresince pembe renk oluşumu gözlenebilir. Analiz reaktifi 1/25 oranında saf su ile seyreltildikten sonra 505 nm de ölçülen absorbans değerinin 0.05 in üzerinde olması durumunda analiz reaktifi kullanılmamalıdır. -3-

4 gerekiyorsa 50 analiz için gerekli kimyasalların yer aldığı şişe içerikleri daha büyük hacimli amber renkli cam bir şişe içerisinde birleştirilmelidir. Bu sayede her bir analiz şişesi için ayrı bir kalibrasyon grafiği hazırlamaksızın tek bir kalibrasyon grafiği ile ölçümler gerçekleştirilebilecektir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin berrak ve homojen olması gerekmektedir. Katı veya bulanık örneklerde glukoz analizi gerçekleştirilmesi durumunda EK1 de verilen berrak örnek hazırlama yöntemlerinden yararlanılmalıdır. Örneğin 2 g/l den fazla glukoz içermesi durumunda seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Glukoz derişimi (g/l) Örnek + Saf Su Miktarı Seyreltme Faktörü < ANALĐZ BĐLGĐLERĐ > Spekrofotometre dalga boyu : 505 nm Küvet : 1 cm standart (Plastik veya cam) Ölçüm sıcaklığı : 25ºC veya 37ºC Spekrofotometre sıfır ayarı UYARILAR : Kör çözeltisi Analiz çözeltilerini hazırladıktan sonra dondurmayınız. Analiz çözeltilerini çapraz-kontamine etmeyiniz. Analiz kimyasallarının ve çözeltilerinin gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. -4-

5 ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 3. Test tüplerine 0.05 ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 4. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız ml glukoz analiz reaktifini ilave ediniz ml tampon ilave ediniz. 7. Son hacim 2.50 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz ºC de 40 dakika veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz. 9. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 4 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar tabloda özetlenmiştir. KÖR ÖRNEK Örnek veya standart ml Tüplerin, analiz çözeltisinin ve saf suyun analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. Glukoz analiz reaktifi 0.05 ml 0.05 ml Glukoz analiz tamponu ml 0.40 ml Saf su 2.05 ml 2.00 ml 25ºC de 40 dk veya 37ºC de 20 dk inkübe ediniz Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 505 nm de absorbans artışını ( A) ölçünüz. 4 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. 5 Analiz tamponunu ölçüm sıcaklığına gelmesini sağladıktan sonra ilave ediniz. -5-

6 KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE ÖRNEK GLUKOZ DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan glukoz standart çözeltileri kullanılarak derişim-absorbans grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orijinden geçiriniz. 6, 7 Eğilim çizgisinin eğimini (M, L abs x g glukoz ) saptayınız. Örneğin glukoz derişimi (g/l) = Örnek için ölçülen absorbans artışı ( A) Kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) ÖNEMLĐ UYARI Derişim hesaplamalarında sadece sıvı örnekler (veya filtratlar) için seyreltme faktörü kullanılarak hesaplamalar gerçekleştirilmiştir. Örneğinizde seyreltme tablosunda yer alan seyreltme harici herhangi bir ön seyreltme yapılmışsa hesaplamalarda mutlaka kullanılmalıdır. Katı örneklerde örneğin hazırlandığı toplam hacim ile hesaplanan derişim değerleri çarpılarak toplam analit miktarı saptanmalı ve sonrasında alınan örnek miktarına bölünerek birim örnek ağrılığı başına derişim değerleri hesaplanmalıdır. DOĞRUSALLIK SINIRI Hazırlanan glukoz tayin kitinin 2 g/l derişimine kadar doğrusal olduğu saptanmıştır. Daha yüksek glukoz içeren örneklerin seyreltme tablosu kullanılarak seyreltilmesi gerekmektedir. HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Glukoz tayin kiti ortamda 2 g/l glukoz varlığında yaklaşık 1.40 Abs üretecek şekilde hazırlanmıştır Abs değerinde değişim olması 6 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 7 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. -6-

7 durumunda glukoz derişimde ~1.43 mg/l lik bir değişim ölçülebilecektir. Ölçüm sınırı spekrofotometre gürültü seviyesinin 3 katı absorbans değerine eşdeğer glukoz derişimi olarak hesaplanmıştır. Ölçüm sınırı kullanılan spekrofotometreye bağlı olarak değişmekle birlikte üretim ve kalite kontrol sürecinde kullanılan Agilent UV/Vis Spekrofotometre için ölçüm sınırı 2.5 mg/l olarak saptanmıştır. DOĞRULUK Glukoz tayin kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı glukoz derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK=ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki glukoz değeri için de %DK değerinin % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Glukoz derişimi (g/l) Standart Sapma % DK ± ± Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. -7-

8 GÜVENLĐK Glukoz analiz tamponu içerisinde fenol bulunmaktadır. Fenol organik toksik bir madde olması nedeniyle analiz sürecinde dikkatli olunmalıdır. Fenol içeren çözeltilerin koklanmaması, içilmemesi, vücuda temas ettirilmemesi gerekmektedir. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. GĐRĐŞĐM FAKTÖRLERĐ Geliştirilen yöntemin glukozun oksidasyonu sonucu oluşan hidrojen peroksidin kantitatif olarak saptanmasını temel alan bir yöntem olması nedeniyle analiz ortamında hidrojen peroksidin bulunması veya reaksiyon süresince hidrojen peroksidin üretiminin gerçekleşmesi durumunda enzimatik test kiti yanlış sonuç üretecektir. Böyle bir durumla karşılaşıldığında üretici firma ile temasa geçiniz. Gerekli teknik destek üretici firma tarafından sağlanacaktır. -8-

9 EK 1. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin bulanık olmaması, herhangi bir partikül içermemesi, renksiz olması gerekmektedir. Renkli çözelti olması durumunda analize başlamadan önce her bir örnek için örnek miktarı kadar hacim analiz tamponu ile karıştırılmalı ve analiz tamponuna karşı okunarak örneğin neden olmuş olduğu absorbans artışı saptanmalıdır. Bu absorbans değeri örnek-analiz reaktifi varlığında saptanan absorbans değerinden çıkartıldıktan sonra saptanan absorbans değeri hesaplamalarda kullanılmalıdır. Absorbans değerinin çok yüksek olması durumunda örnek seyreltilerek ölçüm gerçekleştirilebilir. Örneğin seyreltilmesi durumunda örneğin glukoz derişimi glukoz tayin kiti ölçüm sınırının altına iniyorsa seyreltme işlemi yapılmaksızın renk giderici maddeler ile muamele edilmelidir. Örneğin ph değerinin analiz tamponu ph değerine yakın olması tercih edilmelidir. Seyreltik asit veya baz içeren örneklerde bu ph değeri aranmamaktadır. Fakat derişik asit veya baz içeren örneklerin ph değerleri ph 7.6 olacak şekilde sodyum hidroksit veya sülfürik asit ilave edilerek ayarlanmalıdır. ph nın ayarlaması esnasında meydana gelecek hacim artışı hesaplamalarda kullanılmak üzere kaydedilmelidir. Katı örnekler öğütülmeli, homojenize edilmeli ve su kullanılarak çözünür maddeler ekstrakte edilmelidir. Bulanık çözeltiler filtre edilmelidir. Bulanık, renkli veya protein içeriği yüksek örnekler Carrez çözeltileri kullanılarak berraklaştırılmalıdır. Yağ içeren örneklerde ekstraksiyon işlemi yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilmeli, su-yağ karışımı soğutularak veya santrifüj edilerek yağ fazının ayrılması sağlanmalıdır. Berrak su fazında glukoz ölçümü gerçekleştirilmelidir. Örneğinizde herhangi bir şekilde glukozu substrat olarak kullanan enzimin bulunması durumunda, bu enzimin çalışma koşullarının dışında analizin gerçekleştirildiğinden emin olunmalı, mümkünse enzimler inhibe edilmelidir. Ayrıca mikrobiyal gelişme ihtimali ortadan kaldırılmalı, örnekler bekletilmeden analizlenmeli veya uygun koşullarda saklamalıdır. Yapısında glukoz içeren di, oligo veya polisakkaritin ortamda bulunması durumunda bu moleküller parçalandığı takdirde örneğin glukoz içeriğinin artacağı unutulmamalı, -9-

10 kuvvetli asitlerle etkileştirilmemeli ve muhtemel enzimatik reaksiyonlar engellenmelidir. Yüksek miktarda renk maddesi içeren örneklerde polivinilpoliprolidon veya poliamid çözeltileri kullanılarak renk giderme işlemi gerçekleştirilmelidir (1g/100 ml). Karbondioksit ve benzeri gaz içerikli örneklerde mutlaka gaz giderme işlemi yapılmalıdır. Carrez Çözeltileri ile Çöktürme Đşlemi 100 ml lik balon joje içerisine sıvı örneğinizi pipet yardımıyla veya katı örneğinizi tartarak aktarınız (Örnek miktarına örneğin tahmini glukoz içeriğine göre karar verilmelidir.). Örnek üzerine 60 ml saf su ve ardından 5 ml Carrez-I çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Daha sonra 5 ml Carrez-II çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Çözeltinin ph değerini 7.6 olacak şekilde sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız, 100 ml ye saf su ile tamamlayınız ve filtre ediniz. Filtratı analizinizde kullanınız ve bu işlemde gerçekleşen seyreltme faktörünü örneğinizin glukoz içeriğinin saptanmasında kullanınız. Carrez-I çözeltisi: g çinko asetat dihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.2H 2 O] veya 24 g çinko asetat trihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.3H 2 O] suda çözündürülür, 3 ml glasiyal asetik asit katılır, damıtık su ile 100 ml'ye tamamlanır. Carrez-II çözeltisi: 10.6 g potasyum demir-ii siyanür trihidrat [K 4 Fe(CN) 6.3H 2 O] suda çözündürülür, 100 ml ye tamamlanır [4]. -10-

11 EK 2. ÖRNEK HAZIRLAMA UYGULAMALARI Meyve suyu ve benzeri örneklerde glukoz tayini: Bulanıklık etmenlerini örneği filtre ederek uzaklaştırınız. Gerekli olması durumunda Carrez çözeltilerini kullanarak berraklaştırınız. Örneğinizi yaklaşık glukoz içeriği g/l olacak şekilde seyreltiniz. Renkli örnekleri seyrelterek rengin analiz üzerindeki olumsuz etkisini ortadan kaldırınız gerekiyorsa kimyasallar kullanarak renk giderme işlemi gerçekleştiriniz. Kimyasal renk giderme amacıyla 10 ml örnek üzerine 0.1 g poliamid veya polivinilpoliprolidon ilave ediniz, kuvvetlice karıştırınız ve sonrasında filtre ederek berrak çözeltide glukoz tayini yapınız. Gazlı alkollü ve alkolsüz içeceklerde glukoz tayini: Karbonik asidin örneğin yapısından ayrılması için 3 dk C de karıştırınız ve sonra glukoz tayinini yapınız. Reçel ve benzeri örneklerde glukoz tayini: Örneği homojenize ettikten sonra yaklaşık 0.5 g örneği 100 ml lik balon içerisine tartınız ve saf su ile 100 ml ye tamamlayınız. Gerekli olması durumunda filtre ediniz ve berrak filtratta glukoz tayinini gerçekleştiriniz. Bal örneklerinde glukoz tayini: Spatül yardımıyla balı karıştırınız ve yaklaşık 20 g örnek alınız. Örneğinize 15 dk süre ile 60-65ºC de ısı uygulayınız ve bu süre içerisinde örneğiniz karıştırınız. Sonrasında soğumasını bekleyiniz. 100 ml lık balon içerisine 1 g örnek tartınız, aşamalı olarak saf su ile çözünüz ve son hacmi 100 ml ye tamamlayınız. Örneğinizi 1:10 oranında saf su ile seyreltiniz ve glukoz tayinini gerçekleştiriniz. Un, ekmek, bisküvi ve benzeri örneklerde glukoz tayini: Yaklaşık 10 g örneği 50 ml saf su içerisinde homojenize ediniz ve 250 ml lık erlen içerisine aktarınız. Erlene 150 ml saf su ilave ediniz, karıştırınız ve 5 ml Carrez I ilave ediniz, karıştırınız, 5 ml Carrez II ilave ediniz, karıştırınız. Karışımın ph sını 7.6 ya sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız ve sonrasında 250 ml lik balon jojeye transfer ediniz. Son -11-

12 hacim 250 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz ve çözeltiyi filtre ederek berrak filtratta glukoz tayini yapınız. 8, 9 Bitkisel ve hayvansal doku parçalarında glukoz tayini: Örneğinizi gerekli olması durumunda parçalayınız, öğütünüz, saf su kullanarak homojenize ederek glukozun örnekten ekstrakte ve sonrasında filtre edilebilmesini sağlayınız. (Bu aşamada örneğinizin kuru madde ve glukoz miktarına bağlı olarak değişmekle birlikte kuru bir örnek için 0.25 g örneğin alınması ve filtrasyon öncesi hacminin 100 ml ye tamamlanması tavsiye edilmektedir. 100 ml lik bir balon joje içerisine 50 ml filtratınızdan ilave ediniz ve daha sonra 5 ml Carrez-I ve 5 ml Carrez-II ilave ediniz. Her bir aşamadan sonra kuvvetli bir şekilde çalkalayınız ve sonrasında son hacmi 100 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz. Karışımı filtre ediniz ve filtratınızda glukoz tayinini gerçekleştiriniz [5]. REFERANSLAR 1. Keston, A.S., Colorimetric, "Enzymatic Reagents for Glucose" Abstracts of Papers, 129th Meeting ACS, 131C (1956). 2. Trinder, P., "Determination of Blood Glucose Using 4- Aminophenazone.".J. Clin. Path., 22:246 (1959). 3. Tietz, N.W., Fundamentals of Clin. Chem., Philadelphia, W.B. Saunders (1970) z.pdf Örneğinizdeki glukoz içeriğini kuru madde üzerinden vermek istiyorsanız örneğinizdeki nem içeriğini saptayınız ve hesaplamalarınızda kullanınız. 9 Ekmek, bisküvi ve benzeri örneklerde gerekli olması durumunda 30 dk süre ile 60-70ºC de ısıl işlem uygulayınız -12-

13 UYARI Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almak ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. -13-

14 NOTLAR -14-

15 NOTLAR -15-

16 NOTLAR -16-