Mersin Bölgesi nde Bulunan Rana ridibunda Üzerine Sitogenetik Bir İnceleme

Transkript

1 Araştırma Makalesi Mersin Bölgesi nde Bulunan Rana ridibunda Üzerine Sitogenetik Bir İnceleme Serap Ergene 1*, Aşkın Hasan Uçar 2, Filiz Kaya 1, Cemil Aymak 1, Yasemin Kaçar 1 1. Mersin Üniversitesi Fen-Ed. Fakültesi Biyoloji Bölümü, 33342, Mersin, Türkiye 2. Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi Fen-Ed. Fak. Biyoloji Bölümü, 80010, Osmaniye, Türkiye * sr.ergene@gmail.com Özet: C ve G bantlama yöntemi kullanılarak Rana ridibunda nın karyolojik olarak incelenmesi gerçekleştirilmiştir. Mersin de çeşitli sulak alanlarda yaşayan R. ridibunda örneklerinin kromozom analizleri havada kurutma tekniği kullanılarak bağırsak ve kemik iliği dokularından elde edilen hücrelerde gerçekleştirilmiştir. R. ridibunda nın 14 metasentrik, 10 submetasentrik ve 2 subtelosentrik olmak üzere 2n=26 diploid sayıda kromozoma sahip olduğu tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: Rana ridibunda, Sitogenetik, G ve C bantlamaları. A Cytogenetic Analysis of Rana ridibunda from Mersin Abstract: The karyotype of Rana ridibunda was analyzed using C banding and G banding. Chromosome analysis of R. ridibunda, which lives in the various wetlands area of Mersin, was performed with air-dried technique, using bone marrow and intestine epithelium cells. The diploid chromosome number of R. ridibunda was determined to be 26, comprising 14 metacentric, 10 submetacentric and 2 subtelocentric chromosomes. Key words: Rana ridibunda, Cytogenetic, G and C bandings Giriş Amphibia omurgalılar içerisinde hem suya hem de karaya en iyi uyum sağlamış bir canlı grubudur. Türkiye de Rana ridibunda (Pallas 1771) nın da dahil olduğu Anura takımı toplam 7 familya ile 16 tür ve bunların alttürleri ile temsil edilir (Özeti ve Yılmaz 1994, Baran ve Atatür 1997). R. ridibunda türü, oldukça geniş bir yayılış alanına sahip olup Kuzey Afrika, Orta ve Güney Avrupa ve Batı Asya da dağılım gösterir. Geniş dağılımlı türlerde tür içi ve türler arası varyasyonları tanımlayabilmek güç olmaktadır. Bu nedenle morfometri yanında sitogenetik ve moleküler çalışmalara da ihtiyaç duyulmaktadır. Sitogenetik tekniklerin gelişmesi gruplar arasındaki karyolojik farklılıkların ortaya çıkarılması açısından bir fırsat olarak tanımlanabilir. Son yıllarda omurgalı hayvanlarda karyoloji ile ilgili farklılıkları ortaya koyacak çeşitli çalışmalar yapılmaktadır (Alpagut ve Falakalı 1995, Ergene ve ark. 1999, Uğurtaş ve ark. 2001, Ergene ve Çavaş 2002, Lymberakis ve ark. 2007, Mindrescu ve Ghiorghita 2008, Martirosyan ve Stepanyan 2009, Napoli ve ark. 2009, Amor ve ark. 2010, Arslan ve ark. 2010, Ergene ve ark. 2010)

2 R. ridibunda nın Türkiye deki iki populasyonunun (İzmir-Beyşehir) karşılaştırmalı olarak karyolojileri incelenmiş (Alpagut ve Falakalı 1995), Güney Batı Anadolu da 9 farklı populasyonda sitogenetik ve izoenzimik çalışmalarla iki farklı (Göller Bölgesi ve Ege) grup ortaya çıkarılmıştır (Alpagut Keskin ve Falakalı Mutaf 2006). Tespit edilen tür içi farklılıklar yanında karyolojik analizlerin de yapılması farklılıkların ortaya çıkarılması konusunda yarar sağlayabilmektedir. Bu nedenle çeşitli araştırıcılar tarafından daha önce Güneybatı Anadolu populasyonları (İzmir, Manisa, Aydın, Denizli, Burdur, Isparta ve Konya illerindeki 10 farklı lokaliteden toplanan populasyonlar) çalışılan R. ridibunda nın Doğu Akdeniz i temsil edebilecek Mersin populasyonunun karyolojik olarak açığa çıkarılması amaçlanmıştır. Materyal ve Yöntem Mersin Bölgesi nde Göksu Deltası, Müftü Deresi, Berdan Barajı ve Mersin Üniversitesi Çiftlikköy Kampüsü civarından toplanan 11 i erkek 8 i dişi toplam 19 örnek üzerinde inceleme yapılmıştır. R. ridibunda örneklerine diseksiyondan saat önce intraperitonal olarak hytohemagglutinin ve diseksiyondan saat önce her 10 gr. vücut ağırlığı için kolşisin stok solüsyonundan 10 mg/ml enjekte edilmiştir. Daha sonra hayvanlar disekte edilerek bağırsak çıkarılmış ve hipotonik sıvı içinde (0,07 M KCl) boydan boya kesilerek, oda sıcaklığında yaklaşık dakika bekletilmiştir. Hücre süspansiyonunu içeren tüpler 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek 3:1 oranında hazırlanmış metanol:glasiyal asetik asit içinde tespit edilmiş, son fiksasyonda süpernatant atılarak tüpte kalan 0,5 ml lik hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş temiz lamlar üzerine damlatılmıştır. Havada kuruyan lamlar Söransan fosfat tamponla hazırlanmış % 4 lük Giemsa boyasıyla boyanmıştır. Kemik iliğinden kromozom eldesinde, diseksiyondan sonra hücreleri elde etmek için hayvanın uzun kemikleri olan tibia ve femur, kas ve bağ dokudan iyice arındırılarak kemiklerin epifizleri her iki taraftan düzgünce kesilmiştir. Kemik iliği, 0,046 M KCl içeren bir insülin enjektörü yardımıyla itmek suretiyle bir saat camı içerisine alınıp, doku küçük parçalara ayrılarak dakika hipotonikte bekletilmiştir. Tespit ve boyama işlemleri tekrarlanmıştır (Mac Gregor ve Varley 1988). Giemsa (Tripsin) bantlama için lamlar 100 ml. izotonik sıvı ile hazırlanmış 0,1 gr. Tripsin çözeltisine daldırılarak 5 saniye bekletilmiş ve yıkanarak % 4 lük Giemsa da 5-6 dakika boyanmıştır. Sentromer (C Banding) Bantlama için preparatlar oda sıcaklığında 1 saat 0,2 N HCI solüsyonu içinde bekletilmiş ve 37 C etüvde saklanan % 5'lik Ba(OH) solüsyonu derecesi 50 C oluncaya kadar pastör fırınında bırakılmıştır. Daha sonra preparatlar beher içinde 15 dakika bekletilmiştir. Preparatlar içinde 2XSSC bulunan 100 ml. lik beherde bir saat bekletilmiş ve distile suda çalkalanmıştır. Daha sonra 1,5 saat Giemsa boyası içinde boyanması sağlanmıştır

3 Preparatlar ışık mikroskobunda 100 X objektifle incelenmiş, iyi dağılan metafazların fotoğrafları bilgisayara aktarılarak karyogramları hazırlanmıştır. Kromozomların ölçümleri Micromeasure 5.0 software programı kullanılarak yapılmış ve idiogramı hazırlanmıştır. Bulgular Bu çalışmada kromozom elde etme yöntemi modifiye edilerek Phytohemaglutinin ön uygulaması yapılmıştır. Bu uygulama ile daha fazla sayıda metafaz plağı elde edilebilmiştir. Mersin Bölgesi nde Göksu Deltası, Müftü Deresi, Berdan Barajı ve Mersin Üniversitesi Çiftlikköy Kampüsü civarından toplanan toplam 19 örnek üzerinde inceleme yapılmıştır. Doğu Akdeniz de bulunan R. ridibunda nın kromozom sayısı 2n=26 olup 14 metasentrik, 10 submetasentrik 2 subtelosentrik kromozoma sahip oldukları tespit edilmiştir. R. ridibunda ya ait Giemsa ve C bantlı metafaz plağı Şekil 1 de görülmektedir. R. ridibunda nın kromozom ölçümleri ve tanımlanmaları Çizelge 1 de verilmektedir. R. ridibunda nın C bantlama sonucuna göre tanımlanan karyotip ve idiogramı Şekil 2 de görülmektedir. a b Şekil 1. R. ridibunda ya ait C bantlı (a) ve Giemsa boyama (b) metafaz plağı X100 Çizelge 1 -. R. ridibunda nın kromozom ölçümleri. Kromozom Kısa Kol Uzun Kol Kromozom Sentromer Kol Sentromer 1 750,9 778,8 1529,7 0,49 1,03 M Çiftleri 2 479,6 565,6 1045,2 Boyu İndeksi 0,45 İndeksi 1,1 Pozisyonu M 3 204,5 319,9 524,5 0,38 1,5 M 4 188,1 290,0 478,2 0,39 1,5 M 5 360,6 518,4 879,0 0,41 1,4 M 6 193,4 279,3 472,7 0,40 1,4 M 7 204,5 319,9 524,5 0,38 1,5 M 8 329,6 885,5 1215,1 0,34 1,9 SM 9 416,6 770,8 1187,4 0,35 1,8 SM 10 88,43 267,3 355,8 0,24 3,0 SM 11 90,38 198,1 288,4 0,31 2,1 SM ,6 291,3 422,9 0,31 2,2 SM 13 78,9 359,1 438,0 0,18 4,5 ST

4 Şekil 2. R. ridibunda nın karyogram ve idiogramı. Rutin boyama yöntemleri karyotip hakkında genel bilgi sağladığından bantlama yöntemleri ile daha ayrıntılı bilgi edinilebilir. Bu nedenle R. ridibunda nın karyolojik özelliklerini incelemek amacıyla C ve G bantlama yöntemlerinden yararlanılmıştır. R. ridibunda nın G bantlamaya ait metafaz plağı Şekil 3 te görülmektedir. İncelenen 11 erkek ve 8 dişi R. ridibunda örneği karyotipinde cinsiyete özel heteromorfizme rastlanılmamıştır. Tartışma Şekil 3. R. ridibunda nın G bantlama metafaz plağı örnekleri. Taksonomik problemlerin aydınlatılmasında geleneksel morfometrik ölçümler yanında karyolojik çalışmalarda kullanılmaktadır (Ergene ve ark. 1999, Kaya 2003, Amor ve ark 2010, Napoli ve ark. 2009). Ranidae familyasına ait türlerin genellikle 2n=26 kromozoma sahip olduğu görülmektedir. Mindrescu ve Ghiorghita (2008), Rana ridibunda ve Rana esculenta türlerini sitogenetik olarak incelemiş ve her iki türün de 2n=26 kromozoma sahip olduğunu belirtmişlerdir. Her iki türün kromozomlarını da boyutlarına göre iki grup içerisinde değerlendirmişler; ilk grubun 1-5 numaralı büyük kromozom çiftinden, ikinci grubun ise 6-13 numaralı küçük kromozom çiftlerinden oluştuğunu ifade etmişlerdir. Martirosyan ve Stepanyan (2009), Ermenistan ın 9 farklı lokalitesinden topladıkları Pelophylax ridibundus ve 1 bölgeden Rana macrocnemis örnekleri üzerinde yapmış oldukları karyolojik inceleme sonucunda her iki türün de diploid kromozom sayısını 2n=26 olarak tespit etmişlerdir. P. ridibundus türünde karyotipin 10 metasentrik, 12 submetasentrik ve 4 subtelosentrik kromozomdan oluştuğunu, 10. kromozom çiftinde ikincil boğum bulunduğunu; 2. ve 10. kromozom çiftlerinin uzun

5 kollarında, 9. kromozom çiftinin uzun kolunun telomerik bölgesinde ve 5. kromozom çiftinin kısa kolunda C hetorokromatin bölgelerin bulunduğunu belirtmişlerdir. Arslan ve ark. (2010) ise Konya ilinden (Meram, Beyşehir, Hadim) toplanan 9 Rana ridibunda örneğinin karyotip, C- bantlama ve nükleolar organizatör bölgelerinin özelliklerini incelemiş, karyotipin 14 metasentrik ve 12 submetasentrik kromozomdan oluştuğunu ve diploid kromozom sayısının da 2n=26 olduğunu belirtmişlerdir. Rana genusunun çeşitli tür ve alttürlerine ait farklı populasyonlarda karyolojik farklılıkların olduğu belirlenmiştir (Birstein 1984, Green 1985, Napoli ve ark. 2009). Karyolojik analizlerde farklılıkların olması türleşme yolunda giden sürecin bir göstergesi olarak kabul edilebilir. Alpagut Keskin ve Falakalı Mutaf (2006) ın yapmış oldukları 9 farklı populasyonun mitotik ve mayotik karyotiplerini incelemeleri ve Alpagut ve Falakalı (1995) nın iki farklı populasyonu incelemeleri sonucunda 2n kromozom sayısı 26 olarak korunmuş olmakla beraber bazı populasyonlarda benzerlikler, bazılarında farklılıklar söz konusu olmuştur. Bu çalışmada incelenen populasyonlarda da farklılıkların olduğu görülmektedir (Çizelge 2). Özellikle Batı Anadolu R. ridibunda populasyonlarında subtelosentrik ve submetasentrik kromozom sayıları 2 ile 3 çift arasında değişmekte iken Mersin populasyonlarında 1 çift subtelosentrik ve 5 çift submetasentrik kromozom bulunmaktadır. Çizelge 2. R. ridibunda nın farklı lokalitelere ait populasyonlarının karyolojik özelliklerinin karşılaştırılması. 2n M sm St KAYNAK İzmir * Beyşehir 26 7 (+1)* 3 (+1)* 2 * İzmir ** Beyşehir ** Bulca ** Pazarağaç ** Eber ** Akşehir ** Gelendost ** Eğirdir ** Gölcük ** Konya *** Mersin Bu çalışma m: metasentrik, sm: submetasentrik, st: subtelosentrik. (+1)*: Yapılan çalışmada (Alpagut ve Falakalı 1995) Beyşehir populasyonunda 4 numaralı kromozomda polimorfizm gözlendiği ve çalışma için toplanan örneklerin yarısında 4 numaralı kromozomun metasentrik, yarısında ise submetasentrik olarak bulunduğu ifade edilmiştir. *Alpagut ve Falakalı 1995, **Alpagut Keskin ve Falakalı Mutaf 2006, ***Arslan ve ark Alpagut Keskin ve Falakalı Mutaf (2006) 9 populasyonu yoğun bir şekilde çalışarak batı populasyonları için yorum getirmeye çalışmışlardır. Özellikle bu çalışmalarda daha çok

6 Anadolu nun batı populasyonları çalışılmıştır. Önceki yıllarda yapılan çalışmalar ise daha çok morfolojiye dayanmaktadır (Sinsch ve Schneider 1999, Sinsch ve ark. 2002). Lymberakis ve ark. (2007), Doğu Akdeniz Bölgesindeki Rana populasyonları arasındaki ilişkileri ortaya çıkartmak amacıyla yaptıkları çalışmada Türkiye den de (Antalya ve Marmaris) örnek alarak mitokondrial DNA nın 16S rrna ve sitokrom b gen bölgelerini karşılaştırmışlardır. Elde edilen moleküler veriler doğrultusunda üst miyosen türleşmesini destekler biçimde Batı Palearktik su kurbağalarının temel bir dağılım geçirerek 3 büyük ırka (perezi, lessonae ve ridibunda/bedriagae) ayrıldığını belirtmişlerdir. Lymberakis ve ark. (2007) nın yapmış olduğu çalışma Anadolu ova kurbağasının kökeni için bir bakış açısı getirse de, örnekleme alanı ve örnek sayısı kısıtlı olduğundan Anadolu daki bütün populasyonlarına bir açıklama getirecek çok sayıda lokalite ve yeterli sayıda örneğe dayalı morfometrik, sitogenetik ve moleküler bir çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma ile Doğu Akdeniz den bir grup populasyonun karyolojik özellikleri belirlenerek R. ridibunda ile ilgili yapılmış çalışmalara katkı sağlanmaya çalışılmıştır. Ancak sadece morfometrik ve karyolojik analizler bir türün dağılımı ve özelliklerinin belirlenmesi için yeterli olmadığından Anadaolu da yaşayan Rana ridibunda nın Anadolu daki yayılış alanları dikkate alınarak geniş bir örnekleme ile nuklear ve mitokondrial DNA çalışmalarının da yapılması tür içi farklılıkları da belirliyeceğinden önemlidir. Kaynaklar Alpagut Keskin, N., Falakalı Mutaf, B Rod-Shaped Bivalents indicate new assemblage among Anatolian Water Frog Populations, Amphibia-Reptilia, 27 (1): Alpagut, N., Falakalı, B Karyotype analysis of two Rana ridibunda (Ranidae; Anura) populations in Turkey, Israel Journal of Zoology, 41 (4): Amor, N., Farjallah, A., Ben-Yacoub, S., Said, K Karyological and morphometric variation of the North African gren frog Pelophylax saharicus (Anura) in North-eastern Africa, Current Zoology, 56 (6): - (Uncorrected proof). Arslan, E., Arslan, A., Gülbahçe, E C-Banded Karyotype and Nucleolar Organizer Regions (NORs) of Marsh Frog, Rana ridibunda (Ranidae: Anura) Central Anatolia, Kafkas Univ Vet Fak Derg, 16 (B): Baran, İ., Atatür, M Turkish Herpetofauna (Amphibian and Reptilian), Rep. of Turkey Ministry of Environment, 214 p. Birstein, V.J Localization of NORs in Karyotype of four Rana species, Genetica, (64): Ergene S., Portakal E., Karahan A., Karyological analysis and body proportion of Catfish (Clariidae, Clarias lazera, Valeciennes ) in Göksu Delta, Turkey. Tr Journal of Zoology, 23, Ergene Gözükara, S., Çavaş, T Karyological Analysis of Gobius pagenellus L.,1758 (Pisces:Gobiidae) in Mersin, Turkey, Folia Biologica, Vol.50,No:1-2,5-7. Ergene S., Karahan A., Kuru M Cytogenetic analysis of Pseudophoxinus antalyae, Bogustkaya, 1992 (Pisces:Cyprinidae) from the Eastern Mediterranean River Basin, Turkey, Tr Journal of Zoology, 34,

7 Green, D. M Differantitation in amount of centromeric heterochromatin between subspecies of red legged frog, Rana aorora, Copeia,4: Kaya, F Capoeta capoeta (Guldenstadt, 1773) ve Capoeta barroisi (Lortet, 1894) nin Biyometrik ve Karyolojik Özelliklerinin İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Mersin Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Mersin, 58 s Lymberakis, P., Poulakakis, N., Manthalou, G., Tsigenopoulos, C.S., Magoulas, A., Mylonas, M Mitochondrial phylogeography of Rana (Pelophylax) populations in the Eastern Mediterranean region,molecular Phylogenetics and Evolution, 44: Macgregor, H. C., Varley, J Working with Animal Chromosomes. John Willey and Sons. Chisester, UK. Martirosyan, A., Stepanyan, I Features of the karyotypes of Pelophylax ridibundus Pallas, 1771 and Rana macrocnemis Boulengeri 1885 (Amphibia: Ranidae) from Armenia, Comparative Cytogenetics, 3(1): Mindrescu, C.P., Ghiorghita, G The Preliminary Cytogenetic Investigations in Rana ridibunda and Rana esculenta L. from the North ofmoldavia, pdf Napoli, M. F., Ananias, F., Fonseca, P.M. Silva, P.Z Morphological and Karyotypic Contributions for a Better Taxonomic Definition of the Frog Ischnocnema ramagii (Boulenger, 1888) (Anura, Brachycephalidae) Özeti, N., Yılmaz, İ Türkiye Amfibileri, Ege Üniv. Basımevi, İzmir, 221 s. Sinsch, U., Schneider, H., Kaya, U., Arıkan, H The water frogs (Anura: Ranidae) of Turkey: A morphometric view on systematics. Herpet. J. 12(4): Sinsch, U., Schneider, H Taxonomic reassessment of Middle Eastern water frogs: Morphological variation among populations considered as Rana ridibunda, R. bedriagae or R. levantina. J. Zool. Syst. Evol. Res. 37: Uğurtaş, İ., Tunca, B., Aydemir, N., Bilaloğlu, R A Cytogenetic Study of Pelobates syriacus (Amphibia, Anura) in Bursa-Turkey, Turk J. Zool,25,