ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Gökhan BAKTEMUR KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANMIŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANIMŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez 14/07/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza.... İmza... İmza... Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2008YL14 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANMIŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Yıl : 2009, Sayfa : 61 Jüri : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA : Prof. Dr. Kazım ABAK : Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU Bu çalışma yılları arasında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünde yürütülmüştür. Materyal olarak Bahçe Bitkileri Bölümü bünyesinde toplanan kavun genetik kaynağındaki Yuva tipi geriye melez 3 (GM3) populasyonundan Y2 ve Y3 nolu genotipler kullanılmıştır. Bu çalışmada embriyoların daha kolay, hızlı, ekonomik ve etkili şekilde çıkartılabilmesi için farklı yöntemler denenmiştir. Çalışmada kontrol uygulaması olarak tohumların tek tek açılması yöntemi kullanılmış; bunun yanında, tohumların doğrudan besin ortamına ekimi, tohumlara ışıkta bakma, tohumların sıvı besin ortamına ekimi ve tohumlara yüzey sterilizasyonu yapılarak ekimi yöntemi olmak üzere olmak üzere beş farklı yöntem denenmiştir. Deneme sonucunda, meyve başına elde edilen ortalama embriyo sayıları tanık olarak kullanılan tek tek açma yönteminde 3.3 ile en yüksek çıkmış, bunu sırayla 3.1 adet ile tohumlara ışıkta bakarak ve 2.4 adet ile tohumların hepsinin CP besin ortamına ekimi yöntemleri izlemiş fakat bu üç uygulama arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli çıkmamıştır. Tüm tohumların sıvı ortama ekimi uygulamasında ise hiç embriyo gelişimi sağlanamamış ve yüksek oranda enfeksiyon sorunu meydana gelmiştir. Gerekli süre ile birlikte işçilik maliyeti dikkate alındığında ise en iyi uygulamanın tohumların ışıkta bakılarak ayrılması yöntemi olmuş, bunu tohumların doğrudan CP besin ortamına ekimi izlemiştir. Anahtar Kelimeler: Kavun, haploid üretim, ışıkta tarama kaynağı, ışınlanmış polen I

4 ABSTRACT MSc. THESIS DIFFERENT METHODS ON HAPLOID EMBRYO RESCUE OBTAINED USING IRRADIATED POLLEN Gökhan BAKTEMUR DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Year : 2009, Sayfa : 61 Jury : Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA : Prof.Dr. Kazım ABAK : Prof.Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU This study was conducted between the years in Horticulture Department, Faculty of Agriculture, University of Çukurova. Genotype Y2 and Y3 selected from backcross three (BC3) population of Yuva melon genetic resources collected on the Department of Horticulture are allocated. In this study, different methods for embryo rescue were tested to find an easier, fast, economical and effective method. Inspecting the seeds one by one was used as control treatment. Other four methods tested are sowing seeds direct nutrient media, "inspecting seeds on the light", "floating seeds on liquid media" and " floating seeds on liquid media after surface sterilization. Overcome of this study show that, there is no significant difference statistically between the methods Inspecting the seeds one by one, sowing seeds direct CP nutrient media and "inspecting seeds on the light" although the average number of embryos per fruit are slightly different (3.3, 2.4 and 3.1 respectively). No embryo production was obtained from liquid culture due to infection. When labor costs and time requied for embryo rescue taking into account, the best methods are sowing seeds direct CP nutrient media and "inspecting seeds on the light". Key words: Cucumis melo, doubled haploid production, light source, liquid culture, irradiated pollen. II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmalarım esnasında gerek ders gerekse tez dönemimde her türlü maddi ve manevi yardımlarını esirgemeyen, çalışmaların her aşamasında desteğini aldığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Tez çalışmamın başından beri bilgi ve tecrübesinden faydalandığım Sayın Prof. Dr. Kazım ABAK hocama teşekkürlerimi sunarım. Tüm eğitim ve öğretim dönemim boyunca maddi ve manevi her konuda beni destekleyen ve her zaman yanımda olan aileme teşekkür ederim. Tez çalışmam içinde yer alan istatistik analiz kısmında yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Sevgi PAYDAŞ hocama teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam içinde yer alan ışık kaynağı sistemini hazırlayan Sayın Prof. Dr. Orhan BÜYÜKALACA hocama teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamda yer alan ekonomik analiz kısmında yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Aykut GÜL hocama teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında gerek arazi çalışmaları olsun gerekse laboratuvar kısmında benden yardımlarını esirgemeyen araştırma görevlisi Mehtap YILDIZ a teşekkür ederim. Laboratuvar kısmında yardımlarını aldığım araştırma görevlileri Hatıra TAŞKIN, Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU yüksek lisans öğrencisi Meltem BERBER ve lisans öğrencilerinden Meryem SARI, Özgün ÇAKIROĞLU na teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.... ABSTRACT TEŞEKKÜR İÇİNDEKİLER. SİMGELER VE KISALTMALAR... ÇİZELGELER DİZİNİ..... ŞEKİLLER DİZİNİ.. I II IIII IV VI VIII X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE YÖNTEMLER Materyal Yöntem Bitkilerin Yetiştirilmesi Emaskülasyon Erkek Çiçeklerin Tozlanması ve Işınlanması Çiçeklerin Tozlanması Embriyoların Çıkartılması Dezenfekiyon Tohum ve Embriyoların Çıkartılması Tohumların Tek Tek Açılması Yöntemi Tohumların Doğrudan Besin Ortamına Ekimi Tohumların Sıvı Besin Ortamına Ekimi.. 28 IV

7 Tohumların Yüzey Sterilizasyonu Yapılarak Ekimi Tohumlara Işıkta Bakma Yöntemi Ekonomik Analiz İstatistik Analizi BULGULAR VE TARTIŞMA Çiçeklerin Tozlanması Tohum ve Embriyoların Çıkartılması Tek Tek Açma Doğrudan Ekim Sıvı Ortama Ekim Sterilizasyonu Sonrası Ekim Işıkta Bakma Embriyo Kurtarma Yöntemlerinin Karşılaştırılması Ekonomik Analiz Yöntemlerin Süre Açısından Kıyaslanması Yöntemlerin Maliyet Açısından Kıyaslanması SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 SİMGELER VE KISALTMALAR GM : Geriye Melez Co 60 : Kobalt 60 Gy : Gray % : Yüzde g : Gram mg : Miligram ml : Mililitre l : Litre mg/l : Miligram/litre g/l : Gram/litre E20A : Çalışmada Kullanılan Besin Ortamı CP : Çalışmada Kullanılan Besin Ortamı MS : Murashige and Skoog Besin Ortamı W : Watt (Işık gücü) TBS : Tozlanan Bitki Sayısı TMS : Tutan Meyve Sayısı HGMS : Hasada Gelen Meyve Sayısı BDES : Bitkiye Dönüşen Embriyo Sayısı GBS : Gelişen Bitki Sayısı EO : Enfeksiyon Oranı TL : Türk Lirası $ : Dolar dk : Dakika v : Hacim n : Haploid 2n : Diploid 2,4-D : 2,4 dikloro fenoksi asetik asit M : Molar µm : Mikromolar VI

9 µ : Mikron kgy : Kilogray Ç.Ü. : Çukurova Üniversitesi VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. E20A besin ortamının bileşimi Çizelge 3.2. CP besin ortamının bileşimi Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge 4.3. Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. İki kavun genotipinde yıllara göre tozlanan bitki sayısı, tutan meyve sayısı ve hasada gelmiş meyve sayıları Kavunda tohumların tek tek açma yönteminde meyve başına tohum sayısı, elde edilen embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Kavunda tohumların doğrudan CP besin ortamıyla ekim yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları. 37 Kavunda tohumların doğrudan E20A besin ortamıyla ekim yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 38 Kavunda sterilizasyon sonrası tohumların CP besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 41 Kavunda sterilizasyon sonrası tohumların E20A besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 41 VIII

11 Çizelge 4.7. Kavunda tohumlara ışıkta bakma yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları. 43 Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Çizelge Çizelge Kavunda meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayılarının yöntemlere göre karşılaştırılması.. 44 Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları ve geçen süre Farklı embriyo kurtarma yöntemlerinde işgücü ve süreye göre embriyo maliyetleri. 50 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Olgunlaşmamış Yuva kavunları Şekil 3.2. Tohum ekimi için viyollerin torf: perlit karışımı ile doldurulması 17 Şekil 3.3. Tohum ekimi yapılmış viyollerin fide serasındaki görünümü.. 17 Şekil 3.4. Ekim sonrası bakım işlemleri Şekil 3.5. Fidelerin 2 3 yapraklı dönemi.. 17 Şekil 3.6. Yetiştiricilikte kullanılacak olan bitkilerin dikimden sonraki görünümü 17 Şekil 3.7. Bitkilerin ipe sardırılması Şekil 3.8. Anthesisten 1 gün önceki aşama Şekil 3.9. Emaskülasyon işlemi Şekil Selofan keselerle kapatma Şekil Erkek çiçeklerin taç ve çanak yapraklarından ayrılması Şekil Işınlamaya hazır erkek çiçekler Şekil Erkek çiçeklerin ışınlandığı reaktör ve ışınlamaya hazır erkek çiçekler 19 Şekil Emasküle edilmiş kavun çiçeği. 20 Şekil Emasküle edilmiş kavun çiçeğinde tozlama yapılışı Şekil Kavun çiçeğinin selofan keseyle kapatılması X

13 Şekil Tozlamadan sonraki 4. gündeki bir meyvenin görünüşü. 21 Şekil Hasat zamanı gelmiş bir meyve Şekil Ön hazırlık odasına meyvelerin getirilmesi Şekil Meyvenin kuru yakma yöntemi ile dezenfeksiyonu Şekil Kuru yakmanın yapılışı. 22 Şekil Meyvenin boyuna kesimi.. 23 Şekil Tohumların çıkartılması 23 Şekil Tohumların binoküler mikroskop altında tek tek açılması Şekil Haploid bir embriyonun E20A ortamına aktarılması Şekil Tohumların CP ortamına direk ekimi Şekil Tohumların E20A ortamına direk ekimi Şekil Tohumların sıvı ortama ekimi sonrası iklim odasına alınması. 28 Şekil Kavun tohumlarına yüzey sterilizasyonunun yapılması.. 29 Şekil Sterilizasyon sonrası kavun tohumlarının direk ekimi. 29 Şekil Işık düzeneği Şekil Işık düzeneğinde tohumlara bakma.. 30 Şekil Haploid embriyo olan tohumların açılması.. 30 Şekil 4.1. Kavun genotiplerinde Nisan ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları XI

14 Şekil 4.2. Kavun genotiplerinde Mayıs ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları.. 34 Şekil 4.3. Haploid embriyoların bitkiye dönüşümü Şekil 4.4. CP besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü. 39 Şekil 4.5. E20A besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü. 39 Şekil 4.6. Tek tek açma yöntemine göre olası embriyo kayıp oranları 46 XII

15 1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR 1.GİRİŞ Çok eskilere dayanan kabakgil sebzelerinin yetiştiriciliği günümüzde de oldukça önemli bir yere sahiptir. Bu sebzelerin en önemlilerinden birisi olan kavunun kökeni konusunda birçok kaynakta farklı görüşler bulunmaktadır. Pitrat ve ark., (1999), Cucumis cinsine giren yabani tiplerin Afrika da özellikle Sudan da çok yaygın görüldüğünü belirterek, kavunun orjininin Afrika olduğunu, M.Ö yıllarında yetiştiriciliğine başlanan kavunun M.Ö yıllarında Mısır a ve M.Ö yıllarında da Hindistan a ulaştığını belirtmektedirler. Aynı kaynakta savunulan diğer bir görüşte ise kavunun orjinin Hindistan olduğu belirtilirken bu görüşün Hindistan da uzun zamandır kavun yetiştiriciliğinin yapılması ve çok sayıda yabani tiplerin bulunması ile desteklendiği belirtilmektedir. Aynı araştırıcılar, kavunun ikincil gen merkezi olarak ise Asya nın Akdeniz den Japonya ya kadar olan kesimini göstermektedirler. Bu görüşleri paylaşan Robinson ve Decker-Walters (1997) da, kavunun Afrika kökenli olduğunu belirtmekle birlikte ikincil gen merkezi olarak ise, Türkiye, İran, Hindistan, Afganistan, Çin gibi ülkeleri belirtmektedirler. Aynı yazarlar Doğu Anadolu Bölgesi nin, özellikle Van yöresinin önemli bir mikro gen merkezi olduğunu kaydetmektedirler (Köksal, 1999). Cucurbitaceae familyasında yer alan kavun (Cucumis melo L.) besin değeri ve üretiminin hızla artması nedeni ile oldukça önemli bir sebze türüdür. Kavun protein (% / 100 g), vitamin, mineral maddeler, A ( IU /100 g ) ve K vitaminleri ( mg / 100 g ) yönünden zengindir (Lorenz ve Maynard, 1988). Kavunun tüketim şekillerinin çeşitliliği ekonomik önemini arttırmaktadır. Taze olarak tüketiminin yanı sıra, son yıllarda meyve salatası ve meyve suyu yapımında kullanımı da yaygınlaşmıştır. Ayrıca gıda sanayinin diğer kollarında da (pasta, reçel, dondurma, meyveli yoğurt) kullanılmaktadır. Olgunlaşmamış meyveleri turşu yapımında kullanıldığı gibi, uzak doğuda çorba yapımında da değerlendirilebilmektedir. Bazı kavun çeşitlerinin süs bitkisi olarak da kullanıldığı bilinmektedir. Bunun yanı sıra parfümeri ve kozmetik sanayiinde (şampuan, parfüm) kullanımı da yaygındır (Wien, 1997). Kavun insan beslenmesi açısından ve yıllık 1,2 milyon ha'lık alanda 27,5 milyon ton üretim ile dünyada ekonomik olarak büyük 1

16 1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR öneme sahiptir. Türkiye 116 bin ha alanda yaklaşık 1,7 milyon ton kavun üretimi ile dünya kavun üreticisi ülkeler arasında ikinci sırada yer almaktadır (Anonim, 2007). Türkiye'de üretilen kavunların %85'i inodorous (Kırkağaç, Hasanbey, Yuva ve Kışlık Sarı) diğer kısım (%15) ise cantalupensis ve reticulatus grubunda yer almaktadır (Abak, 2001). Yetiştiricilik hemen tüm bölgelere yayılmış durumdadır. Cantalupensis grubu kavun tipleri genellikle Akdeniz bölgesinde yaygınlık gösterirken, inodorus grubu kavunlar İç Anadolu, Ege ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde yaygınlık göstermektedir. Ülkemiz kantalop kavunların gen merkezi olmasına rağmen, bu türün yabancı tozlanma eğiliminin yüksek olması ve üreticiler tarafından bilinçsizce yapılan tohum karışımları nedeni ile mevcut çeşitler sahip oldukları özellikleri kaybetmişlerdir. Yabancı tozlanmalar nedeni ile klasik ıslah çalışmaları kavunda 8 10 yıl sürmektedir. Bitkilerin ekonomik yararları göz önünde bulundurularak genetik yapılarını değiştirmeyi ve iyileştirmeyi amaçlayan ıslah çalışmaları, son yıllara kadar klasik yöntemlerle sürdürülürken günümüzde in vitro tekniklerin kullanılması ile daha hızlı ve etkin bir şekilde yürütülmeye başlanmıştır. Kendilenmiş bitki hatları sebze ıslahının temel materyalini oluşturmaktadır. Bu hatlar uzun yıllar süren kendilemelerle elde edilmektedir. Bu sürenin kısaltılması ve bir bitki materyalinin durağan hale getirilmesi için ardı ardına yapılması gereken kendilemelere alternatif olarak Dihaploidizasyon yöntemi büyük öneme sahiptir (Sarı, 1994). Haploid kromozom sayısına sahip bitkilerin elde edilmesi ve bunların kolhisin gibi bazı maddelerle kromozom sayılarının iki katına çıkartılmasıyla bir yıl içerisinde % 100 homozigot saf hatlar elde etmek mümkün olabilmektedir. Böylece 5 6 yıl süren homozigotlaştırma işlemini 1 yılda, 8 10 yıl süren ıslah çalışmaları da 3 4 yıl gibi bir sürede tamamlama olanağı ortaya çıkmaktadır. Doğada ortaya çıkış sıklığı az ve düzensiz olan haploid bitkiler yeterli miktarda olmadığı ve istendiği zaman bulunamadığı için ıslah çalışmalarında kullanılabilme özelliğine sahip değillerdir. Erkek veya dişi gamet hücrelerinden in vitro koşullarda haploid embriyo ve bitki elde etme olanağı sağlayan doku kültürü teknikleri birçok bitki türünde dihaploidlerin elde edilmesinde faydalıdır. Solanaceae ve Cruciferae familyalarına ait türlerin birçoğunda anter ve mikrospor kültürleri yoluyla androgenetik haploidler 2

17 1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR elde edilebilirken, Cucurbitaceae familyasına ait kabakgil sebzelerinde yumurta (ovul) kültürü ile daha olumlu sonuçlar alınabilmektedir. Cucurbitaceae familyasında önceleri hem anterler, hem de ovul ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmiştir. Anter kültüründen olumlu bir sonuç alınamamış, ovul-ovaryum kültürlerinden elde edilen bitki sayıları ise çok az olmuştur. Kavunda dihaploidizasyon yöntemi 1979 yılında (Dumas de Vaulx, 1979) başarılı sonuçlar vermiştir lı yıllara doğru gama ışını uygulanmış polenlerle tozlamalar yaparak in sitü haploid embriyo uyartımı ve bu embriyoların özel besin ortamları üzerinde in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmesi araştırılmıştır. Bu yolla Cucumis türlerinin ilk haploid embriyoları kavunda elde edilmiş ve bu embriyolar in vitro da bitkiye dönüştürülmüştür (Sauton ve Dumas de Vaulx, 1987). Daha sonra aynı teknik karpuzda, hıyarda ve kabakta denenmiş ve başarılı sonuçlar alınmıştır ( Sarı ve ark., 1991 ; Çağlar ve Abak, 1999; Kurtar ve ark., 2002). Haploidizasyon ıslah çalışmalarında araştırıcılara önemli avantajlar sunmaktadır (Reinert ve Bajaj, 1977; Pochard ve Dumas de Vaulx, 1979; Hermsen ve Ramanna, 1981; Abak, 1982; Emiroğlu, 1982; Bajaj, 1983; Lespinasse ve ark., 1983; Dunwell, 1985; Abak, 1988; Chambonnet, 1988; Abak, 1993; Demarly ve Sibi, 1989; Pierik, 1989; Bhojwani, 1990; Gallais, 1990; Sangwan ve Sangwan- Norell, 1990; Thorpe, 1990; Zhang ve ark., 1990; Kuckuck ve ark., 1991; Emiroğlu ve Gürel, 1993a; Sarı, 1994; Abak ve ark., 1996). Haploidler ve dihaploidler sitolojik ve genetik açıdan oldukça önemli deneysel materyallerdir. Diploid materyale uygulanan mutagenlerin resesif yönde oluşturduğu mutasyonlar, bu materyallerden seçilen haploidler yardımıyla daha ilk generasyonda belirlenebilmektedir. Ayrıca haploid hücre ya da bitkilerde ortaya çıkan mutasyonlar, bu bitkilerin kolayca diploidizasyonu sonucu yeni çeşitlerin geliştirilmesinde yarar sağlayabilmektedir. Haploid hücre kültürü, mutasyonlar ve hücre modifikasyonlarının incelendiği somatik hücre genetiği çalışmalarında çok elverişli bir yöntemdir. Haploidler ve dihaploid homozigotlarda genetik açılım (segregation) basittir, resesif genler dominantlar tarafından örtülmezler. Haploidlerin, değişik 3

18 1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR ortamlarda ve farklı patojenlere ya da patojenlerin farklı ırklarına karşı in vitro seviyede seçime olanak vermesi hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında yer, zaman maddi kazanç sağlamaktadır. Özellikle yabancı döllenen türlerde generasyon tekrarlanan kendilemeler ile ulaşılan homozigotiye, dihaploidizasyon yönteminin kullanılmasıyla bir generasyonda en hızlı ve kolay bir şekilde ulaşılır. Kendilemenin olanaksız olduğu bazı dioik türlerde haploid uyartımı ve bunu takip eden kromozom katlanmasıyla saf erkek bitkiler elde etmek mümkündür. Klasik yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın oldukça zor olduğu ve kendileme depresyonunun görüldüğü çilek ve lahana gibi türlerde dihaploidizasyon ile bu sorun bir generasyonda çözülebilir Dihaploid bitkilerden oluşturulan saf hatlar kendine ve yabancı döllenen türlerde doğrudan çeşit olarak veya hibrit çeşitlerin geliştirilmesinde ebeveyn olarak kullanılabilirler. Ayrıca dominansi etkisinin kalkması nedeniyle, heterozigot bitkilerin kendilenmiş döllerinin değerlendirilmesinde Dihaploid hatlar çok güvenlidir. Yöntemin yaygınlaşmasını engelleyen iki önemli faktör bulunmaktadır. Birincisi ışın kaynağına bağımlılık, ikincisi ise haploid embriyoların çıkartılmasındaki yoğun işgücü ve zaman ihtiyacıdır. Yapılan bu çalışmada embriyoların daha kolay ve etkili çıkartılabilmesi için farklı yöntemler denemeye alınmıştır. Çalışmada şu anda yaygın olarak kullanılan tohumların tek tek açılarak içinden haploid embriyoların kurtarılması yöntemi kontrol olarak kullanılmıştır. Kapsamlı ıslah çalışmalarında çok fazla bitki ile çalışıldığından bu yöntem çok zaman alıcı olduğu için yeterince etkin olamamaktadır. Bu yönteme alternatif olarak hem daha kısa sürede yapılabilecek hem de etkin olabilecek diğer yöntemler denenmiştir. Bu yöntemler; 1. Çıkarılan tohumların tamamının hiçbir uygulamaya tabi tutulmadan doğrudan olarak besin ortamına ekimi ve 10 gün boyunca gözleminden sonra çimlenmeye başlayan haploid embriyoların kültür tüplerine aktarımı, 2. Çıkarılan tohumların tamamının agar içermeyen sıvı besin ortamına ekimi ve çimlenme gösteren haploid embriyoların agarlı ortama transferi, 4

19 1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR 3. Çıkarılan tohumların hepsine % 15 lik sodyum hipoklorit uygulaması ile 10 dakika yüzey sterilizasyonu yapıldıktan sonra ortama ekim ve diğer doğrudan ekim yöntemlerinde olduğu gibi çimlenme gösteren haploid embriyoların aktarımı, 4. Güçlü bir ışık kaynağı üzerinde çıkarılan tohumların hepsine bakılarak haploid embriyoların aranması, içinde embriyo görünen tohumların açımı ve çıkarılan embriyoların kültür tüplerine aktarımıdır. Çalışma kapsamında bu yöntemlerin tamamı hem embriyoların kurtarılması için geçen süre hem de embriyo sayısı dikkate alınarak karşılaştırılmıştır. Ayrıca çalışma kapsamı içerisinde yöntemlerin ekonomik olarak kıyaslaması da yapılmıştır. 5

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Blakeslee ve ark. (1922), tarafından Datura stroamonium bitkisinde ilk doğal haploid bitkilerin keşfedilmesinden sonra haploidi çalışmaları başlamıştır. Daha sonra, konunun öneminden dolayı pek çok bitki türünde haploid bitki elde etme denemelerine girilmiş, bir yandan çiçeklere dışsal uygulamalar yaparak, öte yandan da haploid eşey hücreleri taşıyan dokuları in vitro kültürlere alarak başarıya ulaşılmaya çalışılmıştır. Bu çalışmalar her iki cinsiyete ait gametlerde de yürütülmüş; ancak 1976 yılına kadar yalnızca erkek gametlerden hareketle haploid bitkiler elde edilmiştir yılında Guha ve Maheswari, 1967 yılında da Bourgin in katkılarıyla geliştirilen anter kültürü tekniği ile bugün birçok bitkide haploidi yöntemi ıslah programlarında kullanılır hale gelmiştir (Oinuma, 1977; Dumas de Vaulx, 1979; Henry ve Buyser, 1983). Aalders (1958), hıyarda (Cucumis sativus L.) haploid bitki elde etmek amacıyla, hasat ettiği olgunlaşmamış meyvelerin tohumlarını suda yüzdürme yöntemini uygulayarak su üzerinde kalan hafif tohumların embriyolarını kültüre almış ve 13 adet haploid hıyar bitkisi elde etmiştir. Cucurbitaceae familyasının ilk monoploid özelliği taşıyan bu bitkilerinin 8 tanesi büyütülebilmiş ve kolhisin uygulanarak diploid hale getirilmiştir. Fakat bu bitkilerden yeni bireyler elde edilememiştir. Dumas de Vaulx (1979), kavunu (Cucumis melo L.) (2n=24), Cucumis ficifolius (2n=4x=48) ile tozlayarak türler arası melezlemeler yapmıştır. Polenlerin çim borusu gelişimini uyartmak amacıyla, stigmalarını yüzeysel olarak bistüri ile kesip dişi çiçekleri kavun polenleri ile tozlayarak meyveler elde etmiştir. Tozlama sonucu elde edilen meyvelerin tohumlarından melez bitki elde edilememiştir ve oluşan bitkilerin gelişimlerinde sorunlarla karşılaşılmıştır. Bitkilerde kromozom sayımları yapıldığında haploid yapıda oldukları ve haploid oranlarının ise ilkbahar aylarında % 0.284, sonbaharda ise % olduğu tespit edilmiştir. 6

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Dryanovska ve IIieva (1983), kavunda (Cucumis melo L.) organogenesis ve haploid bitki elde edebilmek için anter ve ovül kültürü kullanmışlardır. Araştırıcılar, ovülleri plesenta ile kültüre alarak kallus oluşturmuş ve bunun sonucunda da bir tane haploid bitki elde etmişlerdir. Custers ve Bergervoet (1984), 0, 10, 100 ve 1000 Gy dozlarında gama ışını uyguladıktan sonra Cucumis melo var. Noy Yizrael polenleri ile Cucumis sativus var. hardwickii yi tozlamışlardır. Tozlamadan 3 hafta sonra meyveler hasat edilmiştir. Endospermli embriyo taşıyan ovül sayısı ile embriyo ve endosperm boyutlarını incelenmiştir. Sonuç olarak 10 Gy dozundaki uygulama, kontrol polenleri ile yapılan uygulamalardan farklı sonuçlar vermemiş, ışın dozu yükseldikçe parametrelerde düşüş görülmüştür. Chambonnet ve Dumas de Vaulx (1985), kabakta (Cucurbita pepo L.) döllenmemiş ovülleri anthesisten 1-2 gün önce kültüre alarak % 4-7 oranında bitkicikler elde edebilmişlerdir. Araştırıcılar, sitolojik inceleme sonucunda bitkilerin diploid, haploid-diploid kimeralar ve poliploid gibi değişik ploidi düzeyine sahip olduklarını tespit etmişlerdir. Sauton ve Dumas de Vaulx (1987), kavunda ışınlanmış polen tekniği kullanılarak haploid embriyo elde edebilmek amacıyla yaptıkları çalışmada tozlamada kullanılan çiçek tomurcuğu sayısı, ışın dozu ve çeşidin etkilerini araştırmışlardır. Çalışma sonunda denenen her 3 faktörün de embriyo verimine etki ettiğini ve haploid embriyo oranının % 1.59 ile % 2.77 arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Sauton (1987), ticari bir F1 kavun çeşidini normal kültür koşulları altında serada yetiştirerek kendileme yapmıştır. Ovaryumları tozlamadan 5 gün sonra alarak içerisine birkaç damla Tween-20 damlatmış olan % 10 luk kalsiyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika yüzey sterilizasyonu yaptıktan sonra saf su ile 3 kez çalkalayarak içerisinde nemlendirilmiş filtre kağıtları bulunan petrilere aseptik koşullarda transfer etmiştir. Plesanta dokuları dikkatlice çıkarılan ovüllerin 20 g/l sakkaroz + 10 g/l agar ilave edilen MS ortamında kültüre alındıktan 3 4 hafta sonra çimlendiği, 4 hafta sonunda da bitkilerin toprağa şaşırtılacak duruma geldiği gözlenmiştir. 7

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Shail ve Robinson (1987) un Cucurbita pepo türüne ait olan 3 çeşit kabak genotipinde ovül kültürü yapılmıştır. Denenen çeşitlerin sadece bir tanesinde kalluslar elde edilebilmiş; ancak bitkiye dönüşüm gerçekleşememiştir. Bu çeşit C. ecuadorensis ile tozlamadan saat sonra çıkarılıp kültüre alındığında ovüllerden de bitki elde edilememiştir. Olgun meyvelerden çıkartılmış ve in vitro da kültüre alınmış embriyolardan türler arası melez bitkiler elde edilebilmiştir. Zagorcheva ve ark. (1987), Cucumis ficifolius un (2n=24) izole edilen dişi çiçeklerini C. sativus (2n=14) veya C. melo var. flexuosus un çiçek tozları ile tozlamışlar ve 8 bitki elde etmişlerdir. Bu bitkilerin birisinde yapılan kromozom sayımında, bitkinin n=12 kromozom taşıdığı (haploid olduğu) görülmüştür. Diploidlere göre daha yavaş geliştiği görülen bu haploid bitkilerde yaprakların küçük ve daha parçalı, açan dişi ve erkek çiçeklerin küçük, çiçek saplarının daha kısa olduğu ve taç yapraklarının altta birleşmediği belirlenmiştir. Bu haploidlerde kendileme yapıldığında meyve elde edilmezken, C. sativus çiçek tozlarıyla tozlandığında çiçeklerin % 80 inin meyve bağladığı ve bu meyvelerdeki tohum sayısının ortalama 3.5 adet olduğu saptanmıştır. Kwack ve Fujieda (1988) tarafından yapılan bir çalışmada, Cucurbita moschata nın döllenmemiş ovülleri in vitro kültüre alınarak haploidi uyartımı incelenmiştir. Yazarlar anthesis safhasında alınarak 2 gün 5 o C de ön sıcaklık uygulanan ovaryumlardan alınan ovüllerin 30 g/l sakkaroz içeren MS ortamı üzerinde kültüre alınmasının en iyi sonucu verdiğini ve ovüllerden % 17 sinin embriyo oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu embriyoların uygun bir ortama transferinde ise çoğunun kallus oluşturmaya yöneldiğini ve anormal morfolojik gelişmeler gösterdiğini, yalnız birkaç tanesinin normal sürgün ve kök verdiğini tespit etmişlerdir. Araştırma sonucunda elde edilen 3 bitkiden birinin diploid (2n=40), ikisinin ise tetraploid olduğu görülmüştür. Sauton (1988), kavunda ışınlanmış polen tekniği ile haploid embriyo verimi üzerine genotipin ve mevsimin etkisini incelemiştir. Mart-Ekim ve Şubat-Haziran dönemlerinde cam serada yetiştirilen bitkilerden Cucumis melo var. cantalupensis e giren Arizona ve Virka çeşitleri ile Vèdrantais çeşidi 300 Gray dozunda ışınlanmış polenle tozlanmıştır. En başarılı sonuçlar 100 tohumdaki embriyo oranının yaklaşık 8

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR olarak arasında olduğu 10 Haziran 15 Eylül döneminden alınmıştır. Çalışmada 7 farklı genotip kullanılmış ve her genotip için 100 tohum açılmıştır. Açılan tohumlardan haploid embriyolar elde edilmiş olup in vitro ortamda kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmüştür. Çalışmadan elde edilen sonuçlar mevsimin haploid embriyo uyartımı için önemli bir etken olduğunu vurgulamıştır ve en yüksek haploidi oranı % 0.17 ve % 0.16 ile Arizona ve Vèdrantais çeşitlerinde gözlemlenmiştir. Savin ve ark. (1988), X ışınları kullanarak dolu-boş tohum ayrımının yapılması esasına dayanan bir yöntem geliştirmişlerdir. Araştırıcılar, bu teknik yardımıyla partenogenetik haploid embriyoları ayırma ile izole etmede önemli derecede hız kazanıldığından ve embriyo bulunmayan boş tohumları açarak kaybedilen zamandan tasarruf edildiğinden bahsetmişlerdir. Bu yöntem daha sonraki yıllarda Sauton ve ark. (1989), tarafindan kavun bitkisinde kullanılmıştır. Işınlanmış polenlerle toz1amadan 3, 4, 5 veya 6 hafta sonra aldıkları olgunlaşmamış meyvelerdeki tohumları farklı sürelerde (0, 10, 15 veya 20 saat) 4 C'de kurutmuşlardır. X ışınının voltajını 15 kvp, akımını 3 ma ve ışınlanma süresini 2 dakikaya ayarlayan araştırıcılar, haploid embriyoların en iyi görünümünü tozlamadan 4 5 hafta sonra çıkarılan ve 15 saat 4 C'de tutulan tohumlardan elde etmişlerdir. Sauton (1989), kornişon tipi hıyarlarda (Cucumis sativus L.) ışınlanmış polenlerle tozlama ile haploid embriyo uyartımı konusunda yaptığı çalışmada ışın kaynağı olarak Co 60 kökenli gama ışınını ( Gy) kullanmıştır. Tozlamadan 3 hafta sonra hasat edilen meyvelerin içindeki tohumlar tamamen boş bulunurken, sadece 1 adet meyve içerisinde az sayıda tohumda embriyo oluşumları gözlenmiştir. Araştırma sonucunda yaşayan bitki oranı ortalama % 0.3 olarak bulunmuştur. Buna rağmen normal diploid polenlerle toz1ama sonucu meydana gelen tohumların % 30-60'ının dolu ve diploid olduğu gözlenmiştir. 9

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Keller (1990a), yaptığı çalışmada Allium cinsine giren soğan (Allium cepa L. var. Stuttgarter Riesen, Carmen, Kartalski, Copra ile diğer bazı hatlar), pırasa (A. porrum L. ), şalot (A. phoenoprasum) ile A. altaicum ve A. fistulosum gibi bazı türlerde ovül, ovaryum ve çiçek tomurcuğu kültürleri ile başarılı haploidi çalışmaları yapmıştır. Soğanda in vitro kültüre alınan ovüllerden, genotiplere göre % arasında değişen oranlarda doğrudan embriyo gelişimi ile bitkicikler oluşmuştur. Ovaryum kültürlerinde ise sadece kallus gelişimi olduğunu tespit edilmiş olup, diğer Allium türlerinde yalnızca kallus gelişimini sağlayabilmiş, bitki elde edememiştir. Soğanda elde edilen bu bitkilerin tümünün haploid kromozoma sahip olduğu ve morfolojik olarak da diploidlerden daha küçük olduğu gözlemlenmiştir. Keller (1990b), androgenesise tepki vermeyen bir tür olan Allium cepa L. de döllenmemiş ovaryum kültürü yaparak haploid bitki eldesinde başarılı olmuştur. Araştırıcı, geniş bir genotip koleksiyonunda yaptığı çalışmada elde ettiği 457 rejenerantın 164 ünde ploidi durumunu incelemiş ve % 62.2 sinin haploid, % 31.7 sinin diploid ve % 6.1 ininde mixoploid olduğunu saptamıştır. Bu çalışmda in vitro kültürde gelişimin erken döneminde dev çekirdek oluşumu, kallus oluşumu ve vitrifikasyon görülmüş olup, düşük düzeydeki bu oluşumlarla birlikte dejenerasyonun olduğu belirlenmiştir. Gürsöz ve ark. (1991) nın, karpuzda ışınlanmış polenlerle uyartım yoluyla haploid embriyo üzerine yaptıkları çalışmada, değişik safhalarda toplam 761 adet embriyo elde edilmiştir. Araştırıcılar, embriyoların çoğunluğunun (%72) globüler safhada olduğunu ve bitkiye dönüşüm oranlarının çok düşük bir düzeyde (761 embriyodan 17 adet biki elde edilebilmiştir) kaldığını bildirmişlerdir. 31 Mayıs 13 Haziran tarihleri arasındaki tozlama dönemi en uygun dönem olarak bulunmuştur. Elde edilen bitkilerde yapılan sitometrik analizler (Flow Sitometri) sonucunda bitkilerin tamamının haploid oldukları saptanmıştır. Maestro Tejada (1992), Vẻdranatis x PI melez kavun genotipinde, 10

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR 300 Gray dozunda gama ışını uygulanmış Vẻdranatis polenleriyle tozlamalar yapılmıştır. Tozlama sonucunda % arasında olan meyve tutumunun dişi çiçeğin 8 adet erkek çiçek tomurcuğunun polenleriyle tozlanmasıyla % 87 ye çıktığını tespit etmiştir. Bununla birlikte, haziran ayının meyve başına elde edilen embriyo sayısı açısından (6 adet/meyve) en uygun dönem olduğu ve bu oranın eylül ayının ikinci yarısı itibariyle 0.8 adet/meyve ye kadar düştüğü görülmüştür. Embriyoların % 57 si bitkiye dönüştürülmüş olup, kolhisin uygulamalarıyla bunlardan dihaploid hatlar geliştirilmiştir. Sarı ve ark. (1992), üç botanik varyeteye ait (C. melo var. inodorus ve C. melo var. reticulatus ve C. melo var. cantalupensis) ait 5 kavun çeşidinde ışınlanmış polenle (300 Gy) haploid embriyo uyartımını amaçladığı çalışmalarında, bu yöntemin ve ışın dozunun kavunda genotiplere göre değişmekle birlikte etkin olduğu sonucuna varmışlardır. Abak ve ark. (1996), kavunda ışınlanmış polen tozlamaları ile haploid embriyo uyartımında genotip etkisi, dihaploid hatların oluşturulması, haploid ve diploid bitkilerin değişik yöntemlerle ayrımı konusunda yaptıkları çalışmada 3 varyeteye ait 18 genotipi denemeye almışlar ve 14 genotipte haploid embriyo oluşumu gözlemlemişlerdir. Ayrıca ploidi düzeylerinin belirlenmesinde stoma boyutlarının ve içerdikleri kloroplast sayılarının güvenle kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Yanmaz ve Taner (1996), kavun türünde 300 ve 350 Gy dozundaki gama ışını ile ışınladıkları polenlerle Yuva, Kırkağaç ve birkaç ümitvar kantalop hattını tozlamışlar ve 300 Gy dozunun haploid embriyo uyartımında (% 48.18) etkili olduğunu bildirmişlerdir. Yılan kavunu olarak da bilinen acur (Cucumis melo var. flexuosus) türünde embriyo uyartımını sağlamak amacıyla 250, 300 ve 350 Gy ışın dozunu deneyen Yanmaz ve ark. (1997), 300 ve 350 Gy dozlarında embriyo ve bitki elde ettiklerini bildirmişlerdir. 11

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Metwally ve ark. (1998), kabak bitkisinin ovaryumlarını anthesisten 1 gün önce toplayarak 0, 2, 4 ve 8 gün süre ile 4 o C sıcaklıkta tutmuşlardır. Araştırıcılar daha sonra ovülleri çıkararak 30 g/l sakkaroz, 8 g/l agar ve 2,4-D nin 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l lik 4 farklı konsantrasyonunun eklendiği MS ortamında kültüre almış ve 25 ± 1 o C sıcaklık ve 16 saatlik ışık periyodunda 4 hafta bekletmişlerdir. Bu süre sonunda ovüller büyüme düzenleyici madde içermeyen MS ortamına transfer edilmiştir. Kültüre alınan 100 ovülden elde edilen bitki sayısı dikkate alındığında en fazla bitkinin, soğuk uygulaması yapılmayan ovaryumlardan çıkarılan ve 1 veya 5 mg/l 2,4-D eklenen MS ortamında kültüre alınan ovüllerden elde edildiği bildirilmiştir. Çağlar ve Abak (1999) tarafından, hıyarda ışınlanmış polenlerle in situ uyartım sonucu elde edilen değişik gelişme safhalarındaki haploid embriyolar in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, yılları arasında yılın değişik mevsimlerinde dört değişik hıyar genotipinden elde edilen embriyolar steril koşullar altında E20A ortamı üzerinde kültüre alınmışlardır. Embriyoların bitkiye dönüşüm oranları ile bitkiye dönüşme süreleri ve elde edilen bitkiciklerin in vitro gelişimleri incelenmiştir. Ayrıca bu bitkiciklerin in vitro klonlamayla çoğaltım olanakları araştırılmış ve çoğaltım katsayıları belirlenmiştir. İleri gelişim safhalarındaki haploid embriyolar globüler safhadakilere göre daha kısa sürede (3.5 günde) ve daha yüksek oranda (1.yıl % 60, 2. yıl % 80) bitkiye dönüşmüşlerdir. Mayıs Eylül ayları arasında in vitro kültüre alınan embriyolardan yılın öteki dönemlerine göre daha fazla sayıda haploid bitki elde edilmiştir. İkinci yıl haziran ayında embriyoların bitkiye dönüşümleri % 80 e ulaşmıştır. Elde edilen bitkicikler kullanılan besin ortamı üzerinde sağlıklı bir şekilde gelişmişler ve klonlamayla kolayca çoğaltılmışlardır. Arka arkaya yapılan çoğaltımlar arasında geçen süre yaklaşık 30 ar gün olmuş ve bitki başına elde edilen çelik sayısı da 3 12 arasında değişmiştir. Meyve başına haploid bitki sayısı çok yüksek olmamakla beraber, iki yılın sonunda 4 genotipten toplam olarak 190 adet haploid bitki elde edilmiştir. 12

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Sarı ve Yetişir (2002) tarafından, kavunda kendileme depresyonunu araştırmak için dihaploid saf hatlar ile onların üretildiği orijinal diploid hatlar bitki büyümesi, verim ve kalite açısından karşılaştırılmıştır. Geliştirilmiş olan dihaploid hatların bazı meyve ve bitkisel özellikleri belirlenmiştir. Bu özellikler; bitki ana gövde uzunluğu, boğum sayısı, ana gövde çapı, toplam verim, erkenci verim, meyve ağırlığı, meyve çapı, meyve yüksekliği, kabuk kalınlığı, meyve eti kalınlığı, çekirdek evi çapı ve çekirdek evi yüksekliği ile toplam suda çözünebilir kuru madde miktarıdır. Çalışmanın sonuçlarına göre, dihaploid hatlar, orijinal diploid genotiplere yakın değerler vermişlerdir. Kendileme depresyonu tespit edilememiştir. Meyve şekli, büyüklüğü ve kabuk rengi açısından genotipler arasında çok büyük bir varyasyon tespit edilmiştir. Kavunda dihaploidizasyon tekniği ile homozigotlaştırmanın bitki büyümesi, verim ve kalite üzerine önemli olumsuz bir etkiye sebep olmadığı sonucuna varılmıştır. Taner ve ark. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, gama ışınlamasının kavun (300 ve 350 Gy) ve acurda (250, 300 ve 350 Gy) çiçek tozu canlılığı ve haploid embriyo oluşumu üzerine etkileri incelenmiştir. Acurda in vitro çiçek tozu canlılığının 250 ve 300 Gy lik dozlarda (% 28.8 ve % 28.0) 350 Gy e (% 19.4) göre daha yüksek olduğu; artan doza ve çiçek tozu yaşına bağlı olarak çiçek tozu canlılığının azaldığı belirlenmiştir. Kavunda ise ışınlanmış çiçek tozları ile yapılan tozlamadan 72 saat sonra 300 Gy lik dozda çiçek tozu çim borularının % ünün yumurtalığa ulaşarak haploidiyi uyardığı belirlenmiştir. Meyve tutumu ve haploid embriyo oluşumu üzerine ışınlamanın etkileri incelendiği zaman, her iki türde de 300 ve 350 Gy lik dozların 250 Gy e göre daha olumlu etkilere sahip olduğu görülmüştür. Lofti ve ark. (2003), tarafından yapılan bir çalışmada ışınlanmış polenle tozlamadan sonra oluşan tohumlar, embriyoların alınmasından önce 10 gün boyunca sıvı ortamda kültüre alınmışlardır. Bu partenogenetik embriyo içeren tohumların tanımını kolaylaştırmıştır. Çalışma ile 3 fertil hat tanımlanmıştır ve kendilenmiş tohumlar virüslere dayanımı değerlendirmek için elde edilmiştir. Yaprak dokularından flow sitometri ile bu hatlardan 2 tanesinin spontan dihaploid olduğu ve üçüncünün haploid ve diploid hücreleri içeren miksoploid olduğu tespit edilmiştir. 13

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Diğer bitkilerin çiçeklenme aşamasında steril oldukları görülmüştür. 20 steril bitkinin yapılan flow sitometri analizleri ile haploid oldukları görülmüştür. Haploid bitkilerdeki sürgünler yeni in vitro kültürlerin kurulması için kullanılmıştır. İstenilen özellikleri taşıyan dihaploid hatların oluşturulmasının kavun ıslahçıları için değerli bir araç olacağı bildirilmiştir. Claveria ve ark. (2005), hıyarda ışınlanmış polen tekniği ile dihaploid hatların oluşumu üzerine yaptıkları çalışmada öncelikle polenlere Co-60 ile 500 Gy de ışınlama yaparak parthenogenik embriyoları teşvik etmişlerdir. Daha sonra X ışını kullanarak embriyoları in vitro kurtarma yöntemi ile kültüre almışlardır. Kültüre alınan bu embriyolarda flow sitometri ve kodominant hıyar ve kavun SSR markırları kullanılarak istenmeyen zigotik yapıların tanımı yapılmıştır. Ayrıca spontan dihaploidizasyon olup olmadığına bakılmış ve bu olayın gerçekleşmediği belirlenmiştir. Haploid bitkiler kolhisin kullanılarak in vitro da dihaploid hale getirilmiştir. Sanjuan ve ark. (2006), hıyarda yaptıkları bir çalışmada şu yöntemleri kullanmışlardır: 1. Çiçek tozlarına 0.5 KGy dozda Co 60 ile ışınlama yapmışlar; 2. X ışını veya tek tek açım ile haploid embriyoları aramışlar; 3. SSR markırları ile zigotik olanları ayırmışlar; 4. Flow sitometri ile ploidi seviyesini belirlemişler; 5. In vitro kromozom katlamasını uygulamışlar; 6. Dış koşullara alıp kendilemişlerdir. Ko dominant markırlar ve flow sitometri ile bunların gametofitik orjinli oldukları belirlenmiştir. 500 M kolhisinle katlama yapılmış ve araziye aktarılmadan önce flow sitometri ile ploidi durumları belirlenmiştir. Sonuç olarak kendileme yapılan bütün hatlarda tohum elde edilmiştir. YongBing ve ark. (2006), kavunda yaptığı çalışmada haploid bitki eldesine, ana bitki ve dozun etkili olduğunu bildirmiştir. Beş genotipte haploid elde edilme ışınlanmış polen ile denemişler ve iki genotipten haploid elde etmişlerdir. Ortalama embriyo elde etme oranının % 0.29 olduğunu ve iki genotipin biri kalın diğeri ince olduğunu belirtmişlerdir. Meyve tutma oranı ise 300 Gy de % 50, 600 Gy de ise % 10 olarak bulunmuştur. 300 Gy dozda kalın etlide % 0.55 ince etlide % 0.63 oranında haploid embriyo elde edilmiş, 600 Gy de ise hiç embriyo elde edilememiştir. 14

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Lim ve Earle (2008), yapyıkları bir çalışmada gama ışını kullanılarak elde edilen 63 haploid kavun bitkisinde tek boğum kültürü ile çoğaltıldıktan sonra farklı kolhisin uygulamalarına tabi tutularak yapılan uygulamaların katlanmaya, çiçek tozu üretimine ve meyve tutumuna etkilerini incelemişlerdir. En etkili uygulamanın 3 cm lik sürgün ucu eksplantının 500 mg/l kolhisinde 3 saat tutulması olduğunu belirtmişlerdir. Bu uygulama sonunda bitki yaşama oranı nın % 83 ve katlanma oranı % 26 olduğunu ve meyve elde etme oranının ise iyi polen gelişimi gösteren türlerde % 60 olduğunu tespit etmişlerdir. In vivo uygulamalarında 5000 mg/l lik kolhisine, sürgününün uç kısmı 2 ile 4 saat süreyle batırılmış, uygulama sonucunda bazı meyveler elde edilmiş olmasına rağmen yaşayan bitki sayısı düşük olmuş ve bazı morfolojik bozukluklar gözlemlenmiştir. Lotfi ve Salehi (2008), tarafından yapılan çalışmada ışınlanmış polenle elde edilen tohumların sadece bir kaçında haploid embriyo olma şansı olduğundan embriyo kurtarma amacıyla tüm tohumların tek tek açılmasının haploid elde etme etkinliğini arttırmasına rağmen sıkıcı, bıktırıcı ve çok zaman alan bir yöntem olduğunu bildirmişlerdir. Işınlanmış polenle tozlamadan 3 hafta sonra meyvelerin hasadı yapılıp steril kabin ortamda tohumlar alınarak 10 gün boyunca sıvı ortamda tutulmuş ve embriyolar alınmıştır. Bu yöntemle tohum içinde bulunan haploid embriyolar gelişmesine devam etmiş yeşil renge dönüşmüş ve normal tohumdaki gibi çimlenme başlamış olduğundan kolay bir şekilde görülebilmiştir. Yazarlar bu metodun yaygın olarak kullanılan metoda göre çok daha kolay ve hızlı embriyo elde edilmesine, elde edilen embriyo sayısının ve kalitesinin de yüksek olmasına ve sonuç olarak da elde edilen haploid bitki sayısının artmasına neden olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca tohum çıkartımı ve kültüre alınmasında farklı bir yöntem olan çıkartılan tohumların akan su içinde yıkanması sonrası 10 dakika ticari hipo içerisinde dezenfeksiyon yapılarak steril kabin içerisinde açılıp direkt ekiminden daha etkin olarak bulunmuştur. 15

30 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Araştırma 2007 ve 2008 yıllarının ilkbahar ve yaz aylarında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Yürütülmüştür Materyal Çalışmada Ç.Ü Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü bünyesinde yürütülen bir ıslah çalışmasının Yuva tipindeki geriye melez 3 (GM3) populasyonundan Y2 ve Y3 genotipleri materyal olarak kullanılmıştır. GM populasyonu 2005 yılında Fusarium solgunluğunun 0, 1, 2 ırklarına karşı testlemesi sonucunda dayanıklı olarak bulunan bireylerinin Yuva kavunu (Şekil 3.1) ile geriye melezlemesi ile elde edilmiştir Yöntem Şekil 3.1. Olgunlaşmamış Yuva kavunları Bitkilerin Yetiştirilmesi Bitkilerin yetiştirilmesi amacıyla tohumlar Şubat ın üçüncü haftası ekilmiştir. Bu amaçla, 300 adet tohum fide yetiştirme serasında torf : perlit (2 v / 1 v) karışımı harç içeren viyollere ekilerek gerekli bakım işlemleri yapılmıştır (Şekil 3.2., 3.3 ve 3.4). Fideleri 2 3 yapraklı olduklarında (Şekil 3.5) (Mart ayının 16

31 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR ikinci haftası) 50x50x100 cm aralıklarla plastik seraya çift sıralı olarak dikilmiştir (Şekil 3.6). Gelişimleri için gerekli ilaçlama ve gübreleme yapılmıştır. Bitkiler ipe sardırılarak (Şekil 3.7) tek gövdeli yetiştirilmiş ve normal bakım işlemleri uygulanmıştır. Şekil 3.2. Tohum ekimi için viyollerin torf : perlit karışımı ile doldurulması Şekil 3.3. Tohum ekimi yapılmış viyollerin fide serasındaki görünümü Şekil 3.4. Ekim sonrası bakım işlemleri Şekil 3.5. Fidelerin 2 3 yapraklı dönemi Şekil 3.6. Yetiştiricilikte kullanılacak olan bitkilerin dikimden sonraki görünümleri Şekil 3.7. Bitkilerin ipe sardırılması 17

32 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Emaskülasyon Emaskülasyon işlemi anthesisten 1 gün önceki aşamada bulunan çiçek tomurcuklarına (kapalı durumda bulunan taç yaprakların uç kısımlarının yeşilden sarıya dönüşme aşamasında) uygulanmıştır (Şekil 3.8). Kullanılacak tomurcuklar henüz kapalı iken ince uçlu bir pens yardımıyla emasküle edilmiştir (Şekil 3.9). Emaskülasyon işleminden sonra yabancı çiçek tozlarının çiçeğe girişini engellemek için selofan keselerle kapatılarak izole edilmiştir (Şekil 3.10). Şekil 3.8. Anthesisten 1 gün önceki aşama Şekil 3.9. Emaskülasyon işlemi Şekil Selofan keselerle kapatma 18

33 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Erkek Çiçeklerin Tozlanması ve Işınlanması Çiçek tozlarının elde edilmesi için anthesisten bir önceki güne rastlayan büyüklükte, henüz açılmamış fakat iyi gelişmiş erkek çiçek tomurcukları seçilerek toplanmıştır. Bu tomurcuklar taç ve kısmen çanak yapraklardan ayrıldıktan (Şekil 3.11) sonra 9 cm çaplı cam petri kaplarına konularak (Şekil 3.12) gama ışınıyla muameleye tabi tutulmuştur (Şekil 3.13). Işınlanan tomurcuklar oda koşullarında bekletilmiştir. Işınlama işlemi için Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalında ışın kaynağından yararlanılmıştır. Co 60 kaynağından gelen 300 Gy dozunda gama ışını kullanılmıştır. Şekil Erkek çiçeklerin taç ve çanak yapraklarından ayrılması Şekil Işınlamaya hazır erkek çiçekler Şekil Erkek çiçeklerin ışınlandığı reaktör ve ışınlamaya hazır erkek çiçekler 19

34 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Çiçeklerin Tozlanması Tozlama ışınlamanın ertesi günü sabahın erken saatlerinde emasküle edilmiş her dişi çiçek (Şekil 3.14) için 1 2 erkek çiçek tomurcuğunun stigma üzerine sürtülmesi şeklinde yapılmıştır (Şekil 3.15). Tozlamadan sonra yabancı polen girişini engellemek için çiçekler tekrar selofan keselerle kapatılmıştır (Şekil 3.16). İlerleyen günlerde çiçeklerdeki döllenme durumu kontrol edilerek, dişi çiçeğin şişkinleşmeye başladığı ve stigmanın kuruduğu dönemde selofan keseler çıkarılmıştır (Şekil 3.17). Tozlama işlemine 2007 yılında tarihinde, 2008 yılında ise tarihinde başlanmış, 2007 ve 2008 yıllarının Mayıs ayı nın son haftası son verilmiştir. Şekil Emasküle edilmiş kavun çiçeği Şekil Emasküle edilmiş kavun çiçeğinde tozlama yapılışı 20

35 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Şekil Kavun çiçeğinin selofan keseyle kapatılması Şekil Tozlamadan sonraki 4. gündeki bir meyvenin görünüşü 21

36 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3. Embriyoların Çıkartılması Dezenfekiyon Tozlamadan gün sonra olgunlaşmamış meyveler hasat edilmiştir (Şekil 3.18). Hasat edilen meyveler Doku Kültürü Laboratuvarı na getirilmiş (Şekil 3.19) önce çeşme suyuyla yıkanıp kurulandıktan sonra steril kabin içerisinde % 96 lık etil alkolle kuru yakma yöntemi ile dezenfekte edilmiştir (Şekil 3.20., 3.21). Şekil Hasat zamanı gelmiş bir meyve Şekil Ön hazırlık odasına meyvelerin getirilmesi Şekil Meyvenin kuru yakma yöntemi ile dezenfeksiyonu Şekil Kuru yakmanın yapılışı 22

37 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Tohum ve Embriyoların Çıkartılması Her bir uygulama 5 tekerrürlü olarak kurulmuş olup her tekerrür üç meyveden oluşmuştur. Steril kabin içinde kuru yakma sonrası meyveler boyuna kesilerek (Şekil 3.22) tohumlar petri kapları içerisine çıkarılmıştır (Şekil 3.23). Tohumlardan embriyoların çıkartılması ve bitkiciklerin elde edilmesinde 5 farklı yöntem denenmiştir. Denen yöntemler; tohumların tek tek açılması, tohumların doğrudan besin ortamına ekimi, tohumların sıvı ortama ekimi, tohumların yüzey sterilizasyonu sonrası ekimi ve tohumlara ışıkta bakma yöntemleridir. Bu yöntemlerin denenmesiyle bulunan embriyolar ve tohumlar besin ortamına konulmuş, petri ve cam kavanozlara yerleştirildikten sonra sıcaklığı 25 ± 1 C olan ve 16 saat aydınlık 8 saat karanlık olacak şekilde hazırlanmış iklim odasında inkübe edilmiştir. Bu çalışmada ayrıca kurulmuş olan besin ortamı denemesiyle de doğrudan tohum ekimi için en uygun ortam belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla E20A (Çizelge 3.1) ve CP (Çizelge 3.2) ortamları da denenmiştir. Denemede kullanılan besin ortamı bileşenleri aşağıda verilmiştir. Şekil Meyvenin boyuna kesimi Şekil Tohumların çıkartılması 23