ANALİTİK KİMYA LABORATUVAR FÖYÜ 3

Transkript

1 ANALİTİK KİMYA LABORATUVAR FÖYÜ 3 Enstrümental Analizler Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Analitik Kimya Laboratuvarı

2 İçindekiler SPEKTROFOTOMETRİ... 1 KOLORİMETRİ... 4 FLORESANS SPEKTROSKOPİSİ... 7 POLARİMETRİ REFRAKTOMETRİ KROMATOGRAFİYE GİRİŞ KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ VOLTAMETRİ VE POLAROGRAFİ KONDÜKTOMETRİK TİTRASYON (İLETKENLİK TİTRASYONU)

3 SPEKTROFOTOMETRİ Spektrofotometri, dalga boyunun bir fonksiyonu olarak bir maddenin transmittans (geçirgenlik) / absorbans özelliklerini inceleyen bilim dalıdır. Işık enerjisinin absorbsiyonuna dayalı bir yöntemdir. Işık elektromanyetik bir radyasyondur ve frekansı (v) veya dalga boyu (λ) ile karakterize edilir. Işık enerjisi; E = h.v veya E = h.c/ λ olarak verilir. Bu eşitliklerde, h (Planck sabiti) = 6, erg.s ve c = cm/s dir. Işık; atom, iyon ve moleküller tarafından absorbe edilebilir. Absorbe edilen enerji, elektronların düşük enerjili orbitallerden (temel hal) daha yüksek enerjili orbitallere (uyarılmış hal) geçmesine neden olur. Bir enerjinin absorblanması için iki enerji seviyesi arasındaki farka eşit olması gerekir. Şekil 1. Işığın elektromanyetik spektrumu Hangi spektrum bölgesinde olursa olsun belli bir dalga boyundaki ışığın absorbsiyonu enerjiyi absorbe etme kapasitesine sahip bir yapının varlığının göstergesidir. Absorbsiyon miktarının dalga boyunun bir fonksiyonu olarak kaydedilmesi sonucunda absorbsiyon spektrumu meydana gelir. UV ve görünür bölge (UV/GB) spektrumunda, absorbanslar dalga boyuna karşı grafiğe geçirilir ve absorbsiyonun en yüksek olduğu dalga boyunda bir maksimum görülür (λmax). İnfrared spektrumunda ise % transmittans lar dalga boyuna karşı grafiğe geçirilir ve absorbsiyonun en yüksek olduğu dalga boyunda bir minimum görülür. Işık absorbsiyonu spektrofotometre ile ölçülür. Bu ölçüm atom, iyon veya molekül üzerine gönderilen ışığın şiddeti (I0) ile geçen ışığın şiddeti (I) arasındaki farkın ölçümü şeklindedir. % Geçirgenlik (T) = I/I0 Absorbans (A) = log (I0/I) 1

4 Dedektör Lambert Beer Yasası; Absorbans (A) ile derişim (C) ve ışığın numune içinde aldığı yol (l) arasındaki ilişkiyi açıklar. A = k. l. C k absorbtiviteyi ifade etmektedir ve derişim g/l olarak verildiğinde kullanılır. Derişim mol/l (M) cinsinden veriliyorsa, k katsayısı ε (molar absorbtivite) ile gösterilir. ε maddenin cinsine ve dalga boyuna bağlıdır. UV/GB Spektrofotometrisinde Cihaz Bilgisi: Işık kaynağı Monokromatör (Dalga boyu seçici) Numune kabı (küvet) Dedektör Kaydedici Dalga boyu seçici Işık Kaynağı Prizma Numune haznesi Kaydedici (Bilgisayar) Şekil 2. Spektrofotometre cihazının şematik gösterimi Spektrofotometrinin kullanım alanları; Kalitatif analiz Kantitatif analiz Denge sabitinin tayini Molekül ağırlığının belirlenmesi Kinetik çalışmalar Fotometrik titrasyon 2

5 Kantitatif analiz; Lambert Beer yasasına dayanır. Derişimleri bilinen bir seri hazırlanarak absorbansları saptanır. Derişime karşı absorbans değerleri bir grafiğe geçirilerek bir doğru çizilir. y=mx+n formülü sayesinde bilinmeyen derişim bulunur. Spektrofotometrik kafein tayini; Öncelikle 5 mg saf kafein tartılarak 50 ml su içerisinde çözülür. Elde edilen çözeltinin derişimi 100 µg/ml dir. Ardından bu çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılarak her biri 10 ml olacak şekilde 4.0, 8.0, 12, 16 ve 20 µg/ml kafein çözeltileri hazırlanır (seyreltme hesaplamaları öğrenciler tarafından yapılacaktır). Spektrofotometrede dalga boyu aralığı olarak nm seçilir. Standart çözeltilerin spektrumlarında en yüksek absorbansın gözlendiği 272 nm deki absorbanslar ölçülerek not alınır. Bu verilerden hareketle doğrusal regresyon denklemi elde edilir ve bu denklem daha sonra derişimi bilinmeyen numunelerin tayini için kullanılır. Derişimi bilinmeyen kafein içeren numunenin absorbans değeri aynı cihaz parametreleri kullanılarak ölçülür ve doğrusal regresyon denkleminden faydalanılarak numunenin derişimi hesaplanır. 3

6 KOLORİMETRİ Işığın dalga boyunun nm aralığında olan bölgesi görünür bölge olarak tanımlanır. İnsan gözü bu dalga boyuna sahip ışığı algılayabilir. Bu algı renk olarak ifade edilir ve göze gelen ışığın içerdiği dalga boylarına göre değişir. Beyaz ışık bu aralıktaki bütün dalga boylarını içermektedir. Bir nesne beyaz ışığın belirli dalga boylarını absorbladığında geriye kalan dalga boyları o nesnenin rengini oluşturur. Örneğin nm civarındaki ışığı absorbe eden bir nesnenin rengi sarıdır. Görünür bölgedeki hiçbir dalga boyunu absorbe etmeyen nesneler beyaz görünürken, bütün dalga boylarını absorbe eden nesneler ise siyah görünürler. Maddelere gelen ışınlar ya absorblanırlar (ardından maddde floresans yapabilir), ya maddeye çarparak saçılırlar ya da herhangi bir etkileşime girmeden maddenin içerisinden geçerler. Maddenin absorblamadığı ışınlar (floresans durumunda emisyon yapılan ışınlar da dahil edilir), maddenin rengini oluştururlar. Dolayısıyla maddelerin ışık absorbsiyonuyla rengi arasında bir ilişki vardır. Aşağıdaki tabloda absorblanan dalga boyu aralığı ile renk arasındaki ilişki verilmiştir. Buna göre bir maddenin rengine bakarak aşağı yukarı hangi dalga boylarını absorblayabileceğini anlayabiliriz. Tablo 1. Absorblanan ışık ile görünen renk arasındaki ilişki Absorblanan ışık (nm) Absorblanan renk Görünen renk Mor Sarı-yeşil Mor-mavi Sarı Mavi Turuncu Mavi-yeşil Kırmızı Yeşil Eflatun Sarı-yeşil Mor Sarı Mor-mavi Turuncu Mavi Kırmızı Mavi-yeşil Eflatun Yeşil Maddelerin renklerini kullanarak günlük hayatta çeşitli analizler yaparız. Örneğin bir gıdanın bozulup bozulmadığını hatta lezzetli olup olmadığını anlamamızda renk bize fikir verebilir. Çayın rengi bize çayın ne kadar demli olduğu dolayısıyla çaya tadını veren maddelerin hangi miktarda olabileceği ile ilgili fikir verir. Maddelerin rengine bakarak nitel analiz 4

7 yapabileceğimiz gibi renk yoğunluğu kullanılarak nicel analiz de yapmak mümkündür. Çünkü maddelerin renk yoğunluğu ile maddenin derişimi orantılıdır. Maddenin rengi kullanılarak yapılan analize kolorimetri adı verilir. Kolorimetrik ölçümler laboratuvarlarda genellikle spektrofotometreler kullanılarak absorbans ölçümleri üzerinden dolaylı olarak yapılır. Ancak renk ölçümlerinin çok önemli olduğu sektörlerde (giyim gibi) doğrudan renk şiddeti ölçen kolorimetre cihazları kullanılır. Ayrıca görüntülerden renk şiddetlerini ölçebilen yazılımlar da mevcuttur ve bu sayede bilgisayar ve cep telefonları kullanılarak kolayca kolorimetrik ölçümler yapılabilir. Kolorimetrik Fe 3+ Analizi Bu deneyde bir Fe 3+ numunesinin derişimini kabaca bulabilmek için gözle tayin yapılacaktır. Bu yöntemde, tayini yapılacak örneğin derişimi belli standart çözeltileri hazırlanarak bunların renk şiddetleri numuneninki ile karşılaştırılır. Karşılaştırma işlemlerinde örnek çözeltinin renginin standart serideki çözeltilerin renkleriyle uyumu gözlenerek derişimi saptanır. Bu yöntem çok hassas sonuçların gerekmediği ve basit analizlerin yeterli olacağı durumlarda kullanılabilir. Fe 3+ içeren bir numunenin kolorimetrik analizi için, Fe 3+ standartları: g FeCl3.6H2O bileşiği tartılarak üzerine 3 ml derişik HCl ilave edilir ve hacim 50 mililitreye saf su ile tamamlanarak standart Fe 3+ çözeltisi hazırlanır. Bu çözeltiden 1 den 5 e kadar numaralandırılmış tüplere sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 ml alınır ve saf su ile 10 ml ye seyreltilir. Fe 3+ numunesi: 10 ml numune bir başka test tüpüne alınır. K4[Fe(CN)6].3H2O çözeltisi: Fe 3+ ile reaksiyona girerek renkli ürün oluşturacak olan potasyum ferrosiyanür çözeltisinden 3,0 mm 10 ml hazırlanır. 5

8 Deney: Her bir tüpe (standartlar ve numune) 1 er ml potasyum ferrosiyanür ilave edilerek tüpler iyice çalkalanır. Standartların bulunduğu tüplerde mavinin değişik tonlarında koyulaşan renkli bir kalibrasyon dizisi elde edilir. Fe 3+ içeren numunenin renginin hangi standartlar arasına karşılık geldiği belirlenir. Buna göre numune içerisindeki Fe 3+ ün derişiminin hangi aralıkta olduğu bulunur. (Molekül Ağırlıkları: K4[Fe(CN)6].3H2O = 422,39 g/mol, FeCl3.6H2O=270,30 g/mol, Fe = 55,85 g/mol) 4 FeCl3 + 3 K4[Fe(CN)6] Fe4[Fe(CN)6] KCl Prusya mavisi 6

9 FLORESANS SPEKTROSKOPİSİ Atomların veya moleküllerin en kararlı hallerinde, elektronlar farklı enerji seviyelerindeki orbital bölgelerinden en düşük enerjili olanlarını doldururlar ve bu hale en düşük enerjili hal, kararlı hal veya temel hal adı verilir. Temel haldeki bir türe dışarıdan bir enerji verildiğinde elektronlar bu enerjiyi absorblayıp daha yüksek enerjili orbitallere geçiş yapabilirler. Bu durumdaki türler kararsızdır ve bu hale uyarılmış hal adı verilir. Uyarılmış haldeki kararsız türler absorbladıkları bu enerjiyi çeşitli yollarla vererek kararlı hale dönerler. İşte bu enerji yayımının ışık şeklinde olmasına lüminesans denir ve bu ışığı inceleyen bilim alanına da lüminesans spektroskopisi 1 denir. Lüminesans, uyarılmış haldeki elektronun spinine bağlı olarak farklı iki mekanizmayla gerçekleşir; floresans ve fosforesans. Eğer uyarılmış halde, yüksek enerjili orbitallere geçiş yapmış elektronun spini temel seviyede bulunan elektronla ters yönde ise bu hale singlet hal denir (Şekil 3). Tersi durumda, yani yüksek enerjili orbitale geçiş yapmış elektronla temel seviyede bulunan elektronla aynı yönde ise bu hale triplet hal adı verilir (Şekil 3). Temel singlet hal Uyarılmış singlet hal Uyarılmış triplet hal Şekil 3. Temel hal ve uyarılmış haldeki elektronların alabileceği bazı durumların şematik gösterimi Moleküller veya atomlar uyarıldıklarında genellikle temel singlet halden uyarılmış singlet hale geçiş yaparlar ve uyarılmış singlet haldeki bu tür enerjisini çok kısa bir sürede (~10 nanosaniye) ışık şeklinde yayar ve bu olaya floresans adı verilir. Floresans olayı günlük hayatta floresan ve neon lambalarda, fosforlu kalemler gibi malzemelerde kullanıldığı gibi bazı akrep, mercan ve mantar türlerinde de doğal olarak gözlemlenebilir. Daha az görülen bir hal olan uyarılmış triplet halden temel hale dönüş görece daha uzun sürede gerçekleşir (1 milisaniyeden 1 saniyeye kadar) ve bu olaya fosforesans adı verilir. Bazı moleküllerin çok daha uzun sürelerde fosforesans yaptığı gözlemlenmiştir. Örneğin karanlıkta parlayan oyuncaklar, lamba anahtarları gibi materyallerde uzun süreli fosforesans 1 Spektroskopi ışık ile maddenin etkileşimini inceleyen bilim dalıdır. 7

10 gözlemlenir. Ayrıca doğal olarak bazı deniz anası, yengeç, ahtapot türleri gibi deniz canlılarında da fosforesans gözlenir. Lüminesans olayında türlerin uyarılması için gerekli enerjinin sağlandığı kaynakla ilgili lüminesans farklı isimler alabilir. Örneğin molekülleri uyarmak için ışık enerjisi kullanıldığında fotolüminesans, elektrik enerjisi kullanıldığında elektrolüminesans, kimyasal reaksiyon enerjisi kullanıldığında kemilüminesans, canlılardaki biyomoleküller kullanıldığında biyolüminesans gibi isimler verilir. Uyarılmış türler temel hale dönüş sırasında absorbladıkları enerjiyi ışımalı şekilde kaybedebildikleri gibi (floresans ve fosforesans) ışıma yapmadan da kaybedebilecekleri çeşitli mekanizmalar mevcuttur ve bu enerji kaybı genellikle ışımalı ve ışımasız çeşitli mekanizmaların karışımı şeklinde gerçekleşir. Işımalı mekanizmalar ne kadar baskınsa o kadar çok floresans veya fosforesans gözlemlenir. Tersi durumda ise floresans ve/veya fosforesans gözlemlenmeyebilir. Işımasız durulma mekanizmalarında genellikle uyarılmış elektron titreşimsel seviyeler arasındaki geçişleri kullanarak enerjisini ısı şeklinde kaybeder. Floresans yayılımında moleküller, ışımasız durulmalar nedeniyle absorbladıkları enerjiden daha düşük bir enerji yayarlar. Bu yüzden floresans spektroskopisinde moleküle yollanan ışığın dalga boyundan daha uzun dalga boylarında floresans gözlemlenir 2. Bu daha yüksek dalga boylarına kayma olayına Stokes kayması adı verilir. 2 Fotonun enerjisi ile ilgili Planck eşitliği: E = hc/λ burada E fotonun enerjisi, h Planck sabiti, c ışığın hızı ve λ ışığın dalga boyudur. Eşitlikten de anlaşılacağı gibi ışığın dalga boyuyla enerjisi ters orantılıdır yani daha yüksek dalga boylarında ışık daha az enerjiye sahiptir. İnsan gözü nm arasındaki görünür bölge olarak adlandırılan ışığı görebilir. Bu bölgeden daha kısa dalga boylarına sahip olan sırasıyla ultraviyole, X-ışınları ve gama ışınları bölgeleri giderek artan enerjiye sahiptirler. Öte yandan görünür bölgeden daha uzun dalga boylarına sahip sırasıyla kızılötesi, mikrodalga ve radyo dalgaları bölgeleri giderek azalan enerjiye sahiptirler. 8

11 Floresansı belirleyen temel faktör moleküler yapıdır ve bir molekülün floresans emisyonu yaptığı ışığın dalga boyundan yararlanarak o maddenin ne olduğuyla ilgili fikir edinmek mümkün olabilir. Dolayısıyla floresans spektroskopisi kalitatif analizlerde bilgi sağlayabilir. Floresansı belirleyen temel şey moleküler yapı olsa da kullanılan çözücü, sıcaklık, ph, çözünmüş oksijen gibi dış faktörler de floresans şiddetini etkilerler. Seyreltik çözeltilerde bir molekülün derişimi ile floresans şiddeti arasında doğru orantı kurulabilir: F = k C Burada F floresans şiddeti, k floresans sabiti ve C maddenin derişimidir. Bu eşitlik bize seyreltik çözeltilerde floresans şiddeti ölçümlerinden yararlanarak kantitatif analiz yapılabileceğini göstermektedir. Floresans spektroskopisinde kullanılan cihazlar, UV-görünür bölge absorbsiyon spektroskopisinde kullanılan cihazlara benzemekle birlikte bazı farklar mevcuttur. Öncelikle absorbsiyon spektrofotometrelerinde maddeye gönderilen ışığın absorblanmadan geçen kısmı ölçüldüğü için ışık kaynağı, numune ve dedektör aynı doğrultuda yerleştirilirler. Floresans spektrofotometrelerinde ise numunenin absorbladığı ışınları daha sonra yayması ölçülmek istendiği için dedektör numune haznesine 90 o açıyla yerleştirilir. Böylece ışık kaynağından çıkan ve numune tarafından absorblanmayan ışınlar detektöre ulaşmaz, sadece numune tarafından yayılan floresans ölçülür. Numuneye gidecek ışığın ve numuneden yayılan ışığın dalga boylarını seçmesi için hem numuneden önce hem de numuneden sonra bir dalga boyu seçici (genellikle monokromatör) kullanılır. 9

12 Bir floresans spektrofotometresinin şematik gösterimi aşağıdaki gibidir: Dalga boyu seçici Işık Kaynağı Numune haznesi Prizma 90 o Dalga boyu seçici Kaydedici (Bilgisayar) Dedektör Şekil 4. Floresans spektrofotometresinin şematik gösterimi SPEKTRTROFLORİMETRİK RİBOFLAVİN (B2 VİTAMİNİ) TAYİNİ Öncelikle 2,5 mg saf riboflavin tartılarak 50 ml asetik asit çözeltisi (0,02 M) içerisinde çözülür (Çözünme uzun sürebilir ve ısıtarak veya ultrasonik banyo kullanılarak çözünme işlemi hızlandırılabilir, ısıtılacaksa ısıtmaya uygun bir cam malzeme kullanılmalıdır!). Elde edilen çözeltinin derişimi 50 µg/ml dir. Ardından bu çözeltiden gerekli seyreltmeler yapılarak her biri 10 ml olacak şekilde 0,2; 0,5; 1,0; 1,5 ve 2,0 µg/ml riboflavin çözeltileri hazırlanır (seyreltme hesaplamaları öğrenciler tarafından yapılacaktır). Floresans spektrofotometresi cihazında uyarma dalga boyu olarak 450 nm ve emisyon aralığı olarak ise 10

13 nm aralığı seçilir. Slit aralıkları 5 nm ve fotoçoğaltıcı tüp voltajı olarak ise 700 V seçilecektir. Standart çözeltilerin floresans emisyonu spektrumlarında en yüksek floresans şiddetleri olan 526 nm deki şiddet ölçülerek not alınacaktır. Bu verilerden hareketle doğrusal regresyon denklemi elde edilecek ve bu denklem daha sonra derişimi bilinmeyen numunelerin tayini için kullanılacaktır. Derişimi bilinmeyen riboflavin içeren numunenin (multivitamin tabletleri, enerji içecekleri vs) floresans şiddeti aynı cihaz parametreleri kullanılarak ölçülür ve doğrusal regresyon denkleminden faydalanılarak numunenin derişimi hesaplanır. 11

14 POLARİMETRİ Polarize ışık düzlemini sağa veya sola çeviren maddelere optikçe aktif maddeler denir. Bunlardan polarize ışık düzlemini sağa çevirenlere dekstrojir, sola çevirenlere ise levojir denir. Sağa çevirenlerin önüne (+), sola çevirenlerin önüneyse (-) konur. Optikçe aktif bileşikler, biri diğerinin ayna görüntüsü olan iki tür molekül oluştururlar. Ayna simetrisinde olan bu iki molekül birbiri üzerine çakışmaz. Bu şekilde birbirinin ayna görüntüsü olan moleküllere optik izomer adı verilir. Bir maddenin optik izomerisinin olması için asimetrik karbon atomunun olması gerekir. D (dekstrojir)-gliseraldehitte -OH grubu sağda, L(levojir)-gliseraldehitte ise -OH grubu soldadır. POLARİMETRE Polarize ışık düzleminin döndürme açısını ölçmek için kullanılan cihazlara polarimetre denir. Polarimetre, molekül boyutları ile derişim miktarı tayininde ve gıda maddelerinin kontrollerinde kullanılır. Polarimetre, biri sabit diğeri düşey bir düzlemde dönebilen iki kutuplayıcıdan meydana gelir. Kutuplayıcı olarak kullanılan Kalsit kristallerinden sabit olana polarizör, dönebilene ise analizör denir. (Polarizör, tanımlanmamış elektromanyetik dalgalardan oluşan bir ışın demetini tanımlanmış bir polarizasyona sokan bir alettir). Işık, polarizörden girip kutuplanarak analizör üzerine düşer. Analizörden ışık geçtiğinde araya konan madde ışığın kutuplanma düzlemini çevirir. Çevirme miktarı, analizörü tekrar ışık geçmeyecek şekilde döndürerek bulunur. Böylece maddelere ait değişik çevirme açıları bulunabilir. Bu açılar optikçe aktifliğin miktarını gösterir. 12

15 Şekil 5. Polarimetrenin şematik gösterimi ÇEVİRME AÇISINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER; Sıcaklık Kullanılan ışığın dalga boyu (dalga boyu ne kadar küçükse çevirme açısı o kadar büyük olur). Işığın içinden geçtiği yolun uzunluğu Maddenin yapısı Maddenin derişimi Polarimetride metodun amacı ölçülen çevirme açısından yararlanarak derişim tayin etmek olduğuna göre, yapılacak iş derişim dışındaki faktörleri sabit tutup derişimle çevirme açısı arasında bir bağlantı kurmaktır. Asimetrik karbon atomuna bağlı bileşik aynı zamanda optikçe aktiftir. Optikçe aktiflik, bir cismin polarize ışığı kendi düzleminden saptırma kabiliyetidir. Düzlemsel polarize ışık ile asimetrik organik veya inorganik bileşikler etkileştiği zaman, polarize ışığın düzlemi açısı değiştirir. Açı değişimi sonucu polarize ışığın düzlemi saat yönünde yani sağa çevrilmişse bu çevrilmeye dekstro (+), tersine çevrilmişse levo (-) çevrilme denir. 13

16 Optikçe aktif maddelerin polarize ışığın yönünü sağa ve sola çevirenlerin her birisine birbirinin enantiyomeri denir. POLARİMETRE İLE YAPILAN TAYİNLER Molekül boyutlarının tayini, Madde derişiminin tayini, Gıda maddelerinin kontrolleri, Bilimsel araştırmalarda üretilen maddelerin saflık tayini, POLARİMETRENİN KULLANIM ALANLARI Eczacılık; Üretilen ilaçların içindeki optikçe aktif bazı bileşiklerin derişimini ölçmek için kullanılır. Kozmetik Sanayi; Kullanılan esansların ve aromatik yağların denetlenmesinde ve kalite kontrolünde kullanılır. Gıda Sanayi; Üretilen gıdaların kalite kontrolünde ve katkı maddelerinin alt ve üst sınırlarının belirlenmesinde kullanılır. Genellikle şeker bulunduran gıdalarda maddelerin optik aktifliğinden yararlanılır. GLUKOZ MONOHİDRAT TAYİNİ 1 M stok çözelti hazırlanır. (19,817 g glukoz monohidrat tartılıp suda çözülür ve 100 ml lik balon jojede 100 ml ye tamamlanır) Bu stok çözeltiden hareketle 0,1 M, 0,15 M, 0,20 M, 0,25 M ve 0,50 M standart çözeltiler hazırlanır. Derişimi bilinmeyen numune size sorumlu asistanınız tarafından verilecektir. Küçük tüp hava kabarcığı kalmayacak şekilde saf su ile doldurulur ve cihazın okuma bölmesinin tam ortasına yerleştirilip kapak kapatılır. Cihazın mikroskop deliğinden bakılarak çift bölmelerin rengi eşitlenir. Eğer sağ taraftaki bölme koyu ise renk eşitleninceye kadar LEFT tuşuna, sol taraftaki bölme daha koyu ise renk eşitleninceye kadar RIGHT tuşuna basılır. Yani R ve L tuşlarına basılarak ayarlanır. Renkler eşitlendiği anda ZERO SET tuşuna basılır. Ekranda kırmızı renkli sıfır sayısı çıkar. Daha sonra okutulacak numuneler tüpte hava kabarcığı kalmayacak şekilde okuma 14

17 bölmesine konulur. Mikroskop camından bakılarak çift bölmenin renkleri eşitlenir ve ekranda görülen kırmızı sayılar kaydedilir. Kaydedilen değerler derişime karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturulur ve regresyon denklemi hesaplanır. (Excel programından yararlanılabilir) Verilen numune de aynı şekilde ölçülür ve elde edilen değer regresyon denkleminde yerine konarak numunenin derişimi hesaplanır. 15

18 REFRAKTOMETRİ Refraktometri, maddelerin ışığı kırma(refraction) özelliğinden yararlanılan enstrümantal analiz yöntemlerinden biridir. Kırılma indisinin tayininde kullanılan aletlere refraktometre denir. Kırılma indisi (refraktif indeksi), maddenin kaynama noktası, erime noktası, yoğunluğu gibi fiziksel özelliklerinden birisidir ve her maddeye özgü bir kırılma indisi vardır. Bu özellikten yararlanılarak maddelerin tanınması ve kırılma indisi ile konsantrasyon arasındaki ilişkiden yararlanılarak hem kalititatif hem de kantitatif analiz yapılabilmektedir. Kırılma İndisi: Bir maddenin kırılma indisi, bir ortamdan diğerine geçen paralel ışın demetinin yönündeki değişikliğin (kırılma) saptanmasıyla tayin edilir. Bir maddenin kırılma indisi, kullanılan ışımanın dalga boyuna, sıcaklığa ve derişime ve basınca bağlıdır. Kırılma indisi genellikle saydam cisimlerde ölçülür. Örneğin, organik sıvıların kırılma indisi 1.25 ile 1.80 arasında değişirken, katılarda bu değer 1.3 ile 2.5 arasındadır. Gelen Işın i 1. ortam 2. ortam r Kırılan Işın Işının geliş açısı, ışının hızı ve kırılma indisi ile orantılıdır. Işının geliş ve yansıma açılarının bilinmesi durumunda, iki ortamın kırılma indislerinin oranları bulunabilir. Ya da bir ortamın kırılma indisini biliniyorsa, diğer ortamın indisini de bu bağıntı sayesinde hesaplanabilir. 16

19 Snell Yasasına göre; Işının bir ortama geliş açısı i, yansıma açısı r dersek eğer, v 1: Işının 1. ortamdaki hızı v 2: Işının 2. ortamdaki hızı n 1: 1. ortamın kırılma indisi n 2: 2. ortamın kırılma indisi sin i sinr = v 1 v 2 = n 2 n 1 Kırılma indisleri farklı olan bölgelerde ışının hareketi şu şekilde gerçekleşir: Işın, az yoğun ortamdan çok yoğun ortama geçerken hangi açı ile gelirse gelsin normale yaklaşarak kırılır ve ikinci ortama geçer. Işınlar çok yoğun ortamdan az yoğun ortama geçerken ışının, normalle yaptığı açı büyür. Geliş açısını yavaş yavaş arttırdığımızda, kırılma açısı da buna paralel olarak yavaş yavaş büyür. Açı arttırma işlemine devam edildiğinde, öyle bir noktaya gelinir ki, artık gelen ışınlar, iki ortamı ayıran yüzeye paralel olarak yoluna devam eder. Yani kırılma açısı 90 olur. Böylece, gelme açısına sınır açısı(kritik açı) denir. Snell yasasından yararlanarak şöyle bir bağıntı yazabiliriz: sinθc = n 2 n 1 Işının kritik açıdan daha küçük bir değerle gelmesi halinde, yansıma sonucu aydınlık bölge oluşur. Eğer ışın sınır açısından daha büyük açıyla gelirse ikinci ortama geçemez ve geldiği ortama normalle eşit açı yaparak geri döner. Buna da tam yansıma denir. Burada sınır açısının oluştuğu yerden itibaren kuvvetli (karanlık) bir bölge oluşur. Aydınlık ve 17

20 karanlık bölgeyi ayıran çizgeye göre kırılma indisi hesaplanır. Abbe Refraktometresi Abbe refraktometresi en uygun ve en çok kullanılan refraktometredir. Abbe refraktometresinde iki prizmanın arasına kırılma indisini tayin edilecek maddeyi sıvı film olarak yerleştirilir. Refraktometri cihazının içerisinde prizmalar kullanılır. Gönderdiğimiz ışın örnekten geçip prizmaya değişik açılarla gelir. Gelen açı kritik açıdan küçükse aydınlık bölge oluşur. Gelen açı kritik açıdan büyükse karanlık bölge oluşur. Karanlık ve aydınlık bölgenin sınırı kritik açıya karşılık gelir. Kırılma İndisi Ölçümünün Kullanıldığı Yerler Kırılma indisi E.N ve K.N. gibi bir kimyasal türün belirlenmesinde kullanılan sabitlerdendir. Endüstride saflık kontrolünde kullanılır. Kırılma indisleri ile derişim arasındaki ilişkiden derişim tayini yapılabilir. Şeker tayininde, camda SiO 2 tayininde ve petrolde aromatik hidrokarbonların analizinde de kırılma indisinden faydalanılmaktadır. Deneyin Yapılışı: %1, %2, %3, %4, %5 lik glukoz çözeltilerinden abbe refraktometresine sırayla %1 lik glukoz çözeltisinden birkaç damla prizma üzerine damlatılır ve diğer prizma kapatılır. Yayılan glukoz çözeltisi mercekten bakılır ve karanlık ve aydınlık bölgeler görülür. Karanlık ve aydınlık bölgeyi ayıran saç teli çarpı işaretinin tam ortasına getirilince, kırma indisi okunur. 18

21 Diğer çözeltilerin kırma indisini ölçmeden önce prizmalar distile su ile iyice silinir ve %2lik çözeltiden 2 damla prizma üzerine damlatılarak ölçüm yapılır. Bu işlem diğer çözeltiler içinde tekrarlanarak kırma indisleri kaydedilir. Glukoz çözeltilerinin kırma indisleri değerleri tabloya geçirilerek kalibrasyon denklemi bulunur. Bu denklemde konsantrasyonu bilinmeyen glukoz çözeltisinin konsantrasyonu tayin edilir. 19

22 KROMATOGRAFİYE GİRİŞ Ayırma Teknikleri Analizi yapılması gereken numuneler büyük çoğunlukla farklı maddelerin karışımı halinde bulunurlar. Karışım halinde bulunan bu maddelerin verdikleri analitik sinyaller genellikle birbirlerini etkiler, yani girişim yapar. Bu yüzden, bu tip numunelerin kalitatif ya da kantitatif analizinden önce numunenin içeriğinde bulunan maddelerin birbirinden ayrılması gerekir. Örneğin bir farmasötik preparatta bulunan yardımcı maddenin analitik sinyali etken maddenin sinyali ile karışıyorsa, yardımcı maddenin ortamdan uzaklaştırılması bu problemi ortadan kaldırabilir. Ya da A ve B olmak üzere iki etken madde içeren bir farmasötik preparatta A ve B etken maddeleri birbirlerinin analitik sinyallerini etkiliyor olabilir. Bu durumda A maddesi ile B maddesi birbirlerinden ayrılıp, saf halde iken analizleri gerçekleştirilebilir. Böylece herhangi bir girişim söz konusu olmaz. Başka bir örnek ise katyon analizlerinden verilebilir. Alev deneyi yapılan numunede baryum ve kalsiyum katyonları varsa, baryumun aleve verdiği yeşil renk nedeniyle kalsiyumun aleve verdiği kiremit kırmızısı renk seçilemeyebilir. Bu yüzden sistematik analiz basamakları uygulanarak, ortama asetik asit ve potasyum kromat eklenerek baryum kromatın çökmesi, kalsiyum katyonunun ise çözeltide kalması sağlanır. Santrifüj işleminden sonra elde edilen supernatant (süzüntü) baryum içermeyecektir ve alevde sadece kiremit kırmızısı görülecektir. Çökelek ise kalsiyum içermeyeceğinden asitte çözülerek alev deneyi yapıldığında sadece yeşil alev görülecektir. Böylece bu katyonların analizi numunede bulunan diğer katyonun sinyalinden (alev renginden) etkilenmeden gerçekleştirilmiş olur. Karışım halinde bulunan numunelerin analizleri için sıklıkla ayırma tekniklerinden yararlanılır. Çöktürme, süzme, kristalizasyon, ekstraksiyon, distilasyon, kromatografi en çok kullanılan ayırma tekniklerindendir. Kromatografi Karışımlardaki çeşitli maddeleri birbirinden ayırmaya ve böylece kalitatif ve kantitatif analize olanak veren ayırma tekniklerinden biri de kromatografidir. Tüm kromatografik uygulamalarda "sabit faz" ve "hareketli faz" adı verilen ve birbiriyle karışmayan iki ayrı faz (ortam) bulunur. Sabit faz, düzenekte sabit olarak durur, hareketli faz (mobil faz) ise sabit faz üzerinde hareket halindedir. Ayrım, karışım içindeki maddelerin sabit 20

23 faz ve hareketli faz ile etkileşimi doğrultusunda gerçekleşir. Sabit fazın amacı maddeleri üzerinde tutarak alıkoymak, hareketli fazın amacı ise maddeleri kendi ile birlikte sürükleyerek hareket ettirmektir. Yani kromatografide birbirinin tersi amaçlarla çalışan iki bileşen mevcuttur. Hareketli faz maddeleri sürüklerken, sabit faz ise maddeleri kendi üzerinde tutmaya çalışır. Karışımdaki maddelerin her biri sabit faz ve hareketli fazla farklı oranlarda etkileşime girerler ve bu nedenle farklı hızlarla sürüklenirler. Sabit faza ilgisi en çok olan madde en yavaş ilerleyecek ve en fazla alıkonulan madde olacaktır. Hareketli faza ilgisi en yüksek olan madde ise en hızlı sürüklenen, dolayısıyla en az alıkonulan madde olacaktır. Maddelerin göç etme hızlarının farklı olması, her bir maddenin moleküllerinin sabit faz üzerinde gruplaşarak ilerlemesine neden olur. Böylece karışım içindeki maddeler birbirinden ayrılırlar. Kromatografi ilk kez 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail Tswett tarafından kullanılmıştır. Tswett, cam bir boruyu (kolon) kalsiyum karbonatla doldurmuş ve dikey olarak yerleştirmiştir. Bu düzenekte, cam kolonun içinden petrol eteri içinde hazırladığı yaprak ektresini dökmüş, daha sonra sadece petrol eteri dökmeye devam ederek ekstrenin kolon içinde aşağı doğru ilerlemesini sağlamıştır. Ekstre en başta sadece tek bir yeşil tonuna sahip olduğu halde, kolonda ilerledikçe birbirinden farklı tonlarda yeşil ve sarı renklere ayrılmaya başlamıştır. Bunun nedeni, yaprak ekstresinin bileşiminde bulunan ve birbirlerinden farklı renklere sahip α-ksantofil, β-ksantofil, α-klorofil ve β-klorofil gibi moleküllerin kendi içlerinde renkli gruplar oluşturarak kolon içinde farklı hızlarda ilerlemeleridir. Tswett, bu yönteme renkli (chroma) yazmak (graphein) anlamına gelen kromatografi (chroma-tography) adını vermiştir. Kolondan çıkan her farklı renkli bileşik ayrı bir beherde toplanarak kalitatif ve kantitatif tayin yapmak mümkün olmuştur. Tswett in kuruduğu düzeneği oluşturan bileşenler aşağıdaki gibidir. Sabit faz : kalsiyum karbonat Hareketli faz : petrol eteri (aynı zamanda numune çözücüsü) Numune : yaprak pigmentlerini içeren ekstre Analitler : α-ksantofil, β-ksantofil, α-klorofil ve β-klorofil 21

24 Kromatografide ayrım mekanizmaları Kromatografi yöntemleri, gerçekleştirilen ayrımın kimyasal mekanizmasına göre adsorbsiyon, partisyon, iyon değişim, moleküler eleme veya afinite kromatografisi olarak gruplandırılabilir. Bu ayrım mekanizmalarından en önemlileri adsorpsiyon ve partisyondur. Adsorbsiyon, maddelerin katı yüzeylere tutunma olayıdır. Sabit fazın bir katı olduğu kromatografik sistemlerde ayrılma prensibi adsorbsiyondur. Bu sistemlerde, sabit faz bir adsorban görevi görür. Hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçen maddeler farklı güçlerle sabit faz üzerine adsorbe olurlar. Güçlü adsorbe olan maddeler yavaş sürüklenirlerken, daha zayıf adsorbe olan maddeler hareketli fazın etkisi ile daha hızlı sürüklenirler. Böylece adsorbana ilgileri (adsorpsiyon güçleri) farklı olan maddeler birbirlerinden ayrılmış olurlar. Partisyon, çözünmüş bir maddenin birbiriyle karışmayan iki akışkan arasında dağılma olayıdır. Partisyon, denge halinde bulunan ve birbiriyle karışmayan iki sıvıda çözünmüş halde bulunan bir maddenin bu fazlardaki derişimleri/miktarları hakkında bilgi verir. Örneğin 100 birim A maddesi, oktanol ve su karışımında çözüldükten sonra sistemin dengeye gelmesi beklendiğinde, 80 birim A maddesi oktanolde, 20 birim A maddesi suda bulunuyorsa, bu A maddesinin % 80 inin oktanolde dağılmış olduğu anlamına gelir. Her maddenin partisyon oranı her sıvı çifti için farklıdır. Bu oran, söz konusu maddenin hangi sıvı fazına ilgisinin yüksek olduğu hakkında da bilgi verir. Bu örnekte A maddesinin oktanole olan ilgisi daha fazladır. Partisyon mekanizmasına dayanan kromatografi sistemlerinde sabit faz sıvı, hareketli faz ise sıvı veya gazdır. Bu sistemlerde sabit faz olarak çoğunlukla katı bir yüzeye film şeklinde kaplanmış sıvı tabakası kullanılır. Numunede bulunan maddeler her iki fazda da çözünürler, fakat dağılma oranları birbirinden farklı olduğu için sabit faz üzerinde farklı hızlarla ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar. Örneğin hareketli fazdaki partisyonu yüksek olan bir madde hareketli fazla birlikte daha hızlı ilerleyecek, sabit fazdaki partisyonu yüksek olan madde ise daha uzun süre alıkonulacaktır. Kromatografik yöntemlerin sınıflandırılması Ayrım mekanizmasına göre (Sabit faz tipine göre) 1. Adsorbsiyon kromatografisi (Sabit faz:katı) 22

25 a) Sıvı-katı kromatografisi (hareketli faz:sıvı) b) Gaz-katı kromatografisi (hareketli faz:gaz) 2. Partisyon (dağılma) kromatografisi (Sabit faz:sıvı) a) Sıvı-sıvı kromatografisi (hareketli faz:sıvı) b) Gaz-sıvı kromatografisi (hareketli faz:gaz) 3. İyon değişim kromatografisi 4. Moleküler eleme kromatografisi 5. Afinite kromatografisi Uygulama biçimine göre 1. Düzlemsel a) Kağıt kromatografisi b) İnce tabaka kromatografisi 2. Kolon a) Kolon kromatografisi b) Gaz kromatografisi c) Yüksek performanslı sıvı kromatografisi 23

26 KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ En basit ve en eski kromatografi yöntemlerinden biri kağıt kromatografisidir. Kromatografi kağıdı, bir tür süzgeç kağıdı olup sabit faz olarak görev yapar. Hareketli faz olarak ise farklı çözücüler ve bunların karışımı kullanılabilir. İnce tabaka kromatografisinin (İTK) kağıt kromatografisinden tek farkı sabit faz olarak düzgün bir yüzeye ince bir tabaka halinde kaplanmış silika, alumina gibi bir adsorbanın kullanılmasıdır. Bu sabit faz düzeneği İTK plakası olarak adlandırılır. İTK için farklı boyut ve kalınlıklarda, gerçekleştirilecek analize uygun olarak istenen polaritede farklı maddelerle kaplama yapılmış ticari plakalar bulunmaktadır. Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde numuneler kağıdın/plakanın üzerine, bir ucuna yakın olacak biçimde küçük hacimlerde tatbik edilir ve numune çözücülerinin kuruması beklenir. Sonrasında kağıt/plaka, örneklerin tatbik edildiği seviyeden daha düşük bir seviyeye kadar hareketli fazın içine daldırılır. Hareketli fazdaki sıvı molekülleri adhezyon kuvveti (kapiller etki) ile yukarı doğru, yani kağıdın/plakanın üst ucuna doğru hareket etmeye başlarlar. Hareketli faz molekülleri, numunelerin tatbik edildikleri noktalara ulaştıklarında numune moleküllerini çözüp kendileri ile sürüklerler. Numunelerdeki farklı maddelerin sabit ve hareketli fazlara ilgisi farklı olacağı için farklı hızlarda sürüklenerek birbirlerinden ayrılırlar. Hareketli faza ilgisi yüksek olan maddeler daha hızlı ilerleyerek üst kısımlara ulaşırlar. Sabit faza ilgisi yüksek olan maddeler ise daha yavaş ilerler ve kağıdın/plakanın daha alt kısımlarında bulunurlar. Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde yürütme tankı olarak adlandırılan kapalı cam malzemeye yaklaşık 0.5 cm yüksekliğe kadar hareketli faz konulduktan sonra kapağı kapatılarak tankın içindeki tüm hacmin hareketli fazla dengeye gelmesi sağlanır. Kağıdın/plakanın alt ucundan 1.5 cm üstüne bir çizgi çizilerek bu çizgi üzerinde standartların ve numunelerin tatbik edileceği yer işaretlenir. Numuneler ve referans maddeler bu çizgi üzerine tatbik edilir ve kodları işaretlenir. Kromatografik kağıda ve plakaya hiç bir zaman tükenmez kalemle bir işaretleme yapılmaz, kurşun kalem kullanılır. Daha sonra kağıt/plaka tankın içine yerleştirilir ve tankın kapağı kapatılır. Hareketli faz kağıt/plaka üzerinde belli bir yüksekliğe geldiğinde, tanktan çıkarılarak hareketli fazın ulaştığı çizgi seviyesi de işaretlenir. Analiz edilen numunede bulunan maddelerin bıraktıkları lekelerin dış sınırları da kurşun kalemle işaretlenir. Eğer analiz edilen maddeler renkli ise ulaştıkları nokta rahatça 24

27 görülecektir. Renksiz maddelerin ne kadar ilerlediklerini tespit etmek için kağıda/plakaya bir reaktif püskürtülmesi, ya da UV ışığın altında bakılması gerekebilir. Bu işlemler sonucunda elde edilen kağıt/plaka artık bir kromatogramdır. Bu kromatograma bakılarak hangi maddelerin hangi faza ilgisinin daha yüksek olduğu, bir numunenin saf olup olmadığı (saf numuneler tek bir leke verirken karışım halindeki numuneler birden fazla leke oluşturacaktır), iki farklı numunenin aynı kaynaktan gelip gelmediği (benzer numunelerin verdikleri kromatogram desenleri benzer olacaktır), tespit edilebilir. Aynı zamanda numunenin verdiği lekeler standartların lekeleri ile karşılaştırılarak bir numunenin hangi maddeleri içerdiği tespit edilebilir. Bu gibi analizler için en objektif yaklaşım alıkonma faktörlerinin karşılaştırılmasıdır. Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde bir maddenin alıkonma faktörü (Rf), maddenin katettiği mesafenin hareketli fazın başlangıç çizgisinden itibaren katettiği mesafeye oranıdır. A maddesinin alıkonma faktörü şöyle hesaplanır: R fa = R A (cm) M (cm) Örneğin yandaki şekilde ideal bir kromatogram verilmiştir. (Gerçekte lekeler daha asimetrik ya da kuyruklu olabilirler.) Bu örnekteki maddelerin sabit faza ilgileri küçükten büyüğe doğru A, B ve C şeklindedir. Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde maddelerin alıkonma faktörleri karşılaştırılarak bu maddelerin aynı maddeler olup olmadıkları tespit edilebilir. Örneğin yukarıdaki kromatogramda D numunesinin verdiği iki leke vardır. Bu lekelerin alıkonma faktörleri A ve 25

28 C maddelerinin alıkonma faktörleri ile aynı veya çok yakın olduğuna göre, D numunesinin A ve C maddelerini içerdiğini söyleyebiliriz. Bir maddenin alıkonma faktörü maddenin fizikokimyasal özelliklerine, kullanılan sabit faza, sabit fazın kalınlığına, kullanılan hareketli faza, ortam sıcaklığına, tankın doygun olup olmamasına bağlıdır. Maddenin kağıt/plakada katettiği mesafe ise hareketli fazın tanktaki seviyesine, kağıdın/plakanın tankta geçirdiği zamana ve dolayısıyla hareketli fazın katettiği mesafeye bağlıdır. Bu yüzden kağıt ve ince tabaka kromatografisinde bilinmeyen numuneler ve referanslar karşılaştırılacaksa aynı anda, aynı düzenekte deney yapılması tercih edilir. Kağıt ve İnce Tabaka Kromatografisi Uygulaması : Olay Yeri İnceleme Using Paper Chromatography, Oregon State University, Environmental Health Sciences Center (blogs.oregonstate.edu/hydroville/files/2014/06/paper_chrom1.doc) ve Drug Analysis Using Thin-Layer Chromatography, Annina Carter, ( tan uyarlanmıştır. Senaryo : Bir intihar vakasında maktulün başucunda bir mektup ve yastığında tablet parçaları bulunmuştur. Polis olayın intihar değil cinayet olduğundan şüphelenmektedir. Polis, size incelemeniz için bu tablet parçalarını, mektuptaki mürekkep lekesini ve üç şüphelinin üzerinde bulunan siyah mürekkepli kalemleri göndermiştir. Savcılığa vermeniz gereken raporda mektuptaki mürekkebin hangi şüphelinin üzerinde bulunan kaleme ait olduğunu, parçalanmış olarak bulunan tablet parçalarında hangi etken maddelerin bulunduğunu ve bu karara nasıl vardığınızı açıklamanız gerekmektedir. 26

29 Üçer kişilik gruplar halinde çalışılacaktır. Öğrenciler laboratuvara kişisel korunma malzemeleri (önlük, gözlük, eldiven) ile geleceklerdir. İzlenecek Adımlar: Biri İTK biri kağıt kromatografisi için çözücü tankı olarak kullanacağınız iki behere sıvı seviyesi 0.5 cm olacak kadar etanol koyduktan sonra üzerini bir saat camıyla kapatınız. Mürekkep analizi : Kağıt kromatografisi Kromatografi kağıdı olarak başlangıç çizgisi ve olay yerinde bulunan mürekkep lekesi (X) bulunan bir süzgeç kağıdı teslim alacaksınız. Bu kağıdı kenarlarından tutup olabildiğince yüzeyine değmemeye çalışınız. Başlangıç çizgisinde A, B ve C olarak işaretli olan kısımlara, A, B ve C kodlu şüphelilerden alınan kalemlerle mürekkep lekesini oluşturunuz. Oluşturacağınız lekelerin, X kodlu leke ile aynı şekil, kalınlık ve uzunlukta olmasına dikkat ediniz. Kağıdı yavaşça çözücü tankına (behere) yerleştiriniz. Beherdeki etanol çalkalanır haldeyken yerleştirirseniz hareketli fazınız plakada aynı seviyede ilerlemeyecektir. (DİKKAT! Tanktaki etanol seviyesi kağıdın alt ucunu ıslatacak kadar yüksek, oluşturduğunuz lekelere değmeyecek kadar alçak olmalıdır. Bu yüzden 0.5 cm yükseklikte olduğunu kontrol ediniz.) Beherin ağzını saat camıyla kapatınız. Hareketli fazın kağıdın yaklaşık 4/5 ine kadar çıkmasını bekleyiniz. Kağıdı beherden çıkarıp hareketli fazın ulaştığı seviyeyi (bitiş çizgisi) kurşun kalemle işaretleyiniz. Kağıdın kurumasını bekleyiniz. Kromatografi kağıdınızı rapor sayfanızda belirtilen yere bantlayınız. (Gruptaki diğer öğrenciler kromatografi kağıdını ve oluşan lekeleri rapor sayfasına temsili olarak çizeceklerdir.) Rapor sayfasındaki soruları yanıtlayınız. 27

30 İlaç analizi : İnce Tabaka Kromatografisi Size verilen İTK plakasına alt kenarın 1.5 cm üzerinde olacak biçimde bir başlangıç çizgisi çiziniz. (Kurşun kalem ile!) Standart madde olarak plakaya uygulayacağınız üç etken madde bir bilinmeyen numune olacaktır. Bu yüzden başlangıç çizgisine kenarlardan ve birbirinden eşit uzaklıkta 4 küçük işaretleme yaparak altlarına örneklerin kodlarını yazınız. (Plakaları kenarlarından tutup olabildiğince yüzeyine değmemeye çalışınız.) Standart madde ve numune çözeltilerini plaka üzerinde belirlediğiniz noktalara uygulamak için cam kılcal borular (kapiler) kullanacaksınız. Her biri için aynı hacimde çözelti almaya dikkat ediniz, bunun için kapileri çözeltiye daldırdığınızda çözeltinin kapilerde nereye kadar çıktığına, ve plakaya uygularken nereye kadar indiğine dikkat etmeniz gerekir. Lekelerin kurumasını yani numunelerin çözücülerinin buharlaşmasını bekleyiniz. Plakayı yavaşça çözücü tankına (behere) yerleştiriniz. Beherdeki etanol çalkalanır haldeyken yerleştirirseniz hareketli fazınız plakada aynı seviyede ilerlemeyecektir. (DİKKAT! Tanktaki etanol seviyesi plakanın alt ucunu ıslatacak kadar yüksek, oluşturduğunuz lekelere değmeyecek kadar alçak olmalıdır.) Beherin ağzını saat camıyla kapatarak hareketli fazın plakanın yaklaşık 4/5 ine kadar çıkmasını bekleyiniz. Plakayı beherden çıkarıp hareketli fazın ulaştığı seviyeyi (bitiş çizgisi) kurşun kalemle işaretleyiniz. Plakanın kurumasını bekleyiniz. Kuruyan plakayı UV lambası altına yerleştirip oluşan lekelerin sınırlarını kurşun kalemle çiziniz. Plakanızı rapor sayfanızda belirtilen yere bantlayınız. (Gruptaki diğer öğrenciler İTK plakasını ve oluşan lekeleri rapor sayfasına temsili olarak çizeceklerdir.) Rapor sayfasındaki soruları yanıtlayınız. 28

31 Kağıt Kromatografisi Deney Raporu Ad, Soyad: Öğrenci No: Grup adı: Grup üyelerinin numaraları: 1. Olay yerinde bulunan mektup hangi kalemle yazılmış olabilir? Veya hangi kalemle yazılmış olamaz? 2. Savcılığa vereceğiniz raporda yukarıdaki cevabınıza nasıl karar verdiğinizi belirtmeniz gerekmektedir. Kromatografinin mantığından da bahsederek kararınızı savcılığa açıklayınız. 3. X kodlu numunedeki mürekkebi oluşturan renkleri hareketli faza ilgilerine göre büyükten küçüğe sıralayınız. 29

32 İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) Deney Raporu Ad, Soyad: Öğrenci No: Grup adı: Grup üyelerinin numaraları: 1. Her bir leke, yani her bir etken madde için Rf değerlerini hesaplayınız. 2. Olay yerinde bulunan tablet parçalarında hangi etken madde/maddeler vardır? 3. Bu sonuca nasıl karar verdiniz? Kromatografinin mantığından ve bulduğunuz Rf değerlerinin ne anlama geldiğinden bahsederek açıklayınız. 4. Etken maddeleri sabit faza ilgilerine göre büyükten küçüğe sıralayınız. 5. Etken maddeleri hareketli faza ilgilerine göre büyükten küçüğe sıralayınız. 6. Etken maddeleri alıkonma faktörlerine göre büyükten küçüğe sıralayınız. 7. Alıkonma faktörü ile fazlara ilgi arasında bir ilişki var mıdır? Açıklayınız. 30

33 YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK veya HPLC), karışım halindeki maddeleri birbirinden ayırmak, teşhis etmek ve miktar tayinini yapmak için kullanılan modern bir cihaz ve bu cihazın kullanıldığı yönteme verilen addır. YPSK, kolon kromatografisinin otomatik bir cihazda gerçekleştirilmesini ve analitik olarak ölçümü sağlar. Farmasötik preparatlardaki ilaç etken maddeleri, farmasötik preparatlardaki bozunma ürünleri ve safsızlıklar, kandaki ilaç molekülleri ve bu moleküllerin metabolitleri, drogların içerdikleri etkili bileşikler, gıdaların kimyasal bileşimi, organizmadaki enzimler, aminoasitler, proteinler, polisakkaritler, vb. pek çok analitin miktar tayini için sıklıkla kullanılır. YPSK, pek çok endüstri için kalite kontrol laboratuvarlarındaki en önemli cihazdır. Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, paslanmaz çelikten bir kolon, yüzeyi sıvı bir tabaka ile kaplanmış çok küçük partiküllerle doldurulmuştur. Bu yüzden YPSK partisyon prensibine göre çalışan bir sıvı-sıvı kromatografi sistemidir. Sabit fazın kolonda ilerlemesi bir pompa sistemiyle sağlanır. Numune içindeki bileşenler hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçerken sabit fazda ve hareketli fazda farklı oranlarla dağılırlar. Sabit fazda dağılma oranı düşük (sabit faza ilgisi düşük) olan maddeler kolonu çabuk terk ederken, sabit fazda yüksek oranda dağılan maddeler kolonu daha geç terk ederler. Analitik YPSK cihazlarında kolondan çıkan maddeler uygun bir dedektörle izlenerek kolondan çıkış zamanları ve miktarları tespit edilir. Preparatif YPSK adı verilen cihazlarda ise maddeler dedektörden çıktıktan sonra farklı kaplarda biriktirilerek fiziksel ayrım sağlanmış olur. 31

34 Şekil 7. Numunelerin kolon içerisinde ayırımı Örneğin yukarıdaki şekilde A ve B maddelerini içeren ve M ortamında çözünmüş bir numune YPSK sistemine t0 anında enjekte edilmiştir. t1 anında sabit fazda hiç tutunmayan M çözücüsünün hareketli faz ile aynı hızda ilerlediği görülmektedir. B maddesi kolonda daha hızlı, A maddesi ise daha yavaş hareket ettiği için t2 anında görüldüğü gibi A ve B maddeleri birbirlerinden ayrılmıştır. Maddelerin göç hızlarının farklı olması, her bir maddenin sabit faz üzerinde gruplaşarak ilerlemesine neden olur. Maddenin oluşturduğu bu gruplar bant olarak adlandırılır. Maddelerin sabit faz üzerinde geçirdikleri zaman aralığı yani enjeksiyon anından kolonu terk ettiği ana kadar geçen süre alıkonma zamanı olarak adlandırılır ve tr olarak kısaltılır. Bu örnekte kolondan çıkıp dedektöre ulaşan ilk madde B maddesidir, yani sürüklenme hızı yüksek, alıkonma zamanı kısadır. A maddesinin ise sürüklenme hızı yavaş, alıkonma zamanı ise daha uzundur. 32

35 Şekil 8. YPSK cihazının şematik gösterimi YPSK genel olarak 5 kısımdan oluşur: Pompa : Hareketli fazın bulunduğu kaptan alınarak sisteme verilmesini, kolon boyunca yüksek basınçla ilerlemesini, dedektöre ve son olarak atık tankına ulaşmasını sağlayan hareketi sağlar. İkili veya dörtlü pompa sistemleri kullanılarak farklı kaplarda bulunan hareketli faz bileşenleri (su, tampon, metanol gibi) istenen oranlarda karıştırılarak kullanılabilir. Enjektör : Numunenin hareketli fazla karıştırılarak kolona verilmesini sağlar. Otomatik enjektörler kullanıldığında pek çok numunenin enjeksiyonu bilgisayar kontrollü olarak istenen zamanda ve istenen şartlarda gerçekleştirilir. YPSK da çoğunlukla 1-10 µl kadar numune hacmi analiz için yeterlidir. Kolon : Ayrımın gerçekleştiği kısımdır. Genelde cm boyuna ve 4-10 mm çapına sahip paslanmaz çelikten bir kolonun küçük partiküllerle doldurulması ile üretilir. Bu partiküllerin dışı sıvı bir film ile kaplıdır. Kolonun bulunduğu bölme genellikle sıcaklık kontrollüdür. Dedektör : Kolondan çıkan maddelerin sinyallerini algılayan kısımdır. Kaydedici : Dedektörün ölçtüğü analitik sinyali sayısal verilere çevirir ve zamana karşı grafiğe geçirerek kromatogram olarak kaydeder. YPSK da en sık kullanılan dedektörlerden biri ultraviyole / görünür bölge (UV/GB) dedektörüdür. Bunun dışında floresans, kızılötesi, kırılma indisi, elektrokimyasal ve kütle spektroskopi dedektörleri de kullanılmaktadır. Örneğin UV/GB dedektörü kullanılan bir YPSK da, kolonu terk eden tüm sıvı analiz boyunca bir ışık kaynağının önünden geçer. Işık kaynağının karşısında bulunan dedektör ise ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir. Işık geçişindeki azalma, kolondan çıkan sıvıda bu ışığı 33

36 absorblayan moleküllerin olduğu anlamına gelir. Dedektöre ulaşan ışık şiddetindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve pik olarak kaydedilir. Örneğin kolondan sadece hareketli faz çıkıyorsa tüm ışık dedektöre ulaşır ve sinyal sıfır olarak kaydedilir. Ama analiz edilen maddelerden biri kolondan çıkarken, bu madde ışığı absorblayacağı için dedektöre ulaşan ışın yoğunluğu azalır ve sinyal artar. Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır. Örneğin madde miktarını iki katına çıkarırsak, madde iki kat daha fazla ışığı absorblayacak ve ölçülen sinyal iki katına çıkacak demektir. Kolondan çıkan her maddenin derişim profili, pik olarak adlandırılır. Piklerin oluşturduğu grafiğe kromatogram adı verilir. Kromatogram dedektör cevabının zamana karşı grafiğe geçirilmesi ile elde edilir. Bir maddenin derişiminin artması, bu maddenin pik yüksekliğinin ve pik alanının artmasına neden olur. YPSK yönteminde miktar tayini yapılırken çoğunlukla pik alanları ile bilinen derişimler arasında bir ilişki kurulur. Bu ilişkiden yararlanarak ve bilinmeyen derişimdeki maddenin pik alanı tespit edilerek bilinmeyen derişim hesaplanır. Maddelerin kolondan çıkış zamanları alıkonma zamanı olarak adlandırılır ve maddeler hakkında kalitatif bilgi verir. Bir maddenin alıkonma zamanı kromatogramda o maddenin pikinin en yüksek noktasına karşılık gelen zamandır. Bir madde aynı hareketli ve sabit fazlar kullanıldığında aynı alıkonma zamanına sahip olur. Farklı maddelerin alıkonma zamanları karşılaştırılarak polarlıkları ya da apolarlıkları hakkında bilgi sahibi olunabilir. Önceki şekilde kolonda ilerleyişleri gösterilen A ve B maddelerinin kromatogramı aşağıda verilmiştir. Kromatogramlarda X ekseni zamanı, Y ekseni ise dedektörden alınan sinyali gösterir. X ekseninde zamanın 0 olduğu nokta enjeksiyonun yapıldığı andır. 34

37 Şekil 9. Örnek kromatogram tr1 : İlk maddenin (B) alıkonma zamanı tr2 : İkinci maddenin (A) alıkonma zamanı t0 : Ölü zaman (Numune çözücüsünün kolondan çıkma zamanı) w1, w2 : Madde piklerinin taban genişliği Pik yüksekliği : Pikin tepe noktası ile taban çizgisi arasındaki mesafedir. Maddenin derişimi arttıkça, pik yüksekliği de artar. Pik alanı : Piki oluşturan eğri ile taban çizgisi arasında kalan alandır. Maddenin derişimi ile doğru orantılıdır. YPSK uygulamalarında sabit ve hareketli fazın polarlıklarına göre iki farklı teknikten söz edilebilir. Normal faz Sabit faz : Polar Hareketli faz : Apolar (hekzan, oktanol vb) Ters faz Sabit faz : Apolar (alkil zincirleri bağlı partiküller) Hareketli faz : Polar (su, tampon, metanol, asetonitril vb) Normal faz tekniğinde sabit faz polar, hareketli faz ise apolardır. Kromatografinin ilk uygulamaları da normal faz kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Tswett). Normal faz YPSK tekniğinde en polar olan analit, kendisi gibi polar olan sabit fazla daha çok etkileşeceği için daha çok alıkonulur ve kolondan en son çıkar. Daha az polar (apolara daha yakın) olan 35

38 analitler, sabit fazda daha az dağılacakları için hareketli fazla birlikte daha hızlı sürüklenirler, alıkonma zamanları kısadır ve kolonu daha erken terk ederler. En apolar analit ise alıkonma zamanı en kısa olan, dolayısı ile kolonu ilk terk eden olacaktır. Ters faz tekniği ise, normal faza bir alternatif olarak sonradan geliştirilmiştir. Apolar bir sabit faz ve polar bir hareketli faz kullanılır. Ters faz tekniğinde en polar analit, sabit faz ile en az etkileşime giren molekül olacağı için hızlı biçimde sürüklenerek kısa sürede kolondan çıkar ve alıkonma zamanı düşüktür. En apolar analit ise sabit fazla güçlü bir etkileşime gireceği için daha yavaş sürüklenir, kolondan en son çıkar ve alıkonma zamanı yüksektir. YPSK uygulamalarının büyük bir kısmında ters faz tekniği kullanılmaktadır. Bunun nedeni hareketli faz olarak seçilen su, metanol, asetonitril gibi polar çözücülerin daha çok çeşitli olması, pek çok farklı karışım yapılarak geniş bir polarite skalasına ulaşılabilmesi, tamponlar kullanılarak istenen ph ın sağlanabilmesi ve daha ucuz olmalarıdır. 36

39 VOLTAMETRİ VE POLAROGRAFİ Akımın, elektroda uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak ölçülmesine dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri denir. Voltametrik deneyler bir elektrokimyasal hücrede gerçekleştirilir ve genellikle üç elektrotlu bir sistemler kullanılır. Bu elektrotlar, çalışma elektrodu, referans elektrot ve yardımcı (karşıt) elektrottur. Voltametri yönteminde çalışma elektrodu ile referans elektrot arasına değeri zamanla değişen bir potansiyel uygulanır ve çalışma elektrodu ile karşıt elektrot arasındaki akım ölçülür. Uygulanan potansiyelin ölçülen akım değerine karşı grafiğine voltamogram denir. Voltametride herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranışını incelemek üzere uygulanabilecek potansiyel aralığı, çalışma elektrodu, çözücü ve elektrolit türüne bağlıdır. Voltametrik yöntemlerin ilki olan polarografi, 1922 yılında Çek kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından bulunmuştur ve bu buluşundan ötürü 1959 yılında Nobel Kimya Ödülü nü kazanmıştır. Elektrokimyanın önemli bir dalı olan polarografide, voltametriden farklı şekilde, çalışma elektrodu olarak damlayan civa elektrot kullanılmaktadır. Bu yöntemde uygulanan potansiyelin ölçülen akım değerine karşı grafiğine polarogram denir. Şekil 9. Polarogram ve voltamogram Analizi yapılacak maddenin elektrotla reaksiyona girmeye başlamasından sonra, potansiyelde oluşabilecek en küçük değişikliğe karşı akımdaki artış hızlı olacaktır. Akımın büyüklüğü elektroaktif maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızı ile sınırlanır ve bu sebepten dolayı belli potansiyel değerinden sonra artış görülmez. Artışın görülmediği bu bölgedeki akım büyüklüğüne sınır akımı (C-D) denir. 37

40 Elektroaktif maddenin elektrot ile reaksiyona girmesinden önce küçük bir akım gözlenmektedir. Elektriksel çift tabakanın yüklenmesi ve çözeltideki safsızlıklar gibi nedenler dolayısıyla oluşan bu akım büyüklüğüne artık akım (A-B) denir. Şekildeki B-C bölgesinde potansiyeldeki küçük bir artışla akım büyük oranda artış göstermektedir. Bu bölgedeki akımın büyüklüğüne difüzyon akım (id) denir. Difüzyon akımının yarısına karşılık gelen potansiyele yarı dalga potansiyeli (E1/2) denir. Voltamogram ve polarogramlar maddenin hem kalitatif (nitel) hem de kantitatif (nicel) analizini yapmamıza imkan verir: 1) Her madde için belirli koşullar altında belirli bir yarı dalga potansiyeli vardır. Yarı dalga potansiyelleri, elektroaktif maddeler için karakteristik olduklarından kalitatif analizde kullanılırlar. 2) Difüzyon akımının derişimle orantılı olması özelliğinden yararlanılarak kantitatif analizde kullanılırlar. Bu ilişki İlkoviç denklemi ile verilir: id = 605 n D 1/2 C m 2/3 t 1/6 id: difüzyon akımı n: elektrot reaksiyonunda yer alan elektron sayısı D: çözünen maddenin difüzyon katsayısı C: çözünen maddenin derişimi m: civa kütlesi mg/s olarak t: s olarak damlama zamanı 605: damlanın geometrisi ve Faraday sabitini içeren bir sayı İlkoviç denkleminde kullanılan elektrot ve madde için diğer parametreler sabit iken id değeri ile C arasında doğrusal bir ilişki vardır (id = k C). Bundan yararlanılarak farklı derişimlerdeki standart maddelerin ölçülen akım değerleri ile elde edilen kalibrasyon denkleminden hareketle bilinmeyen numunedeki madde miktarı hesaplanabilir. Kantitatif analizde ayrıca bilinen ve bilinmeyen derişimdeki çözeltiler için okunan id değerleri oranlanarak da miktar tayinleri yapılabilir: 38

41 i dstandart i dnumune = C standart C numune Voltametrik Yöntemle İlaç Analizi Bu deneyde verilen ilaç çözeltisinin derişimi voltametrik yöntemle tayin edilecektir. Bunun için öncelikle ilaç etken maddesinin stok çözeltisinden hareketle beş farklı derişimde çözeltiler hazırlanarak akım değerleri ölçülecek ve derişime karşı akım doğrusu elde edilecektir. İlaç numunesinin içerdiği etken madde standardının stok çözeltisi hazırlanacaktır ( M). Bu stok çözeltiden hareketle M, M, M, M ve M derişiminde analiz çözeltileri H2SO4 destek elektroliti ortamında hazırlanacaktır. Her birinin ölçülen akım değeri derişim değerlerine karşı grafiğe geçirilerek doğru denklemi elde edilecektir. Verilen numunenin (derişimi bilinmeyen) ölçülen akım değeri bu doğru denkleminde yerine yazılarak numunenin derişimi hesaplanacaktır. 39

42 KONDÜKTOMETRİK TİTRASYON (İLETKENLİK TİTRASYONU) İletkenlik (C) maddenin elektrik akımını iletebilmesinin ölçüsüdür. C= 1/R dir. Yani direncin (R) tersidir. Birimi S.m -1 dir. (Siemens birimi Alman bilim insanı ve mucit Werner von Siemens e ithafen verilmiştir) Bilindiği gibi saf su elektrik akımını iletmez, teorik olarak iyon içermediği için iletkenliği yoktur denir. Ancak pratikte saf suda çok çok az da olsa iyon kalacağı içen mikrosiemens (µs) civarında bir iletkenlik okunur. Bir suyun saf olup olmadığı iletkenlik değerine bakılarak anlaşılır. Örneğin ultrasaf suyun iletkenliği 0,055 µs/cm, distile suyun iletkenliği 0,5 µs/cm civarındayken deniz suyunda bu değer µs/cm civarındadır. İyonların çözücüye kazandırdığı iletkenlik çözücünün viskozite gibi özelliklerine, çözünen iyonun sayısına, büyüklüğüne ve yüküne göre değişir. Çözeltideki iletkenlik değişimlerine dayanarak yapılan analiz yöntemine iletkenlik ölçme (kondüktometri) denir. İletkenlik ölçmede kullanılan araçlara kondüktometre denir. Kondüktometreler bir elektrik kaynağı, analiz çözeltisinin bulunduğu iletkenlik hücresi ve bir direnç ölçerden oluşur. Cihazın en duyarlı bölgesi olan iletkenlik hücresinde genellikle üzeri platin siyahı ile kaplanmış platin elektrotlar kullanılır. Derişimi bilinmeyen numunenin (analitin) derişimi bilinen titrant ile reaksiyonu sırasında iletkenlikteki değişimlerden yararlanılarak dönüm noktasının belirlendiği titrasyona kondüktometrik titrasyon denir. Kondüktometrik titrasyon yöntemi, koyu renkli veya berrak olmayan çözeltilerin analizinde ve çökelme tepkimelerinde çok kullanılan oldukça uygun yöntemlerden biridir. Kuvvetli Bir Asidin Kuvvetli Bir Bazla Titrasyonu Kuvvetli bir asidin kuvvetli bir bazla titrasyonunda HCl ve NaOH çözeltileri kullanılabilir. Hazırlanan analit (kuvvetli asit (HCl)) çözeltisinden 50 ml alınır ve kondüktometrenin iletkenlik hücresine konur. Başlangıçtaki iletkenlik ölçülür. Manyetik karıştırıcı çalıştırılır. Büretten akıtılan titrant (NaOH) çözeltisinden damlatılarak titrasyona başlanır. Her 0,1 0,2 ml titrant eklendikten sonra iletkenlik ölçülür. İletkenlik değerleri koordinat düzleminin Y eksenine ve ml olarak titrant hacimleri koordinat düzleminin X eksenine olacak şekilde grafiğe yazılır. 40

43 Kuvvetli bir asit ile kuvvetli bir bazın titrasyonunda NaOH eklendikçe hidrojen iyonu derişimi azalacağından eşdeğerlik noktasına kadar iletkenlik hızla azalır. Eşdeğerlik noktasından sonra ise ortamda fazla hidroksil iyonları bulunacağından iletkenlik tekrar hızla artar. Grafikten elde edilen eşdeğerlik noktasındaki NaOH miktarı kullanılarak analiz edilen asidin derişimi bulunur. Hesaplamalar Eşdeğerlik noktasının tayini için elde edilen bu değerler Microsoft Excel veya Open Office Calc gibi bir veri işleme programına yüklenir. Veriler iletkenliğin azaldığı ve arttığı parçalar olmak üzere iki parçaya ayrılır. Bu iki ayrı veri grubunun doğru denklemleri çıkarılır ve bu iki doğrunun kesim noktasını bulmak için denklemler birbirine eşitlenir. Bulunan x değeri eşdeğerlik noktasıdır. Örneğin; y =150x ve y = -150x şeklinde bulunan iki doğru denklemi birbirine eşitlendiğinde: 150x = -150x x = x =0.545 olarak bulunur. NOT: Bu işlemler bilimsel hesap makinelerinin lineer regresyon fonksiyonları kullanılarak da yapılabilir. 41

44 POTANSİYOMETRİ Bir karşılaştırma(referans) elektrodu ve uygun bir çalışma(indikatör) elektrot ile oluşturulan elektrokimyasal hücrede ölçülen gerilim değerleri kullanılarak hücrenin çözeltisindeki iyonların nicel analizine potansiyometri denir. Elektrokimyasal hücreler; redoks reaksiyonlarının oluştuğu hücrelerdir. Bu hücrelerde potansiyel oluşması için redoks reaksiyonlarına yani elektron aktarımına gereksinim vardır. Elektrot potansiyelleri mutlak olarak ölçülemez ancak referans elektrodun potansiyeli ile karşılaştırılarak aradaki potansiyel fark ölçülür. Potansiyometrik Yöntemin Üstünlükleri, Uygun bir renkli indikatörün mümkün olmadığı durumda, Koyu renkli veya çok seyreltik çözeltilerde İki veya daha fazla bileşenin analizinde kullanılabilir. Potansiyometride potansiyel ölçümleri esas olduğu için elektrotlar önemlidir. Bir potansiyel ölçümünde; referans elektrot, indikatör elektrot kullanılır. Referans Elektrotlar: Referans elektrodun potansiyeli sabit olup, uygulanan dış potansiyelden etkilenmez. İdeal bir referans elektrot; 1. Tersinir olmaslı ve Nerst eşitliğine uygun olmalı 2. Ufak bir akıma maruz kaldıktan sonra orjinal potansiyeline dönebilmeli 3. Sıcaklık değişiminden etkilenmemelidir. Kalomel ve Ag/AgCl elektrotlar en çok kullanılan referans elektrotlardır. Şekil 1. Kalomel elektrodun şeması Şekil 2. Ag/AgCl elektrodun şeması 42

45 İndikatör Elektrot (Çalışma Elektrodu): Potansiyeli çözelti bileşimine bağlı olarak değişen elektrotlardır ve referans elektrotla beraber kullanılır. Elektrodun potansiyeli, uygulanan dış potansiyelden etkilenir ve değişir. Membran elektrotlar (cam elektrot, iyon seçici elektrotlar v.b) ve metal elektrotlar bu sınıfa örnektir. Metal Elektrotlar: o I. Sınıf Elektrotlar: Çözeltide kendi iyonları ile dengede olan metal elektrotlardır. Zn 2+ iyonlarını içeren bir çözeltiye daldırılmış Zn metali Ag + iyonlarını içeren bir çözeltiye daldırılmış Ag metali Cu 2+ çözeltisine daldırılmış Cu metali o II. Sınıf Elektrotlar: Az çözünen bir tuzun doygun çözeltisi ile dengede olan metal elektrotlardır. AgCl ün doygun çözeltisi ile dengede bulunan Ag metali Hg 2Cl 2 ün doygun çözeltisi ile dengede bulunan Hg metali o III. Sınıf Elektrotlar: Aynı anyona sahip iki az çözünen tuzun doygun çözeltisi ile ya da aynı liganda sahip iki kompleks iyonu içeren çözelti ile dengede olan metaller Hg 2C 2O 4 tuzlarının doygun çözeltisi CaC 2O 4 tuzlarının doygun çözeltisi Hg metali Membran Elektrotlar: Belli iyonlara karşı duyarlı olan elektrotlardır. Bunlardan en önemlisi cam elektrottur. Cam elektrot; H + iyonlarına duyarlı elektrottur ve ph ölçümünde kullanılır. Günümüzde phmetrelerde cam elektrotlar kalomel elektrot ile kombine edilmiş olarak kullanılmaktadır. Özel bir camdan yapılmış baloncuğun içerisinde konsantrasyonu belli ve genellikle 0.1 M HCl çözeltisi bulunur ve buna Ag/AgCl elektrot daldırılmıştır. Bu elektrot çözeltiye daldırılır. Bu anda iki çözelti arasındaki konsantrasyon farkından dolayı bir potansiyel doğar. Bu potansiyel referans elektroda karşı okunur. Oluşan potansiyel farkı çözeltinin ph sına bağlıdır. 43

46 Şekil 3. Cam elektrot şeması Bu elektrotta oluşan emk kuvveti: E=e Ag, +e cam + e kalomel Bu eşitlikte e Ag, e cam sabit olduğu için potansiyel doğrudan e cam hesaplayarak ph tayini yapmak mümkündür. a bağlıdır. e cam değerini Bu ilişki, 0 0 e cam = e cam log a H + = e cam pH(25 C) Cam elektrot en iyi ph 0-10 arasında çalışır. Cam elektrotta: ph<1 => ASİT HATASI (Cam elektrodun cam yüzeyindeki merkezlerin doldurulması ve artık H + değişikliğine cevap vermemesi olduğu düşünülmektedir) ph>1 => ALKALİ HATASI (Alkali ortamlarda elektrot H + yanında camın yapısında bulunan alkali metal iyonlarının değişimini de cevap vermeye başlar) Potansiyometrik Titrasyon: Potansiyometri aynı zamanda titrasyon işlemlerinde de kullanılan elektroanalitik bir yöntemdir. Bu yöntemde indikatör kullanmadan titrasyon işlemi yapılmaktadır. Çünkü bazı maddelerin titrasyonu için uygun indikatör bulunmamakta yada indikatör bulunduğu ortamda bozunabilmektedir. Asit baz tepkimelerinde kullanılan iyon seçici elektrot, cam elektrottur. 44

47 Bu nicel analiz yönteminde her titrant eklenmesinden sonra ölçülen ph ya da gerilim değeri eklenen titrant hacmine karşılık grafiğe geçirilerek Potansiyometrik titrasyon eğrisi oluşturulur. Şekil 4. Potansiyometrik Titrasyon Şeması Eşdeğerlik noktasının daha net belirlenebilmesi için titrasyon eğrisinin birinci ve ikinci türevleri hesaplanır. 1.türev eğrisinde meydana gelen pikin maksimumu, 2. türev eğrisinde ise meydana gelen eğrinin x eksenini kestiği nokta eşdeğerlik noktasına kadar harcanan titre edici hacmini göstermektedir. Şekil 5. Potansiyometrik titrasyon eğrisi Yapılan deneyin sonucunda öncellikle titre edilen her ml NaOH hacmine karşılık okunan ph değeri grafiğe geçirilir. Ama bu grafikten dönüm noktası hassas olarak okunamaz. Bu nedenle grafik yöntemle türevi alınır. ph = ph2 ph1 v V2 V1 e karşı kullanılan NaOH hacim(v) grafiğidir. 45