ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Fulya HARP GEMLİK, DOMAT, ADANA TOPAĞI ve ADANA YERLİ ZEYTİN YAPRAKLARININ ANTİOKSİDAN ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GEMLİK, DOMAT, ADANA TOPAĞI VE ADANA YERLİ ÇEŞİDİ ZEYTİN YAPRAKLARININ ANTİOKSİDAN ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Fulya HARP YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu Tez / / 2011 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ile Kabul Edilmiştir Yrd.Doç.Dr.Türkan KEÇELİ MUTLU Doç.Dr.Ramazan BİLGİN Yrd.Doç.Dr.Asiye AKYILDIZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2009YL59 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ GEMLİK, DOMAT, ADANA TOPAĞI ve ADANA YERLİ ZEYTİN YAPRAKLARININ ANTİOKSİDAN ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Fulya HARP ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Yrd. Doç. Dr. Türkan KEÇELİ MUTLU Yıl : 2011 Sayfa : 55 Jüri : Yrd. Doç. Dr. Türkan KEÇELİ MUTLU Doç. Dr. Ramazan BİLGİN Yrd. Doç. Dr. Asiye AKYILDIZ Bu çalışmada, Gemlik, Domat, Adana Topağı ve Adana Yerli zeytin yaprağı antioksidan aktivitesi incelenmiş ve bu aktivite ticari zeytin yaprağı ekstraktı ile BHT (Bütillendirilmiş Hidroksi Toluen) ve BHA (Bütillendirilmiş Hidroksi Anilin) gibi sentetik antioksidanlar ile karşılaştırılmıştır. Araştırma sonuçlarına göre, tüm derim zamanlarında Domat zeytin yaprağı, diğer zeytin yapraklarının ise bazı derim zamanlarında ticari zeytin yaprağı ekstraktı ile karşılaştırıldığında toplam fenol içeriğinin daha yüksek olduğu bulunmuştur. Ayrıca Adana Topağı ve Domat zeytin yapraklarındaki toplam fenolik madde miktarlarının derim zamanına bağlı olarak değiştiği ve azaldığı belirlenmiştir. Ticari zeytin yaprağı ekstraktının DPPH serbest radikalini tutma kapasitesine ilişkin ARP değerleri çeşide ve hasat zamanına bağlı olmaksızın diğer zeytin yaprağı ekstraktlarından daha yüksek olduğu bulunmuştur. Antioksidan aktivite açısından, zeytin yapraklarının radikal tutma kapasitesinin 100 ve 200 ppm konsantrasyonda ticari zeytin yaprağı ekstraktına benzer, BHT den daha yüksek ve BHA ile benzer veya daha etkili olduğu bulunmuştur. Oksidatif stabilite açısından ise, 100 ve 200 ppm konsantrasyonda zeytin yaprağı ekstraktları tüm derim zamanlarında ticari zeytin yaprağı ekstraktından daha etkili antioksidan aktivite göstermiş ve antioksidan etki konsantrasyona bağlı olarak artmıştır. Rafine zeytin yağının oksidatif direncinde, zeytin yaprağının ticari zeytin yaprağı ekstraktı kadar veya daha etkili olduğu ancak BHT ve BHA dan daha az etkili antioksidan aktivite gösterdikleri bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Zeytin yaprağı, Toplam Fenol, BHT, BHA, Antioksidan I

4 ABSTRACT MSc THESIS DETERMINATION OF ANTIOXIDANT EFFECTS OF GEMLIK, DOMAT, ADANA TOPAGI and ADANA LOCAL TYPE OLIVE LEAVES Fulya HARP CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING Supervisor : Asst. Prof. Dr. Türkan KEÇELİ MUTLU Year : 2011, Pages : 55 Jury : Asst. Prof. Dr. Türkan KEÇELİ MUTLU Asst. Prof. Dr. Asiye AKYILDIZ Assoc. Prof. Dr. Ramazan BİLGİN In this study, the antioxidant activity of Gemlik, Domat, Adana Topağı ve Adana Yerli olive leaves were investigated and the results were compared to that of commercial olive leaf extract as well as snythetic antioxidants such as BHT and BHA. The results showed that Domat olive leaf at all harvesting time and other olive leaves at some harvesting time showed higher total phenolic contents than commercial olive leaf extract. The total phenolic content of Adana Topağı and Domat olive leaves were signifantly reduced depending on harvesting time. Values for DPPH radical scavenging activities showed that ARP values of commercial olive leaf extract were higher than other olive leaf extracts regardless of variety and harvesting time. However, the radical scavenging activity of olive leaves at some harvesting time at 100 or 200 ppm were similar to commercial olive leaf extract and higher than BHT and similar or higher than BHA. The addition of refined olive oil 100 and 200 ppm all olive leaves increased oxidative stability and caused to extracts to show better activity than commercial olive leaf extract. The activity of olive leaves were equal or better than commercial olive leaf extract but lower than that of BHT and BHA.. Key Words : Olive leaf, Total Phenol, BHT, BHA, Antioxidant II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Türkan KEÇELİ MUTLU ya teşekkürlerimi sunarım. Jüri üyesi olarak tezimi değerlendiren değerli hocalarım, sayın Yrd. Doç. Dr. Asiye AKYILDIZ a ve Doç. Dr. Ramazan BİLGİN e teşekkür ederim. Çalışmanın laboratuar aşamasında sorumlu olduğu laboratuarı ve bu laboratuardaki çeşitli alet ve ekipmanları kullanmama izin veren, sayın Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER e ve Prof. Dr. Yeşim AYSAN a teşekkür ederim. Çalışmamın deneme aşamasında olanaklarından yararlandığım Kale Naturel Bitkisel Ürünler Ltd. Şti ye sağladıkları maddi ve manevi yardımlarından dolayı sayın Faruk DURUKAN a teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın her aşamasında yardımını benden hiçbir zaman esirgemeyen Araştırma Görevlileri; İbrahim Başar SAYDAM, Yaşar AKIŞCAN, değerli arkadaşlarım, Mostafa SOLTANI ve Duygu DİNÇER e teşekkür ederim. Hayatımın her döneminde yanımda olan, maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme teşekkür ederim. Maddi ve manevi desteklerinden dolayı Ç.Ü Araştırma Fonu ve Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsüne teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.. I ABSTRACT.. II TEŞEKKÜR..... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ.. VIII KISALTMALAR X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Zeytin Yaprağından Ekstrakt Eldesi Zeytin Yapraklarındaki Fenolik Madde Miktarının Belirlenmesi Zeytin Yapraklarının Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi Zeytin Yapraklarının DPPH Serbest Radikalini Tutma Aktivitesinin Belirlenmesi Zeytin Yapraklarının Yağın Oksidatif Stabilitesine Olan Etkilerinin Belirlenmesi (1). Peroksit Değerinin Belirlenmesi (2). Konjuge Dienlerin Belirlenmesi İstatistiksel Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Zeytin Yapraklarının Toplam Fenol İçeriği Zeytin Yapraklarının Antioksidan Aktivitesi Zeytin Yapraklarının DPPH Radikalini Tutma Aktivitesi Zeytin Yapraklarının Yağın Oksidatif Stabilitesi Üzerine Etkisi. 35 IV

7 5. SONUÇ VE ÖNERİLER.. 43 KAYNAKLAR. 45 ÖZGEÇMİŞ.. 55 V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1 Zeytin Yaprağında Bulunan Fenolik Bileşikler. 9 Çizelge 4.1 Zeytin Yapraklarının Farklı Derim Zamanlarındaki Toplam Fenolik 29 Madde Miktarı(mg/100g) Çizelge 4.2 Zeytin Yapraklarının Farklı Derim Zamanlarındaki EC 50 Değerleri 31 Çizelge 4.3 Zeytin Yapraklarının Farklı Derim Zamanlarındaki ARP Değerleri. 32 Çizelge 4.4 Rafine zeytinyağının 100 ppm zeytin yaprağı, ticari ekstrakt, BHT ve BHA ile zenginleştirilmesi ile elde edilen 21. gün PV değerleri.. 36 Çizelge 4.5 Rafine zeytinyağının 200 ppm zeytin yaprağı, ticari ekstrakt, BHT ve BHA ile zenginleştirilmesi ile elde edilen 21.gün PV değerleri Çizelge 4.6 Rafine zeytinyağının 100 ppm zeytin yaprağı, ticari ekstrakt, BHT ve BHA ile zenginleştirilmesi ile elde edilen 21. Gün % Konjuge dien değerleri.. 38 Çizelge 4.7 Rafine zeytinyağının 200 ppm zeytin yaprağı, ticari ekstrakt, BHT ve BHA ile zenginleştirilmesi ile elde edilen 21. Gün % Konjuge dien değerleri VI

9 VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil.3.1. Zeytin yaprağından ekstrakt eldesi 24 Şekil 4.1. Zeytin yapraklarının toplam fenol içeriğinin hesaplanmasında kullanılan kaffeik asit standart eğrisi 29 Şekil 4.2. Farklı derim zamanlarında Adana Topağı zeytin yaprağından elde edilen % radikal tutma aktivitesi 33 Şekil 4.3. Farklı derim zamanlarında Adana Yerli zeytin yaprağından elde edilen % radikal tutma aktivitesi Şekil 4.4. Farklı derim zamanlarında Domat zeytin yaprağından elde edilen % radikal tutma aktivitesi Şekil 4.5. Farklı derim zamanlarında Gemlik zeytin yaprağından elde edilen % radikal tutma aktivitesi.. 34 VIII

11 IX

12 KISALTMALAR AOCS : Amerikan Yağ Kimyacıları Derneği ARP : Antiradikal Etkinlik BHA : Bütillenmiş Hidroksi Anilin BHT : Bütillenmiş Hidroksi Toluen CAE : Kafeik Asit Eşdeğeri DİE : Devlet İstatistik Enstitüsü DPPH : 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil EC 50 ARP : Başlangıç DPPH Konsantrasyonunu %50 Azaltmak İçin Gereken Antioksidan Miktarı : Antiradikal Etkinlik SPSS : Sosyal Bilimler İçin İstatistik Paketi TGK : Türk Gıda Kodeksi X

13 XI

14 1.GİRİŞ Fulya HARP 1. GİRİŞ Zeytin ağacı, Nisan-Mayıs ayları arasında yeşilimsi-beyaz renkli çiçekler açan, kışın yapraklarını dökmeyen bir ağaçtır. Zeytin ağacı yavaş büyür, tam büyümesi yaklaşık 20 yılı bulur ve ağacın verimi zamanla artar (Ünsal, 2000; Luchetti, 2002). Akdeniz bölgesinde zeytin ağacı sosyal ve ekonomik öneme sahiptir. Akdeniz ülkelerinde yaklaşık 8 milyon hektar alanda yetiştirilen zeytin (dünya zeytin üretiminin % 98 i) tarımsal aktivitelerin en önemlilerinden bir tanesidir (Guinda ve ark., 2004). Ülkemizde 2009 yılı itibariyle 153 milyon zeytin ağacının olduğu bilinmektedir (Anonymous, 2010). Zeytin ağaçları ülkemizdeki tüm tarım alanlarının %2 sini bağ-bahçe tarımına ayrılmış alanın ise %22 sini oluşturmaktadır (Erbay ve İçier, 2008). Dünyadaki zeytin üretimi yıllık 15 milyon ton civarındadır. Dünyadaki üretimin ülkelere göre dağılımı açısından bakıldığında Türkiye son 10 yıldaki 1.3 milyon ton/yıl lık ortalama zeytin üretimiyle dünyadaki toplam üretimin %8 inden fazlasını gerçekleştirmekte ve dünya üretiminde İspanya, İtalya ve Yunanistan dan sonra 4. sırada bulunmaktadır. Bu üretimin 460 bin tonu sofralık, 830 bin tonu yağlık olarak değerlendirilmektedir (Anonymous, 2010). Türkiye de Gemlik, Domat, Memecik, Uslu, Ayvalık (Edremit), Edincik-Su, Kan, Halhalı, Tavşan Yüreği, Çelebi ve Yamalak Sarısı diğer ülkelerde ise Manzanilla, Hojiblanca, Ascolana, Kalamata, Haldiki ve Chemlali önemli zeytin çeşitleridir. Bitkisel ve hayvansal yağların oksidasyon direncini arttırmak için BHT, BHA ve TBHQ (Tri Bütillendirilmiş hidroksikinon) gibi sentetik antioksidanlar gıda katkısı olarak kullanılmaktadır. Ancak, yakın bir zamanda yapılan araştırmalar, bazı sentetik antioksidanların toksik, kanser ve kanserojenik etki gibi pek çok sağlık riskine sahip olduğunu bildirmektedir. Güçlü bir antioksidan olan TBHQ nun Japonya, Kanada, Avrupa da ve ülkemizde gıda katkısı olarak kullanımına izin verilmemektedir. Benzer şekilde BHA da güvenli bileşikler listesinden (GRAS) çıkarılmıştır (Bouaziz ve ark., 2008). Böylece, dünyanın pek çok yerinde bu maddelerin çoğu yasaklanmakta ve yağların stabilitesini geliştirmek ve oksidasyonu önlemek için güvenli alternatif çözümler araştırılmaktadır. Doğal antioksidan kaynaklarının bulunmasına yönelik araştırmalar, bu maddelerin istenmeyen yan 1

15 1.GİRİŞ Fulya HARP etkileri olmaması ve güvenli olması nedeniyle hızla artmakta ve bitkisel ekstraktlar sentetik antioksidanlara karşı doğal alternatif oluşturmaktadırlar (Yanishlieva ve Marinova, 2001; Barreira ve ark., 2008; Bahloul ve ark., 2009; Bouaziz ve ark., 2010; Anonim, 2011). Zeytin yaprağı ekstraktı ile yağların zenginleştirilmesine ve fonksiyonel gıda eldesine yönelik çalışmalar son yıllarda oldukça artmıştır. Aynı zamanda BHT ve BHA gibi geçmişte sık kullanılan, hem antioksidan kapasitesi yüksek ve hem de ucuz sentetik katkıların kanserojen etkilerinin olmasına dönük şüphelerin oluşması da doğal antioksidan katkısı olarak zeytin yapraklarının araştırılmasını hızlandırmıştır (Ranalli ve ark., 2006). Zeytin ağacından ana ürün zeytin ve zeytinyağına ilaveten, zeytinyağı üretimi sırasında zeytin keki (prina), karasu, ince dallar ve yapraklar gibi yan ürünlerde büyük miktarlarda oluşmaktadır. Dolayısıyla, zeytin yaprağı zeytin ağacının bir yan ürünüdür ve zeytinin çırpılarak toplanması, zeytinin budanması ve yağa işlenmesi sırasında (toplam zeytin ağırlığın % 10 u kadar) oldukça yüksek miktarda ortaya çıkar. Yalnızca İspanya da elde edilen zeytin yaprağı 106 milyon tondur. Zeytin yaprakları yüzyıllardır tıbbi amaçla kullanılmıştır. Yazılı tarihte bolluk, görkem ve barışın sembolü olarak sıklıkla adı geçen zeytin ağacının yaprakları, yarışmaların ve savaşların galiplerine taç olarak takılan simgesel bir anlama sahiptir (Guinda ve ark., 2004; Silva ve ark., 2006; Erbay ve İçier, 2008; Boudhrioua ve ark., 2009; Bahloul ve ark., 2009;Castro ve Capote, 2010; Tsimidou ve Papoti, 2010). Zeytin yapraklarından elde edilen DNA zeytin çeşitlerinin ve bunlardan elde edilen yağların ayrımında genetik işaretleyici olarak da kullanılmaktadır (Montealegre ve ark., 2010). Zeytin yaprakları fonksiyonel değere sahip olan biyoaktif bileşenlerin doğal bir kaynağıdır. Zeytin yaprağında bulunan fenol bileşenlerinin pek çoğunun antioksidan, antifungal, antibakteriyel özellikler gibi pek çok biyolojik aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir (Ferreira ve ark., 2007; El ve Karakaya, 2009; Jemai ve ark., 2009; Boudhrioua ve ark., 2009). Zeytin ağacı yan ürünlerinin ekstraktları oksidatif parçalanmaları önleyebilen fenolik bileşikler gibi önemli antioksidanları içermesi nedeniyle kozmetik, tıp, farmasuitik ve gıda endüstrisinde kullanılabilmektedir (Jemai ve ark., 2009; Boudhrioua ve ark., 2009 ; Bouaziz ve 2

16 1.GİRİŞ Fulya HARP ark., 2010). Zeytin yaprakları yüksek bir biyolojik değer katan bir kaynak olarak kullanıldığında sağlıklı, güvenli, ucuz, etkili ve alternatif bir antioksidan kaynağıdır ve gıda ürünlerinin duyusal ve besinsel özelliklerindeki kayıpları önleyerek raf ömrünü uzatma özelliğine sahiptir (Jemai ve ark., 2009; Boudhrioua ve ark., 2009; Bouaziz ve ark., 2010). Zeytin yaprağı ekstraktı sekoroididler, flavanoidler, basit fenoller, fenolik asitler ve terpenoidleri içermektedir (Benavente-Garcia ve ark., 2000; Mourtzinos ve ark., 2007; Chiou ve ark., 2007; Tsimidou ve Papoti, 2010). Antioksidan özelliği nedeniyle zeytin yaprağı ekstraktı direkt veya besin takviyesi olarak kullanıldığında ticari bir öneme sahiptir (Papoti ve Tsimidou., 2009a; Suarez ve ark., 2010). Zeytinyağı üreticisi ülkelerin zeytin yaprağını değişik formlarda ticarileşmesini ve bu ürünün değerlendirilmesini sağlamaları gerekmektedir (Tsimidou ve Papoti, 2010). Bu çalışmada, Gemlik, Domat, Adana Topağı, Adana Yerli çeşitlerinden elde edilen zeytin yapraklarının farklı derim zamanlarında (eylül, ekim, kasım ve aralık aylarında) toplam fenol içeriklerinin ve antioksidan potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Elde edilen ekstraktlar Kale ekstrakt firması tarafından üretilen ticari ekstrakt yanında BHT ve BHA gibi sentetik antioksidanlar ile de karşılaştırılmıştır. 3

17 1.GİRİŞ Fulya HARP 4

18 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Oksidatif ransidite sıklıkla depolama sırasında oluşan yağın en önemli bozulma nedenidir. Lipit oksidasyonu gıdaların rengini, lezzetini, tekstürünü, duyusal nitelikleri ve özellikle besin değeri gibi gıdanın kalitesini olumsuz yönde etkileyen ve istenmeyen ürünlerin oluşmasına yol açan ve ürün raf ömrünü etkileyen bir reaksiyondur (Kıralan ve Bayrak, 2005; Bouaziz ve ark., 2008; Bouaziz ve ark., 2010). Bu reaksiyon, doymamış yağ asitleri arasında onların serbest ya da trigliserit molekülüne bir bileşeni olmasından bağımsız olarak meydana gelmektedir. Yağda bulunan yağ asitlerinin tipi ve özellikle çift bağ sayısı yağının depolanması sırasında meydana gelen kimyasal reaksiyonların tipini ve derecesini belirler. Yağın yağ asidi bileşimi ve sahip olduğu antioksidanlar yağın oksidasyon duyarlığını belirleyen faktörlerdir (Bouaziz ve ark., 2010). Yüksek doymamış yağ asidi içeriğine sahip yağlar oksidasyona daha duyarlıdır. Oksidasyon tepkimeleri sonucu serbest kökler ve reaktif oksijen türleri oluşur. Yapısında çiftlenmemiş elektron bulunduran ve son derece reaktif olan bu moleküller başka moleküllerle kolayca reaksiyona girerek onların yapısını bozmaktadır. Hidroperoksitler birincil oksidasyon ürünleridir ve stabil olmayıp alkanlar, alkoller, aldehitler ve asitler gibi çok düşük konsantrasyonlarda bile kötü kokuya sebep olan çeşitli ikincil ürünlere parçalanırlar. Bu ikincil oksidasyon ürünlerinin çoğu oldukça reaktif olup in vivo koşullarda oksidasyonu başlatabilirler. Bu durum kansere, kalp damar hastalıklarına ve alerjik hastalıklara yol açabilir. Bu nedenlerle lipitlerin iyi bir oksidatif stabiliteye sahip oluşu hem insan sağlığı için çok önemlidir hem de ekonomik öneme sahiptir (Yanishlieva ve Marinova, 2001). Oksidasyon sonrasında yağda meydana gelen değişimler nedeni ile tüketici oksitlenmiş ürünleri tüketmeyi kabul etmez ve bu durum ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Oksidasyon işlemi kaçınılamayan bir işlemdir, ortamda oluşan serbest köklerin ayrılması veya lipit oksidasyonun önlenmesi ve yağın oksidatif stabilitesinin geliştirilmesi ancak ortama endojen antioksidanların ilavesi ile mümkün olabilmektedir (Bouaziz ve ark., 2010). Yağ endüstrisi stabilite problemleri nedeni ile bu konuya özel bir önem vermektedir ve yeni doğal alternatifler araştırılmaktadır (Bouaziz ve ark., 2008). 5

19 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Akdeniz beslenme tarzının insan sağlığı üzerinde yarattığı olumlu etkiler ile ilgili son yıllarda elde edilen bulgular zeytin ağacı ürünlerindeki fenolik maddelerin insan sağlığına nasıl etkilerde bulunduğunun belirlenmesine yönelik araştırmalara yol açmıştır (Erbay ve İçier, 2008). Zeytin yaprağına olan ilgi, özellikle oleuropein ve ilgili bileşiklere atfedilen sayısız yararlı sağlık etkileri neden ile bilimsel ve toplumsal arenada hızla artmaktadır (Goulas ve ark., 2010). Akdeniz diyetinde yer alan zeytinyağı ve zeytin yaprağında bulunan fenol bileşenlerinin etkisiyle bu bölgede kalp damar hastalıklarının görülme sıklığı oldukça azdır (Singh ve ark., 2008; Castillo ve ark., 2010). Modern tıpta ve fitoterapilerde tedavi amaçlı olarak kullanılan zeytin yapraklarının, antihipoglisemik, antihipertansif, antifilamatuvar, antiaterojenik, özelliklere sahip oldukları ve bu durumun potansiyel biyoaktif fenol bileşenlerinden kaynaklandığı belirtilmiştir. Zeytin yaprağından elde edilen ekstraktın kalp damarlarındaki kanın akışını arttırdığı, kanın pıhtılaşmasını düzenlediği, kan dolaşımını rahatlattığı ve bundan dolayı kalp rahatsızlıklarını ve krizlerini önleyici etkiye sahip olduğu aynı zamanda düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) oksidasyonunu engelleyerek kalp-damar hastalıklarının önlenmesinde etkin olduğu ve adrenalin üzerine etki ederek kan basıncını düzenleyici etkisinin olduğu belirlenmiştir (Khayyal ve ark., 2002; Somova ve ark., 2004; Singh ve ark., 2008). Buna ilaveten, zeytin yaprağı ekstraktının bağırsaklardaki ritim bozukluklarını azaltıp kas kasılmalarını önlediği bilinmekte ve tümör nekrosis faktörünü önleyici etkisinden dolayı alerji tedavisinde kullanımı önerilmektedir (Bennavente Garcia ve ark., 2000; Nishibe ve ark., 2001). Zeytin yaprağının diabet üzerine etkileri incelenmiş ve olumlu sonuçlar alınmıştır. Aynı zamanda, zeytin yaprağı ekstraktının akciğer epitelyum hücrelerinde meydana gelen iltihabi hastalıklar sonucu oluşan serbest kökleri önleyici etkisi tespit edilmiş ve tedavide kullanımı önerilmiştir (Zaslaver ve ark., 2005). Zeytin yaprağı ekstraktının toksik etkilerinin belirlenmesi amacıyla da kimi çalışmalar yapılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır. Zeytin yaprağı ekstraktının farelerde akut veya kronik etkileri, farelerin üreme ve hamilelik dönemleri üzerine veya genetik yapılarına etkileri ayrı ayrı incelenmiş ve belirgin hiçbir toksik etki tespit edilememiştir (Christian ve ark., 2004). 6

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Zeytin yaprağının ana bileşeni doğal bir sekoroidid olan oleuropeinin iltihap giderici, damar sertliğini engelleyici ve kanser önleme özelliklerinin yanında, endojen peptidleri bağlama özelliği ile de güçlü bir antioksidan etkiye sahip olduğu belirtilmektedir (Gikas ve ark., 2007). Yakın zamanda fareler üzerinde yapılan çalışmalarda oleuropeinin, antioksidan, kalp hastalıklarını önleyici ve hipolipidemik, hipoglisemik özellikler nedeniyle farmakolojik ve sağlık etkilerine sahip olduğu ve metabolizmada bir modülatör olabileceği bildirilmiştir (Mourtzinos ve ark., 2007; Jemai ve ark., 2009). Oleuropein, BHT ve E vitamininin indirgeyemediği süperoksit anyonlarını indirgeyebilmekte ve bu nedenle tıp, ilaç ve kozmetikle ilgili alanlar yanında, gıda ürünlerinde de kullanılabilecek doğal bir katkı olma potansiyeli taşımaktadır (Ranalli ve ark., 2006). Oleuropeinin kendisi insan vücudunda doğrudan emilemez, ancak sindirim sisteminde parçalandıktan sonra emilebilmektedir. İnsan vücuduna alınan oleuropeinin vücutta tamamen hidroksitirozole ve diğer alt ürünlere metabolize olduğu, insan plazmasında ve dışkısında bulunmadığı bilinmektedir. Oleuropein, hidroksitirozol, elenolik asit, eluropein aglikon ve glikoza hidrolize olmaktadır (Mourtzinos ve ark., 2007; Chiou ve ark., 2007). Bu durum oleuropeinin biyoyararlılığının hidroksitirozol gibi parçalanma ürünlerinin biyoyararlılığına bağlı olduğu anlamına gelmektedir (Soni ve ark., 2006). Hidroksitirozolun insan vücudunda hızlı emildiği, aynı zamanda da hızla vücuttan atıldığı ve doğal bileşen olarak bulunduğu gıdaların alımı ile biyoyararlılığının daha yüksek olduğu belirlenmiştir (Bai ve ark., 1998; Tuck ve ark., 2001; Visioli ve ark., 2003; Christian ve ark., 2004). Hidroksitirozolün oksidasyon tepkimelerinin en önemli tetikleyicilerinden olan süpeoksit anyonu ve hidroksi radikalinin çok güçlü bir bağlayıcısı olduğu bildirilmiştir (Jemai ve ark., 2009). Oleuropeinden hidroksitirozol eldesi için öncelikle oleuropeinin zeytin yaprağından ekstrakte edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla, çözgen olarak metanol-su karışımı ve hegzan kullanılarak zeytin yaprağından fenolik maddelerin ekstraksiyonu yapılmıştır (Savournin ve ark., 2001; Guinda ve ark., 2002). Ancak zeytin yaprağı ekstraktlarının kullanım alanları düşünülünce, metanol ve hegzan gibi toksik maddelerle ekstraksiyon ciddi sorun yaratmakta, işlem süresinin uzunluğu ise hem fenolik maddelerde kimyasal dönüşümlere neden olmakta hem de endüstriyel üretim 7

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP düşünülünce yüksek maliyetlere sebep olmaktadır. Bu nedenle ilk olarak, etanol-su karışımını çözgen olarak kullanmış, dinamik ultrason kullanılarak ekstrakt elde edilmiş ve daha sonra yine etanol-su karışımı kullanılmış mikrodalga desteğiyle ekstrakt elde edilmiş ve son olarak da etanol-su karışımı ve süper kritik sıvı ekstraksiyonuyla zeytin yaprağından ekstrakt elde edilmiştir (Japon-Lujan ve ark., 2006a). Oleuropeinin doğada bilinen en önemli kaynağı zeytin yaprağıdır. Oleuropein zeytin yaprağında bol miktarda sofralık zeytinde ve zeytinyağında ise az miktarda bulunmasına rağmen zeytinin ve yağın acı tadı ve buruk aromasından sorumludur (Silva ve ark., 2007). Zeytin yaprağından oleuropein ekstrakte edilip saflaştırılmış ve 100 g taze yapraktan 6,8 g oleuropein elde edilmiştir. Oleuropeinin basit hidrolizi ve C-18 silika jel kolonunda saflaştırılmasıyla da 100 g taze zeytin yaprağından 2,3 g hidroksitirozol elde edilmiştir (Bouaziz ve Sayadi 2005, Malik ve Bradford, 2006). Böylece, zeytin yaprağında oleuropein miktarı kurumaddede % 6-9 a, olgunlaşmamış ham zeytinde ise %14 e kadar çıkmaktadır (Meirinhos ve ark., 2005; El-Nehir ve Karakaya, 2009). Zeytinyağındaki oleuropein miktarı ise % arasında değişmekte zeytin kara suyundaki miktarı %0.87 olarak belirlenmiştir (Savournin ve ark. 2001). Zeytin yaprağından fenolik maddelerin, sıcak su veya çözgen (alkol/su) kullanılarak yapılan ekstraksiyonlarda mikrodalga ve ultrason uygulamasının birlikte kullanıldığı çalışmalarda, zeytin yaprağında g/kg oleuropein, 0,488-0,737 g/kg verbaskozit, 0,976-1,141 g/kg apigenin -7-glikozit, 0,917-1,079 g/kg luteolin-7- glikozit bulunduğu belirlenmiştir (Japon-Lujan ve Luque, 2006b). Zeytin yaprağı ekstraktında bulunan temel fenolik maddeler sekoroidid benzeri oleuropein, ligstroside, dimetil oleuropein ve oleosiddir. Bunun dışında zeytin yaprağı apigenin, kamferol ve luteolin gibi flavanoidler ile kaffeik asit, tirozol ve hidroksitirozol gibi fenol bileşiklerini ve terpenoidleri içermektedir (Benavente- Garcia ve ark., 2000; Mourtzinos ve ark., 2007; Chiou ve ark., 2007; Tsimidou ve Papoti, 2010.). Çizelge 2.1 de zeytin yaprağında bulunan bazı bileşenler belirtilmiştir (Tsimidou ve Papoti, 2010; Anonim, 2011). 8

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Çizelge 2.1. Zeytin Yaprağında Bulunan Fenolik Bileşikler (Tsimidou ve Papoti, 2010) Basit fenoller, asitler ve diğer bileşikler Sekoiridoidler Hidroksitirosol ve Glikozitler Tirosol ve Glikozitler Benzoik asitler: Gallik, vanilik, sirinik, salisilik, hidroksibenzoik, protokateşik, vanilin Sinamik asitler: Sinamik,kafeik, kumarik, ferulik,klorojenik asitler Homovanilik asit Diğer bileşikler 1 Elenolik asit ve türevleri Dimetiloleuropein 3,4-DHPEA-EDA (3,4-dihidroksifeniletil4- formil-3-formiletil-4-hekzonat) Oleosid Oleuropein Oleuropein Aglikon Oleurosit Ligrosit Ligrosit aglikon Verbaskozit Flavonoidler Diğer biyoaktif bileşikler Apigenin Apigenin 7-O-glukozit Apigenin 4-O-rutinozit Apigenin 7-O-rutinozit Hesperidin Luteolin Luteolin 4 -O-glukozit Luteolin 7-O-glikozit Luteolin 7-O-rutinozit Kuersetin, Kuersitrin Rutin Amyrin β-karoten Eritrodiol Maslinik asit Oleanolik asit β-sitosterol Sgualen Stigmasterol Tokoferol Ursolik asit Uvaol 9

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Zeytin yaprağı ekstraktının toplam fenol bileşenleri içeriği çeşide, coğrafik bölgeye, toplama periyoduna, yaprağın yaşı gibi yaprağa dair özelliklere, kurutma, parçalama ve haşlama veya kaynar suda bekletme gibi ön işlemlere, yöntem ve kullanılan çözgenler gibi ekstraksiyon işlemleri ve ekstraktın konsantre edileceği son hacme bağlı olarak farklılıklar göstermektedir (Jimenez ve ark., 2010; Tsimidou ve Papoti, 2010). Malik ve Bradford, (2006), Tunus da yetiştirilen zeytin yapraklarında ana bileşen oleuropeinin dışında altı farklı flavonoid grubu madde (luteolin 7-o-glukozit, luteolin 7-o-rutinozit, apigenin 7-o-glukozit, rutin, luteolin ve apigenin) daha tanımlamıştır. Mourtzinos ve ark. (2007), oleuropeince zengin zeytin yaprağı ekstraktını β- siklodekstrin ile enkapsüle etmiştir. Bu amaçla sulu ortamda bileşenler karıştırılmış ve sonrasında dondurarak kurutulmuştur. Elde edilen üründe oleuropeinin sıcaklığa ve oksidasyona direncinin arttırıldığı ve sudaki çözünürlüğünün oldukça iyi olduğu gözlemlenmiştir. Bu durum, enkapsüle ürünün kolaylıkla gıda katkısı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bayçin ve ark. (2007), zeytin yaprağından elde edilen oleuropein ve rutinin saflaştırılması üzerine çalışmışlardır. İpek ipliğinin zeytin yaprağı ekstraktlarında bulunan oleuropein ve rutinin saflaştırılması için gelecek vaat eden bir biyomateryal olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Zeytin meyvesi ve yaprağında triterponidler ile stereoller de bulunmaktadır. Triterpenik asitler serbest asit olarak bulunurken, pentasiklik triterpenoller serbest veya yağ asitleriyle esterifiye edilmiş olarak bulunurlar. Zeytin üzerinde yapılan çalışmalarda maslinik asit ve oleanilik asidin esas triterpenler olarak baskın bir şekilde bulunan triterponiodler olduğu bildirilmiştir. Triterpenoidlerin konsantrasyonu ve profili meyvenin gelişim aşamasından etkilenmektedir. Zeytin yaprağının triterpenoid içeriği zeytinden 30 kat daha yüksektir ve oleanan tip triterpenoidler önemli miktarlarda bulunmaktadır (Guinda ve ark., 2010). Somova ve ark. (2003), farklı ülkelerde yetiştirilen zeytin yapraklarında yaptıkları çalışmada zeytin yapraklarının triterpenoidlerce zengin olduğunu belirlemişlerdir. Yunan zeytin yapraklarının %0.71, Cape Town zeytin yapraklarının 10

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP ise %2.47 oranında oleonolik asit içerdiğini bulmuşlardır. Zeytinin yetiştirildiği farklı bölgelerden elde edilen yaprak ekstraktlarının bileşim ve içerik açısından farklılık gösterdiği bildirilmiştir. Guinda ve ark. (2004), zeytinin budanması ve zeytinyağı üretiminde yan ürün olan zeytin yapraklarının değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirmişlerdir. Bu yöntem iki aşamada uygulanmıştır. Birinci aşamada triterpenik asit olan oleonolik asiti basit bir işlemle izole edilmiştir. İkinci aşamada zeytinyağı, ayçiçek yağı ve yüksek oleik asit içerikli ayçiçek yağına ppm oranında sıvı ve katı formda elenolik asit ilave ederek yağların oleonolik asit içeriğini gaz kromatografisi ile araştırmışlardır. Elenolik asitin sıvı veya katı formda yağlara ilave edilmesinin yağların oleonolik asit içeriğini değiştirmediği bulunmuştur. Bu şekilde elenolik asit ilavesi ile hazırlanan yağların fonksiyonel gıda olarak kullanılabileceği bildirilmiştir. Sato ve ark. (2007), zeytin yaprağında bulunan oleonolik asit gibi bazı bileşenlerin kan şekeri seviyesine olan etkisini araştırmışlardır. Oleanolik asit, yüksek yağ içeren bir diyetle beslenen farelerin serum glikozunu ve insülin seviyesini düşürmüş ve glikoz toleransını arttırmıştır. Buna göre araştırıcılar, zeytin yapraklarında bulunan hem oleuropein hem de oleonolik asidin kan şekeri üzerinde etkili olduğunu ve metabolik bozuklukları düzenlemede potansiyel etkinin arttığını bulmuşlardır. Guinda ve ark. (2010) İspanyanın önemli zeytin çeşitlerinden Picual, Hojblanca ve Arbequina zeytin ve yapraklarında bulunan pentasiklik triterpenoidleri ve miktarlarını araştırmışlardır. Zeytin yapraklarının önemli miktarda oleonolik asit (% 3-3.5) ile maslinik asit ve düşük düzeylerde ursolik asit, eritrodiol ve uvaol içerdiğini bulmuşlardır. Çeşitler arasında genetik faktörlere bağlı olarak farklılıklar bulunduğu bildirilmiştir. Zeytin yaprakları ekstraksiyon öncesinde nemi azaltmak ve suyun prosesteki olumsuz etkilerini azaltmak için kurutulması gerekmektedir. Hasat sonrası zeytin yapraklarının yüksek katma değeri uygun olmayan koşullarda bekletildiğinde bozulabilmektedir. Depolama sırasında taze yaprakların raf ömrünü uzatmak için nemin azaltılması gerekir (Boudhirioua ve ark., 2009).Yaprakların hasat sonrası derhal kurutulması daha sonra kalite kayıplarını ve mikrobiyolojik veya 11

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP biyokimyasal reaksiyonlar nedeniyle muhtemel parçalanma reaksiyonlarını önlemek açısından çok önemlidir (Bahloul ve ark., 2009). Zeytin yapraklarının gıda katkısı olarak kullanılması ve içerisindeki önemli maddelerin ekstrakte edilmesi ve depolanması için kurutulmaktadır (Erbay ve İçier 2008). Bahloul ve ark. (2009), terapatik ve antioksidan özelikleri ile bilinen zeytin yapraklarının kuruma zamanı, renk, toplam fenol ve serbest radikal tutma kapasitesi gibi kalite parametreleri üzerine kuruma koşullarının (40, 50 ve 60 ºC sıcaklık, m 3 hava akımı) etkisini incelemişlerdir. Zeytin yapraklarını toplam fenol içeriğinin kuruma koşullarından etkilendiğini ve kuruma zamanına bağlı olarak bu miktarın düşme eğilimi gösterdiği bulunmuştur. Taze zeytin yapraklarının DPPH (2,2 difenil 1-pikri hidrazil) serbest radikalini tutma kapasitesinin kurtulmuş yapraklardan daha yüksek olduğunu ancak 60 ºC de kuruyan yaprakların tutma kapasitesinin nispeten iyi olduğunu bulmuşlardır. Erbay ve İçier. (2009), zeytin yaprağının yaygın bir şekilde endüstriyel olarak kullanımı için kurutma prosesini yüzey alan metodolojisi yöntemi kullanarak optimize etmişlerdir. Zeytin yapraklarının sıcak hava ile kurutma prensibine göre kuruma davranışları belirlenmiş ve modellenmiştir. Buna göre kuruma hızını en çok sıcaklığın etkilediği ve kuruma hızını en iyi ifade eden modelin modifiye Henderson ve Pabis modeli olduğu belirlenmiştir. Boudhirioua ve ark. (2009), 4 farklı taze zeytin yaprağının (Chemlali, Chemchali, Zarrazi, Chetoui) renk, toplam fenol bileşenleri ve kimyasal bileşimlerini (nem, protein, yağ, karbonhidrat, ve kül) belirlemişlerdir. Taze yaprakları daha sonra farklı sıcaklıklarda infrared kurutmaya tabii tutmuşlardır ve aynı parametreleri kuru örneklerde de belirlemişlerdir. Araştırıcılar zeytin yaprağının gıda ve kozmetik endüstrisinde kullanılmadan önce rengini koruması ve yüksek biyolojik değerini muhafaza edebilmesi için infrared kurutmanın etkili bir yöntem olabileceğini belirtmişlerdir. Zeytin yaprağının fenol bileşenlerinin etkili ve önemli bir kaynağı olması nedeniyle ve doğal antioksidan katkısı olarak zeytin yapraklarının toplam fenol içeriği ve antioksidan aktivitesine ilişkin araştırılmalar hızla artmaktadır. DPPH yöntemi meyve suları ve ekstraktların antioksidan aktivitesinin ölçümünde tercih 12

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP edilen hızlı ve doğru bir yöntemdir. Bu yöntemin esası stabil 2,2, Difenil-1- pikrihidroksil kökünü antioksidanların tutma kapasitesini ölçümü esasına dayalıdır. DPPH serbest radikali antioksidanlarla reaksiyona girdiğinde hidrozine indirgenmektedir. Bu işlemde çoğunlukla DPPH in metanol veya etanoldeki çözeltisine antioksidan ilavesi ile oluşan ürünlerin nm de absorbansdaki düşüşü ve renkteki açılma değerlendirilmektedir (Sanchez- Moreno, 2002). Papoti ve Tsimidou (2009b), zeytin, zeytinyağı ve zeytin yaprağının toplam fenol bileşenleri içeriğini Folin-Ciocalteou yöntemine alternatif olarak florometrik yöntem kullanarak tayin etmişlerdir. Flurometrik yöntemin, daha duyarlı oluşu, 3 kat daha hızlı olması, reaktif gerektirmemesi ve en önemlisi elde edilen ekstraktların bileşimine herhangi bir zarar vermemesi ve HPLC ve diğer uygulamalarda kullanılabilmesi avantajları nedeniyle Folin-Ciocalteou yönteminden daha iyi olduğunu bildirmişlerdir. Benavente-Garcia ve ark. (2000), zeytin yaprağındaki flavonoidlerin ABTS radikal katyonunu tutma yeteneklerinin, yapılarındaki fonksiyonel grupların varlığına bağlı olarak değiştiğini belirtmişlerdir. Zeytin yaprağında bulunan flavonoidler ve oleuropeinin ABTS radikal katyonunu tutma yeteneklerinin ise yapılarındaki serbest hidroksil gruplarının sayı ve pozisyonuna göre değiştiğini ve birlikte kullanıldığında sinerjistik etki gösterdiklerini belirlemişlerdir. Bouaziz ve Sayadi (2005), budama sırasında elde edilen Chemlali çeşidi zeytin yaprağının fenol bileşenlerini, kalitatif ve kantitatif olarak belirlemişler ve bu maddelerin antioksidan etkilerini incelemişlerdir. Araştırmacılar, zeytin yaprağı ekstraktı ve saf fenol bileşenlerinin antioksidan etkisini DPPH yöntemi ve β-karotenlinoleat testi kullanarak araştırmışlardır. Hidroksitirozol ve hidrolizat ürünleri en yüksek antioksidan etkiye sahip olmuştur. Hidroksitirozolün doğal bir kaynaktan elde edildiğini ve potansiyel antioksidan olarak yararlı etkilere sahip olduğu için gıda, kozmetik ve farmasuitik ürünlere entegre edilebileceği bildirilmiştir. Aktaş ve ark. (2005), zeytin yaprağını eter, etanol, su kullanarak ekstrakte etmiştir. Demleme yoluyla liyofilizasyon işlemleri sonrasında elde edilen ekstraktların antioksidan özelliklerini ölçerek bilinen antioksidanlar ile karşılaştırmışlardır. Çalışma bulgularına göre eter kullanılarak elde edilen zeytin 13

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP yaprağı ekstraktının toplam antioksidan aktivitesi iyi bilinen antioksidanlardan melatonin (%55.6) ve Gingko Biloba ekstraktından (%55.4) fazla ve BHT (%97.3) ninkine ise oldukça yakın olarak bulunmuştur (%83.6). Eter, etanol, su ve demleme su ekstraktlarının fenolik madde içerikleri sırasıyla 67,5; 23,8; 25,0; 37,5 µg/300 µg kuru özüt olarak bulunmuştur. Farag ve ark. (2006), zeytin yaprağı ve BHT nin fare karaciğer ve böbrekleri üzerindeki etkilerini belirlemek için bir çalışma yapmışlardır. Çalışma sonucunda BHT nin fareler üzerindeki etkisi önemli düzeylerde olurken, zeytin yaprağının farelerde görülebilir hiçbir değişime neden olmadığını belirlemişlerdir. Silva ve ark. (2006), Portekiz de yetiştirilen önemli zeytin çeşidinden zeytin, zeytin yaprağı ve zeytin çekirdeğinin fenol bileşenlerini ve ABTS yöntemi kullanarak antioksidan aktivitesini araştırmışlardır. Zeytin yaprağını taze ve kurutulmuş olarak toplam fenol içeriğini 17 ve 40 g/kg tannik asit olarak belirlemişlerdir. Zeytinlerin antioksidan aktivitesinin yapraklardan daha yüksek olduğu bulunmuştur. Ayrıca zeytin çekirdeklerinin de yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar zeytin çekirdeklerinin de doğal antioksidan kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Giao ve ark. (2007), Portekiz de zeytin yaprağının da içinde olduğu geleneksel olarak kullanılan 48 adet tıbbi bitki çayının toplam fenol içeriği ile toplam antioksidan aktivitesini araştırmışlardır. Bitkilerin toplam fenol içeriği ve antioksidan aktivitesinin değerlendirilmesi için bitkilerin yaprağı veya çiçeği gibi bir kısmı kaynatılmış veya bitkiler öğütülüp toz hale getirildikten sonra demlenerek çayları hazırlanmıştır. Tıbbi bitkilerin hazırlanma yönteminin antioksidanların ekstraksiyon derecesini etkilediği ve bitkiler toz hale getirilip daha sonra demlendiği takdirde toplam fenol içeriği ve antioksidan etkinin en iyi olduğu bulunmuştur. Zeytin yaprağının toplam fenol içeriğinin toz halde hazırlananlarda 274 mg/l, yaprak direk demlendiğinde 7 mg/l ve kaynatıldığında 5 mg/l gallik asit eşdeğeri olduğu bulunmuştur. Tıbbi bitkilerin toplam antioksidan aktivitesi ABTS kullanılarak belirlenmiştir. Toplam antioksidan aktivite toz halde hazırlananlarda g/l, yaprak direk demlendiğinde g/l ve kaynatıldığında g/l gallik asit 14

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP eşdeğeridir. Araştırıcılar toplam antioksidan aktivitenin çok yüksek bir korelasyon katsayısı ile toplam fenol içeriği ile doğrudan ilişkili olduğunu belirtmişlerdir. Papoti ve Tsimidou (2009a), zeytin yaprağının fenol bileşenleri içeriği ile çeşit, yaprak tazeliği ve derim zamanının yaprağın DPPH ve diğer radikalleri bağlama özelliklerine olan etkilerini araştırmışlardır. Zeytin yaprağı ekstraktının tüm yıl boyunca önemli bir radikal bağlama kapasitesinin olduğunu ve bileşenler arasındaki farklılığın ise çeşit veya tazelikten çok derim zamanından kaynakladığını bulmuşlardır. Zeytin yaprağının tazeliğe bağlı olmaksızın antioksidan olarak etkin oluşunun ticari olarak kullanımında oldukça önemli olduğu bildirilmiştir. Goulas ve ark. (2010), oleuropeinin iyi bir kaynağı olarak bilinen polar zeytin yaprağı ekstraktlarının DPPH radikal tutma kapasitesini araştırmışlardır. Zeytin yaprağının çeşit, yaprak tazeliği ve derim zamanının etkisi olmaksızın flavonoidlerin önemli bir kaynağı olduğunu bulmuşlardır. DPPH bağlamada, hidroksitirozol, oleuropein ve ilgili bileşikler ile verbaskosit kadar flavonoidlerden özellikle luteolin- 7-o-glikozitin yaprağın toplam antioksidan kapasitesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Castillo ve ark. (2010), zeytin yaprağı ekstraktının suda çözünür özellikte olduğunu ve metabolizmaya girdikten sonra idrar ile atıldığını bildirmişlerdir. Zeytin yaprağı ekstraktında bol miktarda bulunan oleuropein ve diğer fenollerin sinerjistik etki gösterdiklerini ve ABTS serbest radikaline karşı serbest radikal önleyici özellik göstererek antioksidan etkisi olduğunu bildirmişlerdir. Hayes ve ark. (2010a), zeytin yaprağı ekstraktının antioksidan etkisini lutein, sesamol, ellajik asit ve BHA ile karşılaştırmışlar ve ekstraktın DPPH serbest radikalini tutma kapasitesine ilişkin ARP değerlerinin luteinden daha iyi ancak BHA dan daha az olduğunu bildirmişlerdir. Lee ve Lee (2010), zeytin yaprağı ekstraktının tek başına veya diğer antioksidanlarla kombine karışım halinde kullanarak antioksidan etkilerini araştırmışlardır. Tek tek veya kombine halde hazırlanan zeytin yaprağı ekstraktlarının çok etkili serbest radikal tutma özelliğine sahip olduğunu bulmuşlardır. Böylece zeytin yaprağı ekstraktı fenol bileşenlerinin bir kaynağı olarak önemli bir fonksiyonel gıda bileşeni olma özelliğine sahiptir. Araştırıcılar zeytin 15

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP yaprağı ekstraktının ucuz ve etkili bir fonksiyonel gıda bileşeni olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Zeytin yaprağı ekstraktı ile oleuropein, tirozol, hidroksitirozol, kaffeik asit gallik asit ve luteolin gibi bileşenlerinin virüslere, bakteriler, mayalar, küfler ve diğer parazitlere karşı antimikrobiyel etkilerinin olduğu bilinmektedir. Korukluoglu ve ark. (2006), zeytin yaprağı ekstraktının bazı mayalar üzerine olan antifungal etkilerini incelenmişlerdir. Taze zeytin yaprakları ekstraktları su, etanol, aseton ve etil asetat kullanılarak soksalet düzeneğinde hazırlanmıştır. Bu yaprak ekstraktlarının antifungal etkisi 6 farklı maya üzerinde disk difüzyon yöntemi kullanılarak minimum inhibisyon (MIC) ve minimum fungusidal konsantrasyonlar (MFC) belirlenerek yapılmıştır. Sonuç olarak, test edilen mayaların aseton ve etil asetat kullanılarak hazırlanan zeytin yaprağı ekstraktına duyarlı olduğunu bulmuşlardır. Test edilen mayalar arasında ekstraktlara en dirençli davranan mayanın Saccharomyces cerevisia olduğu bulunmuştur. Araştırıcılar, farklı çözgenler kullanılarak hazırlanan zeytin yaprağı ekstraktının gıdaların bozulmasına yol açan bazı mayalar üzerinde etkili olduğunu ve gıda endüstrisinde bu amaçla kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Zeytin yaprağı ekstraktının hazırlanmasında kullanılan çözgenler, yaprağın çeşidi, derim zamanı, iklimin, yaprak bileşimini etkilediğini ve bunun sonucunda antifungal özelliklerinin etkilendiğini belirtmişlerdir. Zeytin yaprağı ekstraktının doğal bir koruyucu olduğu ve sentetik antimikrobiyel maddelere alternatif olabileceği bildirilmiştir. Sudjana ve ark. (2009), zeytin ağacı yapraklarından elde edilen ticari bir ekstraktın 122 mikroorganizmaya karşı olan antimikrobiyel etkisini araştırmışlardır. Zeytin yaprağı ekstraktının geniş spektrumlu bir antimikrobiyel olmadığını ancak, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni ve Staphylococcus aureus üzerinde önemli antimikrobiyel etkiler gösterdiğini bulmuşlardır. Sonuç olarak, zeytin yaprağı ekstraktının H. Pylori ve C. Jejuni gibi bakterilerin miktarlarını seçici olarak azaltmak yoluyla sindirim sisteminin florasının bileşimini düzenlemede bir rolü olabileceğini bildirmişlerdir. Zeytinyağı, oleik asit başta olmak üzere diğer tekli doymamış yağ asitlerince zengindir. Zeytinyağı yağ asitlerine ek olarak polifenoller ve flavonoidler gibi güçlü 16

30 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP antioksidanları içerir ve zeytinyağı tüketiminin insan sağlığına olan etkileri sıklıkla dile getirilmektedir (Hamdi ve Castellon, 2005; Bouaziz ve ark., 2010). Özellikle zeytinyağı α-tokoferol ve koruyucu etkiyi sinerjistik olarak güçlendiren fenolik maddeler kompleksi sayesinde yüksek bir antioksidan kapasiteye sahiptir. Zeytinyağının toplam fenol bileşikleri miktarı genel olarak mg/kg arasında değişmektedir. Kaliteli bir yağ 200mg/kg ı aşan fenolik madde içeriğine sahip olmalıdır (Tiryaki ve Karaman, 2004). Fenol bileşenleri zeytin ve zeytin ürünlerinde kompleks bir bileşim halinde bulunur, fenolik maddeler önce zeytinde oluşur ve sıkma işlemi sırasında yağ globüllerince bulunan zeytinyağına transfer edilirler (Montedoro ve ark., 1993). Zeytinyağı rafine edilemeden doğal hali ile veya rafine bir ürün olarak tüketilebilir. Günümüzde, elde edilen zeytinyağlarının çok büyük bir kısmının yenilebilmesi için rafine edilmesi gerekir. Ancak rafine zeytinyağı üretimde kullanılan rafinasyon işlemi sırasında fenol bileşenleri kayba uğradığı için bu yağlar fenol bileşenlerin çok düşük miktarlarına sahiptir (Bouaziz ve ark., 2010). Yakın zamanda yapılan çalışmalar rafine zeytinyağlarının fenolik bileşenlerce zenginleştirilmesi gerektiğini göstermiştir. Fenolik bileşenlerin zeytinyağı stabilitesi ve antioksidan aktivitesine olan katkısı yağın diğer bileşenlerinden daha çok araştırılmış ve toplam fenol bileşenleri içeriği ile yağın stabilitesi arasında pozitif bir korelasyon olduğu bildirilmiştir (Bouaziz ve ark., 2010). Zeytin, zeytin yaprağı ve prinadan elde edilen fenolik ekstraktların 100, 200 ve 400 ppm de ve BHT den 200 ppm de ayçiçek yağının oksidatif ransiditesini önlemede test etmişler ve ekstraktların 400 ppm de önemli bir antioksidan aktivite gösterdiğini bildirmişlerdir (Farag ve ark., 2003) Farag ve ark. (2007), kızartma yağlarının dayanımını arttırmak amacıyla ayçiçek yağına 400, 800, 1600 ve 2400 ppm oranında zeytin yaprağı ve 200 ppm oranında BHT katkısı ile zenginleştirmiş ve bu katkıların etkilerini belirlemişlerdir. Sonuçta katkısız ayçiçeği yağı ciddi bir şekilde değişime uğrarken, zeytin yaprağı içeren yağın oksidatif stabilitesinin, BHT içeren yağın oksidatif stabilitesinden daha iyi olduğu bulunmuştur. Salta ve ark. (2007), palm yağı, zeytinyağı ve ayçiçeği yağını 200 mg zeytin yaprağı ile zenginleştirerek oksidatif stabiltesitesini araştırmışlardır. Çalışma 17

31 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP sonucunda zeytin yaprağı ekstraktının hidroksitirozol, kuersetin ve özellikle oleuropein açısından çok önemli bir kaynak olduğu ve yemeklik yağların oksidatif stabilitesini önemli ölçüde arttırdığını bulmuşlardır. Chiou ve ark. (2007), palm yağı, zeytinyağı ve ayçiçek yağını 120 ve 240 mg/kg zeytin yaprağı ekstraktı ilavesiyle zenginleştirmişlerdir. Patateslerin kızartılmasında ev tipi kızartma koşularında zenginleştirilmiş ve kontrol yağlar kullanılmıştır. Zeytin yaprağı ekstraktlarında oleuropeinin baskın olarak bulunduğu (1.25 g/kg zeytin yaprağı) ve ayrıca 14 çeşit polifenol olduğu da saptanmıştır. Oleuropein ve diğer polifenoller zenginleştirilmiş yağlarda saptanabilmiştir. Zenginleştirilmiş yağlar ile tavada yapılan patates kızartması tüketimiyle oluşan polifenol alımının, yağın tipine bağlı olarak ticari zenginleştirilmemiş yağlar kullanılarak elde edilen patates kızartmaları tüketiminden 6 ile 31 kat daha fazla olduğu bulunmuştur. Kızartma sonrası zeytin yaprağı ekstraktı ilave edilmiş kızartma yağlarının doğal antioksidanları olan polifenolleri koruduğu bulunmuştur. Zeytinyağı endüstrisinin potansiyel yan ürünü olan zeytin yapraklarının yaygın bir şekilde tüketilen bitkisel kızartma yağlarına ilavesi ve bu yağlarla kızartılmış gıdalar zeytin ağacının yetiştirildiği yerlerde ekonomik yarar sağlayabilir ve tohum yağları üreten firmalar için zeytin yaprağı ekstraktı ile zenginleştirilmiş yağların sağlık özellikleri nedeniyle fonksiyonel gıda olarak kullanılabileceği bildirilmiştir. Paiva-Martins ve ark. (2007), rafine zeytinyağlarının toplam fenolik madde içeriğini zeytin yaprağı ekstraktı ilavesiyle natürel sızma zeytinyağlarına benzetmeye çalışmışlardır. 1 kg zeytin yaprağından elde edilen ekstrakt katkı olarak kullanıldığında, L rafine zeytinyağının fenolik madde içeriğini natürel sızma zeytinyağlarına benzer hale getirilebilmektedir. Bu şekilde zenginleştirilmiş ürünün tat özellikleri iyileşmekte ve dayanımı arttırılabilmektedir. Japon-Lujan ve Castro (2008), zeytinyağı, ayçiçek yağı ve soya yağını 187, 261 ve 442 mg/ml zeytin yaprağı ekstraktı ilavesiyle zenginleştirmişler ve bu yağların fenol bileşenleri içeriğini incelemişlerdir. Yazarlar bu uygulamanın yağların fenol bileşenleri miktarını önemli ölçüde zenginleştirdiğini ve bunun endüstriyel bir uygulaması olabileceğini belirtmişlerdir. 18

32 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Bouaziz ve ark. (2008), rafine zeytinyağı ve prina yağına 400 ppm zeytin yaprağı ekstraktı ve hidrolizatı katmış ve 6 ay boyunca 50ºC de depolayarak yağın zeytin yaprağı ekstraktıyla zenginleştirilmesinin yağın raf ömrüne olan etkisini incelemişlerdir. Sonuç olarak, zeytin yaprağı ekstraktının yağların raf ömrünü önemli ölçüde iyileştirdiği bulunmuştur. Araştırıcılar gıda endüstrisi için antioksidan olarak zeytin yaprağı ekstraktının büyük bir potansiyeli olduğunu ve bunun yanında zeytin yaprağının gıda ürünlerinin raf ömrünü uzatmada kullanılabileceğini göstermişlerdir. Ayrıca, zeytin yaprağı ekstraktlarının antioksidan olarak çok etkili olduğunu ve sentetik antioksidanlar yerine kullanılabileceği bildirilmiştir. Singh ve ark. (2008), zeytin yaprağı ekstraktlarında bulunan polifenollerin trombosit fonksiyonuna olan etkisini incelemişlerdir. Zeytin yaprağı polifenolleri sigara içmeyen erkeklerde trombosit aktivasyonunu laboratuar ortamında inhibe etmiştir. Zeytin yaprağı ekstraktında aktif olarak bulunan fenol bileşiklerinin sekoroidid grubuna dahil olduğunu ve H 2 O 2 yakalama kapasitesine sahip olduğu bildirilmiştir. Chiou ve ark. (2009), kızartma yağlarından rafine palm yağı, zeytinyağı ve ayçiçek yağını 120 ve 240 mg/kg zeytin yaprağı ekstraktı ilavesiyle zenginleştirmişlerdir. Zenginleştirilmiş kızartma yağlarının zenginleştirilmemiş yağlara göre daha yüksek toplam polifenol, tokoferol, fitosteroller ve skualen içeriğine sahip olduğu ve daha yüksek oksidatif stabilitesi ile antioksidan aktivitesi gösterdiğini bulmuşlardır. Zenginleştirilmiş yağlar ile tavada patates kızartması tüketimiyle tokoferol, fitostrerol ve skualen alımının sırasıyla 1.4, 2.2 ve 1.5 kata kadar arttığı bulunmuştur. Bouaziz ve ark. (2010), rafine zeytin yağı ve prina yağına zeytin yaprağı ekstraktı katarak zenginleştirmişler bu yolla hem yağların kalitesini iyileştirmişler hem de bu yağları sızma zeytinyağına benzetmeye çalışmışlardır. Bu amaçla 400 ppm zeytin yaprağı ekstraktı ilave ettikleri rafine zeytinyağı ve prina yağını 50ºC de hızlandırılmış test koşullarında depolanmış ve yağların depolama stabilitesini araştırmışlardır. Araştırıcılar, zeytin yaprağı ekstraktı fenolik maddelerinin yağın oksidatif stabilitesini geliştirerek bu yağlarda ransiditeyi önlediğini bulmuşlardır. 19

33 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fulya HARP Zeytin yaprağında bulunan doğal antioksidanların gıda endüstrisi için güçlü bir potansiyele sahip olduğu bildirilmiştir. Jimenez ve ark. (2010), arbequina çeşidine ait zeytin yaprağı ekstraktının etanol-su (1:1), su ve süper kritik CO 2 ile ekstrakte ederek hazırlamışlardır. Bu ekstraktların 250 ve 630 mg/kg oranında farklı doymamışlık dercesine sahip soya yağı, kanola yağı ve yüksek oleik asit içerikli ayçiçek yağına ilavesinin yağların oksidatif stabilitesine olan etkilerini incelemişlerdir. Oleuropein ve türevleri etanol su ile ekstra edilen zeytin yaprağı ekstraktının ana bileşenleri olarak tanımlanmıştır. Zeytin yaprağı ekstraktının 630 ppm de yağların oksidatif stabilitesini artırmada daha etkili olduğu ve bu etkinin yüksek oleik asit içerikli ayçiçek yağında daha yüksek olduğu bulunmuştur. Su ile ekstrakte edilen zeytin yaprağı ekstraktının her iki konsantrasyonda da tüm yağlar için prooksidan etki gösterdiği bulunmuştur. Süper kritik CO 2 ile elde edilen ekstraktın ise yağların stabilizasyonunda serbest polifenolleri (daha hidrofilik) içermesi ve bu polifenolerin yağ-hava ara fazında yer alması ile daha etkili antioksidan etki gösterdiği bildirilmiştir. Günümüzde gıda endüstrisi, insan fizyolojik sistemini etkileme yeteneğine sahip biyolojik aktiviteli bileşenleri içeren fonksiyonel gıdaların üretimi için büyük bir çaba sarf etmektedir. Zeytinyağı üretiminde zeytin yapraklarının doğal antioksidan katkısı olarak kullanımı geçmişten beri, özellikle fazla olgunlaşmış zeytinlerden zeytinyağı üretiminde zeytinlerin içerisine %2-3 oranında zeytin yaprağı katılması şeklinde uygulanmaktadır. Bu işlemle zeytin meyvesinde olgunlaştıkça azalan oleuropeinden kaynaklanan son üründeki tat değişiminin önlendiği ve düşen antioksidan direncin arttırıldığı bilinmektedir (Ranalli ve ark., 2006). Allouche ve ark. (2009), İspanyanın önemli bir çeşidi olan Picual çeşidi zeytinyağı üretimi sırasında kırma aşamasından önce zeytin çekirdeği ve zeytin yaprağı ilavesinin yağın triterpenik asit içeriğine ve yağın dayanımına olan etkilerini incelemişlerdir. Araştırmacılar % 2 oranında yaprak ilavesinin yağın oleonolik asit, maslinik asit ve eritrodiol içeriğini önemli derecede arttırdığını ve yerden toplanan zeytinlerden elde edilen yağın kalitesinin düştüğünü bulmuşlardır. Nenadis ve ark. (2010), zeytinyağına % 5, 10 ve 15 zeytin yaprağı ilave ederek hazırladıkları zeytinyağı-zeytin yaprağı karışımlarının bitkisel materyali 20