Prof.Dr.Tülay İrez Yeni Yüzyıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı

Transkript

1 Prof.Dr.Tülay İrez Yeni Yüzyıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı

2 IVF laboratuvarında standardizasyon Kalite kılavuzları (Guidelines) ve medikal laboratuvar standartları Laboratuvar ekipmanlarının standardizasyonu, İşlemlerin standardizasyonu Akreditasyon kurumuna bağlı kalma Personel eğitimi Standardizasyon için yeni görüşler

3 IVF laboratuvarları için kalite yönetimi Quality assurance in the reproductive biology laboratory. Byrd W.Arch Pathol Lab Med Apr; 116(4): Guidelines for human embryology and andrology laboratories by the American Fertility Society (1992) Guidelines for good practice in IVF laboratories by the European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) (2000) Reproductive Laboratory Accreditation standards, College of American Pathology (2002) Accreditation standards and guidelines for IVF laboratories by the Association of Clinical Embryologists (2002) * Revised Guidelines for human embryology and andrology laboratory, Commite for ASRM (2008)

4 Standartlar ISO standard ları ISO standard (1999) Laboratuvarlarda kalibrasyon testleri için genel gereksinimler. ISO standard (2003) Medikal laboratuvarlar için kalite ve yeterlilik ile ilişkili gereksinimler.

5 Ulusal ve uluslararası standartlar ISO (International Organization for Standardization) EN (European standard) kalite sistem standartları ISO ISO /IEC kılavuz 25 EN IEC (International Electrotechnical Commission)

6 ISO 9004 ve EN Kalite Sistemi ve Klinik Laboratuvar akreditasyonu 1. Organizasyon 2. Prosedürler 3. Kayıt 4. Tanımlamalar 5. Malzemelerin Kontrolü 6. Örneklerin doğru taşınması ve transferi 7. Cihazların kalibrasyonu 8. Kayıtların kontrolü 9. Ortaya çıkan normalden sapmaların regülasyonu 10. İnternal ve external şikayetlerin düzeltilmesi 11. İnternal ve external denetleme 6

7 ISO Organizasyon ve yönetim Yönetimde kalite Dökümentasyon kontrolü kontratlar Refere laboratuvarlar ile ortak çalışmalar Dış ilişkiler ve gereksinim temini Danışma servisleri Sorunların çözülmesi Uygunsuzlukların tanımlanması ve kontrolü Düzeltici eylemler Koruyucu işlemler Sürekli eğitim Kalite ve teknik raporlar İç denetim Yönetim şeması Personel

8 Teknik gereksinimler Personel Yerleşim ve çevre koşulları Laboratuvar ekipmanı İnceleme öncesi prosedürler İnceleme prosedürleri İnceleme prosedürlerinde kalite tanımlanması İnceleme sonrası prosedürler Sonuçların raporlanması

9 Laboratuvar hizmetlerinde akreditasyon ve sertifikasyon Akreditasyon: Yetkili bir kurumca bir kuruluş veya kişinin spesifik uygulamaları yapabilme konusunda yetkin olduğunun tanınmasına yönelik prosedürlerdir. Sertifikasyon: Bir ürünün, hizmetin veya sürecin yetkili kuruluşlar tarafından belirlenen niteliklerde, kurallarda veya usullerde üretildiğinin, sunulduğunun veya yürütüldüğünün yine yetki verilmiş kuruluşlarca incelenerek belgelendirilmesidir.

10 ESHRE 2008 Magli MC, Van Den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L. ESHRE Pages: Revised guidlines for good practice in IVF laboratories. Human Reproduction : Personel ve yönetimi 2. İzlenen politikalar ve prosedürler 3. Laboratuvar güvenliği 4. Doğru örnek alımı ve hasta bilgilerinin etiketlenmesi 5. Kültür medya hazırlığı ve kalite kontrol testleri 6. Spermlerin manipülasyonu ve hazırlığı.

11 Personel ve yönetimi Deneyim Yeterli sayıda olmalı Yeni göreve başlayan personel eğitimi Tüm personele sürekli eğitim Her personelin görev ve sorumluluğunun yazılı bildirimi

12 Staff requirements The number of staff has to be adjusted according to the number and nature of the procedures performed in the laboratory * Including laboratory director ESHRE guidelines

13 Kısa ve uzun vadede eğitim sonuçlarının değerlendirilmesi Verilerin depolaması Kısa vadede değerlendirme; Oosit matüritesinin değerlendirilmesi Embriyo kalitesinin değerlendirilmesi Semen analizi değerlendirilmesi Uzun sürede değerlendirme; Gebelik oranı

14 Ekip elemanlarının performanslarının ölçümü Uygun laboratuvar programları ile embriyolog performansları ölçülebilir Kısa sürede oosit maturite değerlendirmesi embryo kalite değerlendirmesi Sperm parametrelerinin değerlendirilmesi Uzun süreli değerlendirme Gebelik / transfer Fertilizasyon/ICSI uygulamasında dejenerasyon oranı

15 Laboratuar güvenliği Lab. Düzeni Aseptik koşullar Dolaşan havanın filtrasyonu Enfeksiyöz ajanlar (Hastaların enfeksiyöz ajanlara karşı taranması) Personelin aşılanması (HBV) Koruyucu önlemler Uygun giysi ve eldiven kullanımı Düzenli el yıkama Steril tek kullanımlık malzeme kullanımı Atıkların uygun şekilde atılımı ve yüzey temizliği /01/a-call-to-arms-lab-safety

16 Semen toplama Abstinens 2-6 gün İdrar yapıldıktan sonra verilmeli Eller sabun ile yıkanıp, durulanır Geniş ağızlı steril kaplar bu işlem için kullanılır. Örnek vücut sıcaklığında muhafaza edilir güneş ışığına tutulmaz. Örnek bir saat içinde laboratuvarda olmalıdır.

17 İnkübatörlerde kontrol Firma tarafından yapılacak bakım Yılda 3 kez bakım ve kalibrasyon yapılır. Bakım sonrası en az 48 saat gaz ve ısı parametreleri gözlenmelidir. Filtre değişimi Her üç ayda bir değiştirilir. Kültür alınması

18 Tüplerin kontrolu Her gün sabah ve akşam doluluk kontrol edilir. Tüp değişimlerinde daha dikkatli olunur. Ana regulatörlerdeki, miktar ve genel şebekeye giden basıncı gösteren göstergeler kontrol edilir. Miktar göstergesi 10 bar dan düşük ise tank değiştirilir. Basınç göstergesi 2 bar olacak şekilde ayarlanmalıdır (Laminar air flow için 1 bar). Her bir inkübatör için ayrı basınç düşürücüsü yerleştirilmiştir. Göstergenin bar arasında ayarlanması gerekmektedir. CHANGE-OVER SİSTEMİ - bir tüp bittiğinde uyarıp diğerine geçen otomatik gaz sistemi

19 Laminar flow kontrolu Ana ve ön filtre 6 ayda bir değiştirilir. Flowmetre ve cam fanusa nem sağlayan tüpteki su haftada bir değiştirilir. Termostat ayarı her gün kontrol edilir ve haftada bir manuel olarak yüzey ısısı ölçülür.

20 ISITICI BLOKLAR: *Her hafta: -Sıcaklıklar ölçülür, kabul edilebilir limitlerin dışında ise ayar yapılır. PH METRE: *Her kullanımdan önce; -Kalibrasyon işlemleri gerçekleştirilir. -Ölçüm yapılır. Sonuç kaydedilir.

21 Quality Control using Evaluation of Results (ESHRE Guidelines) Fertilization rates Embryo quality Pregnancy rates Multiple pregnancy rates Implantation rates 21

22 IVF de Gebelik sonuçlarını etkileyen faktörler Kullanılan disposable malzeme Aspirasyon iğneleri Kataterler Pipetler cam malzeme Kültür kapları Test tubleri Personel Embryolog Jinekolog Aletler Isıtılmış yüzeyler Isıtıcı bloklar Androloji lab malzemeleri İnkübatörler Filtrasyon

23 Reprotoksitite Tanımı: Kontakt materyalin gamet ve embriyocanlılığı ve fonksiyonları üzerine etkisi Belirtiler: Azalmış fertilizasyon oranı Zayıflamış embryo gelişimi Düşük implantasyon oranı Azalan yürüyen gebelik oranı -Testler: Mouse embryo assay (MEA) Sperm survival test (SpsT)

24 QC Test Yöntemleri Fonksiyonel testler Fare embriyosu testi Hamster sperm motilite testi İnsan spermi vitalite testi Somatik hücre kültürü Diğerleri 24

25 Mouse Embryo Assay Safety and efficacy of culture media and disposables are determined by observing the in vitro development of mouse embryos exposed to the item to be tested. Blastocyst formation and cell number should be above acceptance criteria

26 Sperm Survival Test - SpST Motility of spermatozoa in test sample compared with control sample after 24 and 96 hours. Percentage of motile sperm in test sample Percentage of motile sperm in control sample < 0.85 TOXIC!

27 36 product types of 72 different brands were tested in 350 human sperm survival tests (approx 35% were toxic) Products used for gamete and embryo related procedures 207 tests Pipettes: micro, dispense, denudation, Pasteur Products used for patient related procedures 143 tests OPU needles Catheters Gloves Condom for semen collection Tips Syringes Flask Dishes Freezing straws Filters Semen specimen container + lid REF: Nijs M et al. Fertil & Steril 92(2), 2009

28 Reprotoksitite azaltılabilir Bu konuda ne yapabiliriz? Kendi laboratuvar testlerimizi geliştirme (Embriyo testinden geçmiş materyal yok ise) Sperm survival test uygulanabilir Disposable materyal yıkanabilir fare embriyo testi yapılmış materyal kullanımı always when available Culture and handling media Disposables

29 Proper air quality Chemical air contaminants (COC) are believed to exert a range of effects, from fertilization failure and delayed embryonic development to a reduction in viability and pregnancy rates These effects may or may not be evident morphologically

30 Requirements for Heating Ventilation and Air Conditioning (HVAC) system in the IVF laboratory High fresh air changes (15 25 air changes/hour) Positive pressurization HEPA filtration Chemical air processing using activated carbon and potassium permanganate Active filtration units inside or at the inlets of incubators and in the laboratory area

31 Effect of air filtration

32 Calibration of Laboratory instruments Proper maintenance of laboratory instruments is a key for providing a consistent environment that will guarantee normal embryo development

33 Laboratory instruments -- general requirements Handling of equipment failures Actions required in cases of unexpected events (power failure) The availability of an automatic emergency generator backup (UPS) Back up for decisive pieces of equipment (Cryopreservation, micromanipulation systems)

34 IVF/ICSI outcomes after culture of human embryos at low oxygen tension: a meta-analysis. Rep.Biol.Endocrinol 2011 IVF/ICSI outcomes after culture of human embryos at low oxygen tension: a meta-analysis. Gomes Sobrinho DB, Oliveira JB, Petersen CG, Mauri AL, Silva LF, Massaro FC, Baruffi RL, Cavagna M, Franco JG Jr. Source Department of Gynaecology and Obstetrics, Botucatu Medical School, São Paulo State University-UNESP, Botucatu, Brazil. Abstract BACKGROUND: Improved pregnancy, implantation, and birth rates have been reported after the use of reduced O2 concentration during embryo culture, mainly due to a reduction of the cumulative detrimental effects of reactive oxygen species. However, some studies have failed to report any positive effects. The objective of this meta-analysis was to evaluate the effect of a low-o2 environment on IVF/intracytoplasmic sperm injection (ICSI) outcomes. METHODS: All available published and ongoing randomised trials that compared the effects of low (~5%; OC~5) and atmospheric (~20%; OC~20) oxygen concentrations on IVF/ICSI outcomes were included. Search strategies included online surveys of databases from 1980 to The outcomes measured were fertilisation rate, implantation rate and ongoing pregnancy rates. The fixed effects model was used to calculate the odds ratio. RESULTS: Seven studies were included in this analysis. The pooled fertilisation rate did not differ significantly (P=0.54) between the group of oocytes cultured at low O2 tension and the group at atmospheric O2 tension. Concerning all cycles, the implantation (P=0.06) and ongoing pregnancy (P=0.051) rates were not significantly different between the group receiving transferred sets containing only OC~5 embryos and the group receiving transferred sets with only OC~20 embryos. In a meta-analysis performed for only those trials in which embryos were transferred on day 2/3, implantation (P=0.63) and ongoing pregnancy (P=0.19) rates were not significantly different between the groups. In contrast, when a meta-analysis was performed using only trials in which embryos were transferred on days 5 and 6 (at the blastocyst stage), the group with transferred sets of only OC~5 embryos showed a statistically significantly higher implantation rate (P=0.006) than the group receiving transferred sets with only OC~20 embryos, although the ongoing pregnancy (P=0.19) rates were not significantly different between the groups. CONCLUSIONS: Despite some promising results, it seems too early to conclude that low O2 culture has an effect on IVF outcome. Additional randomised controlled trials are necessary before evidence-based recommendations can be provided. It should be emphasised that the present metaanalysis does not provide any evidence that low oxygen concentration is unnecessary.

35 SPERM ANALİZİ NORMAL DEĞERLERİ (WHO 2010) 2 (1999) 40 (1999) 20 (1999) 50 (1999) 75 (1999) 14 (1999) WHO laboratory manuel fort he examination and processing of human semen,fifth edition

36 Sperm konsantrasyonunun ölçümü 10 ul semen üzerine 190 ul su = 20x dilution. karıştır 10 ul karışım sayma kamarasına konur. 2-3 dakika beklenir 5 kare (merkez grid)sayılır = sperm konsantrasyonu x 10 6 /ml Bütün spermler sayılır, pinhead olanlar hariç Okuma x20 objektifte L kuralı uygulanır Neubauer haemocytometer chamber is the WHO 2010 recommended standard

37 Strict morfoloji değerlendirme Spermler boyanırken kurallara uygun boyanmalıdır. Strict criteria /Kruger /Tygerberg Sperm başı oval, simetrik dış hatlı, 3-5 um uzunluğunda ve 2-3um genişliğinde bulunur. Akrozom başın 40-70% ini kaplar ve vacuoller (=/<2) sayıda ~ 20% baş alanını kaplamalıdır. Orta kısım düzgün, 0.5 um eninde ve 7-8um uzunluğunda, başa simetrik şekilde bağlanmış olmalı. Kuyruk düzgün olmalı um uzunluğunda bulunmalı Normal bir sperm tüm parametreleri normal olandır. En az 400 sperm sayılmalıdır Normal Form (%) = normal spermler / sayılan total spermler x 100.

38 Anormal spermler

39 Morfoloji ölçümü Sperm büyüklüğü ve şekli değiştiğinden ölçüm subjektiftir. % Normal fertilizasyon ve gebelik oranları ile korelasyon göstermektedir. [Kruger et al, 1996; Morgenthaler et al, 1995] Baş veya kuyruk anomalisi taşıyan spermlerin normallere kıyasla daha düşük hareketleri vardır[aitken et al, 1995].

40 Oocyte scoring Cumulus Oocyte Complex (COC)Alpha,Eshre,Asrm 2011 Little corroborated evidence for predicting embryo outcome COC scoring important tool for troubleshooting Binary score (0 or 1): Good = 1; expanded cumulus and radiating corona

41 Oocyte scoring Zona pellucida scoring No specific benefit to measuring thickness Insufficient evidence for effect on outcome Could be patient-specific effects Exception scoring: note unusual thickness or colouration

42 Oocyte scoring Cytoplasm scoring Expect homogeneous cytoplasm (but significance of non-homogeneous not known) Organelle Clustering = lower implantation potential (different to granularity ) Smooth Endoplasmic Reticulum (ser) disks: risk of serious, significantly abnormal outcome Strong recommendation not to inseminate oocytes with ser disks (and to re-examine all sibling oocytes before inseminating)

43 DAY Date DAY 0 DAY 1 DAY 2 DAY 3 DAY 4 DAY 5 DAY 6 IVF Lab Procedures Embryo picture Lab procedure Communication unfertilized egg blastocyst 2 PN 2 cell 4-cell 7-cell morula expanded blastocyst mid-morning Day 3 Transfer Egg retrieval- morning Fertilization- afternoon Fertilization check Embryo development check If few If many embryos (<5) embryos (>5) Embryo development check If blastocysts mid-morning Day 5 transfer If few embryos (<5 at 7-cells) Embryo development check If many embryos (>5 at 7-cells) None If pre-blastocysts mid-morning Day 6 Transfer When: after egg retrieval How: in recovery room Why: if fewer eggs were retrieved than consented for transfer then schedule When: 2-4 day PM 2 transfer How: call IVF lab Why: fertilization results, if the # fertilized the # to be transferred a day 2 transfer is scheduled When: 2-4 PM How: call IVF lab Why: embryo development results. If few embryos, then establish day 3 transfer time When: 7-8:30 AM How: we ll call you Why: Only if day 3 transfer was NOT established on day 2. See transfer Note: day Only decision 5% of patients next page continue on to day 4-6 When: No contact When: 7-8:30 AM How: we ll call you Why: embryo development results. Establish transfer day and time. (see transfer day decision next page) When: No contact

44 The Author Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please Images of in vitro embryonic development showing morphology changes from culture Day 0 to Day 5. Devroey P et al. Hum. Reprod. Update 2009;15:

45 Timing of observationsconsensus blastocyst scoring system: Alpha,ESHRE,ASRM 2011,Hum.Rep Observation Timing (hours postinsemination) Standardized timing relative to insemination time Report cell number/stage and grade (separately) with time post-insemination Expected stage of development Fertilization check 17 ± 1 h Pronuclear stage Syngamy check Early cleavage check 23 ± 1 h 26 ± 1 h post-icsi 28 ± 1 h post-ivf Up to 50% in syngamy (up to 20% at the 2-cell stage) 2-cell stage Day 2 assessment 44 ± 1 h 4-cell stage Day 3 assessment 68 ± 1 h 8-cell stage Day 4 assessment 92 ± 2 h Morula Day 5 assessment 116 ± 2 h Blastocyst

46 PN scoring PN scoring should be performed at the same time as the fertilization check Consensus scoring system for PN: Grade Rating Description 1 Symmetrical Equivalent to Z1 and Z2 2 Non-symmetrical Other arrangements, including peripherallysited pronuclei 3 Abnormal Pronuclei with 0 or 1 NPB

47 Cleavage stage embryos Optimal d2 embryo (44 ± 1 h post-insem): 4 equally-sized mononucleated blastomeres in a 3-dimensional tetrahedral arrangement, with <10% fragmentation Optimal d3 embryo (68 ± 1 h post-insem): 8 equally-sized mononucleated blastomeres, with <10% fragmentation

48 Cleavage stage embryo scoring system Scoring format: cell number, grade, reason for grade Grade Rating Description 1 Good 2 Fair 3 Poor <10% fragmentation stage-specific cell size no multinucleation up to 25% fragmentation stage-specific cell size for majority of cells no evidence of multinucleation severe fragmentation (>25%) cell size not stage-specific evidence of multinucleation

49 Day 4 embryo scoring system Consensus scoring system for day 4 embryos: Grade Rating Description 1 Good 2 Fair 3 Poor Entered into a 4 th round of cleavage Evidence of compaction that involves virtually all the embryo volume Entered into a 4 th round of cleavage Compaction involves the majority of the volume of the embryo Disproportionate compaction of <½ embryo, with some cells remaining as discrete blastomeres

50 Consensus blastocyst scoring system: Alpha,ESHRE,ASRM 2011,Hum.Rep Stage of development Grade Rating Description 1 Early 2 Blastocyst 3 Expanded Inner Cell Mass 1 Good 4 Hatched/hatching Prominent, easily discernible, with many cells that are compacted and tightly adhered Trophectoderm 2 Fair Easily discernible with many cells loosely grouped together 3 Poor Difficult to discern, with few cells 1 Good Many cells forming a cohesive epithelium 2 Fair Few cells forming a loose epithelium 3 Poor Very few cells

51 Yeni teknikler 1.Oocyte zona birefringence (Montag et al 2008) 2. gene expression profiling of oocyte cumulus cells (McKenzie et al., 2004; Assou et al., 2006; Feuerstein et al., 2007) 3. evaluation of spent culture fluid by proteomic analysis (Katz-Jaffe et al., 2006) 4. metabolic profiling using near-infrared spectroscopy (McKenzie et al., 2004; Vergouw et al., IMSI 6. Time lapse imaging 7. CGH

52 IVF Viability score calculated using (A) NIR and (B) Raman spectra of culture media are shown for embryos that implanted and lead to delivery (empty) and those that did not implant (shaded).

53 IVF Result: Glutanate concentrations Viability indices Conclusion Correlation of metabolic profile of spent embryo culture media with reproductive potential of embryos

54 Table 1. Comparison of fertilization, pregnancy, implantation and miscarriage rates arising from intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) groups. Group 1, ICSI Group 2, IMSI (n = 219) (n = 227) Mean age (years) ± ± 3.23 No. of previous ICSI failures 1.45 ± ± 1.69 No. of MII oocytes recovered 6.29 ± ± 3.34 No. of injected oocytes 2.92 ± ± 0.29 No. of 2 PN zygotes 2.76 ± ± 0.45 No. of transferred embryos/patient 2.37 ± ± 0.68 Clinical pregnancy rate (%) 58/219 (26.5)a 89/227 (39.2)a Implantation rate (%) 59/521 (11.3)b; 1 twin 97/560 (17.3)b; 8 twins Miscarriage rate (%) 14/58 (24.1) 15/89 (16.9) MII = metaphase II; PN = pronucleate. Continuous variables are presented as means ± SD. a P = 0.004; b P =

55 The Author Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please The odds of post-thawing survival rate of cleavage-stage embryos after vitrification or slow freezing.ci, confidence interval; OR, odds ratio. Devroey P et al. Hum. Reprod. Update 2009;15:

56

57 First child born using DNA sequencing IVF technique SCIENCE 08 JULY 13 by LIAT CLARK

58 Preimplantasyon embriyoda morfokinetik parametreler

59 SONUÇLAR 1. IVF uygulamalarında kalite kontrol sistemlerinin hasta bazlı artırılması gereklidir 2. IVF tedavisinde standardizasyon uygulamalarına başlanmalıdır

60 3. Tek embryo transferi uygulanacak olguların standardlarının oluşturulması 4. Kademeli dondurma ve vitrifikasyon yöntemlerinin seçiminin vitrifikasyona yönelik olarak her laboratuvarda elde edilen canlı embriyo sayısının artırılması ile birlikte vitrifikasyona geçiş sağlanması tek embriyo transferi sistemlerinde embriyo hasarının minimal düzeyde tutulması hedeflenmelidir.

61 5. Tüm personelin infertilite tedavisinde eksiksiz olarak laboratuvar uygulamalarını yapmaları hedeflenmelidir. 6. Embriyolog eğitimi üniversite lisans üstü eğitimi şeklinde olmalı ve uluslararası standarda kavuşturulmalıdır.

62 6.Selection of culture conditions Individual laboratory culture strategies are complex and highly varied, and there are few data on which to base the selection of a specific culture strategy. For example, each culture fluid contains up to 80 components that will influence embryo development and assessments. Greater standardization of culture conditions is required to permit accurate comparisons of embryo and/or blastocyst quality-assessment tools.

63 7. Preimplantation genetic screening (PGS) for aneuploidy can currently be performed in up to 15 chromosomes using fluorescence in situ hybridization (Munne, 2006). PGS requires removal and analysis of a single blastomere from a Day-3 embryo (Gianaroli et al., 1997; Wells and Delhanty, 2000). Embryos with a normal genetic constitution are subsequently selected for transfer and those with an abnormal number of chromosomes are discarded (Mastenbroek et al., 2007).