ARRAY CGH TEKNOLOJİSİ VE BLASTOKİST TRANSFERİ. DÜNÜ, BUGÜNÜ VE YARINI. Prof. Dr. Muhterem BAHÇE

Transkript

1 ARRAY CGH TEKNOLOJİSİ VE BLASTOKİST TRANSFERİ. DÜNÜ, BUGÜNÜ VE YARINI Prof. Dr. Muhterem BAHÇE

2 Preimplantasyon Genetik Tanı; YÜT sonuçlarını arttırmak Tekrarlayan gebelik kayıplarını azaltmak Kalıtsal hastalıkları önlemek

3 3.Gün biyopsi ve FISH analizleri Hipotez: Embriyoların %50 si kromozomal olarak anormal ise normal embriyoların transferi implantasyonu 2 kat arttırmalıdır. (Munné et al. 1993) Sonuç: 3.gün biyopsi ve FISH analiz sonuçları beklentiyi karşılamıyor ve PGT nin tüm potansiyelini gösteremiyor.

4 3. Gün biyopsisi ve FISH analizinde karşıt veriler Pozitif etki Gianaroli et al Munné et al 1999 Gianaroli et al 2001a Gianaroli et al. 2001b Munné et al Gianaroli et al Munné et al Munné et al 2006 Verlinsky et al Colls et al Garrisi et al Rubio et al Rubio et al * Etki yok Werlin et al * Staessen et al * Platteau et al * Jansen et al * Mersereau et al * Schoolcraft et al * Negatif etki Mastenbroek et al * Hardarson et al * * CRT

5 Optimal PGD methods for FISH Optimal Questionable Biopsy media with aminoacids simple media Biopsy time / embryo 1 min > 5 min # cells biopsied one two Fixation method Carnoy s Tween 20 # chromosomes tested 8 6 # analysts / case 2 1 Reanalysis no results yes no Large experience yes no Error rate <10% 10-50% Number of zygotes >5 5 Munné et al. (2010) Fertil. Steril. 94:408

6 Biyolojik: 3. Gün biyopsisi ve FISH analizinde olumsuz sonuçların nedenleri - Mozaisizm - Self-correction Teknik: - Yeterli sayıda kromozom analiz edilmiyor - Standart olmayan yöntemler - Biopsi basamağı

7 Technical differences: high error rates Technical errors are lab dependent and the best measure to assess a PGD laboratory: Study: Technique Error rate Baart et al 2004 FISH 50.0% Li et al FISH 40.0% Gleicher et al FISH 15-20% Munné et al FISH 7.2% Geraedts et al 2011 array CGH 6.0% Colls et al., 2007 FISH 4.7% Scott et al qpcr 4.0% Magli et al FISH 3.7% Gutierrez-Mateo et al array CGH 1.8%

8 Mozaisizm 592 anormal embriyonun tüm blastomerleri kullanılarak tekrar analiz edilmiş ve: normal 13 <49% anormal % anormal % anormal 528 7% Colls et al. Fertil Steril 2007;88(1):53 61

9 Analiz edilen kromozom sayısı 24-kromozom testleri (CGH, acgh, etc) FISH-12 ye göre % 50 daha fazla anomali yakalıyor ancak sadece % 20 daha fazla embriyo anormal tanı alıyor. Colls et al. (2009) Reprod Biomed Online 19:

10 3.gün embriyolarında morfoloji kromozomal anomaliler için uygun belirteç midir? 56% % abnormal embryos Morphology: Maternal age Embryos analyzed: Morphologically normal embryos: Source: Munné et al Similar results also found by Munne et al 1995, Marquez et al. 2000, Magli et al

11 5.gün embriyolarında morfoloji kromozomal anomaliler için uygun belirteç midir? 55% of best morphology blastocysts were aneuploid

12 Time-laps ile morfoloji anöploidi ile kısmi korelasyon gösteriyor Hızlı ve yavaş gelişen blastosistler benzer anöploidi oranlarına sahip(2) 2.gündeki anöploid embriyoların %30 u öploid embriyolar ile aynı gelişimi gösteriyor(3) Blastula oluşumu anöploid embriyolarda gecikiyor(1,4), ancak hala iyi gelişen blastosistlerin %50 sinde anöploidi mevcut(1) Euploid Euploid Complex abn. Trisomy 21,22 (1) Melzer et al (in press) (2) Stevens et al. (2012), (3) Chavez et al. (2012), (4) Campbell et al. (2013)

13 Number of embryos Time-lapse ve anöploidi: Melzer ve ark.ları (2013) 18 Only timing of compaction was correlated by aneuploidy Only gross morphological abnormalities (group E) were more likely aneuploid Euploid Aneuploid Category A Category B Category C Category D Category E Hierarchal Classification Melzer et al. (2013) Reprod Biomed Online, in press

14

15 Figure 1 Reproductive BioMedicine Online 2013; 27: Copyright 2013 Reproductive Healthcare Ltd The previously established three-class aneuploidy risk model applied to embryos with known fetal heart beat outcome (gestational weeks 6 8). Blue crosses represent embryos that resulted in a fetal heart beat and red lines represent embryos that did not result in a fetal heart beat. Area under the ROC curve is tsb = time from insemination to the start of blastulation; tb = time from insemination to the formation of a full blastocyst.

16 6.gün öploid embriyolar hala implante olabiliyor 5.gün morulalar 6. güne kadar kültüre edildiler ve blastosiste ulaştıklarında biyopsi edildiler. 5 veya 6. günde biyopsi edilen blastosistlerden tek blastosist transferi yapıldı. Day-5 biopsy Day-6 biopsy Implantation: 58% 21% p<0.005 Grifo et al., unpublished

17 3.Gün ve blastosist biyopsisinin karşılaştırılması cleavage stage blastocyst biopsy not biopsy not Implantation rate 31% 53% 52% 54% P<0.05 N.S. but biopsy is an operator-dependent procedure and its effect may vary Scott et al. (2013) Fertil Steril

18 PGD v.2: Array ile 24 kromozom analizi Blastosist biopsisi

19 Blastosist biopsisi: Avantaj ve Dezavantajları Daha fazla DNA: Daha az sonuç yok Daha az mozaisizm ve hata Daha az biopsi etkisi Daha az iş yükü ve maliyet Daha fazla tek embriyo transferi Frozen siklus: Endometriyum optimizasyonu Dezavantajları: Bütün embriyolar aynı gün blastosiste ulaşmıyor

20 Sonuç yok: 3. gün vs. 5. gün Biopsi aşaması Cleavage Blastosist Sonuç yok embriyo %3.2 %2.3 Merkez* dağılımı %1 - %5 %0 - %18 En deneyimli Deneyimsiz Gutierrez-Mateo et al. (2011) Fertil Steril and Reprogenetics data on 9049 embryos * Centers with >20 cycles done for that biopsy stage

21 Trofoektoderm analizi ICM yansıtıyor mu? ICM vete %97 (31/32) uyumlu (acgh) ( a ). acgh ile anormal olan blastosisler FISH ile tekrar analiz edildiğinde %97.5 yine anormal (39/40)( b ). (a) Capalbo et al. (2013), (b) Colls et al. (in preparation)

22 Array Comparative Genome Hybridization Embryo DNA Normal DNA Trisomy Monosomy Normal

23 Örnek kabulu Tüm genom amplifikasyonu (3 saat) DNA işaretleme (3 hrs) DNA nın bir bölümü yedekleme için veya tekrar analiz için saklanır Hybridizasyon (min. 6 saat) Yıkama (30 dk) Tarama ve değerlendirme (45 dk) Raporlama

24 46,XY

25 46,XX+7-10

26 acgh avantajları 24 kromozoma ait anöploidileri ve translokasyonları tanımlayabiliyor. Sonuçlar saat: 5.gün biyopsi ve 6. gün sabah transfer Parental DNA analizi gerektirmez

27 PGS evolution 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% acgh day 5 acgh day 3 CGH FISH 12 FISH : Cornell Univ. ; : Saint Barnabas; 2001-present: Reprogenetics data

28 Day 5: Prognosis depending on age and ovarian response Ata, Munne et al. (2012) Reprod Biomed Online (875 cycles, 4600 embryos) and unpublished data. Euploidy significantly decreased with age (p<0.001) but

29 Overall clinical results

30 CGH, blastocyst biopsy and vitrification: clinical results Cycles Mat. Prev. embryos implant. age failed replaced (+ sac) cycles CGH : % control : % p= Schoolcraft et al. (2010) Fertil. Steril. 94:1700

31 Clinical results with fresh transfer: qpcr Average age: 32, average blastocysts biopsied: 8 Control PGD Ongoing implant. rate 47.8% 66.4% P=0.01 Ongoing preg. rate 67.5% 84.7% P=0.01 Scott et al., 2013 Fertil Steril.

32 Prospective Randomized Trial in patients <35 with day 5 biopsy, day 6 transfer Control PGD (acgh) Patients Maternal age <35 <35 Biopsy on day 5 no yes Transfer on day 6 day 6 Embryos euploid (N) n/a 53.2% (425) Embryos replaced (av.) 48 (1) 55 (1) Pregnancy rate (sac) 45.8% 70.9% p<0.05 Ongoing preg rate 41.7% 69.1% p<0.05 Multiple pregnancies 0 0 Yang et al. (2012) Molec Reprod

33 Array CGH with Day 5 biopsy: Results from centers with >20 cycles total range per center cycles: Maternal age: # blasts biopsied: Implantation after PGD 52% 37-82% Pregnancies / cycle 50% 28-71% Pregnancies / transfer 66% 52-91% Reprogenetics data to 1/2013

34 qpcr with Day 5 biopsy: CRT results Good prognosis patients. Control replaced on day 5, test biopsied on day 5 and replaced on day 6 PGD Control age N blastocysts Emb replaced implantation 79.8% 63.2% P=0.002 Sustained implant 66.4% 47.9% P=0.03 Delivery rate 84.7% 67.5% P=0.01 Scott et al. (2013) Fertil Steril

35 Fresh or Frozen?

36 Day 5 biopsy and vitrification: Other center results ongoing pregnacy rate 1 euploid 2 untested blastocyst blastocyst Fresh transfer 65% 70% Frozen transfer 55% 52% NS NS

37 Blastocyst biopsy fresh vs. frozen: Array CGH results ongoing pregnancy rate / transfer cycles FET day 6 Center % 66% NS Center % 61% NS Data from: Reprogenetics, unpublished

38 Four-hour quantitative real-time polymerase chain reaction based comprehensive chromosome screening and accumulating evidence of accuracy, safety, predictive value, and clinical efficacy Nathan R. Treff, Ph.D.,a,b,c and Richard T. Scott Jr., M.D.a,b a Reproductive Medicine Associates of New Jersey, Morristown; b Division of Reproductive Endocrinology, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Science, University of Medicine and Dentistry of New Jersey Robert Wood Johnson Medical School, New Brunswick; and c Department of Genetics, Rutgers State University of New Jersey, Piscataway, New Jersey Although there are many advantages, it is also important to note the requirement and capital equipment expenses associated with the need for multiple real-time PCR instruments to handle concurrent processing of multiple embryo biopsies and to maintain quality control for each of the individual components of the procedure.

39 Blastosist biopsisi: ÖZET Dezavantajları: Bütün embriyolar aynı gün ve saatte blastosiste ulaşmıyor Maliyet acgh Daha fazla DNA: Daha az sonuç yok 24 kromozoma ait anöploidileri ve Daha az mozaisizm ve hata translokasyonları Daha az biopsi etkisi tanımlayabiliyor. Sonuçlar saat: Daha az iş yükü ve maliyet 5.gün biyopsi ve 6. gün Daha fazla tek embriyo transferi sabah transfer Parental DNA analizi Frozen siklus: Endometriyum gerektirmez optimizasyonu Taze / Donmuş İki çalışmada fark yok