Akut Lenfoblastik Löseminin Farmakogenetiği

Transkript

1 Akut Lenfoblastik Löseminin Farmakogenetiği Elif ÜNAL İNCE *, Mehmet ERTEM ** Akut Lenfoblastik Löseminin Farmakogenetiği Bir ilacın etkinliğinin ve toksisitesinin kişiden kişiye farklılık gösterdiği yaklaşık 5 yıldır bilinmektedir. Günümüzde farmakogenetik bilimi benzer tedavilere cevapta görülen bu kişisel farklılıkların genetik dayanaklarını araştırmaktadır. İnsan genomunda her nukleotidde görülen farklılıkların (polimorfizmler), özellikle kanser tedavisinde kullanılan ilaçların etki ve yan etki profilleri ve genel tedavi başarısı ile ilişkisi araştırma konusudur. Polimorfizmlerin ilaç metabolizmasındaki rollerinin kesin olarak bilinmesi, her hastaya uygun tedavi ile daha başarılı sonuçlar almaya yardımcı olacaktır. Bugün farmakogenetik çalışmalardan edinilen bilgilerle, kişilerin genetik yapısına göre kişiselleştirilmiş tedaviden en çok yarar görecek hastalık gruplarından birisi çocukluk çağı akut lenfoblastik lösemisidir. Bu alanda yapılan laboratuar ve klinik temelli çalışmalarla özellikle tiopurin Smetiltransferaz enzimi gibi bazı temel kemoterapötik ilaçların metabolizmasında yer alan enzimleri kodlayan genlerdeki polimorfizmlerin klinik etkileri ispatlanmıştır. Fakat bu polimorfizmlerin klinikteki etkileri henüz tam olarak netlik kazanmamıştır. Yakın zamanda, farmakogenetik alanında ve araştırma metod ve teknolojisinde gelişmeler, bu alanda yapılacak daha geniş klinik çalışmalarla, kanser tedavisinin kişiselleşmesi ve böylece daha az toksisite ile daha iyi sonuçların alınması mümkün olacaktır. Anahtar kelimeler: Akut lenfoblastik lösemi, pediatri, farmakogenetik Pharmacogenetics in Acute Lymphoblastic Leukemia The individual differences in the efficacy and toxicity of the medications has been known for almost 50 years. Today pharmacogenetics study the genetic basis of these individual differences in response to medications. The human genome has differences in every 300 to 1500 nucleotides (polymorphism) and the relationship between these polymorphisms and medication efficacy and toxicity profiles as well as the overall treatment responses has been an area of research. Knowing the effect of a certain polymorphism on the drug metabolism may help to prescribe the most effective treatment for the patient. From the knowledge gained from pharmacogenetic studies, the childhood acute lymphoblastic leukemia seems to be a disease that will potentially most benefit from individualized treatment. The clinical and basic research in this field had proven the clinical effects of the polymorfisms in the genes encoding the enzymes which play an important role in the metabolism of mostly used cancer therapeuticslike thiopurine methyltransferase. But further studies are needed to understand the final clinical influence of these polymorphisms. With the advances in research technology and methods in the fileld of pharmacogenetics, individualizing cancer treatment and having better ourcome by enhancing the efficacy and limiting the toxicity will be possible. Key words: Acute lymphoblastic leukemia, pediatrics, pharmacogenetics GENEL BİLGİ Belirli ilaçların etkinliğinin her insanda farklı olduğu yaklaşık 50 yıldır bilinmektedir (1,2). Farmakogenetik bilimi bazı hastalıklarda standart olarak uygulanan benzer tedavilere cevapta görülen kişiler arasındaki farklılıkların genetik dayanaklarını araştırmaktadır (3). Moleküler incelemelerin çok gelişmemiş olduğu ilk zamanlarda bu araştırmalar, bilinen bir fenotipe neden olabilecek muhtemel gen seçilerek sürdürülmüş (fenotipten genotipe) ve bu fenotipin genetik dayanağı moleküler genetik araştırmaların yardımıyla tanımlanmaya çalışılmıştır (4). Bugün ise kişiler arasında sık görülen genetik farklılıklar (polimorfizmler) rahatlıkla tanımlanabilmekte ve farmakogenetik bilimi günümüzde genotipten fenotipe bir yaklaşımla bu polimorfizmlerin fenotipik karşılıklarını araştırmaktadır. Böylece belli kişilerdeki ilaç etkinliğinin farklılığını ve bunun sonucunda uygulanan tedavinin sonuçlarında yaratabileceği farklılıkları ortaya koymaya çalışmaktadır. Kişiler birbirinden ortalama olarak her nükleotidde bir farklılık göstermektedir (5). İnsan genomundaki bu * Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Uz. Dr. ** Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Prof. Dr. 6

2 kişisel farklılıklar hastalık risklerini ve kanser tedavisine yanıtı olumlu veya olumsuz etkileyebilir. Şu anda milyonlarca olan bu kişisel genetik farklılıklardan hangilerinin fonksiyonel olarak önemli olduğunu ve hangilerinin hangi hastalıklarda tedavinin kişisel olarak düzenlenmesinde önem kazanacağı halen çok net olarak bilinmemektedir. Bugün farmakogenetik çalışmalardan edinilen bilgilerle kişilerin genetik yapısına göre kişiselleştirilmiş tedaviden en çok yarar görecek hastalık gruplarından birisi çocukluk çağı akut lenfoblastik lösemisidir (ALL). Çocukluk çağı ALL sinde % 75 hastada sadece kemoterapi ile tam ve kalıcı iyileşme sağlanabilmektedir. Ancak tedavide sıklıkla kullanılan ilaçların çoğunun terapötik aralığı oldukça dar olup ilaca bağlı yan etkiler tamamen tedavi edilebilen bu hastalıkta ne yazık ki önemli mortalite nedenlerindendir. ALL tedavisinde kematerapötik ilaçların doz ve sıklık açısından yoğun olarak kullanılması tedavi başarısı açısından çok önemli bir faktör olmasına karşın ilaca bağlı yan etkiler birçok hastada doz sınırlayıcı olmaktadır. İlaç metabolizması ile ilgili çalışmalardan öğrenildiği kadarıyla birçok antilösemik ilacın sistemik etkinliğinde hastalar arasında belirgin fark vardır. Bu nedenlerle ALL de kür şansını ve antilösemik ilaçların olumsuz etkilerini belirleyen genetik polimorfizmlerin tedavi başarısı açısından çok önemli etkiler oluşturabileceği öngörülebilir. Akut lenfoblastik lösemide blastlardaki edinsel genetik değişikliklerin uzun dönem sağkalıma olan etkisi uzun zamandan beri çok iyi bilinmektedir. Blastlardaki bu edinsel genetik değişikliklere göre tedavinin özelleştirilmesi ALL tedavisinde kabul edilen standart bir uygulama olmuştur (8). Her ne kadar bu edinsel genetik değişikliklerin prognozu ve tedaviye cevabı etkileme mekanizması tam anlaşılamamışsa da, prognozdaki önemleri nedeniyle bu farklılıklara göre tedavi yoğunluğunda azaltma veya artırma yapılmaktadır. Somatik edinsel genetik değişikliklere karşın kalıtsal genetik farklılıkların ALL tedavisine etkileri üzerinde daha az durulmuştur. Kalıtsal genetik farklılıklar ALL deki edinsel genetik değişikliklerin olasılığını veya doğasını da etkileyerek direk veya indirek yollarla blastların intrinsik ilaç hassasiyetini farklılaştırabilirler (3). Şimdiye kadar özellikle çocukluk çağı ALL sinde birçok genetik polimorfizmin tedavi sonuçlarına etkisi araştırılmıştır. Bu yazıda ALL tedavisinde en sık kullanılan kemoterapötik ilaçlar olan 6merkaptopurin, 6thioguanin ve metotreksat metabolizmasında etkili polimorfizmler ile birçok ilacın metabolizmasında yer alan bazı önemli enzimlerdeki genetik farklılıkların (polimorfizm) klinik açıdan önemini araştıran çalışmalar özetlenmeye çalışılmıştır. A. ANTİLÖSEMİK İLAÇLARIN METABOLİZMASINI ETKİLEYEN POLİFORFİZMLER: 1. TİOPURİNLER (6MERKAPTOPURİN VE 6TİOGUANİN): 6merkaptopurin (6MP) ve 6tioguanin (6TG) günümüzde ALL tedavisinin en temel ilaçlarındandır ve ALL tedavi protokollarının hemen hemen hepsinin özellikle idame tedavisinde yer almaktadır. 6MP ve 6TG inaktif ilaçlardır ve hücre içine alındıktan sonra birçok enzimin katalizlediği reaksiyonlarla aktif metabolitleri olan tioguanin nükleotidlerine (TGN) dönüşürler. Sitotoksik aktivitelerini de bu TGN lerin DNA ve RNA yapısına girerek ve denovo purin sentezini bozarak gerçekleştirirler (9). 6MP ve 6TG nin hücre içinde inaktivasyonu ise tiopurin Smetiltransferaz (TPMT) enzimi ile gerçekleşir. Bu ilaçların etkinliği ve toksisitesi için belirleyici olan, hücre içinde 6MP ve 6TG in aktif metabolitlerine dönüşmesi için kullanılan yolak ile tiopurin metiltransferaz (TPMT) ile katalizlenen inaktivasyon yolağı arasındaki dengedir. Tiopurin metiltransferaz aktivitesi tiopurinlerden ne kadarının tioguanin nukleotidlerine dönüşmek 7

3 üzere hücre içerisinde kalacağını ve dolayısı ile sitotoksik aktivite ve toksisitede rol alacağını belirler. TPMT aktivitesinin düşük olması durumunda, yolak inaktif metabolitlerin oluşumundan çok aktif metabolitlerin oluşumu yönüne kayacak ve sonuç olarak ilaç etkinliği ile birlikte toksisitesi de teorik olarak artacaktır. Tiopurin inaktivasyon metabolizmasının önemli enzimlerinden olan TPMT enzim düzeyi, TPMT genindeki polimorfizme bağlı olarak kişiler arasında farklılık göstermektedir. Toplumun % 10 nunda TPMT geninin sadece bir alelinde farklılık olması (heterozigot) nedeniyle TPMT enziminde orta derecede aktivite, 300 insandan 1 inde ise her iki alelinde polimorfik olası nedeniyle TPMT enziminde düşük düzeyde aktivite vardır (1013). Tiopurin metiltransferaz genindeki polimorfizmler tek nokta polimorfizmleridir (SNP) ve vakaların % 90 nından 3 tip SNP sorumludur (TPMT*3A, TPMT*3C ve TPMT*2) (14,15). Bu SNP lerin enzim yıkımında artışa neden olarak düşük TPMT aktivitesi oluşturduğu gösterilmiştir (16). Kişilerde genetik düzeyde tespit edilmiş bu polimorfizmlerin TPMT enzim aktivitesi ile korelasyonunu ilk olarak gösteren Yates ve ark. olmuştur (14). Yaptıkları çalışmada TPMT enzimi ciddi düzeyde düşük olan 6 hastanın tamamı TPMT polimorfizmi için homozigot, orta düzeyde enzim aktivitesi olan 21 hastanın 20 si bu polimorfizm için heterozigot, normal enzim aktivitesi gösteren 21 hastanın hepsi ise yabanıl tip TPMT geni için homozigot bulunmuştur. Bu polimorfizmin tedavi sonuçlarına etkisi, ilaç etkinliği ve toksisite olarak ayrı gruplarda tartışılmıştır: a. Etkinlik Tioguanin nukleotidleri (TGN) 6MP ve 6TG lerin hücre içindeki aktif metabolitleridir. Eritrositlerde bakılan TGN lerinin düşük bulunduğu hastalarda daha sık relaps görüldüğü Lennard ve arkı tarafından 1990 yılında ortaya konmuş ve genetik olarak kodlanmış TPMT enzim aktivitesinin 6MP nin sitotoksisitesine ve ALL tedavi sonuçlarına etkili olabileceği hipotezi ortaya atılmıştır (17). Bunu takiben 6MP doz yoğunluğunun ALL tedavisi alan 182 çocukta tedavi başarısında en kuvvetli belirteç olduğu gösterilmiştir (18). Bu çalışmada orta ve düşük TPMT enzim aktiviteli çocuklarda, normal enzim aktivitesi olanlara kıyasla daha yüksek bir olaysız sağkalım elde edildiği gözlenmiştir (p=0.096). Tiopurin metiltransferaz genotipinin ALL tedavisine erken cevaptaki rolü de başka bir çalışma ile gösterilmiştir (19). Dört haftalık 6MP tedavisi de içeren bir remisyon indüksiyon tedavisi sonrası 78. günde minimal rezidüel hastalık (MRD) değerlendirilmiş ve 2 normal TPMT aleli bulunan hastaların, TPMT gen polimorfizmi açısından heterozigot olanlara göre 2.9 kat daha fazla pozitif MRD riski taşıdığı ortaya konmuştur. Bu polimorfizmin relaps gelişmesine olan etkisi İngiltere, Kanada ve Danimarka da oral 6MP ve metotreksat (MTX) alan hastalarda yapılan çalışmalarda araştırılmıştır. Bu çalışmalarda TPMT enzim fonksiyonu eritrosit TGN konsantrasyonları ile ölçülmüştür. Tiopurinlerin aktif metabolitleri olan TGN lerin konsantrasyonlarının, katabolizmada görevli enzim TPMT nin normal olması durumunda düşük bulunduğu ve ortancadan daha düşük eritrosit TGN konsantrasyonu olan hastalarda daha fazla relaps olduğu bu çalışmalarda gösterilmiştir (2023). b. Toksisite Tiopurin metiltransferaz aktivitesi düşük olan kişiler tiopurinleri katabolize edemezler ve aktive TGN ler çok yüksek oranda birikerek çok ciddi ve hatta ölümcül hematotoksisiteye neden olabilirler. Bu hastalarda 6MP dozlarının konvansiyonel dozların ortalama % ine kadar azaltılması gerekebilmektedir (24,25). Orta düzeyde TPMT aktivitesi olanlar ise hematolojik toksisite için orta risk taşırlar ve toksisiteyi önlemek için tedavi süresince normal enzim aktivitesine sahip olanlara göre daha sıklıkla doz azaltımını gerektirirler. Tiopurin metiltransferaz polimorfizmi için heterozigot olanların 6MP ile doz sınırlayıcı hematotoksisitelerinin arttığını literatürde ilk gösteren Relling ve ark. olmuştur (26). Bu ça 8

4 lışmada, tedavi süresi boyunca 6MP için toplam doz azaltımını TPMT polimorfizmi için homozigot fenotipi olanlarda en yüksek (% 100), heterozigot fenotip hastalarda orta (% 35) ve normal düzeyde TPMT enzimi olanlarda ise en düşük (% 5) bulmuştur (p<0,001). Ayrıca başka bir çalışmada TPMT enzim aktivitesi normal olan hastalar, tüm tedavileri boyunca tüm sürenin % 84 ünde 6MP tam doz olarak kullanırken, bu oran enzim aktivitesi orta olanlarda % 65, enzim aktivitesi düşük olanlarda ise % 7 olarak gösterilmiştir (18). 6tioguanin tedavisi alanlarda TPMT enzim aktivitesinin bu hematolojik toksisiteye ek olarak karaciğerde venooklusif hastalık (VOD) gelişimindeki rolü de Lennard ve ark. tarafından araştırılmıştır. Yapılan bu çalışmada VOD gelişen hastaların TPMT aktivitesi VOD gelişmeyen kontrol grubuna oranla anlamlı şekilde düşük bulunmuştur (27). Ayrıca TPMT enzim eksikliğinin kemoterapi sonrası akut myeloid lösemi (AML) ve radyoterapi sonrası beyin tümörü gibi tedaviye ikincil malignite gelişim riskini arttırdığı da gösterilmiştir (2830). Tedaviye ikincil AML gelişen hastalarda, AML gelişimine kadar geçen süre TPMT aktivitesi daha düşük olan grupta, TPMT aktivitesi yüksek olanlara göre daha kısa bulunmuştur (29). Relling ve ark. radyoterapi sonrası beyin tümörü gelişen 6 hastanın eritrosit TGN lerini % 70. persentil. üzerinde bulmuş ve bunlardan TPMT polimorfizmi saptanan 3 hastanın beyin tümörü riskinin diğerlerine oranla 4.7 kat artmış olduğunu hesaplamıştır (31). Tiopurin metiltransferaz polimorfizm sıklığı Türkiye de de Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Sami Ulus Çocuk Hastanesi ve Orta Doğu Teknik Üniversitesi nin ortak çalışması ile ALL tedavisi alan 106 çocuk hastada çalışılmış ve TPMT polimorfizmi % 0,9 ile İngiliz, Fransız ve İtalyan toplumlarına oranla daha düşük bulunmuştur. Görülen TPMT mutasyonları ise sadece TPMT*3A ve TPMT*3C olmuştur (32). Ancak bu polimorfizmlerin klinik korelasyonu bu çalışma kapsamına alınmamıştır. 2. METOTREKSAT: Metotreksat (MTX) 50 yıldan uzun süredir ALL tedavisinde kullanılan fakat halen en uygun doz ve uygulama şeması tam olarak bilinmeyen önemli bir kemoterapötik ajandır. Birçok çalışma, hücre içi yüksek MTX düzeylerinin ALL tedavisindeki önemini göstermiştir (33,34). Metotreksat indirgenmiş folat taşıyıcısı (reduced folate carrierrfc) tarafından hücre içine alındıktan sonra aktif metabolitleri olan metotreksat poliglutamatlarına (MTXPG) çevrilerek daha etkin duruma gelirler. Folat metabolizması ve MTX yolaklarında çeşitli polimorfizmler tanımlanmıştır. a. İndirgenmiş Folat Taşıyıcısı (Reduced folate carrierrfc) Bu taşıyıcı protein aynı zamanda SLC19A1 olarak da bilinir ve özellikle düşük doz MTX kullanımında hücre içine MTX girişinde rol oynar. İnvitro olarak lösemik blastlardaki RFC ekspresyonu hücrelerin MTX a hassasiyeti ile ilişkili bulunmuştur (35). Düşük doz MTX alan ALL li çocuklarda lösemik blastlarda SLC19A1 in yüksek ekspresyonunun daha iyi tedavi sonuçlarıyla ilişkisi gösterilmiştir (36). SLC19A1 geni 21 nci kromozom üzerinde bulunmaktadır ve edinsel olarak fazladan 21 nci kromozom bulunan hiperdiploid ALL lerde (tüm ALL lerin % 25 i) daha fazla SLC19A1 ekspresyonu ve dolayısıyla daha yüksek intraselüler MTXPG değerleri gözlenmiştir. Bu etki sadece düşük doz MTX kullanımında gösterilmiş, ancak yüksek dozlarda fark görülmemiştir. Bunun nedeni olarak da düşük doz MTX in hücre içine alınmasının yüksek dozlara kıyasla daha çok SLC19A1 ya bağımlı olduğu düşünülmüştür (34,37). Down sendromlu hastalardaki artmış MTX toksisitesinde fazladan olan 21 nci kromozom nedeniyle olan yüksek RFC ekspresyonunun rol oynadığı düşünülmektedir. Bugüne kadar tanımlanan RFC gen polimorfizmlerinden sadece bir tanesi [SLC19A1 9

5 (G80A;Arg>His)] yüksek lösemi relapsı riski ile ilişkili bulunmuştur (38). StJude hastanesinde 204 çocuk ALL hastasında yapılan bu çalışmada G80A;Arg>His polimorfizminin daha düşük olaysız sağkalımla daha kötü prognoza neden olduğu gösterilmiştir. Toksisite açısından bakıldığında ise StJude hastanesinden 53 çocuk ALL hastasında yapılan çalışmada bu polimorfizm artmış tromboz veya nörotoksisite riski ile ilişkili bulunmamıştır (39). b. GamaGlutamil Hidrolaz (GHH) Bu enzim metotreksat aktif metabolitleri olan MTXPG ların yıkım yolağında görev almaktadır. Teorik olarak bu enzimin düzeyinde azalma ile aktif metabolitlerin hücre içerisindeki konsantrasyonlarında ve dolayısıyla etkinlik ve toksisitelerinde artış beklenmektedir. Gamaglutamil hidrolaz enziminde tespit edilmiş olan bir SNP (C452T;Thr>Ile) ALL hücrelerinde MTXPG birikimine ve MTXPG(46) uzun zincirinin yıkımında % 67 azalmaya neden olduğu bulunmuştur (40). Yabanıl tip GGH aleli içeren fazladan kromozom 8 kazanılması da bunu destekler şekilde ALL hücrelerinde daha yüksek GGH aktivitesine neden olmaktadır (41). Bu gözlemlerin klinik çalışmaları devam etmektedir. c. Timidilat Sentaz (TS) Timidilat sentaz folat metabolizmasının pirimidin sentezi yolağında yer alır. Timidilat sentaz deoksiüridilat monofosfattan deoksitimidilat monofosfat oluşumunda rol alır. Bu enzimin inhibisyonu deoksitimidin trifosfat azalmasına, kromozom kırıklarına ve hücre ölümüne neden olmaktadır. Timidilat sentaz, MTX ın hedef enzimlerindendir. Teorik olarak bu enzimin sentezinde artış, MTX direncine neden olabilir. Timidilat sentaz geninde de klinik öneme sahip bir polimorfizm tespit edilmiştir. Enzimin yabanıl tip alel promotorunda 28bp lik 2 kopya (2R) bulunurken bu polimorfizmde 3 kopya (3R) bulunmakta ve bu da daha yüksek protein ekspresyonuna neden olmaktadır (42). Bu polimorfizmin klinik yansıması çocukluk çağı ALL sinde iki çalışma ile değerlendirmiştir. Krajinovic ve ark. (43) 3R alel için homozigot olan hastalarda relaps riskini yabanıl tip aleli olanlara göre 4 kat daha fazla bulmuşken, Lauten ve ark. (44) relaps ile 3R aleli arasında bir ilişki bulamamıştır. Sonuçlar arasındaki bu farklılık ALL hastalarındaki heterojeniteye, çalışma gruplarının küçüklüğüne, metod farklılıklarına ve sonraki çalışmada kullanılan yüksek doz MTX in 3R alelinin prognoza etkisini azaltmış olabileceğine bağlanmıştır (45). Timidilat sentaz genotipinin çocukluk çağı ALL prognozundaki yerinin daha iyi anlaşılabilmesi için daha geniş çaplı araştırmaların yapılması gerekmektedir. d. Metilen Tetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) Metilen tetrahidrofolat redüktaz, folat metabolizması için çok önemli olan 5,10metilentetrahidrofolattan 5metiltetrahidrofolat oluşum reaksiyonunu katalize eder ve MTX ın indirek hedef enzimlerindendir. MTHFR gen polimorfizmleri kişiler arası enzim düzeylerinde farklılık yaratabilmektedir. Şimdiye kadar 2 MTHFR polimorfizmi MTHFR nin azalmış enzimatik aktivitesiyle ilişkili bulunmuştur. Bunlardan en çok çalışılan C677T (valin aminoasidinin alaninin yerini alması) homozigot genotipi toplumun % 1012 sinde görülmektedir ve bu kişilerde enzim aktivitesi normalin % 30 u kadardır. Aynı polimorfizm için heterozigot genotip ise toplumun % 40 ında bulunur ve bu kişiler enzim aktivitesinin % 60 ına sahiptirler. Bir diğer polimorfizm ise A1298C (alanin aminoasdinin glutamatın yerini alması) polimorfizmidir ve bu genetik değişikliğinde düşük MTHFR enzim düzeylerine neden olduğu bilinmektedir (46,47). MTX ın sitotoksik etkisini oluşturmasında hedef enzimlerden olan MTHFR enziminin düzeylerindeki bu kişisel farklılıkların hem ilaç etkinliğini hem de toksisitesini etkileyebileceği düşünülmüştür. Metilen tetrahidrofolat redüktaz enzim aktivitesinin düşüklüğü durumunda yolak, 5,10 metilen tetrahidrofolat için yarışmacı enzim olan TS yönüne kay 10

6 makta ve TS aktivitesini artırmaktadır. Bu enzim de daha önceki bölümde açıklandığı gibi MTX ın hedef enzimlerindendir ve TS aktivitesinin artışı MTX direnci ile sonuçlanmaktadır. Bu da MTX etkinliğinin azalmasıyla sonuçlanmaktadır. Bu alanda ilk geniş kapsamlı çalışmalardan biri Krajinovic ve ark. ı tarafından yayınlanmıştır. MTHFR ve metilen tetrahidrofolat dehidrogenaz (MTHFD1) polimorfizmlerinin tedavi cevabına etkileri DanaFarber Cancer Institute (DFCI) protokolüne göre tedavi gören 201 ALL li çocukta araştırılmış, gerek MTHFR T677A1298 haplotipinde gerekse MTHFD1 A1958 polimorfizminde olaysız sağkalım daha düşük bulunmuştur (48). Her iki genetik değişikliğe de TS 3R polimorfizminin eşlik etmesi durumunda, artmış TS düzeyleri ile beraber, olaysız sağkalımda daha da yüksek derecede bir düşüş gözlenmiştir. Bu çalışmayı takiben bir Children Cancer Group çalışmasında ALL tanılı 520 çocuk hasta değerlendirilmiş ve MTHFR C677T aleli taşıyan hastalarda relaps oranı anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Ayrıca MTHFR polimorfizminin olması 7. gün kemik iliği cevabı gibi diğer relaps belirleyicilerinden daha iyi oranda relaps olasılığını gösterdiği bulunmuştur (49). Bu polimorfizmlerin toksisiteye etkisi de klinik çalışmalarla araştırılmıştır. Metilen tetrahidrofolat redüktaz enzim aktivitesinde azalma ile 5metiltetrahidrofolat havuzu azalmakta ve daha az homosistein metilasyonuna ve daha az oranda DNA metilasyonuna neden olmaktadır. Bu mekanizmanın da MTX toksisitesinde rol oynadığı düşünülmektedir. MTX a bağlı gelişen nörotoksisitenin hiperhomosisteinemiye bağlı olduğu daha önce gösterilmiştir (50). Kishi ve ark. da MTHFR ve RFC farklı genotiplerinin kan ve BOS homosistein düzeyleri ile nörotoksisiteye olan etkilerini araştırmıştır. Her ne kadar yüksek homosistein düzeyleri ile konvülziyonlar arasında ilişki bulunmuşsa da, kan ve BOS homosistein düzeyleri ile sözü edilen genotipler arasında anlamlı bir ilişki gösterilememiştir (39). Bu polimorfizmin toksisiteye etkisi kemik iliği transplantasyon hastalarında verici atak hastalığını (GVHD) önlemek amacıyla kullanılan MTX içinde değerlendirilmiştir. Kronik miyeloid lösemi nedeniyle kemik iliği transplantasyonu uygulanan hastalardan MTHFR polimorfizmi için homozigot olanlarda mukozal toksisite ve engrafman süresi yabanıl tip alel taşıyan hastalara kıyasla anlamlı derecede fazla bulunmuştur (51). Fakat bu çalışmaların aksine Aplenc ve ark. C677T polimorfizminin artmış toksisite veya enfeksiyon ile ilişkini gösterememiştir (49). e. Metilen Tetrahidrofolat Dehidrogenaz (MTHFD1) Metilen tetrahidrofolat dehidrogenaz 10formiltetrahidrofolat, 5,10metenil tetrahidrofolat ve 5,10metilentetrahidrofolat arasındaki birbirine dönüşüm reaksiyonlarını katalizler. Krajinovic ve ark. MTHFR polimorfizmiyle beraber MTHFD1 GØA R653Q polimorfizminin ALL relapsına etkisini araştırmış ve tek değişkenli analizde MTHFD1 polimorfik alelini artmış relaps riski ile ilişkili bulmuştur. Çok değişkenli analizde ise bu artmış relaps riski ancak MTHFD1 polimorfik alelinin TS 3R polimorfizmiyle birlikteliği durumunda anlamlı bulunmuştur (48). f. Dihidrofolat Redüktaz (DHFR) Dihidrofolat redüktaz, dihidrofolatlardan tetrahidrofolat oluşumunu sağlayan enzimdir. Metotreksat aktif metabolitleri olan MTXPG ları bu enzimin yarışmacı inhibitörleridir ve hücre içi tetrahidrofolatları azaltarak sitotoksik etki gösterir. Dihidrofolat redüktaz geninde saptanan bir tek nokta polimorfizmi (DHFR 829T>C) DHFR mrna ekspresyonunda artış ile ilişkili bulunmuştur. DHFRpolimorfizmi için homozigot veya heterozigot olan hastalarda DHFR proteini yabanıl tip genotipi olan hastalara oranla 2 ila 11 kat daha yüksek bulunmuştur (52). Fakat bu polimorfizmin MTX a olan cevapla ilişkisi henüz kesinlik kazanmamıştır. Bir başka çalışmada DHFR enzimi Thücre ALL lerde Bhücre ALL lere kıyasla daha yüksek 11

7 bulunmuş (% 78 e karşın % 47) ve maksimum DHFR enzim düzeylerinin Thücrelerde B hücrelerine kıyasla anlamlı yüksekliği gösterilmiştir (53). Aynı çalışmada relaps olan hastaların 11/14 ünde DHFR proteininin hem T hem de B hücre ALL subgruplarında arada fark olmaksızın yüksek bulunması bu enzimin prognozla ilgili olabileceğini düşündürmüştür. Levy ve ark. ise beklenenin tersine düşük DHFR ekspresyonunu daha kötü olaysız sağkalım ile ilişkili bulmuştur (36). A. DİĞER ENZİMLERDEKİ POLİMORFİZMLER: 1. Siklin D1 (CCND1) Siklin D1 gen ürünü hücre siklusunun G1 fazında hücrelerin progresyonunu düzenleyen önemli enzimlerden birisidir (54). Retinoblastoma proteininin (prb) fosforilasyon ve fonksiyonel inaktivasyonundan sorumludur. CCND1 ekspresyonunda artış prb nin fosforilasyon durumunu etkileyebilir ve böylece transkripsiyonel faktör 2 (E2F) nin yüksek seviyede bulunmasına neden olur (55). Bu da DHFR ve TS gibi belli başlı MTX hedeflerinin E2Fbağımlı transkripsiyonunu artırarak hücrenin MTX a hassasiyetini etkileyebilir (55,56). Son zamanlarda CCND1 A870G polimorfizmi tanımlanmıştır (57). Costea ve ark. bu polimorfizmi 200 ALL tanılı çocukta değerlendirmiş ve bir sorun gelişen (relaps gelişen veya herhangi bir nedenle kaybedilen) gruptaki çocuklarda bu polimorfizm için homozigot sıklığını % 41.2 ve sorun gelişmemiş gruptakilerde ise % 19.3 bulmuştur. Aynı zamanda bu bulguyu destekler şekilde CCND1 A870G genotipi olanlarda 5 yıllık olaysız sağ kalımın daha düşük olduğu gösterilmiştir (58). 2. Glutatyon Stransferaz Enzimleri (GST) Bu enzim ailesindeki enzimler ALL tedavisinde kullanılan kemoterapötiklerin detoksifikasyon yolağında yer almaktadır (59,60). Bu enzim grubunda olan birçok polimorfizmden en çok çalışılanlar GSTM1 ve GSTT1 genlerindeki polimorfizmlerdir ve bu genlerdeki homolog delesyon fenotipik olarak enzim aktivitesinin yokluğuna neden olur (61,62). GSTT1 de polimorfizm steroid kullanılan çocuk ALL hastalarında steroide erken cevap (63) ve düşük relaps riski ile (64) ilişkili bulunmuştur. Buna karşın St. Jude hastanesinde 197 ALL li çocuk hastada yapılan bir çalışmada ne GSTM1 ve ne de GSTT1 polimorfizminin hastalıksız yaşama etkisi gösterilememiş fakat GSTM1 homolog delesyonu olan hastalarda daha az santral sinir sistemi relapsı bulunmuştur (65). Bu çalışmayı destekler şekilde 170 çocuk ALL hastasının çalışıldığı bir CCG çalışmasında da GSTM1 ve GSTT1 protein üretmeyen genotiplerinin yaşam, olaysız sağkalım ve hastalıksız sağkalıma etkisinin olmadığı bildirilmiştir. Farklı olarak bu çalışmada diğer çalışmada gösterilen medüller veya ekstramedüller relaps oranlarında da farklılık da gözlenmemiştir (66). Başka bir farklı sonuç ise Takanashi ve ark. tarafından ALL tanılı Japon çocuklarda gösterilmiştir. Bu çalışmada protein üretmeyen GSTM1 ve GSTT1 genotiplerinde daha yüksek ALL erken relapsı görülmüştür (67). Araştırmalar arasında alınan bu farklı sonuçlar, çalışılan toplumlardaki farklı ALL karakteristikleri veya glutatyon konjugasyonuna bağımlılığı farklı olan tedavi protokollerinin kullanılmış olmasına bağlanmıştır (68). Başka bir GST enzim polimorfizmi olan GSTP1*B, tedavi protokollerinde steroid de kullanılan AfrikalıAmerikalı ALL tanılı çocuklarda daha hızlı etoposid klirensi ile ilişkili bulunmuştur (69). Bu sonuç düşük GST aktivitesi ile daha yüksek steroid teması ve dolayısı ile daha çok steroidindüklenmiş etoposid metabolizması ile tutarlılık göstermektedir. Tedavide steroidin olmaması durumunda bile GSTP1*B homozigot genotipi daha iyi tedavi sonuçları vermiş (70) ve orta ve yüksek riskli ALL hastalarında daha az santral sinir sistemi relapsı 12

8 bildirilmiştir (71). Bunun nedeni de katabolize eden enzim yokluğunda lösemik hücrelerin kemoterapötik ilaçların aktif formlarına daha çok maruz kalmaları olarak düşünülmüştür. 3. Sitokrom P450 Enzimleri (CYP) Sitokrom P450 enzimleri, özellikle de CYP3A altgrubu birçok kemoterapötik ilacın aktivasyonu (epipodofilotoksinler ve siklofosfamid) ve inaktivasyonunda (vinka alkaloidleri) görev almaktadır (72,73). Bu enzimle ilgili birkaç polimorfizmin kliniğe etkisi araştırılmış ve CYP1A1*2A polimorfizmi çocukluk çağı ALL sinde, özellikle de DNA tamir enziminde bir polimorfizmle (hmlh1 ile 219) birlikteliğinde, kötü prognozla ilişkili bulunmuştur (74). CCG1891 çalışmasında da relaps olan 124 hasta ve relaps olmayan 409 hasta CYP polimorfizmleri açısından değerlendirilmiş fakat CYP3A polimorfizminin artmış relaps ile ilişkisi gösterilememiştir (75). Aynı çalışmada yapılan sekonder analizler CYP3A4*1B ve CYP3A5*3 polimorfizmlerinin vinkristin ile görülen periferal nöropatiden koruyucu olabileceğini göstermiştir. SONUÇ Sonuç olarak değişik polimorfizmlerin ALL tedavi sonuçlarına etkisini anlamak üzere yapılan araştırmalarda tutarlı klinik sonuçlar elde edilebilen tek polimorfizm TPMT gen polimorfizmdir ve TPMT homozigot ve heterozigot polimorfizmi varlığında yüksek toksisite ve düşük relaps riski birçok çalışma ile gösterilmiştir. Diğer hiçbir polimorfizmin tedavi sonuçlarına net etkisi kesin olarak gösterilememiştir. Araştırmalar arasında çıkan tutarsız sonuçların nedenleri tedavi protokolleri, hasta sayıları, laboratuar metodları ve veri analiz tekniklerindeki farklılıklar olabilir. Ayrıca her bir polimorfizmin aynı hastada bulunan farklı polimorfizmlerle ve ilaç metabolizmasını etkileyen diğer kişisel faktörlerle etkileşiminin olması polimorfizmlerin tek başlarına değerlendirilmesinde zorluklara neden olmaktadır. Yakın zamanda, farmakogenetik alanında ve araştırma metod ve teknolojisinde gelişmeler, bu alanda yapılacak daha geniş klinik çalışmalarla kanser tedavisinin kişiselleşmesi ve böylece daha az toksisite ile daha iyi sonuçlar alınması mümkün olacaktır. KAYNAKLAR 1. Kalow W. Familial incidence of low pseudocholinesterase level. Lancet 1956; 211: Carson PE, Flanagan CL, Ickes CE, Alving AS. Enzymatic deficiency in primaquinesensitive erythrocytes. Science 1956; 124: Carroll WL, Bhojwani D, Min DJ, Raetz E, Relling M, Davies S, Downing JR, Willman CL, Reed JC. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2003; Evans WE, Relling MV. Pharmacogenomics:translating functional genomics into rational therapeutics. Science 1999; 286: Lander ES, Linton LM, Birren B et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409: Cheok MH, Evans WE. Acute lymphoblastic leukaemia: a model for the pharmacogenomics of cancer therapy. Nat Rev Cancer 2006; 6: Pui CH, Boyett JM, Hughes WT, et al. Human granulocyte colonystimulating factor after induction chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 1997; 336: Pui CH, Evans WE. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 1998; 339: Waters TR, Swann PF. Cytotoxic mechanism of 6thioguanine: hmutsalpha, the human mismatch binding heterodimer, binds to DNA containing S6methylthioguanine. Biochemistry 1997; 36: Weinshilboum RM, Sladek SL. Mercaptopurine pharmacogenetics: monogenic inheritance of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity. Am J Hum Genet 1980; 32: CollieDuguid ES, Pritchard SC, Powrie RH, Sludden J, Collier DA, Li T, McLeod HL. The frequency and distribution of thiopurine methyltransferase alleles in Caucasian and Asian populations. Pharmacogenetics 1999; 9: McLeod HL, Lin JS, Scott EP, Pui CH, Evans WE. Hiopurine methyltransferase activity in American white subjects and black subjects. Clin Pharmacol Ther 1994; 55: Hon YY, Fessing MY, Pui CH, Relling MV, Krynetski EY, Evans WE. Polymorphism of the thiopurine Smethyltransferase gene in AfricanAmericans. Hum Mol Genet 1999; 8:

9 14. Yates CR, Krynetski EY, Loennechen T, Fessing MY, Tai HL, Pui CH, Relling MV, Evans WE. Molecular diagnosis of thiopurine Smethyltransferase deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine intolerance. Ann Intern Med 1997; 126: Otterness D, Szumlanski C, Lennard L, Klemetsdal B, Aarbakke J, ParkHah JO, Iven H, Schmiegelow K, Branum E, O Brien J, Weinshilboum R. Human thiopurine methyltransferase pharmacogenetics: gene sequence polymorphisms. Clin Pharmacol Ther 1997; 62: Tai HL, Krynetski EY, Schuetz EG, Yanishevski Y, Evans WE. Enhanced proteolysis of thiopurine Smethyltransferase (TPMT) encoded by mutant alleles in humans (TPMT*3A, TPMT*2): mechanisms for the genetic polymorphism of TPMT activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94: Lennard L, Lilleyman JS, Van Loon J, Weinshilboum RM. Genetic variation in response to 6mercaptopurine for childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 1990; 336: Relling MV, Hancock ML, Boyett JM, Pui CH, Evans WE. Prognostic importance of 6mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic leukemia. Blood 1999; 93: Stanulla M, Schaeffeler E, Flohr T, Cario G, Schrauder A, Zimmermann M, Welte K, Ludwig WD, Bartram CR, Zanger UM, Eichelbaum M, Schrappe M, Schwab M. Thiopurine methyltransferase (TPMT) genotype and early treatment response to mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA 2005; 293: Lennard L, Lilleyman JS. Are children with lymphoblastic leukaemia given enough 6mercaptopurine? Lancet 1987; 2: Lennard L, Van Loon JA, Lilleyman JS, Weinshilboum RM. Thiopurine pharmacogenetics in leukemia: correlation of erythrocyte thiopurine methyltransferase activity and 6thioguanine nucleotide concentrations. Clin Pharmacol Ther 1987; 41: Schmiegelow K, Schroder H, Gustafsson G, Kristinsson J, Glomstein A, Salmi T, Wranne L. Risk of relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia is related to RBC methotrexate and mercaptopurine metabolites during maintenance chemotherapy. Nordic Society for Pediatric Hematology and Oncology. J Clin Oncol 1995; 13: Koren G, Ferrazini G, Sulh H, Langevin AM, Kapelushnik J, Klein J, Giesbrecht E, Soldin S, Greenberg M. Systemic exposure to mercaptopurine as a prognostic factor in acute lymphocytic leukemia in children. N Engl J Med 1990; 323: Evans WE, Hon YY, Bomgaars L, Coutre S, Holdsworth M, Janco R, Kalwinsky D, Keller F, Khatib Z, Margolin J, Murray J, Quinn J, Ravindranath Y, Ritchey K, Roberts W, Rogers ZR, Schiff D, Steuber C, Tucci F, Kornegay N, Krynetski EY, Relling MV. Preponderance of thiopurine Smethyltransferase deficiency and heterozygosity among patients intolerant to mercaptopurine or azathioprine. J Clin Oncol 2001; 19: Evans WE, Horner M, Chu YQ, Kalwinsky D, Roberts WM. Altered mercaptopurine metabolism, toxic effects, and dosage requirement in a thiopurine methyltransferasedeficient child with acute lymphocytic leukemia. J Pediatr 1991; 119: Relling MV, Hancock ML, Rivera GK, Sandlund JT, Ribeiro RC, Krynetski EY, Pui CH, Evans WE. Mercaptopurine therapy intolerance and heterozygosity at the thiopurine Smethyltransferase gene locus. J Natl Cancer Inst 1999; 91: Lennard L, Richards S, Cartwright CS, Mitchell C, Lilleyman JS, Vora A. UK MRC/NCRI Childhood Leukaemia Working Party. The thiopurine methyltransferase genetic polymorphism is associated with thioguaninerelated venoocclusive disease of the liver in children with acute lymphoblastic leukemia. Clin Pharmacol Ther 2006; 80: Bo J, Schroder H, Kristinsson J, Madsen B, Szumlanski C, Weinshilboum R, Andersen JB, Schmiegelow K. Possible carcinogenic effect of 6mercaptopurine on bone marrow stem cells: relation to thiopurine metabolism. Cancer 1999; 86: Relling MV, Yanishevski Y, Nemec J, Evans WE, Boyett JM, Behm FG, Pui CH. Etoposide and antimetabolite pharmacology in patients who develop secondary acute myeloid leukemia. Leukemia 1998; 12: Evans WE. Thiopurine Smethyltransferase: a genetic polymorphism that affects a small number of drugs in a big way. Pharmacogenetics 2002; 12: Relling MV, Rubnitz JE, Rivera GK, Boyett JM, Hancock ML, Felix CA, Kun LE, Walter AW, Evans WE, Pui CH. High incidence of secondary brain tumours after radiotherapy and antimetabolites. Lancet 1999; 354: Tumer TB, Ulusoy G, Adali O, Sahin G, Gozdasoglu S, Arinc E. The low frequency of defective TPMT alleles in Turkish population: A study on pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Am J Hematol 2007; 82: Gorlick R, Goker E, Trippett T, Steinherz P, Elisseyeff Y, Mazumdar M, Flintoff WF, Bertino JR. Defective transport is a common mechanism of acquired methotrexate resistance in acute lymphocytic leukemia and is associated with decreased reduced folate carrier expression. Blood 1997; 89: Belkov VM, Krynetski EY, Schuetz JD, Yanishevski Y, Masson E, Mathew S, Raimondi S, Pui CH, Relling MV, Evans WE. Reduced folate carrier expression in acute lymphoblastic leukemia: a mechanism for ploidy but not lineage differences in methotrexate accumulation. Blood 1999; 93: Gorlick R, Cole P, Banerjee D, Longo G, Li WW, Hochhauser D, Bertino JR. Mechanisms of methotrexate resistance in acute leukemia. Decreased transport and polyglutamylation. Adv Exp Med Biol 1999; 457: Levy AS, Sather HN, Steinherz PG, Sowers R, La M, Moscow JA, Gaynon PS, Uckun FM, Bertino JR, Gorlick R. Children s Cancer Group Study. Reduced folate carrier and dihydrofolate reductase expression in acute lymphocytic leukemia may predict outcome: a Children s Cancer Group Study. J Pediatr Hematol Oncol 2003; 25: Kager L, Cheok M, Yang W, Zaza G, Cheng Q, Panetta JC, Pui CH, Downing JR, Relling MV, Evans WE. 14

10 Folate pathway gene expression differs in subtypes of acute lymphoblastic leukemia and influences methotrexate pharmacodynamics. J Clin Invest 2005; 115: Laverdiere C, Chiasson S, Costea I, Moghrabi A, Krajinovic M. Polymorphism G80A in the reduced folate carrier gene and its relationship to methotrexate plasma levels and outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: Kishi S, Griener J, Cheng C, Das S, Cook EH, Pei D, Hudson M, Rubnitz J, Sandlund JT, Pui CH, Relling MV. Homocysteine, pharmacogenetics, and neurotoxicity in children with leukemia. J Clin Oncol 2003; 21: Cheng Q, Wu B, Kager L, Panetta JC, Zheng J, Pui CH, Relling MV, Evans WE. A substrate specific functional polymorphism of human gammaglutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics 2004; 14: Cheng Q, Yang W, Raimondi SC, Pui CH, Relling MV, Evans WE. Karyotypic abnormalities create discordance of germline genotype and cancer cell phenotypes. Nat Genet 2005; 37: Kawakami K, Salonga D, Park JM, Danenberg KD, Uetake H, Brabender J, Omura K, Watanabe G, Danenberg PV. Different lengths of a polymorphic repeat sequence in the thymidylate synthase gene affect translational efficiency but not its gene expression. Clin Cancer Res 2001; 7: Krajinovic M, Costea I, Chiasson S. Polymorphism of the thymidylate synthase gene and outcome of acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2002; 359: Lauten M, Asgedom G, Welte K, Schrappe M, Stanulla M. Thymidylate synthase gene polymorphism and its association with relapse in childhood Bcell precursor acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2003; 88: Aplenc R, Lange B. Pharmacogenetic determinants of outcome in acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2004; 125: Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ, den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet 1995; 10: Evans WE. Differing effects of methylenetetrahydrofolate reductase single nucleotide polymorphisms on methotrexate efficacy and toxicity in rheumatoid arthritis. Pharmacogenetics 2002; 12: Krajinovic M, LemieuxBlanchard E, Chiasson S, Primeau M, Costea I, Moghrabi A. Role of polymorphisms in MTHFR and MTHFD1 genes in the outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia.pharmacogenomics J 2004; 4: Aplenc R, Thompson J, Han P, La M, Zhao H, Lange B, Rebbeck T. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and therapy response in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res 2005; 65: Quinn CT, Kamen BA. A biochemical perspective of methotrexate neurotoxicity with insight on nonfolate rescue modalities. J Investig Med 1996; 44: Ulrich CM, Yasui Y, Storb R, Schubert MM, Wagner JL, Bigler J, Ariail KS, Keener CL, Li S, Liu H, Farin FM, Potter JD. Pharmacogenetics of methotrexate: toxicity among marrow transplantation patients varies with the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism. Blood 2001; 98: Goto Y, Yue L, Yokoi A, Nishimura R, Uehara T, Koizumi S, Saikawa Y. A novel singlenucleotide polymorphism in the 3 untranslated region of the human dihydrofolate reductase gene with enhanced expression. Clin Cancer Res 2001; 7: Matherly LH, Taub JW, Wong SC, Simpson PM, Ekizian R, Buck S, Williamson M, Amylon M, Pullen J, Camitta B, Ravindranath Y. Increased frequency of expression of elevated dihydrofolate reductase in Tcell versus Bprecursor acute lymphoblastic leukemia in children. Blood 1997; 90: Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer. II: Cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell 1994; 79: Review. 55. Hochhauser D, Schnieders B, ErcikanAbali E, Gorlick R, MuiseHelmericks R, Li WW, Fan J, Banerjee D, Bertino JR. Effect of cyclin D1 overexpression on drug sensitivity in a human fibrosarcoma cell line. J Natl Cancer Inst 1996; 88: Gorlick R, Goker E, Trippett T, Waltham M, Banerjee D, Bertino JR. Intrinsic and acquired resistance to methotrexate in acute leukemia. N Engl J Med 1996; 335: Hosokawa Y, Tu T, Tahara H, Smith AP, Arnold A. Absence of cyclin D1/PRAD1 point mutations in human breast cancers and parathyroid adenomas and identification of a new cyclin D1 gene polymorphism. Cancer Lett. 1995; 93: Costea I, Moghrabi A, Krajinovic M. The influence of cyclin D1 (CCND1) 870A>G polymorphism and CCND1 thymidylate synthase (TS) genegene interaction on the outcome of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Pharmacogenetics 2003; 13: Salinas AE, Wong MG. Glutathione Stransferasesa review. Curr Med Chem 1999; 6: Tsuchida S, Sato K. Glutathione transferases and cancer. Crit Rev Biochem Mol Biol 1992; 27: Seidegard J, Vorachek WR, Pero RW, Pearson WR. Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on transstilbene oxide are due to a gene deletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85: Pemble S, Schroeder KR, Spencer SR, Meyer DJ, Hallier E, Bolt HM, Ketterer B, Taylor JB. Human glutathione Stransferase theta (GSTT1): cdna cloning and the characterization of a genetic polymorphism. Biochem J 1994; 300: Meissner B, Stanulla M, Ludwig WD, Harbott J, Moricke A, Welte K, Schrappe M. The GSTT1 deletion polymorphism is associated with initial response to glucocorticoids in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2004; 18: Anderer G, Schrappe M, Brechlin AM, Lauten M, Muti P, Welte K, Stanulla M. Polymorphisms within glutathione Stransferase genes and initial response to glucocorticoids in childhood acute lymphoblastic leu 15

11 kaemia. Pharmacogenetics 2000; 10: Chen CL, Liu Q, Pui CH, Rivera GK, Sandlund JT, Ribeiro R, Evans WE, Relling MV. Higher frequency of glutathione Stransferase deletions in black children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 1997; 89: Davies SM, Bhatia S, Ross JA, Kiffmeyer WR, Gaynon PS, Radloff GA, Robison LL, Perentesis JP. Glutathione Stransferase genotypes, genetic susceptibility, and outcome of therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: Takanashi M, Morimoto A, Yagi T, Kuriyama K, Kano G, Imamura T, Hibi S, Todo S, Imashuku S. Impact of glutathione Stransferase gene deletion on early relapse in childhood Bprecursor acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2003; 88: Mehta PA, Davies SM. Pharmacogenetics of acute lymphoblastic leukemia. Curr Opin Hematol 2004; 11: Kishi S, Yang W, Boureau B, Morand S, Das S, Chen P, Cook EH, Rosner GL, Schuetz E, Pui CH, Relling MV. Effects of prednisone and genetic polymorphisms on etoposide disposition in children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2004; 103: Stanulla M, Schrappe M, Brechlin AM, Zimmermann M, Welte K. Polymorphisms within glutathione Stransferase genes (GSTM1, GSTT1, GSTP1) and risk of relapse in childhood Bcell precursor acute lymphoblastic leukemia: a casecontrol study. Blood 2000; 95: Stanulla M, Schaffeler E, Arens S, Rathmann A, Schrauder A, Welte K, Eichelbaum M, Zanger UM, Schrappe M, Schwab M. GSTP1 and MDR1 genotypes and central nervous system relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Int J Hematol 2005; 81: Danesi R, De Braud F, Fogli S, Di Paolo A, Del Tacca M. Pharmacogenetic determinants of anticancer drug activity and toxicity. Trends Pharmacol Sci 2001; 22: Relling MV, Dervieux T. Pharmacogenetics and cancer therapy. Nat Rev Cancer 2001; 1: Krajinovic M, Labuda D, Mathonnet G, Labuda M, Moghrabi A, Champagne J, Sinnett D. Polymorphisms in genes encoding drugs and xenobiotic metabolizing enzymes, DNA repair enzymes, and response to treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. Clin Cancer Res 2002; 8: Aplenc R, Glatfelter W, Han P, Rappaport E, La M, Cnaan A, Blackwood MA, Lange B, Rebbeck T. CYP3A genotypes and treatment response in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 2003; 122:

12 Çocukluk Çağı Lösemilerinde Minimal Kalıntı Hastalık Ebru TUĞRUL SARIBEYOĞLU *, Günter HENZE ** Çocukluk Çağı Lösemilerinde Minimal Kalıntı Hastalık Akut lösemi hastalarında minimal kalıntı hastalığın takibi erken tedavi cevabının değerlendirilmesine ve relapsın saptanmasına olanak sağlamaktadır. Akut lenfoblastik lösemide MRD tayini için antijenreseptör genlerin PCR ile amplifikasyon yöntemi ve akım sitometri kullanılabilirken akut myeloid lösemide günümüzde MRD takibi için sadece akım sitometre kullanılmaktadır. MRD pozitif hastalarda relaps olasılığının arttığının gösterilmesinden sonra bu hastalara daha yoğun tedaviler öneren tedavi protokolleri oluşturulmaya başlanmıştır. MRD sonuçları hematopoetik kök hücre nakli için en uygun zamanın belirlenmesinde de kullanılabilmektedir. MRD erken dönemde negatifleşen hastalarda tedavi yoğunluğunun azaltılması da araştırılmaktadır. MRD ölçümleri ile ilgili yapılan çalışmalarla tedavi yoğunluğu değiştirme kararının verileceği en uygun ölçüm zamanlaması, klinik önemi olan MRD düzeyinin belirlenmesi ve ölçüm için etkin ve maliyeti uygun yöntemin belirlenmesi mümkün olacaktır. MRD takibinin kliniğe kazandırdığı bilgilerin dışında in vivo ilaç direncinin moleküler ve hücresel mekanizmalarının anlaşılmasında da ışık tutacaktır. Lösemide yeni markerların belirlenmesi, nadir hücrelerin ileri teknolojiler ile tespit edilmesi MRD nin rutin monitörize edilmesini, böylece ilaçlara dirençli lösemik hücrelerin özelliklerinin saptanmasını sağlayacaktır. Anahtar kelimeler: Lösemi, çocukluk çağı, minimal kalıntı hastalık Minimal Residual Disease in Childhood Leukemias In patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL), monitoring of minimal residual disease (MRD) offers a way to precisely assess early treatment response and detect relapse. In acute lymphoblastic leukaemia (ALL), the most useful MRD assays are based on polymerase chain reaction (PCR) amplification of antigenreceptor genes, and of flow cytometric detection of abnormal immunophenotypes. The latter is the only MRD assay available for most patients with acute myeloid leukaemia (AML). Because of the strong correlation between MRD levels and risk of relapse, several ongoing regimens include treatment intensification for children wtih higher MRD. Results of MRD studies can be also used to estimate the optimal timing for hematopoeietic stem cell transplantation. Treatment deintensification for patients with early MRD clearance is also being tested. Practical issues in the implementation of MRD assays in clinical studies include determining the most informative time point to study MRD and the levels of MRD that will trigger changes in treatment intensity, as well as the relative cost and informative power of different methodologies. In addition to their direct clinical application, MRD measurements can be used to better unterstand the molecular and cellular mechanisms of drug resistance in vivo. The identification of new markers of leukaemia and the use of increasingly sophisticated technologies for detection of rare cells should further facilitate routine monitoring of MRD and elucidate the features of drugresistant leukaemic cells. Key words: Leukemia, childhood, minimal residual disease Son yıllarda kemoterapi protokollerinin yoğunlaştırılması, daha iyi destek tedavilerinin düzenlenmesi ve kemik iliği transplantasyonu (KİT) yapılan hastalarda sağkalımın artmasıyla pediatrik akut lenfoblastik lösemi (ALL) hastalarının yaklaşık % 80 inde uzun dönem hastalıksız sağkalım mümkün olmaktadır (1). Tüm bu başarılı sonuçlara rağmen ALL de erken relaps yapan ve bu nedenle tedavi edilemeyen % 20 lik bir hasta grubu vardır. Günümüzde özellikle bu hasta grubunun belirlenmesi, bu hasta grubuna yönelik daha yoğun tedavilerin planlanması pediatrik hematoloji çalışmalarının büyük kısmını oluşturmaktadır. Pediatrik lösemilerde hastanın remisyona girmesi prognozu etkileyen en önemli bağım * İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Çocuk Hematoloji Onkoloji Bilim Dalı, Uzm. Dr. **Berlin Charite Üniversitesi, Virschow Kampüsü, Çocuk HematolojiOnkoloji Bölümü, Prof. Dr. 17

13 sız risk faktörüdür. İster akut lenfoblastik lösemi (ALL) ister akut nonlenfoblastik lösemi (ANLL) olsun, indüksiyon tedavisi ile remisyona girmeyen tüm hastalarda prognoz çok kötüdür. Remisyon sitomorfolojik olarak kemikiliğinde (K.İ.) % 5 den az blast saptanması durumudur. Ancak sitomorfolojik remisyondaki hastalarda bile K.İ nde 1x10 10 blast yükü olabildiği gösterilmiştir (2). Bu nedenle moleküler teknikler kullanılarak sitomorfolojik olarak tanınamayan K.İ. ndeki kalıntı malign hücrelerin belirlenmesi günümüzde çok popüler bir konudur. Minimal kalıntı hastalığın (minimal residual diseasemrd) saptanması ile sitomorfolojik olarak K.İ. nde saptanamayan ama varolan ve relapstan sorumlu olan blast yükünü tanımlamak mümkün olmuştur. Ancak bu bilginin kliniğe ve tedavi protokollerine ne şekilde yansıyacağı halen tartışmalıdır. MRD ölçümünün çok zaman alıcı ve pahalı yöntemler gerektirmesi, standardizasyonunun zor olması yanında değişik tedavi protokolleri ile tedavi edilmekte olan hastalarda MRD ölçümlerinin hangi zamanlarda ve ne sıklıkla yapılacağı, hangi ölçümün klinik öneminin daha fazla olduğu, MRD negatif hastalarda tedavinin azaltılması ve/veya MRD pozitif hastalarda tedavinin yoğunlaştırılması gibi çözüm bekleyen pek çok konu vardır. MRD belirleme yöntemleri B ve T hücrelerinin erken diferansiyasyonu esnasında, immunglobulin (Ig) ve T hücre reseptör (TCR) lerinin germline segmentlerinde (variable [V], diversity [D], ve joining [J]) rearanjmanlar olur. Böylece her lenfosit, Ig ve TCR moleküllerinin değişken bölgelerini kodlayan kendine özgü bir VDJ kombinasyonundan oluşan gen segmentine sahip olur. Nukleotidlerin V, D, J gen segmentlerindeki bağlanma bölgelerinde rastlantısal insersiyonu veya delesyonu sonucu her lenfositte sadece o lenfosite özgü Ig ve TCR birleşme bölgeleri meydana gelir. Lösemi klonal bir hastalık olduğundan prensip olarak bir hastadaki tüm blast hücreleri aynı Ig ve TCR rearanjman bölgelerine sahiptirler ve bu bölgeler sanki bu hücrelerin parmak izi gibidir. Tanı anında blastlardaki nukleotid sekanslarının tanımlanması ile her hastaya özgü lösemik hücrelerin parmak izi çıkartılmış olur. Bu yöntemle hem lösemi spesifik kromozomal aberasyonların kırılma bölgeleri hem de Ig ve TCR gen rearanjmanları tespit edilir. PCR yöntemleri ile normal hücrede 1 malign hücreyi tanıyacak duyarlılığa ulaşılmaktadır (1,3,4,5). Tanı anında saptanan rearanjmanlar tedavi izlemi sırasında alınan örnekler için hedef sekanslar olarak kullanılırlar. Böylece lösemik klona ait parmak izleri aranarak minimal hastalığın izi sürülür (1). Her hastaya özgü rearanjmanların belirlenmesi ve tedavi boyunca izlenmeleri için hücre kültürü sistemleri, floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri, Southern blotting, immunfenotipleme, akım sitometrisi ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri ve kombinasyonları kullanılır. MRD izleminde en can alıcı nokta klonal rearanjmanların tedavi sürecinde klonal stabilitelerini koruyup korumamalarıdır. Stabil olmayan klonlar söz konusu olduğunda yanlış negatif MRD bulma olasılığı yükselmektedir. Bu nedenle en az iki primer ile MRD tayini yapılmalıdır (2). 18

14 ALL hastalarında kullanılabilecek, tüm ALL lerde sık görülen, yanlış negatif sonuç oranını en aza indirecek çeşitli PCR primer ları geliştirilmiştir (2). RQPCR analizinin duyarlılığı rearanjmanının tipine, birleşme bölgesinin büyüklüğüne ve DNA miktarına göre değişkenlik gösterir. MRD tayininde akım sitometrisi de kullanılabilmektedir. Akım sitometrisi yönteminde malign hücreler tarafından eksprese edilen immunofenotipik kombinasyonlar aranmaktadır. Malign hücreler florokromlarla işaretlenmiş spesifik monoklonal antikorlar ile inkübe edildikten sonra sitometre aracılığıyla sayılmaktadırlar. Bu yöntem ile 10 4 normal hücrede 1 malign hücreye kadar duyarlılıkla sayım yapılabilmektedir. Akım sitometrisi ile PCR yöntemlerini karşılaştıran çalışmalar iki yöntem arasında özgüllük ve duyarlılık açısından büyük fark olmadığını, bu konuda merkezin deneyiminin çok önemli bir kriter olduğunu göstermektedir (1,6,7,8). Akım sitometrisi daha ucuz ve daha az zaman alıcı bir yöntem olmakla birlikte standardizasyonu büyük bir sorun oluşturmaktadır. Özellikle çok merkezli çalışmalarda sonuçlar merkezin deneyimine göre değişkenlik gösterdiğinden akım sitometrisi yönteminin daha kesin standardizasyon basamaklarına ihtiyacı olduğu öngörülmektedir (1,6,7,8,9). MRD ölçümünde standardizasyon en önemli sorundur. Yapılan multisentrik çalışmalarda tüm laboratuarların aynı özgüllük ve duyarlılıkla çalışabilmesi için yöntemlerin standardizasyonu her aşamada kontrol edilmelidir yılında kurulan Avrupa MRD çalışma grubunda (ESGMRDALL) Avrupa, Avustralya ve Singapurdan 30 dan fazla merkez bulunmaktadır. Bu laboratuarlar kalite kontrolü amacıyla yılda 2 kez birbirlerinin örneklerinin kör olarak çalışmakta, bir araya gelmekte ve sonuçlarını toplu olarak değerlendirmektedirler. Bir çok çalışma ALL de tedavi yanıtının belirlenmesinde en duyarlı yöntemin MRD olduğunu göstermiştir. Ayrıca tedavi yanıtı prognoz ile direkt ilişkili olduğundan prognozun belirlenmesinde de çok yardımcı bir yöntemdir (4,10). Remisyon indüksiyonunun herhangi bir fazında 10 2 blastı olan hastalarda relaps riski çok fazladır, bu hastalarda erken dönemde transplantasyon gündeme gelmelidir (4). Sorun <10 2 blastı olan hastalardır, çünkü bu gruptaki hastalarda sağkalımı arttırmak için yapılması gereken tedavi seçeneği (tedavi yoğunluğunun arttırılması, tedavi süresinin uzatılması, transplantasyon) halen tartışmalıdır. Bir çok çalışma çocukluk çağı ALL sinde MRD nin prognostik öneminin olduğunu kanıtlamıştır. IBFM çalışma grubunun çalışmasında hastalar 33. ve 78. günkü MRD sonuçlarına göre 3 risk grubuna ayrılmışlardır. MRD cut off değeri olarak <10 3 kullanılmıştır. Hastaların yaklaşık % 45 i hem 33. hem de 78. günde MRD negatif olduklarından (<10 3 ) düşük risk grubuna girmişlerdir ve bu grup hastalarda 5 yıllık relaps riski % 2 olarak saptanmıştır. Hastaların yaklaşık % 15 inde her iki ölçümde de MRD 10 3 saptanmış ve yüksek risk grubuna alınan bu hastalarda 5 yıllık relaps oranı % 80 bulunmuştur. Bu sonuçlar ışığında halen yürümekte olan AIEOP/BFM ALL 2000 ve DCOG ALL 10 protokollerinde MRD, risk stratifikasyonunda kullanılmaya başlanmıştır (5). ALL de 15. gündeki ve indüksiyon sonundaki MRD ölçümlerinin in vitro prednizolon duyarlılığının da bir göstergesi olduğu saptanmıştır, ancak bu durum vinkristin ve daunorubisin 19

15 için kanıtlanamamıştır (11). Ayrıca MRD, T ALL ve prekürsör B ALL de tedavi yanıtındaki farklılıkları da göstermektedir (12). Böylelikle T ALL ve pre B ALL de kişiye özel tedavi protokollerinin uygulaması da gündeme gelmektedir (13). Erken relaps yapan ALL hastalarında KİT yapılmaksızın sağkalım çok kötüdür. Bu gruptaki hastalarda MRD sonucu ne olursa olsun nakil önerilmektedir (14,15). ALL REZ BFM çalışma grubu orta risk grubundaki (S2) hastalarda 36. günde bakılan MRD değerinin prognoz ile direkt ilişkisini gösterdiğinden halen yürümekte olan ALL REZ BFM 2002 protokolünde MRD risk stratifikasyonunda ve KİT kararı alınmasında MRD rutin olarak kullanılmaktadır (14). İlginç olarak St Jude ve BFM çalışma gruplarının verdiği sonuçlara göre relaps ALL vakalarında uygulanan protokolden bağımsız olarak MRD prognoz hakkında önemli bilgi vermektedir (16). İzole ekstramedüller relapslarda MRD nin yeri ise halen tartışmalı bir konudur. Çünkü bu hasta grubunda baştaki K.İ tutulumu MRD teknikleri ile bile tanımlanamayabilir. Beyin omurilik sıvısından elde edilen örneklerdeki işaretleyicilerin tedavi sırasında stabilitelerini koruyup koruyamadıkları ve K.İ. relapsını izlemedeki etkinlikleri de henüz kanıtlanmamış bir durumdur (17,18). Hem ALL de hem AML de KİT sonrası MRD tayinleri relapsın erken belirlenmesinde faydalı olabilirler. Ancak sıklıkla nakil sonrası MRD pozitifliği belirlendikten sonraki ilk 8 haftada sitomorfolojik relaps da ortaya çıkmakta olduğundan relapsı erken belirlemenin klinik önemi tartışmalıdır. Bazı çalışmalar postransplant dönemde MRD pozitifliği belirlenir belirlenmez immunsupresyonun azaltılarak graft versus lösemi etkisinin arttırılmasını, donor lenfosit infüzyonu uygulanmasını veya retransplantasyon yapılmasını önermektedirler, ancak bu konuda veri çok azdır (19,20,21,22). Nakil öncesi bakılan MRD nin prognostik önemi ise bir çok çalışmada kanıtlanmıştır. MRD negatifleşmişken nakil yapılan hastalarda sağkalım belirgin olarak daha iyidir (23,24). Nakil öncesi MRD pozitif hastalarda prognozun kötü olması, postransplant kurtarma rejimlerinin çok etkin olmaması nedeni ile nakil öncesi MRD pozitif hastalara nakil işlemi gerçekleşmeden ek tedavilerin verilmesi de gündeme gelebilir (25). Ayrıca standart riskli ALL relaps hastalarında MRD negatif alt gruba nakil gerekliliğinin olmadığı da kanıtlanmıştır (14). AML de MRD nin klinik önemi halen tartışmalıdır. Özellikle MRD ölçümü için en uygun zaman ve en etkin primer en çok tartışılan konudur. AMLBFM çalışma grubunun yaptığı çalışmada MRD tayininin bilinen diğer AML risk faktörleri ile birlikte değerlendirildiğinde klinik gidiş için ek bir bilgi vermediği, ancak 28. gün remisyonun kalitesini belirlemede faydalı olabileceği sonucuna varılmıştır (26). Yüksek risk AML hastalarında çoğu protokol KİT önermektedir. Standart risk grubu hasta 20

16 ların yaklaşık % 50 si ise nakil yapılmaksızın uzun dönem yaşam şansı elde etmektedirler. Bu nedenle özellikle standart risk hastalarda nakil ihtiyacı olacakların belirlenmesinde MRD faydalı bir yöntem olabilir (27,28). AML de relaps göstergesi olarak MRD uygulamasında karşılaşılan en büyük sorun AML blastlarının tedavi sırasında ve/veya relaps anında çok fazla antijenik değişikliğe uğramalarıdır. Bu nedenle relaps AML vakalarında başlangışta belirlenenden farklı hedefler seçilmesi gerekli olabilir (29). MRD tayini tüm pediatrik lösemilerde araştırılmaya değer bir konu olarak kalmaktadır. MRD tekniklerinin standardize edilmesi, MRD sonuçlarına göre yapılan protokollerin sonuçlarının elde edilmesi ile yakın gelecekte lösemi tedavisinde kişiye göre tasarlanmış kemoterapi rejimlerinin gündeme gelmesi mümkün olacaktır. KAYNAKLAR 1. Jolkowska J, Derwich K, Dawidowska M. Methods of minimal residual disease (MRD) detection in childhood haematological malignancies. J Appl Genet 2007; 48: Cazzaniga G, Gaipa G, Rossi V et al. Monitoring of minimal residual disease in leukemia, advantages and pitfalls. Ann Med 2006; 38: Faderl S, Kurzrock R, Estrov Z. Minimal residual disease in hematologic disorders. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: Cazzaniga G, d Aniello E, Corral L et al. Results of minimal residual disease (MRD) evaluation and MRDbased treatment stratification in childhood ALL. Best Pract Res Clin Haematol 2003; 15: Van der Velden VHJ, PanzerGrimayer ER, Cazzaniga G, et al. Optimization of PCR based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multicenter setting. Leukemia 2007; 21: Campana D, CoustanSmith E. Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry 1999; 15: Kerst G, Kreyenberg H, Roth C et al. Concurrent detection of MRD in childhood acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry and real time PCR. Br J Hematol 2000; 128: Neale GA, CoustanSmith E, Stow P et al. Comparative analysis of flow cytometry and polymerase chain reaction for the detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2004; 18: Von Stackelberg A, Seeger K, Henze G. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18: Flohr T, Schrauder A, Cazzaniga G et al. Minimal residual diseasedirected risk stratification using realtime quantitative PCR analysis of immunoglobulin and Tcell receptor gene rearrangements in the international multicenter trial AIEOPBFM ALL 2000 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2008; 31 [Epub ahead of print]. 11. Schmiegelow K, Nyvold C, Seyfarth J et al. Postinduction residual leukemia in childhood acute lymphoblastic leukemia quantified by PCR correlates with in vitro prednisolone resistance. Leukemia 2001; 15: Szczepanski T, Orfao A, van der Velden VHJ et al. Minimal residual disease in leukemia patients. The Lancet Oncology 2001; 2: Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K et al. Detection of minimal residual disease identifies differences in treatment response between T ALL and precursor B ALL. Blood 2002; 99: Eckert C, Biondi A, Seeger K et al. Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Lancet 2001; 358: CoustanSmith E, Gajjar A, Hijiya N et al. Clinical significance of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18: Von Stackelberg A, Seeger K, Henze G. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18: Henze G, von Stackelberg A. Treatment of relapsed acute lymphoblastic leukemia. In: Pui CH (ed). Treatment of acute leukemias. New directions for clinical research. Totova, USA:Humana Pres 2002: Goulden N, Langlands K, Steward C et al. PCR assessment of bone marrow status in isolated extramedullary relapse of childhood B precursor acute lymphoblastic leukemia. Br J Haematol 1994; 87: Knechtli CJ, Goulden NJ, Hancock JP et al. Minimal residual disease status before allogeneic bone marrow transplantation is an important determinant of successful outcome for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia. Blood 19981; 92: Tamura K, Kanazawa T, Suzuki M et al. Successful rapid discontinuation of immunosuppressive therapy at molecular relapse after allogeneic bone marrow transplantation in a pediatric patient with myelodysplastic syndrome. Am J Hematol 2006; 81: Schilham M.W, Balduzzi A, Bader P. On behalf of the PDWP of the EBMT. Is there a role for minimal residual 21

17 disease levels in the treatment of ALL patients who receive allogeneic stem cells? Bone Marrow Transplant. 2005; 35: Izraeli S, Waldman D. Minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: current status and challenges. Acta Haematol 2004; 112: Goulden NJ, Bader P, van der Velden V et al. On behalf of the ESG on MRD. MRD prior to allogeneic SCT. Br J Hematol 2003; 122: Sramkova L, Muzikova K, Fronkova E et al. Detectable minimal residual disease before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation predicts extremely poor prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia Pediatr Blood Cancer 2007; 48: Bader P, Hancock J, Kreyenberg H et al. Minimal residual disease status prior to allogeneic stem cell transplantation is a powerful predictor for posttransplant outcome in children with ALL. Leukemia 2002; 16: Langebrake C, Creutzig U, Dworzak M et al. Residual disease monitoring in childhodd acute myeloid leukemia by multiparameter flow cytometry: The MRD AML BFM Study Group. J Clin Oncol 2006; 24: Goulden N, Virgo P, Grimwalde D et al. Minimal residual disease directed therapy for childhood acute myeloid leukemia; the time is now. Br J Hematol 2006; 134: Sievers EL, Lange BJ, Alonzo TA et al. Immunophenotypic evidence of leukemia after induction therapy predicts relapse:results from a prospective Children s Cancer Group study of 252 patients with acute myeloid leukemia. Blood 2003; 101: Langebrake C, Brinkmann I, TeiglerSchlegel A. Immunophenotypic differences between diagnosis and relapse in childhood AML: Implications for MRD monitoring. Cytometry B Clin Cytom 2005; 63:19. 22

18 BetaTalasemi Taşıyıcılarında BetaGlobin Gen Mutasyon Tipi ve Hematolojik Fenotip Arasındaki İlişki Sevilay ÖNEY *, Zeynep ÖZTÜRK **, Alphan KÜPESİZ ***, İbrahim KESER ****, M. Akif YEŞİLİPEK ***** BetaTalasemi Taşıyıcılarında BetaGlobin Gen Mutasyon Tipi ve Hematolojik Fenotip Arasındaki İlişki Amaç: BBu çalışma betatalasemi taşıyıcılarında belirlenen mutasyon tipinin hematolojik parametreler üzerine olan etkisini belirlemek amacıyla yapıldı. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi tarafından takip edilen, taşıyıcılıkları HPLC ile belirlenen, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Moleküler Genetik Laboratuvarında RDBH ve DNA dizi analizi ile mutasyonları tanımlanan 84 heterozigot talasemi taşıyıcısı (36 erkek ve 48 kadın) araştırmaya alındı. Sonuçlar: Çalışılan 84 bireyin mutasyon tipleri IVS I110 (G A), IVS II745 (C G), IVS I1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I6 (T C), IVS II1 (G A), Cod 5 (CT), Cod 8 (AA) ve Cod 44 (C) olarak belirlendi. Olguların 45 inde b + mutasyonu (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 745) ve 39 unda ise b 0 mutasyonu (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1) saptandı. b + grubunda hematokrit değeri daha yüksek bulundu (p=0,042). Hb F ve Hb A 2 değerlerinin ise b 0 grubunda daha yüksek olduğu görüldü (sırası ile p=0.044 ve p=0.001). IVS I6 mutasyonu taşıyan bireylerde hem Hb F hem de Hb A 2 düzeylerinin, diğer mutasyon tiplerine göre istatistiksel olarak farklı olduğu bulundu. Sonuç olarak, betaglobin gen mutasyonlarını heterozigot taşıyan bireylerde, Hb A2 ve Hb F düzeyleri bireyin mutasyon tipine göre değişmektedir. Literatürde % 014 arasında bildirilen Hb F düzeyi bizim çalışmamızda % 08.9 olarak bulunmuştur. Sonuçta betatalasemi taşıyıcılığında genotipin hematolojik fenotip üzerine etkili olduğu, daha fazla olgunun çalışılması ile toplumumuza yönelik elde edilecek verilerin klinik bakımdan önemli olduğu düşüncesindeyiz. Anahtar kelimeler: Betatalasemi taşıyıcılığı, betaglobin geni, mutasyon, genotip, fenotip The Relationship Between Mutation Type of BetaGlobin Gene and Hematological Phenotype in BetaThalassemia Carriers Aim: This study was conducted to determine the effect of the mutation type at betaglobin gene on the hematological parameters in betathalassemia carriers. Materials and Methods: Eighty four patients (36 males and 48 females) were included to our study. All of patients were diagnosed for betathalassemia carrier by HPLC and betaglobin gene mutations using RDBH and DNA sequencing in the Thalassemia Unit and Medical Genetics, Faculty of Medicine, Akdeniz University. Results: The mutation types of betaglobin gene were IVS I110 (G A), IVS II745 (C G), IVS I1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I6 (T C), IVS II1 (G A), Cod 5 (CT), Cod 8 (AA) and Cod 44 (C) in the patients investigated. Of patients 45 have had the b + mutions (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 745) and 39 had the b 0 mutations (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1). Hematocrit level was found to be increased in b + group (p=0,042). Hb F and Hb A2 were found to be higher in b 0 group than b + group (p=0.044 and p=0.001, respectively). Hb F and Hb A 2 levels were statistically different in IVS I6 heterozygous than other mutation types. In conclusion, Hb F and Hb A 2 levels vary in patients who have the heterozygous carrier for betaglobin gene mutation according to mutation type. Hb F level was lower (08.9 %) in our study than reported (014 %) in the literature. As a results, we suggest that genotype for betaglobin gene mutation effects the hematological phenotype, further studies should be planned to obtain the more data for clinical using and our population. Key words: Betathalassemia carrier, betaglobin gene, mutation, genotype, phenotype * Akdeniz Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Öğr. Gör. ** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi, Biolog *** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi,Yrd. Doç. Dr. **** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Doç. Dr. ***** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi, Prof. Dr. 23

19 GİRİŞ Talasemi, bir ya da daha fazla globin zincir (α, β, γ, δβ, γδβ, δ ve εγδβ) sentezinin azalması ile karakterize hemoglobin bozukluğudur. Betatalasemi, betaglobin genindeki mutasyonlar nedeni ile betaglobin sentezinin azalması (β + ) veya hiç sentezlenmemesi (β 0 ) sonucunda oluşur. Heterozigot βtalasemide, tek bir βtalasemi aleli (β + ya da β 0 ) kalıtılmaktadır. Betatalasemide, homozigot olgular transfüzyon bağımlılığı gerektiren ağır bir anemi, heterezigotlar ise hafif anemi hipokromik mikrositik kırmızı küre, HbA 2 ve Hb F düzeyinin değişken olarak yükselmesi ile karakterizedir. Heterozigot bireylerdeki Hb A 2 artışı genellikle % 3,55,5 arasında seyrederken, nadir olarak görülen % 6,5 un üzerindeki yüksek Hb A 2 düzeyine ise β promotor bölgesindeki regulatör elementlerin delesyonu neden olur. Heterozigot bireylerin hematolojik fenotipleri çok çeşitlilik gösterebilir; bazı heterozigotların kan tabloları tipik heterozigot talasemi olmasına rağmen Hb A 2 leri normal olabilmektedir (1). Bu bireylerin çoğunluğu β talasemi ile birlikte kalıtılması sonucunda oluşur. Sessiz betatalasemilerde ise βglobin üretiminde çok az bir eksiklik vardır ve bu nedenle heterozigot bireyler belirgin hematolojik fenotip göstermezler (2,3). Bu olguların OEH (Ortalama Eritrosit Hacmi), OEHb (Ortalama Eritrosit Hemoglobini), HbA 2 ve HbF değerleri normal olduğu için rutin tarama yöntemleriyle belirlenemezler. Dominant olarak kalıtılan β talasemi mutasyonlarını taşıyan heterozigot bireyler ise taşıdığı bu mutasyonun öncü kırmızı kürelerde inklüzyon cisimciklerini oluşturabilecek ürünlere yol açmasından dolayı hastalık fenotipi oluşabilir ve genellikle orta şiddette anemi, splenomegali ve talasemik kan tablosu ile talasemi intermedia fenotipi gösterirler (4,5). Talasemiler dünyada en yaygın olarak görülen tek gen hastalığıdır. Seksen milyonunu beta talasemi taşıyıcılarının oluşturduğu yaklaşık 270 milyon talasemi taşıyıcısı bulunmaktadır. Beta globin geni, 11. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunur ve üç ekzon ile iki intron bölgesinden oluşur. Genel olarak iki tür β talasemi tipi vardır; β 0 ve β +. Nadiren bu iki alelden daha hafif seyreden bir form da β ++ olarak gösterilir ve β zincir üretiminde minimal eksikliğe yol açar. β talasemi taşıyıcıları β 0 veya β + olsun klinik olarak asemptomatiktir. Hipokromik mikrositik kırmızı küreler ile karakterize hafif bir anemi, Hb A 2 de ve değişken düzeylerde Hb F de artış söz konusu olabilir. Ancak daha önce de açıklandığı gibi heterozigotlar çok çeşitli olabilir; tamamen fenotipik olarak sessiz olabildikleri gibi ağır anemi ile seyreden tipleri de vardır. Bu olgularda mutasyon tipine bağlı olarak hematolojik parametrelerde, Hb A 2 ve Hb F düzeylerinde değişiklikler gözlenebilmektedir. Yapılan çalışmalarda β 0 talasemi tipine sahip bireylerin OEH değerlerinin β + tipine sahip olanlardan daha düşük seyrettiği gösterilmiştir (6). Skarmoutsou ve ark. (7) ise retikulosit, Hb A 2 ve Hb F seviyelerini β 0 talasemi heterozigotlarında daha yüksek bulmuşlardır. Türkiye genelinde yapılan çalışmalar, nüfusumuzun ortalama % 2,1 nin β talasemi taşıyıcısı olduğunu ve bu oranın bazı bölgelerde % 10 u bulduğunu ortaya koymuştur (810). Bugüne kadar moleküler düzeyde yapılan çalışmalar ile dünyada betatalasemiye neden olan 200 den fazla mutasyon belirlenmiştir. Bunlardan 40 farklı mutasyon tipi Türkiye de rapor edilmiştir. Ülkemizde en sık rastlanılan βtalasemi mutasyonları; IVS I 110 (% 40), IVS I 6 (% 7.14), IVS I 1 (% 7.14) ve IVS II 745 (% 4.28) dir (11,12). Bu çalışmamızda amaç heterozigot bireylerde Türk populasyonundaki yaygın mutasyon tipleri ile hematolojik parametrelerin değişkenliğini karşılaştırmaktır. 24

20 GEREÇ ve YÖNTEM Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi tarafından takip edilen, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Moleküler Genetik Laboratuvarında mutasyonları tanımlanan yaşları 3 yaş ile 42 yaş arasında değişen 84 heterozigot talasemi taşıyıcısı incelemeye alındı. Olguların 36 sı erkek, 48 i kadındı. Taşıyıcı bireylerin kanları K3EDTA lı tüpe alındı ve eritrosit indeks parametreleri otomatik kan sayım cihazı ( Beckman Coulter LH 750) ile belirlendi. Hemoglobin A 2 ve Hb F düzeyleri βthalassemia Short Programı kullanılarak (BioRad Variant) yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (HPLC) yöntemi ile belirlendi. BetaTalasemi mutasyonları ise bölgemizdeki yaygın 22 mutasyonu gösteren RDBH (Reverse DotBlot Hybridization) (ViennaLab, BetaGlobin StripAssay), ARMS (Allele refractory mutation system), REA (Restriction Enzyme Analyse) ve gerektiğinde DNA Dizi Analizleri ile belirlendi (13,14). Elde edilen sonuçlara iki grup arasındaki farkın anlamlılığını ortaya koymak için Kikare ve ttestleri uygulandı. BULGULAR Beta globin gen mutasyonu için heterozigot olan bu 84 bireyin mutasyon tipleri IVS I110 (G A), IVS II745 (C G), IVS I1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I6 (T C) IVS II1 (G A), Cod 5 (CT), Cod 8 (AA), Cod 44 (C) olarak bulundu. Bu mutasyon tiplerinin hastalara göre dağılımları Tablo 1 de gösterilmektedir. DNA dizi analizi ve diğer yöntemler kullanılarak bglobin geninin mutasyon tipleri belirlenmiştir. 45 örnekte b + mutasyonu (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 745) ve 39 örnekte b 0 mutasyonu (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1) saptanmıştır. Tablo 2 de heterozigot talasemi olguların mutasyon tipleri ve Hb A 2 ve Hb F yi içeren hematolojik bulguları gösterilmektedir. Eritrosit göstergelerinin (Hb, KK, OEH, OEHB) istatistiksel analizi b + ve b 0 talasemi mutasyonlarını içeren grup değerleri arasında belirgin farklılıklar göstermemiştir. Ancak hematokrit değerleri b + grubunda daha yüksek olarak bulunmuştur (p=0,042). Hb F ve Hb A 2 değerlerine baktığımızda ise iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmektedir. Hb F ve Hb A 2 değerlerinin her ikisi de b 0 grubunda daha yüksek olarak bulunmuştur (sırası ile p=0.044 ve p=0.001). IVS I6 mutasyonunu b ++ olarak Tablo 1. Olguların mutasyon tip ve yüzdelik dağılımları. Mutasyon Mekanizma Sayı % IVS I.110 (G A) Cod 39 (C T) IVS II.745 (C G) IVS I.6 (T C) IVS I.1 (G A) Cod 5 (CT) Cod 8 (AA) Cod 44 (C) IVS II.1 (G A) RNA işlenmesi RNA işlenmesi RNA işlenmesi RNA işlenmesi RNA işlenmesi Çerçeve kayması Çerçeve kayması Çerçeve kayması RNA işlenmesi