ANKİLOZAN SPONDİLİT HASTALARINDA HLA-G POLİMORFİZMİ VE ÖNEMİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ANKİLOZAN SPONDİLİT HASTALARINDA HLA-G POLİMORFİZMİ VE ÖNEMİ Dr. Hakan ERDEM İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Ümit ÖLMEZ ANKARA HAZİRAN 2014

2 KABUL VE ONAY i

3 ÖNSÖZ Asistanlık eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini benden esirgemeyen, fikirleri ile tez çalışmama yön veren, tezimin hazırlanmasında yardımlarını esirgemeyen değerli tez danışman hocam Sayın Prof. Dr. Ümit ÖLMEZ e teşekkür ederim. Ayrıca hastaların temini ve değerlendirmesinde yardımlarını esirgemeyen Uzm. Dr. Orhan Küçükşahin e, birlikte çalıştığım tüm öğretim üyelerine, uzman ve asistan arkadaşlarıma, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji Laboratuvarı öğretim görevlisi Sayın Doç. Dr. Türker Duman a ve laboratuvar çalışanlarına ve istatiksel değerlendirmelerin yapılması ve yorumlanması aşamasında yardımcı olan istatistik uzmanı Zeynep Bıyıklı ya teşekkür ederim. Ayrıca bu çalışmanın yürütülmesinde maddi destek sağlayan Ankara Tıplılar Vakfı na katkılarından dolayı teşekkür ederim. Dr. Hakan ERDEM ii

4 İÇİNDEKİLER Sayfa No: KABUL VE ONAY... i ÖNSÖZ... ii İÇİNDEKİLER... iii KISALTMALAR... v GRAFİKLER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii TABLOLAR DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER ANKİLOZAN SPONDİLİT AS Epidemiyolojisi Etyoloji ve Patogenez Ankilozan Spondilit Sınıflandırma Kriterleri Ankilozan Spondilitte Klinik Hastalık Aktivite İndeksi Ankilozan Spondilitte İmmünolojik Faktörler MAJOR HİSTOKOMPATİBİLİTE KOMPLEKS GENLERİ MHC-1 Genleri HLA-G HLA-G, HLA-G Polimorfizmi ve İmmunoloji Gen Polimorfizmi Tespitinde Kullanılan Moleküler Yöntemler HASTALAR ve YÖNTEMLER MOLEKÜLER ANALİZ YÖNTEMLERİ DNA İzolasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Poliakrilamid Jelin Hazırlanması ve Elektroforez iii

5 Poliakrilamid Jeli İçin Gümüş Boyama DNA Dizi Analizi İSTATİKSEL ANALİZ BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ ÖZET SUMMARY KAYNAKÇA EKLER EK-1. ETİK KURUL ONAY iv

6 KISALTMALAR AS AAÜ Anti-TNF BASDAI CRP Del DNA EDTA ESR Het HLA ILT-2 ILT-4 İns KIR mrna NK hücresi RA RBC SLE SpA SS THR : Ankilozan spondilit : Akut Anterior Üveit : Anti tümör nekrozis faktör : Bath Ankilozan Spondilit Hastalık Aktivite İndeksi : C - Reaktif protein : Delesyon : Deoksiribonükleik asit : Etilendiamin tetraasetik asit : Eritrosit Sedimantasyon Hızı : Heterozigot : Human Lökosit Antijen : Immunglobulin like transkript-2 (LILRB1/CD85J) : Immunglobulin like transkript-4 (LILRB2/CD85d) : İnsersiyon : Killer immunglobulin like reseptör (KIR2DL4/CD158d) : Messenger Ribonükleik asit : Doğal öldürücü (natural killer) hücre : Romatoid artrit : Red blood cell : Sistemik lupus eritematozus : Spondiloartropati : Sistemik skleroz : T hücre reseptörü v

7 GRAFİKLER DİZİNİ Sayfa No: Grafik 1. AS hastalarında aksiyel ve periferik tutulum oranı Grafik 2. Sağlıklı kontrol grubunda HLA-G polimorfizm dağılımı Grafik 3. AS hastalarında HLA-G polimorfizm dağılımı Grafik 4. AS hastaları ve sağlıklı kontrol grubunda HLA-G polimorfizm dağılımı Grafik 5. AS alt gruplarında HLA-G polimorfizm oranları Grafik 6. Aile öyküsü ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Grafik 7. Entezopati ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Grafik 8. Anterior üveit ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Grafik 9. HLA-B27 ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Grafik 10. ESR değerleri ve HLA-G ilişkisi Grafik 11. CRP değerleri ile HLA-G ilişkisi Grafik 12. İlk BASDAİ skoru ve HLA-G ilişkisi Grafik 13. Son BASDAİ skoru ve HLA-G ilişkisi Grafik 14. Anti TNF ilaç gereksinimi HLA-G polimorfizm ilişkisi vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No: Şekil 1. İnsan MHC Sınıf 1 bölgesindeki genler Şekil 2. MHC Sınıf 1 molekül modeli Şekil 3. HLA-G yapısı; ağır zincir mavi, β2 mikroglobülin yeşil ve peptid yapı ise mor renkte gösterilmiştir Şekil 4. HLA-G membran bağlı ve çözünebilir formları Şekil 5. HLA-G 3 UT bölgesinde yer alan 14 baz çifti Şekil 6. Polimeraz zincir reaksiyonu Şekil 7. Sanger metodu ile DNA dizi analizi Şekil 8. HLA-G geninin PCR ile çoğaltılan 210 bç lik bölümü (kırmızı renk primer bağlanma bölgelerini göstermektedir.) Şekil 9. Poliakrilamid Jel örneği vii

9 TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No: Tablo 1. Modifiye New York Kriterleri... 6 Tablo 2. Aksiyal spondiloartrit kriterleri... 7 Tablo 3. ASAS periferik spondiloartrit sınıflama kriterleri... 8 Tablo 4. Hasta ve kontrol grubu demografik özellikleri Tablo 5. Hastalarda aksiyel ve periferik tutulum dağılımı Tablo 6. AS hastaları ve sağlıklı kontrol grubunda HLA-G polimorfizm oranları Tablo 7. HLA-G polimorfizmleri dağılım ve yüzdeleri Tablo 8. HLA-G polimorfizmleri arasında karşılaştırma Tablo 9. HLA-G polimorfizmi ve AS aksiyel/periferal tutulumu ilişkisi Tablo 10. Aile Öyküsü ve HLA-G polimorfizmi ilişkisi Tablo11. Entezopati ve HLA-G polimorfizmi ilişkisi Tablo 12. Anterior üveit ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 13. HLA-B27 ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 14. ESR değerleri HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 15. CRP değerleri HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 16. İlk BASDAİ skoru ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 17. Son BASDAİ skoru ve HLA-G polimorfizm ilişkisi Tablo 18. Anti TNF ilaç gereksinimi ve HLA-G polimorfizm ilişkisi viii

10 1. GİRİŞ VE AMAÇ Ankilozan spondilit (AS) aksiyel iskeleti etkileyen kronik inflamatuar bir hastalık olarak, kronik bel ağrısına ve omurganın progresif ankilozuna neden olmaktadır. AS, spondiloartropati olarak adlandırılan hastalık grubunun prototip hastalığıdır (1,2). Ankilozan spondilit gelişiminde genetik faktörlerin rolünün %90 dan fazla olduğu bilinmektedir. Hastalığın majör doku uyumluluk (histokompatibilite) kompleks (MHC) antijenlerinden HLA-B27 ile olan ilişkisi net bir şekilde tanımlanmıştır (3). Hastalığın sıklığının yanısıra, hastalık başlangıç yaşı, klinik aktivasyon düzeyi ve radyolojik hastalık ciddiyetinin de, genetik faktörlerden etkilendiği bilinmektedir (4). Bu sonuçlara ulaşılan araştırmaların çoğunun HLA-B27 pozitif hasta grubunda gerçekleştirilmiş olduğu, buna rağmen özellikle hastalığın klinik özelliklerini belirleyen genetik faktörlerin belirleyici rolünün %40-62 arasında değiştiği bildirilmiştir. Bu araştırmaların sonucunda, hastalığın genetik özelliklerinin sadece HLA-B27 tarafından belirlenmediği düşünülmüştür. Aile ve ikizler üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilen veriler, HLA B27 dışında önemli sayıda genetik faktörün hastalık sürecinde etkin olduğunu destekler niteliktedir (1,4). Son yıllarda yapılan çalışmalarda HLA-G geni ve immüntolerans üzerindeki etkileri araştırılmıştır. HLA-G ekspresyonu ilk olarak sitotrofoblastlarda tanımlanmıştır. T hücre aracılı sitolizis ve NK (doğal öldürücü) hücreleri ile ilişkili sitolizisin inhibisyonu ile fetüsü maternal immüniteden korumaktadır (5). HLA-G sitotoksik T hücreleri ve doğal öldürücü hücrelerin aktivasyonunu inhibe edebilir. Alloproliferatif CD4+ T hücre cevabını, T ve NK hücrelerinin proliferasyonunu, antijen sunucu hücrelerin olgunlaşmasını ve fonksiyonlarını inhibe edebildiği gösterilmiştir (6). HLA-G ekspresyonu ve inflamatuvar hastalıklar arasındaki ilişki yeni bir araştırma alanıdır. Gendeki 14 bç (baz çifti) polimorfizmleri çeşitli romatolojik hastalıklarda araştırılmıştır. İnsersiyon alleli, sarkoidoz ve Behçet hastalığında yüksek sıklıkta gözlenmiştir; delesyon alleli ise, idyopatik dilate kardiyomiyopati ve pemfigus vulgariste risk faktörü olarak raporlanmıştır (7, 8, 9). 1

11 Romatoid artrit (RA) hastalarında yapılan çalışmalarda sağlıklı bireylere göre daha düşük HLA-G plazma seviyesi saptanmıştır. HLA-G polimorfizmi çalışmalarında ise, RA hastaları ve sağlıklı kontrol grupları arasında anlamlı fark gözlenmemiştir (9,10,11). Sistemik lupus eritematozus (SLE) hastalarında HLA-G plazma seviyesi ile ilgili değişik sonuçlar bildirilmiştir (10,11,12,13). SLE hastalarında serum HLA-G seviyeleri farklı çalışmalarda düşük ve yüksek olarak bildirilmiş olmalarına rağmen, 14 bç polimorfizm ins/ins genotipi SLE gelişimi açısından risk faktörü olarak tanımlanmıştır (9,13,14,15). Sistemik skleroz tanılı Brezilyalı hastalarda, cilt biyopsilerinde HLA-G ekspresyonu saptanmış; bu ekspresyon daha düşük sıklıkta, kütanöz vasküler ülserler, telenjiyektaziler, poliartritler ve daha iyi sağkalım oranları ile ilişkilendirilmiştir (9). HLA-G immün sistem regülasyonunda önemli role sahiptir. İmmün sistem hücreleri arasında geniş dağılıma sahip değişik reseptör tiplerine bağlanabilmektedir. Uzun dönem tolerojenik etkilerini baskılayıcı hücreler vasıtasıyla sürdürür. HLA-G negatif hücreler tragositozis (interselüler HLA-G yakalama) fenomeni ile, geçici olarak HLA-G pozitif hale gelebilir. HLA-G pozitif T hücreleri fizyolojik koşullarda çevresel kanda bulunabilir. Bu hücreler CD4+ veya CD8+ olabilir ve yüzeylerinde HLA-G1 ekspresyonu yaparlar. HLA-G ile indüklenmiş T hücreleri, ilk olarak in vitro ortamda antijen sunucu HLA-G1 pozitif hücrelerin allojenik stimülasyonu sonrasında tanımlanmıştır. Bu hücreler, düşük cevaplı ve otolog T hücrelerinin proliferasyonunu inhibe edici özelliklere sahiptir (9). Bu çalışmalar neticesinde HLA-G geninin immüntolerans üzerinde etkili olduğu ve inflamatuvar hastalıklarda önemli rol oynadığı sonucuna varılmıştır. Bu çalışmada, ankilozan spondilitli ve sağlıklı kontrollerde karşılaştırmalı olarak, 3 UTR bölgesindeki HLA-G gen ins/del polimorfizminin ankilozan spondilit gelişiminde ve hastalık aktivasyonunda belirleyici rolü olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. 2

12 2. GENEL BİLGİLER 2.1. ANKİLOZAN SPONDİLİT Ankilozan spondilit, aksiyel iskeleti etkileyen kronik inflamatuar bir hastalıktır. Kronik bel ağrısı ve omurganın progresif ankilozuna neden olmaktadır. AS genellikle yaşamın 2 ya da 3. dekadında ortaya çıkar. Erkekler kadınlara göre hastalıktan 2-3 kat daha yüksek oranda etkilenmektedir. Hastalık klinik seyrine bakıldığında erkeklerde daha şiddetli klinik seyir izlenmektedir (1,2). Ankilozan spondilit ailelerde kümelenme gösteren bir hastalıktır. Ailesel özelliğinin ortaya çıkmasında paylaşılan genetik özelliklerin yanı sıra çevresel faktörlerin de rol oynadığı düşünülmektedir. Ankilozan spondilit gelişiminde genetik faktörlerin rolünün %90 dan fazla olduğu bilinmektedir. Hastalığın majör doku uyumluluk kompleks (MHC) antijenlerinden HLA-B27 ile olan ilişkisi net bir şekilde tanımlanmıştır. HLA-B27 ile AS arasındaki genetik ilişki patolojik olarak bilinen en güçlü ilişki olarak kabul edilmektedir. Bu sonuçlara ulaşılan araştırmaların çoğunun HLA-B27 pozitif hasta grubunda gerçekleştirilmiş olduğu, buna rağmen özellikle hastalığın klinik özelliklerini belirleyen genetik faktörlerin belirleyici rolünün %40-62 arasında değiştiği bildirilmiştir. Bu araştırmaların sonucunda hastalığın genetik özelliklerinin sadece HLA-B27 tarafından belirlenmediği düşünülmüştür. Aile ve ikizler üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilen veriler, HLA B27 dışında önemli sayıda genetik faktörün hastalık sürecinde etkin olduğunu destekler niteliktedir (1,2,4). AS deki en yaygın enflamasyon bölgeleri sakroiliak eklemler, entezit noktaları, intervertebral disklere bitişik vertebral cisimler, periferik eklem sinovyum, gastrointestinal sistem ve gözü içerir. Erken sakroiliitte miksoid görünüşlü kemik iliği ve ardından pannus ve granülasyon dokusu oluşumu ile sinovit söz konusudur (1,16). Ankilozan spondilit omurga ve komşu yapıların daha az sıklıkta da periferik eklemlerin tutulumu ile karakterize sebebi bilinmeyen, kronik, sistemik, inflamatuar bir hastalıktır. AS in kardinal bulgusu radyografik sakroiliit ve spondilitin eşlik ettiği inflamatuar bel ağrısıdır. Hastalığın kliniği, asemptomatik sakroiliitten ileri derecede 3

13 deformitelerin ve ekstra artiküler bulguların eşlik ettiği şiddetli tutuluma kadar değişkenlik gösterir (1) AS Epidemiyolojisi AS insidans ve prevalansı değişik toplumlarda araştırılmıştır. Kuzey Norveç te hastalık insidansı de 7,26 bulunmuştur. Yunanistan da yapılan bir çalışmada AS prevalansı %0,29 olarak saptanmıştır. Çek Cumhuriyeti nde yaşa göre standardize edilmiş AS insidansı yıllık 6,4/ olarak bulunmuş. Çin de yapılan çalışmalarda AS prevalansı toplumların etnik özelliklerine göre %0,06 ile %0,54 arasında değişmektedir. Finlandiya da yapılan araştırmada hastalık prevalansı %0,15 saptanmıştır (1,17,18,19,20). Türkiye de yapılan bir araştırmada İzmir de AS prevalansının %0,49, AS hastalarının da dahil edildiği genel spondiloartropati prevalansının ise %1,05 düzeyinde olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada AS için kadın/erkek oranı 1,2 bulunmuştur. Spondiloartropatilerde ise erkek/kadın oranı 0,7 saptanmıştır (21). Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından yapılan ve doğu karadeniz bölgesinde AS prevalansının araştırıldığı bir çalışmada ise hastalık prevalansı %0,25 saptanmıştır. Bu çalışmada cinsiyet dağılımına göre prevalans değerlerinin erkeklerde %0,44, kadınlarda ise %0,05 olduğu bulunmuştur (22) Etyoloji ve Patogenez AS, HLA-B27 ile ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır. Spondiloartrit grubu hastalıkları içinde yer alan bir grup hastalığın önemli bir öğesidir. Hastalığın etyolojisi açık olmamakla birlikte iyi bilinen genetik bir yapısı mevcuttur. İki farklı AS ikiz çalışmasında monozigot ikizlerde %63, dizigot ikizlerde %13 lük kümelenme saptanmıştır. Genetik alt yapıya bağlı hastalık geliştirme riski %90 olarak tahmin edilmiştir. İlk kez 1973 yılında tanımlanan AS ve HLA-B27 genleri arasındaki ilişki günümüzde kesin olarak bilinmektedir. AS li hastaların %90-95 inde HLA-B27 pozitif olmasına rağmen, B27 hastalık için genetik riskin üçte birinin daha azından sorumludur. HLA-B27 pozitif kişilerde seropozitif yakını yoksa 4

14 hastalık gelişme riski %5 saptanmıştır. Birinci derecede AS tanılı akrabası olanlarda risk 5-16 kat artmaktadır (4). Avrupa ve Tayvan da HLA-B27 pozitif ve negatif hastalarda AS riski HLA-B60 ile ilişkili bulunmuştur (1) ve 2010 yıllarında yapılan iki insan genom çalışmasında AS için yüksek risk taşıyan altı lokus daha saptanmıştır. Bunlar endoplazmik retikulum aminopeptidaz 1 (ERAP1), interlökin-23 reseptör (IL-23R), interlökin-1 reseptör tip II (IL-1R2), antrax toksin reseptör 2 (ANTXR2) ve kodlanmamış 2 gen sekansıdır (1,23). Ankilozan spondilit lezyonlarının histopatolojisine bakıldığında inflamasyon alanında; doğal öldürücü (NK) hücreler, B lenfositler, T lenfositler, makrofajlar, proliferasyon yapıcı fibroblastlar ve neovaskülarizasyon eşlik etmektedir. Aşırı TNFα ve TGF-β mrna ekspresyonu görülür. Parçalanmış kemik sonunda yenilenir ve endokondral ossifikasyon kemik ankilozu ile sonuçlanır. Ankilozan spondilitin sık rastlanan lezyonu entezit kemik iliği infiltrasyonu ile birlikte hiperosteoklastik, enflamatuar, aşındırıcı lezyonları içerir. Entezit patolojisinde, tendonların kemikle birleştikleri fibrokartilaginöz bölgelerde ve kemik dokuda ödem ile makrofajlar ve CD 8+ T hücrelerinin hakim olduğu hücresel infiltrasyon dikkat çeker (16,24,25,26,27). Son yıllarda yapılan çalışmalarda HLA-G gen ürünlerinin immünitede önemli role sahip oldukları gözlenmiştir. HLA-G antijenleri sitokin ve kemokin sekresyonu ile ilişkili olup immün cevabı modüle edici özellikleri vardır. HLA-G gen antijenleri sitotoksik CD8+ T hücre ve NK hücrelerini inhibe etmeleri ve sitotoksik CD8+ hücre aracılı apopitozu önlemeleri, CD4+ T hücre proliferasyonunu inhibe etmeleri ve bu hücrelerin immunsupresif özelliklerini baskın hale getirmeleri, antijen sunucu hücrelerin ve B hücrelerinin farklılaşmasını inhibe etmeleri, TH1/TH2 dengesini TH2 yönüne kaydırmaları, regülatuar T hücrelerini indüklemeleri açısından önem taşımaktadır (10). HLA-G B lenfosit, T lenfosit, NK, monosit, makrofaj ve dendritik hücrelerde eksprese edilen üç inhibitör reseptörün ligandıdır. HLA-G inhibitör etkilerini ILT2-4 ve KIR reseptörleri üzerinden gösterir. ILT2 reseptörleri üzerinden lenfoid ve myeloid hücreler ile; ILT4 reseptörleri üzerinden dendritik hücreler, makrofajlar ve 5

15 monositler ile; KIR reseptörleri üzerinden ise NK ve CD8+ T hücreleri ile etkileşim halindedirler. Bu etkileşim neticesinde NK ve CD8 (+) T hücrelerinin proliferasyonu ve sitotoksik fonksiyonları inhibe olur (9,27,10,28). Bu verilerden yola çıkılarak son zamanlarda yapılan araştırmalarda HLA-G gen polimorfizmlerinin romatolojik hastalıklar ile olan ilişkileri araştırılmaktadır Ankilozan Spondilit Sınıflandırma Kriterleri Ankilozan spondilit bilindiği gibi genç erişkinleri özellikle hayatın 3. dekadında etkileyen kronik inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın en önemli özelliği aksiyel tutulum olup, ilerleyen hastalıkta hastaların %90 ında radyografik sakroiliit görülür. Radyografik olarak sakroiliit saptanması bazı hastalarda yıllar almakta ve böylelikle tanıda gecikme yaşanmaktadır. Modifiye New York kriterleri hastalığın erken evrelerinde duyarlılığını yitirmektedir (1,29). Tablo 1. Modifiye New York Kriterleri Modifiye New York kriterleri Klinik Kriterler 1. Üç aydan daha fazla süredir egzersizle düzelen ancak istirahatle geçmeyen bel ağrısı ve sertlik 2. Lomber omurga hareketlerinin hem sagital hem de frontal planlarda kısıtlanması 3. Yaş ve cinsiyete uygun normal değerlere göre göğüs ekspansiyonunda daralma 2. Radyolojik Kriterler Sakroiliit bilateral evre>2 veya tek taraflı evre 3-4 Kesin AS için; unilateral evre 3-4 sakroiliit veya bilateral evre 2-4 sakroiliit ve herhangi bir klinik kriter Olası AS; üç klinik kriter varlığı veya radyolojik kriterlerin klinik kriterler olmaksızın varlığı Ankilozan spondilitte tanı gecikmesi yaklaşık 5 yıl olup bu süre, jüvenil başlangıçlı formlarda, kadınlarda ve HLA B27 negatif olan kişilerde daha da uzamaktadır. Erken tanıda önemli olan nokta inflamatuar bel ağrısı ve direkt 6

16 radyografilerde saptanamayan sakroiliit bulgularının preradyografik dönemde gösterilebilmesidir. Hastalıkta tanı ve tedavi gecikmesi nedeni ile ortaya atılan görüşler neticesinde erken spondiloartritler için bir çatı oluşturacak olan aksiyal SPA terimi doğmuştur. Tanısal olasılığı artırmak için klinik bulguların, laboratuar bulgularının ve görüntülemenin de eşlik ettiği tanısal bir algoritma oluşturulması bu hastaların daha erken tanınmasına ve tedavilerinin de erken başlanmasına neden olacaktır. Assessement of Spondyloarthritis International Society (ASAS) tarafından yapılan uluslararası çalışmanın sonucunda aksiyal spondiloartropati kriterleri oluşturulmuştur (1,30). Tablo 2. Aksiyal spondiloartrit kriterleri ASAS aksiyal spondiloartrit sınıflama kriterleri (bel ağrısı süresi 3 ay olan ve başlangıç yaşı<45 yaş olan hastalarda) Görüntülemede sakroiliit ve 1 SpA bulgusu VEYA HLA B27 ve 2 SpA bulgusu Görüntüleme MRG de aktif inflamasyon Modifiye New York kriterlerine göre kesin radyografik sakroiliit SpA bulguları İnflamatuar bel ağrısı Artrit Entezit (topuk) Üveit Daktilit Psöriyazis Crohn/Kolit NSAİİ iyi yanıt SpA için aile öyküsü HLA B27 Artmış CRP ASAS kriterlerinde sakroilitin MR ile görüntülenmesi büyük öneme sahiptir. Sakroiliak eklem ve çevresinde görülen aktif inflamatuar lezyonlar/akut değişiklikler (en iyi STIR veya T1 kontrastlı serilerde); kemik iliği ödemi (osteit), kapsülit, sinovit 7

17 ve entezit olarak tanımlanırken, kronik inflamatuar lezyonlar/yapısal hasarlar; skleroz, erozyon, yağ depolanması ve ankiloz olarak tanımlanmıştır. ASAS aksiyal SpA sınıflandırma kriterleri, aksiyel iskelet tutulumuyla birlikte periferik tutulumu olan veya olmayan hastalara odaklanmış kriterlerdir (1,30). Tablo 3. ASAS periferik spondiloartrit sınıflama kriterleri Periferik artrit ve/veya entezit ve/veya daktilit (Ek olarak) 1 SpA bulgusu Üveit Psöriazis İnflamatuar barsak hastalığı Enfeksiyon öyküsü HLA B27 veya 2 diğer SpA bulgusu Artrit Entezit Daktilit İnflamatuar sırt ağrısı SpA aile öyküsü (31). Görüntülemede sakroiliit Ankilozan Spondilitte Klinik Spondiloartropati grubunun bir üyesi olan AS sebebi bilinmeyen, kronik, sistemik, enflamatuar bir hastalıktır. AS sıklıkla 3. dekatta pik yapmasına karşın geç başlangıçlı formları da mevcuttur. Öncelikli olarak omurgayı tutan bazen periferik eklemleri ve eklem dışı dokuları da etkileyebilen bir hastalıktır. AS klinik bulguları iskelet bulguları ve iskelet dışı bulguları olarak iki başlıkta incelenebilir (1,4). İskelet tutulumunda en çok etkilenen bölge omurga ve sakroiliak eklemlerdir. Omurga tutulumunda görülen bel ağrısı gluteal bölgede hissedilen, künt karakterli bir ağrıdır. Tipik olarak sabah erken saatlerde kötüleşir ve en az 30 dakika süren sabah 8

18 tutukluğu eşlik eder. İstirahatle şiddeti artan, egzersiz ile azalan niteliktedir (1,29). Başlangıçta sakroiliak eklemin aşağı ön sinovyal bölümü etkilenir. Entezit omurga boyunca sakroiliak eklemler, intervertebral diskler, kostovertebral eklemler, interspinöz ve paravertebral ligamanların bağlantı yerlerinde manubriosternal eklem ve symphizis pubisin ligamantöz yapılarında görülür (1,3). Manubriosternal ve kostovertebral, kostotransversal, kostosternal eklemlerin etkilenimi ile göğüs ağrısı oluşabilir (32). Alt ekstremitelerde aşil tendonu ve plantar fasyanın kalkaneusa yapışma yerinde de entezit görülebilir. Hastalığın ileri dönemlerinde omurganın ilerleyici ankilozu sonucunda lomber lordozun kaybına ve dorsal kifoza yol açar. Göğüs ekspansiyonu kısıtlanır. Hastaların yaklaşık %50 sinde kalça ve omuz eklemleri etkilenir. Kalça eklemi tutulumunda fleksiyon kontraktürü gelişir. Kök eklemler dışında diz, ayak bileği ve metatarsofalengeal eklemlerde tutulabilir. Temporomandibüler eklem tutulumuna bağlı olarak çiğneme fonksiyonları etkilenebilir. Omuz tutulumuna bağlı olarak rotator manşon yırtıkları oluşabilir. Sinovit oligoartiküler, asimetrik ve tekrarlayıcı karakterdedir (2,33). Uzun süreli AS hastalarının yaklaşık yarısında osteoporoz ya da osteopeni görülür (34). Hastalık aktivitesine bağlı azalmış mobilite, proinflamatuar sitokinlerin lokal etkisi ve kullanılan tedavi ajanları osteoporozdan sorumlu olabilir. Sindesmofit ve ligaman kalsifikasyonlarının ölçüm alanı içinde olması durumunda kemik mineral yoğunluğu değerleri yanlış yüksek görüleceğinden KMD ölçümlerinde BT kullanılabilir. AS hastalarında görülen bir diğer iskelet sistemi lezyonu spondilodiskittir. Genelde torasik ve lomber omrgada görülür ve lokal ağrı, hassasiyete neden olur (35). AS de iskelet dışı tutulumda etkilenen organ sistemleri göz, kalp, akciğer, renal, gastrointestinal sistem, genitoüriner sistem ve sinir sistemidir. En sık rastlanan sistemik bulgu ve belirtiler subfebril ateş, iştahsızlık, kilo kaybı ve yaşam kalitesinde azalmadır. Akut anterior üveit (AAÜ) AS in en sık iskelet dışı bulgusudur. Hastaların yaklaşık %40 ında görülür (36). Göz tutulumu olan hastaların %90 ında HLA B27 9

19 pozitiftir. Erkeklerde daha sıktır. Kadınlarda ise gebelik dönemlerinde sıklığı artmaktadır. AAÜ atağı unilateral ani başlangıçlı ve kendini sınırlayıcı özelliktedir. AAÜ atağı dışında özellikle inflamatuar barsak hastalıklarının eşlik ettiği olgularda ağır seyirli posterior üveit atakları bildirilmiştir. Hastalarda ani başlayan ağrı, kızarıklık, görme bulanıklığı, artmış lakrimasyon, fotofobi ve myozis mevcuttur. Yeterli tedavi edilmediğinde katarakt ve maküler ödemle sonuçlanan anterior ve posterior sineşilere yol açabilir (1). AS de görülen kardiyak komplikasyonlar aortit, kapak hastalıkları ve iletim anormallikleridir. AS hastalarında kardiyak tutulum sıklığı %9 dur ve hastalığın ilerleyen dönemlerinde görülür (37). Perikardit, kardiyomiyopati ve mitral kapak hastalığı daha az oranda görülür. Kardiyak tutulum gösteren hastaların tamamına yakını HLA B27 pozitiftir. Etkilenmiş eklemler ve kardiyak lezyonların benzer histopatolojik özellikleri olduğu gösterilmiş ve HLA B27 ile ilişkilendirilmiştir (3). Periferik eklem tutulumu olan hastalarda kardiyak tutulum ve iletim sorunları daha sıktır. Aortik rejurjitasyon aort kökünün dilatasyonu, kapakçıkların fibröz kalınlaşması ve retraksiyonu ile kapakçıkların kenarlarının içeriye doğru dönmesi sonucu ortaya çıkan aort yetmezliğinin bir sonucudur. Aortik rejurjitasyona bağlı gelişen sol ventriküler dilatasyon sonucu mitral rejurjitasyon görülebilir. Atriyoventriküler ve interventriküler blok en sık görülen iletim anormallikleridir ve hastalığı 30 yıldır devam edenlerde %8,5 oranında görülür (2). Bloklar prognozu ve yaşam süresini etkilemez. Perikardit, perikardial efüzyon, asendan aort anevrizması hastalık seyrinde gelişen nadir bulgulardır (1). Akciğer tutulumu AS seyrinde %1 oranında görülür. Apikal lob fibrozisi, miçetoma oluşumu ve plevral kalınlaşma en sık görülen bulgulardır (2,3). Öksürük dispne ve hemoptizi gibi semptomlara yol açabilir. Erkeklerde daha sık görülür ve kavitelerin enfekte olması dışında asemptomatiktir. Kostovertebral eklem füzyonu ve torakal omurga ankilozu sonucunda restriktif AC fonksiyon bozukluğu gelişebilir. AS tanılı 32 hasta ile yapılan çalışmada vital kapasitenin beklenen değerlerin %88 i kadar olduğu ve bunun göğüs kafesi kompliyansının azalmasına bağlı olduğu gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda AS hastalarında HRCT kullanılması ile AC tutulumunun aslında beklenenden daha yüksek olduğu gösterilmiştir. HRCT de en sık görülen bulgular lineer opasiteler ve bronşial kalınlaşmalardır (38). 10

20 AS de renal tutulum görülmez ancak sekonder amiloidoza daha az sıklıkta da non steroid anti-enflamatuar ilaç (NSAİİ) kullanımına bağlı olarak nefropati, IgA nefropatisi ve glomerülonefrit görülebilir. Uzun süren hastalıkta ve periferik eklem tutulumu, artmış ESR, hipergamaglobulinemi ile birlikte daha sık görülür. Nefrotik düzeyde proteinüri görülebilir ve son dönem böbrek yetmezliğine ilerleyebilir. IgA nefropatisi daha nadirdir. Uzun süreli NSAİİ kullanımına bağlı olarak interstisyel nefrit görülebilmektedir (1). AS hastalarının yaklaşık %60 ında kolonoskopi ile intestinal inflamasyon saptanmıştır. AS deki barsak inflamasyonu immünolojik olarak crohn hastalığında görülen ile ilişkili olduğu düşünülmektedir (3). AS ve Crohn hastalarından alınan ileal biopsi bulguları iki hastalık arasında belirgin ilişki olduğunu göstermektedir. Şiddetli eroziv periferal ve kalça artriti olanlarda kronik inflamatuar barsak lezyonları daha sık rastlanmaktadır. Bu hastaların bir kısmında inflamatuar barsak hastalığı gelişir. AS deki barsak inflamasyonunun önemi bilinmemektedir. Barsak inflamasyonu sonucunda insan antijenlerine veya mikroorganizmalara karşı barsak bariyerinin bozulmasının kıkırdak dokuya yönelik HLA B27 ile ilişkili bir immün yanıtı başlattığı düşünülmektedir. AS li hastalarda düşük erektil ve orgazmik fonksiyonlar görülmektedir. Erektil disfonksiyonun sabah tutukluğu ile ilgili olduğu saptanmıştır. AS li hastalarda seksüel fonksiyon bozukluğu olmadığına dair sonuçları olan yayınlarda mevcuttur (1). AS hastalarında nörolojik tutulum spinal kırıklar, atlantoaksiyel subluksasyon ya da kauda ekina sendromundan oluşur. Spinal kırıklar ankiloze omurganın minör travmaları sonucunda C5-6 ve C6-7 seviyelerinde meydana gelir. Bu kırıklar medüller yaralanmaya neden olursa mortalite yükselir (1,25). Omurga daha alt segmentlerinde servikotorasik ve torakolomber geçiş bölgelerinde stres kırkları uzun süreli hastalığa bağlı olarak ortaya çıkar. AS de atlantoaksiyel subluksasyon %2 sıklıkta görülür. Periodontial proliferatif pannus, anterior ve posterior longitüdinal ligamanların ossifikasyonuna bağlı transvers ligaman hasarı, inflamatuar lezyonlar ve fiziksel stres atlanto aksiyel subluksasyon nedenleri arsında sayılabilir (39,40). AS de görülen kauda ekina sendromunun araknoidite bağlı lumbosakral sinir kökü 11

21 hasarı ile oluştuğu düşünülmektedir. AS hastalarında geç görülen bir bulgudur. Duyusal, motor ya da refleks kaybını izleyen sfinkter bozuklukları görülebilir. Hastaların yaklaşık yarısında nörojenik kaynaklı rektal ya da alt ekstremite ağrısı görülür. Diğer olası mekanizma kaudal kesenin kompliyansında azalma ile serebrospinal sıvı basıncında artış ve zamanla kaudal kesede genişleme ve kemik dokuda erozyon oluşumu ile lumbosakral sinir kökü hasarı oluşturduğudur (1) Hastalık Aktivite İndeksi AS de laboratuar bulgularıyla klinik veya görüntüleme bulguları her zaman birbiriyle uyumlu olmayabilir. Bu nedenle hastalık aktivitesini değerlendirmede sadece laboratuar verileri değil inflamasyonu işaret eden hasta bildirimli sorulara alınan yanıtlarda dikkate alınmalıdır. Bath Ankilozan Hastalık Aktivite İndeksi (BASDAİ) tüm bunları kapsayan komposit bir indeks olup değişimlere hassastır ve Türkçe geçerlilik ve güvenilirliği test edilmiştir. BASDAİ en yaygın kullanılan hastalık aktivite indeksidir. Garrett ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu sklada yorgunluk, spinal ve periferik eklem tutulumlarına bağlı ağrı, entezit bölgelerindeki lokalize hasssayet ile sabah tutukluğunun süre ve şiddeti değerlendirilir. Bu amaçla hastaya 6 soru sorulur, VAS kullanarak 0-10 arası puan vermesi istenir Sorudaki cevaplar toplanıp ikiye bölünür, çıkan sonuç ile diğer puanlar toplanıp sonuç 5 e bölünür. Elde edilen skor 0-3 arasında ise hafif, 3,1-5 arasında ise orta; 5,1-7 arasında ise şiddetli ve 7,1-10 arasında ise hastalık çok şiddetli olarak belirlenir. Genel pratik uygulamada 4 ve üzeri skora sahip hastalar aktif, altındakiler ise inaktif olarak değerlendirilmektedir (41,42) Ankilozan Spondilitte İmmünolojik Faktörler Erken lezyonlarda makrofajların ve T hücrelerinin infiltrasyonu ve TNF alfa gibi proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonu ön plandadır. Sakroiliak eklem incelemelerinde sinovial dokuda inflamasyonla birlikte, kemik iliği miksoid görünümde bulunur. Sinovial dokudaki inflamasyon pannus ve granülasyon dokusu oluşumuna neden olabilir. Dokularda CD4+ hücreler daha baskın olmak üzere T hücreleri ve CD 68+ makrofajların yaptığı infiltrasyon fibroblast proliferasyonuna ve 12

22 neovaskülarizasyona yol açar ve inflamasyon bölgesinde artmış TNF alfa ile, daha az oranda da olsa TGF beta ekspresyonu görülür. İnflamasyon dokusunda uyarılmış T hücreleri, doğal öldürücü (NK) hücreler, B lenfositleri ve CD 68+ makrofajlar dışında, artmış oranda CD 163 eksprese eden makrofajlar bulunur. Entezit patolojisinde, tendonların kemikle birleştikleri fibrokartilaginöz bölgelerde ve kemik dokuda ödem ile makrofajlar ve CD 8+ T hücrelerinin hakim olduğu hücresel infiltrasyon dikkat çeker (6,24,25,27,43) MAJOR HİSTOKOMPATİBİLİTE KOMPLEKS GENLERİ MHC-1 Genleri İmmun yanıt oluşumunda T hücrelere antijen sunumundan sorumlu proteinler MHC sınıf 1 ve 2 proteinleridir ve bunlar aslında doku uygunluk (histokompatibilite) antijenleri olarak bulunmuşlardır. Majör doku uygunluk kompleksi loküsü 100 den fazla ayrı genden oluşur. MHC kompleksinin detayları bir türden sonrakine değişmekle birlikte tüm memeli türleri MHC taşırlar. İnsanlarda MHC HLA olarak bilinir (44). Üç temel insan MHC sınıf 1 loküsü HLA-A, HLA-B, HLA- C dir. HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H sınıf 1b genleridir (Şekil 1). A, B, C loküsü gen ürünlerinden farklı olarak daha az polimorfiktirler ve son çalışmalar çeşitli fonksiyonları olduğunu ortaya koymuştur. HLA-G gen ürünleri antijenik peptidlere bağlanabilir ancak immüntolerans ile ilişkilidir (44). Şekil 1. İnsan MHC Sınıf 1 bölgesindeki genler (44) MHC sınıf 1 molekülü antijenik peptidin CD 8+ T hücresine sunumunda rol almaktadır. MHC sınıf 1 molekülü Kd luk β2-mikro globülin olarak adlandırılan ve MHC dışında kodlanan bir proteinden oluşur. Alfa zincirinin amino terminal α1 ve α2 segmentlerinin herbiri yaklaşık 90 aminoasit rezidüsünden oluşur. Alfa 1 ve 2 domainleri 8-11 aminoasit uzunluğunda peptidlerin yerleşebileceği büyüklükte bir peptid bağlama yarığı oluştururlar. Bu bağlama oluğunun tabanı T 13

23 lenfositlerine gösterilecek peptidlerin bağlandığı kısım, oluğun yanları ve üst kısmı ise T hücre reseptörü ile temas halinde bulunan kısımdır. Sınıf 1 moleküllerinin polimorfik noktaları, yani farklı bireylerin MHC molekülleri arasında farklılık gösteren aminoasitleri, α zincirinin α1 ve α2 alt birimlerinde yer alır. Polimorfik noktalardan bazıları oluğun tabanında yer alır ve böylece değişik MHC moleküllerinin peptid bağlama özelliklerinde değişkenliğe yol açar. Bu polimorfik noktalardan bazıları oluğun tepesinde değişikliğe neden olarak T hücre reseptörünün MHC molekülünü tanımasını etkiler. Zincirin alfa3 segmentinin aminoasit sekansı nonpolimorfiktir ve T hücre eş reseptörü CD8 in bağlandığı yerdir. T hücre aktivasyonu için T hücre reseptörünün MHC ile gösterilen peptidi tanıması ve eş zamanlı olarak T hücre eş reseptörünün MHC ile bağlanması gerekir. Sınıf 1 molekülün transmembran bölgesi 25 hidrofobik aminoasitten oluşurken; 30 rezidüden oluşan bir sitoplazmik kuyruğa sahiptir. Β2-mikroglobülin α3 ile nonkovalan olarak etkileşir. Beta2-mikroglobülin de yapısal olarak immunglobülin domainine homologtur ve tüm sınıf-1 molekülleri içinde değişmez. Sınıf-1 molekülün stabil ekspresyonu α-zinciri, β2-mikrogloülin ve bağlanmış antijenik peptidden oluşan heterodimer yapının varlığıyla sağlanır. Β2-mikroglobülin ve α3 etkileşimi α1 ve α2 tarafından oluşturulan oluğun peptid antijenleri bağlamasını stabilize ederken; peptidin bağlanması da β2-mikroglobülin α3 etkileşimini kuvvetlendirir. MHC moleküllerinin peptid bağlama oluğu protein yapılı antijenlerden kaynaklanan peptidleri bağlar ve bu peptidleri tanıması için T hücrelerine gösterir. MHC moleküllerinin çoğunun peptid bağlama oluğunun tabanında cepler vardır. Amino ucundan karboksi ucuna kadar uzanan ve A dan F ye kadar adlandırılan 6 cep tanımlanmıştır. HLA B -27 nin, HLA sınıf 1 alellerine bağlı olarak ortaya çıkan ayırt edici özelliği ağır zincirin B cebi olarak bilinen rezidüsüne bağlıdır. Bu B cebi antijenik peptidin 2. rezidüsü (P2) ile uyum göstermektedir. Glutamik asidin, HLA B27 nin B cebini kaplaması önemlidir; B cebi antijenik peptiddeki arjinin rezidüsü ile uyum göstermektedir. Sitozolik protein antijenlerden peptid sentezlenmesi için kullanılan mekanizma proteolizistir. İşlem proteozom adı verilen 700 kd luk molekül aracılığı 14

24 ile gerçekleşir. Sitozolik proteinler ubiquitin adı verilen polipeptid kopyaları ile bağlanarak proteozomda degredasyona hazırlanır. Ubiquitin ile bağlanmanın ardından protein lineer hale gelir. Daha sonra ubiquitin çıkarılır ve proteinler proteozomlar tarafından işlenir. Oluşturulan peptidler ER a getirilerek MHC sınıf 1 moleküllerle bağlanır. TAP (transporter associated with Ag processing) adı verilen transport molekülü ER membranının lümen tarafında tapasin aracılığıyla sınıf 1 molekülüne non-kovalan olarak bağlanır. ER a transloke olan peptidler TAP dimerine bağlanmış MHC sınıf 1 molekülüne bağlanır. ER içine alınan peptid boş MHC sınıf 1 molekül oluğuna bağlanır. Peptid MHC sınıf 1 kompleksi tapasinden ayrılarak ER dan çıkar ve hücre yüzeyine transport olur. Peptid MHC sınıf 1 kompleksi golgi kompleksine, oradan da ekzositik veziküllerle hücre yüzeyine ulaşarak CD 8+ sitolitik T lenfositlerine sunulur (26). MHC sınıf 1 bölgesindeki aa sekans değişkenlikleri α1 ve α2 büklümlerinin üç ana bölgesinde toplanmıştır. Α3 büklümünün ise daha korunmuş halde olduğu görülmüştür. α1 ve α2 büklümleri antijenik peptidlerle ve THR (T hücre reseptörü) ile etkileşirken α3 büklümü monomorfik CD 8 molekülü ile etkileşir. MHC sınıf 1 moleküllerindeki polimorfik aminoasitlerin çoğu peptid bağlayıcı bölgenin çevresinde molekülün tepe kısmında toplanır. Bu nedenle değişiklikler antijen bağlanma oluğunun tabanında veya alfa heliksin yanlarındaki noktalarda yer alır. Bu polimorfizm farklı MHC moleküllerinin antijenik peptidlere bağlanma yeteneğini etkiler (Şekil 2) (44). MHC moleküllerindeki genetik değişiklikler: Antikor üretim düzeyini de içeren immün yanıt oluşturma yeteneğini Enfeksiyon hastalıklarına direnç ve duyarlılığı Otoimmün hastalıklar alerjilere direnç veya duyarlılığı etkiler. Bu bilgiler ışığında MHC molekülünün neden bu denli polimorfik yapıya sahip olduğunu anlayabiliriz. Bir birey birkaç MHC molekülü kazanarak çeşit çeşit antijenler sunabilir ve böylece etkin bir immun yanıt oluşturabilir. Bu nedenle de farklı MHC moleküllerine sahip olmak seçici bir avantaj sağlar (44). Vücudun tüm çekirdekli hücreleri MHC sınıf 1 molekülü sunarlar. MHC molekülleri birbirine eşit üstünlükte sunulurlar. Bunun anlamı, bir bireyde temel 15

25 MHC gen loküslerinin hem anne hem babadan gelen kromozomlardan sunulmasıdır. insanlarda MHC gen loküsü polimorfik olduğundan çoğu birey tümü hücre yüzeyinde sunulabilen altı farklı sınıf 1 molekül geni taşıyabilirler. Her bir MHC molekülü çok az farklı bir şekildedir ve farklı antijenik peptid setleri sunar (44). Şekil 2. MHC Sınıf 1 molekül modeli (44) HLA-G HLA-G 6.kromozom kısa kolu üzerinde (6p21) kodlanmış klasik olmayan MHC sınıf 1b HLA molekülüdür (şekil 3). HLA bölgesinde HLA-A ve HLA-F arasında yer alır. 7 intron ve 8 ekzon tanımlanmıştır. Ekzon 1 sinyal peptidi kodlarken, ekzon 2, 3, 4 ise ekstraselüler α1, α2 ve α3 domainlerini kodlar. Ekzon 5 ve 6 ağır zincirin transmembran ve sitoplazmik domainlerini kodlar. Ekzon 7 16

26 bölgesinde transkripsiyon olmaz ve ekzon 8 bölgesi 3 UT bölgesi ile ilişkilidir (45,46,47). Şekil 3. HLA-G yapısı; ağır zincir mavi, β2 mikroglobülin yeşil ve peptid yapı ise mor renkte gösterilmiştir (45). Diğer klasik HLA moleküllerinden protein çeşitliliğinin kısıtlı olması, membran bağlı ve çözünebilir izoformlarının olması, kısaltılmış sitoplazmik kuyruk gibi özel bir molekül yapısına sahip olması, immünolojik cevap modülasyonunda görev alması, kısıtlı allelik polimorfizminin olması ve kısıtlı doku ekspresyonu gibi nedenlerle ayrılır (11,46). HLA-G, stres ile indüklenebilen bir gendir. Isı şoku ve hipoksemi uyarısı ile farklı HLA-G alternatif transkripsiyonlarının artışı söz konusudur (10). Fizyolojik koşullarda HLA-G ekspresyonu kornea, timüs, eritroid ve endotelyal prekürsörlerde gözlenmektedir ve temel olarak aktive olmuş CD14+ 17

27 monositler tarafından üretilmektedir. Fizyolojik olmayan koşullarda örneğin viral enfeksiyon, kanser, transplantasyon, inflamatuar ve otoimmün hastalıklarda HLA-G moleküllerinin modifiye ekspresyonları gözlenmiştir (10,11). HLA-G1, G2, G3, G4 izoformları transmembran ve solubl olan G5, G6, G7 izoformları ise sitoplazmik domainlere sahiptir (Şekil 4). Membrana bağlı ya da solubl HLA-G etkisi ile reseptörler upregüle olur (28,48). Her iki formda inhibitör reseptörlere bağlanarak etki gösterir (48). HLA-G, NK hücreleri ve CD8+ T lenfositlerinin sitolitik etkileri üzerinde direk inhibitör etkiye sahiptir (11,46). Şekil 4. HLA-G membran bağlı ve çözünebilir formları (48) Ekzon 8 de yer alan 3 UTR bölgesindeki ins/del polimorfizmleri mrna stabilite, mobilizasyon ve ekspresyonunu kapsar (Şekil 5). HLA-G geni 3 UT bölgesi AU zengin ve bir poli-a sinyali içeren bir bölgedir ve mrna stabilitesi ile ilişkilidir (46). Özellikle DEL alleli mrna stabilizasyonu ve yüksek oranda HLA-G ekspresyonu ile ilişkilidir (10). 14 bç insersiyon alleli unstabil mrna ve daha düşük düzeyde solubl HLA ile ilişkili bulunmuştur. Bu da genotipler arası inflamasyon cevabında farklılık yaratır (15). 18

28 Şekil 5. HLA-G 3 UT bölgesinde yer alan 14 baz çifti (15) HLA-G, HLA-G Polimorfizmi ve İmmunoloji HLA G molekülleri kendine özgü 4 adet membrana bağlı (G ) ve 3 adet solubl (G5-6-7) toplam 7 protein ekspresyon paternine sahiptirler. Allelik polimorfizmleri limitlidir ve sınırlı doku dağılımına sahiptir. Bu özelliklerinden dolayı HLA-G molekülleri non klasik HLA 1 proteinleri olarak sınıflandırılır. Farklı HLA-G izoformları arasında membran bağlı HLA-G1 ve solubl HLA-G5 en çok çalışılan formlarıdır. Bu iki formun aktif solubl formlar arasında fonksiyonel olarak en önemlileri olduğu düşünülmektedir. Fizyolojik koşullar altında HLA-G molekülleri ekspresyonu temel olarak plasental sitotrofoblastlardan olmaktadır. Aynı zamanda timüs, kornea, tırnak matriksi, pankreas, eritroid ve endotelyal prekürsörlerde yer almaktadır. Transplantasyon, tümör, viral enfeksiyon ve otoimmün hastalıklarda monositlerden ektopik ekspresyonuda saptanmıştır. Fetomaternal aralıkta ve transplantasyonlarda tolerans sağlanması, inflamatuar immün cevabın azaltılması, tümör büyümesine katkısı ve virüs enfekte hücrelerin immüniteden kaçışı durumlarında HLA-G rolü olduğu ve HLA-G antijenlerinin immünmodülatuar etki gösterdiği kabul edilmektedir (10,11). HLA-G; B lenfosit, T lenfosit, perifer NK, monosit, makrofaj ve dendritik hücrelerde eksprese edilen üç inhibitör reseptörün ligandıdır. HLA-G inhibitör etkilerini ILT2, ILT4 reseptörleri ve KIR (Killer immünglobülin like reseptör) üzerinden gösterir. ILT2 lenfoid ve myeloid hücreler, ILT4 dendritik hücreler, makrofaj ve monositler için ve KIR reseptörleri ise NK ve CD8 hücreleri için reseptör görevi görmektedir (9,10,15,28). NK hücrelerinin sitotoksik fonksiyonları 19

29 ILT2 ve KIR2DL4 reseptörleri üzerinden proliferasyonu ise ILT2 reseptörü üzerinden inhibe olur. ILT2 CD8+ T hücrelerinin sitotoksik fonksiyonlarını ve proliferasyonunu inhibe eder; apopitoz sürecini indükler. ILT2 ve 4 reseptörleri ile CD4+ T hücrelerinin alloreaktivite ve proliferasyonu inhibe olmaktadır. Ancak ILT4 reseptörleri üzerinden regulatuar T hücrelerini ise indükleyici özelliğe sahiptir. Dendritik hücrelerin olgunlaşması ve antijen sunma kabiliyetleri ILT4 aracılığı ile inhibe edilir. ILT2 reseptörü üzerinden T hücrelerini G1 fazda bloke eder, NK hücrelerinin aktivasyon ve fonksiyonunu inhibe eder (38,48). Solubl HLA-G nin de doğal öldürücü hücrelerin ve sitotoksik T hücrelerinin apopitozunu indüklediği gösterilmiştir (48). HLA-G bağımlı baskılayıcı hücreler tragositoz yoluyla indüklenmektedir. Tragositoz hücreler arası membran fragmanlarının transferi olarak tanımlanmaktadır. Bu alışverişe hücreye özgü moleküller dahil edilemez. HLA-G içeren membran parçaları tragositoz ile hücreye alındığında; hücre yüzeyinde HLA-G ekspresyonu oluşmasına ve regulatuar hücre olarak davranmasına sebep olur (9,49). Sonuç olarak HLA-G nin immünsupresif etkileri şu şekilde sıralanabilir: Sitotoksik CD8+ T hücre ve NK hücrelerinin aktivasyonunu inhibe etmeleri ve sitotoksik CD8+ hücre aracılı apopitozu önlemeleri CD4+ T hücre proliferasyonunu inhibe etmeleri ve bu hücrelerin immünsupresif özelliklerini baskın hale getirmeleri Antijen sunucu hücrelerin ve B hücrelerinin farklılaşmasını inhibe etmeleri TH1/TH2 dengesini TH2 yönüne kaydırmaları Regülatuar T hücrelerini indüklemeleri (10,28,49,50). Bu etkileri immün hücreler tarafından eksprese edilen ILT2 (LILRB1/CD85j), ILT4 (LILRB2/CD85d) ve KIR2DL4 (CD158d) gibi spesifik inhibitör reseptörlerin HLA-G molekülü ile etkileşmesine bağlıdır. HLA-G dendritik hücreler üzerindeki inhibitör reseptör Ig-like transkript (ILT) ile etkileşerek bu hücrelerin maturasyon ve aktivasyonunu önler. HLA-G çeşitli romatolojik ve immünolojik hastalıklarda araştırılmaktadır. RA hastalarında ins/ins polimorfizminde solubl HLA-G oranında ve metotrexat 20

30 cevabında artış tespit edilmiştir. 265 RA hastası ve 356 kontrol ile yapılan araştırmada ise HLA-G polimorfizmi ile ilişki saptanmamıştır (51). HLA-G ekspresyonu psöriazis ve atopik dermatitte gösterilmiş ancak normal cilt kontrollerinde gösterilememiştir. Sistemik skleroz hastalarının cilt biyopsilerinde HLA-G varlığı gösterilmiş ve daha iyi prognoz ile ilişkilendirilmiştir. Osteoartrit sinovial fibrobastlarda HLA-G ekspresyonu anlamlı derecede artmıştır (10,52). İtalya da 200 SLE ve 451 kontrol hastası ile yapılan bir çalışmada hastalarda ins/ins polimorfizmi daha yüksek oranda ve del/del polimorfizmi daha düşük oranda saptanmış ve bu farklılık istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Yine aynı çalışmada HLA-G solubl formu hasta grubunda anlamlı derecede düşük bulunmuştur (14). İspanya da 50 SLE hastası ile yapılan çalışmada ise solubl HLA-G düzeyi daha yüksek saptanmıştır (53). Çin de 231 SLE hastası ve 367 sağlıklı kontrol ile yapılan çalışmada 14 bç polimorfizmi ile ilişki saptanmamıştır. Aynı çalışmada solubl HLA- G düzeyi daha yüksek saptanmıştır (12). Çin de 117 idiyopatik dilate kardiomiyopati hastasında del/del polimorfizm oranı daha yüksek saptanmış ve istatiksel olarak fark anlamlı bulunmuştur (54). İtalya da juvenil idiyopatik artrit hastalarında yapılan çalışmada hastaların serum solubl HLA-G düzeylerinde anlamlı düşüklük tespit edilmiştir (55). Bu gözlemlere dayalı olarak son yıllarda HLA-G molekülü inflamasyon ve immünmodülasyon ilgili çalışmalarda dikkat çekmiştir. HLA-G antijenlerinin multipl skleroz, intraserebral hemoraji, gastrointestinal hemoraji, astım ve romatolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıklarda önemli rol oynadıkları açıklık kazanmıştır Gen Polimorfizmi Tespitinde Kullanılan Moleküler Yöntemler HLA-G 3 UTR bölgesi polimorfizmi saptama amacı ile kullanılan moleküler yöntemler polimeraz zincir reaksiyonu ve jel elektroforez yöntemleridir. DNA dizi analizi ile doğrulama yapılabilir. 21

31 Polimeraz zincir reaksiyonu, ilgilenilen bir dizinin sınırsız miktarda oluşturulmasıyla klonlama için bir alternatiftir. PCR seçici olarak birkaç saat içerisinde tek bir DNA veya RNA molekülünü birkaç milyon katına amplifiye eder. Bu reaksiyon temelde üç aşamadan oluşur. DNA nın yüksek ısı ile denatürasyonu, sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA ya bağlanması (hibridizasyon) ve ardından zincirin uzaması (polimerizasyon) gerçekleşir. Bu aşamalara bir PCR döngüsü denir. PCR, iki oligonükleotid primer arasında bulunan bir DNA fragmentinin enzimatik amplifikasyonudur (şekil 6). Elektroforez yüklü proteinler, DNA ve RNA nın elektriksel alandaki hareketine dayanan bir yöntemdir. Seçilen ph değerine göre aynı özellikteki biyomoleküllerin iyonizasyonu benzer olacağı için yalnızca bir kutuba doğru ilerleme görülür. Bu yürüme hareketi bir boya (örneğin; brom fenol mavisi) ile takip edilir. DNA dizi analizi, herhangi bir saf DNA fragmentinin dizisini tespit edebilmek için kullanılan metoddur. Bu yöntemin avantajı orjinal kalıp için komplementer zinciri sentezleyen DNA polimerazı inhibe etmek amacıyla nükleotidlerin kimyasal analoglarının kullanılmasıdır. DNA sentezinin başlatılmasının ardından dört sekans reaksiyonunun her birine dört normal nükleotidin her biri yalnızca bir inhibitör analoğunun eklenmesi ile bir sekans bilgisi sağlanır. Sentez belli bölgelerde bu şekilde durdurulur ve jel elektroforezi ile analiz edilir. Bu şekilde DNA dizisi bilinerek aminoasit dizisi tesbiti ya da mutasyon tesbiti yapılabilmektedir (56) (şekil 7). 22

32 Şekil 6. Polimeraz zincir reaksiyonu (56) 23

33 Şekil 7. Sanger metodu ile DNA dizi analizi (56) 24

34 3. HASTALAR ve YÖNTEMLER Bu çalışmada İç Hastalıkları Romatoloji, İmmünoloji ve Allerji polikliniğine rutin kontrolleri için başvuran AS tanılı hastaların rutin alınan kanlarından ve kan merkezine kan vermek için başvuran sağlıklı gönüllülerin arta kalan serum örneklerinden, PCR ve jel elektroforezi yöntemleri kullanılarak HLA-G 3 UT bölgesi polimorfizmi çalışılmıştır. Ekim 2012 ve Kasım 2013 tarihleri arasında Romatoloji, İmmünoloji ve Allerji polikliniğine başvuran hastaların mevcut poliklinik kayıtlarından yararlanarak, hastalar ile iletişime geçilmiş ve dahil edilme kriterleri çerçevesinde çalışma için gönüllü olan 166 AS hastası ve sağlıklı 158 kişilik kontrol grubu oluşturulmuştur (Tablo 4). Araştırmaya dahil edilme kriterleri; yaş arasında olanlar 2. Ankilozan spondilit tanısı olan hastalar 3. Sağlıklı gönüllüler 4. Aydınlatılmış onam formunu kabul eden ve imzalayanlar Araştırmaya dahil edilmeme kriterleri: 1. Yaş sınırı dışında kalan hastalar 2. Aktif başka bir sistemik hastalığı olan bireyler (malignite, akut ya da kronik infeksiyon vb) 3. Olur formunu kabul etmeyenler ve imzalamayanlar 4. Gebeler ve psikiyatrik hastalığı olanlar AS hastaları değerlendirilerek hastalık tutulum bölgesi, aile öyküsü, anterior üveit varlığı, entezopati varlığı, HLA B27, ESR, CRP, BASDAİ skoru ve TNF alfa bloker tedavi kullanımı her bir hasta için kaydedildi. Hastaların değerlendirilmesi; anamnezlerinin alınması ve fizik muayenelerinin yapılması, İç Hastalıkları uzmanlık öğrencisi tarafından yapıldı. Bu değerlendirmeler sırasında Romatoloji, İmmünoloji ve Allerji Bölümü yan dal uzmanlık öğrencileri ile birlikte çalışıldı. 25

35 Tablo 4. Hasta ve kontrol grubu demografik özellikleri Gruplar Ortalama-median yaş Cinsiyet (min-max) Erkek Kadın AS hasta grubu 39, n:166 (18-65) %67,5 %32,5 Sağlıklı kontrol 37, grubu n:158 (18-65) %62 %38 Hastaların yaş ortalaması 39, kontrol grubunun ise 37,8 dir. AS hasta grubunda 112 (%67,5) erkek, 54 (%32,5) kadın mevcuttur. Sağlıklı kontrol grubunda 100 (%63,3) erkek, 58 (%36,7) kadın mevcuttur. AS ve kontrol grubu arasında yaş ve cinsiyet bakımından fark saptanmadı (Tablo 4 de gösterilmiştir) (p=0,131, p=0,305). Tablo 5. Hastalarda aksiyel ve periferik tutulum dağılımı AS tipi Sayı Yüzde Aksiyel AS ,76 Periferik AS 7 4,22 Aksiyel+periferik AS 10 6,02 Total hastanın 149 u aksiyel AS, 10 u aksiyel+periferik AS, 7 si periferik AS tanısı ile takiplidir (Tablo 5). 26

36 6,02 4, ,76 Aksiyel Aksiyel+periferik Periferik Grafik 1. AS hastalarında aksiyel ve periferik tutulum oranı Çalışmada gönüllü katılımcılardan alınan kanlardan genomik DNA izolasyonu yapılarak, 14 bç lik delesyonu içeren bölge polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış ve poliakrilamid jel elektroforezi ile delesyon tespiti yapılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu, in vitro ortamda belli bir DNA dizisinin çoğaltılmasıdır. Sırasıyla DNA nın denatürasyonu, sentetik oligonükleotidlerin hedef bölgeye bağlanması (hibridizasyon) ve zincirin polimerizasyonu laboratuvar ortamında gerçekleştirilir. Daha sonra DNA nın elektriksel alandaki hareketine dayanan bir ayırma yöntemi olan, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak, oluşan bantlar gümüş nitrat ile görüntülenmiştir. Bant boylarına bakılarak delesyon taşıyan 2 örnek ve insersiyon taşıyan 2 örnek seçilerek DNA dizi analizi yapılmıştır. Tespit edilen delesyon DNA dizi analizi yöntemi ile doğrulanmıştır. HLA-G geninin 3 UT bölgesindeki 14 bazlık delesyonun, her 2 allelde homozigot olarak bulunması DEL (del/del), tek allelde heterozigot olarak bulunması HET (del/ins), hiç bulunmaması İNS (ins/ins) olarak değerlendirilmiştir MOLEKÜLER ANALİZ YÖNTEMLERİ DNA İzolasyonu Çalışmaya katılanlardan 1ml 0.5M EDTA içeren tüplere 2ml kan örneği alındı. QIAGEN Gentra Puregene DNA izolasyon kiti kullanıldı. DNA izolasyon kiti 27

37 kullanılarak elde edilen 150 μl genomik DNA PCR için kullanıldı. Çalışma için gerekli malzemeler: 1- DNA izolasyon kiti (QIAGEN Gentra Puregene) 2- Mikrosantrifüj (Beckman Coulter, Amerika) 3- Termomikser (65 C, Wealtec Corp, Amerika) 4- Vorteks (Nüve, Türkiye) 5-1,5 ve 2 ml lik eppendorf tüpleri 6- Pipet ve pipet ucu 7- %70 lik etanol 8- %100 lük izopropil alkol 9- Kurutma kağıdı Çalışmada, DNA elde edilmesi için 2 ml lik eppendorf tüplerine 1350 μl RBC lysing solüsyonu konularak, üzerine 450 μl alt-üst edilmiş kan örnekleri eklendi. Karışım alt-üst edilerek 40 sn g de santrifüj edildi. Santrifüj sonrası oluşan süpernatant döküldü ve kan peletten uzaklaştırıldı. Pelet 20 sn vortekslendikten sonra, üzerine 450 μl Cell lysis solusyonu konuldu ve tekrar 20 sn vortekslendi. Üzerine 150 μl Protein Precipitasyon solüsyonu eklendikten sonra, g de 1 dakika 40 sn santrifüj edildi. 1,5 ml lik tüplere 450 μl %100 lük izopropil alkol eklendi. Santrifüjlenen 2 ml lik tüplerdeki süpernatant daha önce hazırlanmış olan 1,5 ml lik tüplerdeki etanolün üzerine ters çevrilip dökülerek tüpler çalkalandı ve DNA ların oluşması sağlandı. Tüpler tekrar g de 1 dakika 40 sn santrifüj edildikten sonra oluşan süpernatant dökülüp; kalan peletin üzerine 450 μl %70 lik etanol ilave edilerek, dipte çöken DNA nın hareketlendirilmesi sağladı. Tüpler g de santrifüj edilerek süpernatant döküldü ve tüplerde kalan sıvı kurutma kağıdı ile alındı. Kurutulmuş tüplere 150 μl DNA hidratasyon solüsyonu eklenerek 65 C ye ayarlanmış termal mikserde 5 dk bekletildi ve -20 derecede saklandı. DNA ların kalitesini belirlemek için, %1 lik Agaroz jel elektroferezi yapıldı ve örnekler -20 derecede PCR yönteminde kullanılmak üzere saklandı. 28

38 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) HLA-G geninin sekizinci ekzonundaki 14bç'lik delesyon polimorfizm bölgesini içine alan 224 bç'lik bölge PCR yöntemi ile amplifiye edilmiştir. Kullanılan forward ve reverse primer dizileri çizelgede verilmiştir. Forward 5 - GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3 Reverse 5 - GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3 GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACCCCTCACTGTGACTGATATGAATTTGTTC ATGAATATTTTTCTGTAGTGTGAAACAGCTGCCCTGTGTGGGACTGAGTGGCA A (İnsersiyon)GTCCCTTTGTGACTTCAAGAACCCTGACTCCTCTTTGTGCAGAGA CCAGCCCACCCCTGTGCCCACCATGACCCTCTTCCTCATGCTGAACTGCATTCC TTCC Şekil 8. HLA-G geninin PCR ile çoğaltılan 210 bç lik bölümü (kırmızı renk primer bağlanma bölgelerini göstermektedir) (57). PCR tüplerinin hazırlanmasının ardından karışım tüpünün içine sırasıyla 1- Distile su 2-10X reaksiyon buffer (Fermantas, Litvanya) 3- dntp mix (dttp, dctp, datp, dgtp) (Fermantas, Litvanya) 4- Forward primer (Metabion International AG-Almanya) 5- Reverse primer (Metabion International AG-Almanya) 6- Magnezyum Klorür (Fermantas, Litvanya) 7- Taq DNA Polimeraz (Fermantas, Litvanya) 8-2,3 μl DNA örnekleri eklenerek termalcycler a kondu. Son konsantrasyonlar 25 µl hacimde; 100 ng genomik DNA, 1x Buffer, dttp, dctp, datp, dgtp bazları dntp mix olarak 2 mm, MgCl2 1.5 mm, herbir primer 0.6 mm ve Taq polimeraz 1 ünite olacak şekilde ayarlandı. Termalcycler da bütün PCR reaksiyonlarında 94 C de 4 dakika başlangıç denatürasyonu sağlandı. PCR sıcaklıkları 94 C de 50 saniye denatürasyon, 61 C de 29

39 50 saniye bağlanma ve 72 C de 50 sn uzama olmak üzere 35 döngü ayarlandı. 72 C de 7 dak bir son uzama gerçekleştirildi ve 4 C son sıcaklık olarak belirlendi Poliakrilamid Jelin Hazırlanması ve Elektroforez Agaroz (Sigma, ABD) kullanılacağı amaca uygun olarak belirli yüzdelerde hazırlanır. Bu çalışmada PCR ürünlerini %1 lik agaroz jel için 1,5 gram agaroz tartılıp, TBE 1X solüsyonu ile 150ml ye tamamlandı. TBE 1X solüsyonu; TBE 5X solüsyonunun 1/5 oranında ddh2o ile seyreltilmesiyle hazırlanır. Agaroz istenilen yüzdede hazırlandıktan sonra, mikrodalga fırında (Beko, Türkiye) kaynatılır. Üzerine etidyum Bromid in (Sigma, ABD) %5 lik stok solüsyonundan 2 şer μl ilave edildikten sonra iyice karıştırılır ve jel tabağına (Qwl Scientific, ABD) dökülür. Jel dökülmeden önce jel tabağı uygun taraklar kullanılarak hazırlanır. Agarozun donması için 30 dakika beklenir. Agaroz donduktan sonra jel tabğıyla birlikte jel elektroforez tankına (Biometra, Almanya) yerleştirilir. Elektroforez tankı TBE 1X solüsyonu ile jelin üstünü kapatacak şekilde doldurulur. PCR ürünlerinden 5 μl, temiz bir parafilm (Parafilm, Chicago, ABD) üzerinde 2 μl brom-fenol mavisi (BBF, Merck, Almanya) ie karıştırılır ve jellere yüklenir. Ürünlerinin değerlendirilebilmesi ve reaksiyonun istenilen uzunluktaki doğru bölgeyi çoğalttığını görebilmek için marker (ΦX174 DNA-HaeIII Fermantas, Litvanya) ürünlerle birlikte jele 2 μg kadar yüklenir. 100 V akımda 20 dakika kadar yürütülür (Wealtec, Tayvan). Ultraviyole ışıkta (spectroline, ABD) incelenir. Image analyser da (Alpha Imager, ABD) fotoğraflanır. Poliakrilamid jelinin döküleceği camlar distile su ile yıkanıp alkol ile silindikten sonra camlar arasına 1,5 mm kalınlığında spacerlar yerleştirilip camlar sabitlenmiştir. Bu çalışmada %7 lik poliakrilamid jel kullanılmıştır. Bu jel için %40 lık, 49:1 oranındaki akrilamid/bisakrilamid solüsyonu kullanılmıştır. Bunun için 380 gram akrilamid (Merck, Almanya) ve 20 gram N-N -metilen-bis-akrilamid (Sigma, Almanya), distile su ile 37 C de ısıtılarak çözülür ve toplam hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlanır. Jelin polimerleşmesi için kullanılan %10 luk amonyum persülfat; 1 gram amonyum persülfat (AppliChem, Almanya) distile su ile 10 ml lik hacime 30

40 tamamlanarak hazırlanmıştır. Jel 12,34 ml %40 lık akrilamid/bisakrilamid solüsyonu, 14 ml TBE 5X solüsyonu, 40,16 ml distile su ve 3,5 ml gliserol (Merck, Almanya) kullanılarak hazırlanmıştır. Karışım 0,22 µm filtreden süzüldükten sonra vakum ile havası alınmıştır. Ardından bu jel içeriğine 0,6 ml %10 luk Amonyum Persülfat ve 40 ml TEMED (N,N,N,N -tetrametilenetilendiamid) (Sigma, Almanya) eklenerek hazırlanan camlar arasına dökülmüştür. Jel polimerleştikten sonra 1,5 mm lik tarak camlar arasına yerleştirilerek örneklerin yükleneceği kuyuların oluşması sağlanmıştır. Jel polimerleştikten sonra taraklar çıkartılmış ve camlar vertikal jel elektroforez sistemine (BioRad, ABD) yerleştirilmiştir. Sistemde tampon olarak TBE 1X solüsyonu kullanılmıştır. Örnekler 200 volt akımda +4 C de 16 saat yürütülmüştür Poliakrilamid Jeli İçin Gümüş Boyama %1 lik stok gümüş nitrat %0,1 lik olacak şekilde 100 ml %1 lik stok gümüş nitrat solüsyonu, 900 ml distile su kullanılarak seyreltilir. Jeller bu solüsyonda 10 dk bekletilmiştir. Daha sonra formaldehit ilave edilmiş %1,5 lik sodyum hidroksit solüsyonu ile boyanmıştır. Jel %0,75 lik sodyum bikarbonat solüsyonu ile muamele edilerek boyama işlemi sonlandırılmıştır. Böylece jeller görünür hale getirilerek PCR ürününde beklenen 14 bç fark, bant boylarının büyüklüklerine göre belirlenmiştir (Şekil 9). Jeller kurutularak saklanmıştır. Şekil 9. Poliakrilamid Jel örneği 2, 5, 8, 9 numaralı örneklerde 210 bç bant görülmekte olup 14 bç delesyon mevcuttur. 7 numaralı örnekte 224 bç bant görülmekte olup; delesyonun olmadığı normal örnektir. 1, 3, 4, 6, 10 numaralı örneklerde ise heterozigot durum söz konusudur. 31

41 DNA Dizi Analizi PCR sonrasında poliakrilamid jel elektroforezi ile mutasyon tespit edilen örneklerde, jel görüntülerinin doğrulanması amacıyla DNA dizi analizi yapılmıştır. Bant boylarına bakılarak delesyon taşıyan 2 örnek ve insersiyon taşıyan 2 örnek seçilerek dizi analizi yapılmıştır. Analiz öncesinde PCR ürünlerinin dntp ve primer artıklarından temizlenmesi için kolonlu pürifikasyon kiti kullanılmıştır (Roche, ABD). Bu çalışmada istenen DNA parçacığının nükleotit dizisinin belirlenmesi için Sanger in enzimatik yöntemi esasına dayalı, tam otomatik kapiller sistemli çalışan bir DNA dizi analizi cihazı kullanılmıştır (CEQ2000XL, Beckman Coulter, ABD). Cihaz için 0,2 ml lik, 96 tane kuyucuk içeren plaklar kullanılmıştır. Her bir örnek için 8 µl sekans solüsyonu (premix; 2 μl 10X reaksiyon tamponu, 1 μl dntp karışımı, 2 μl ddutp, 2 μl ddgtp, 2 μl ddctp, 2 Μl ddatp, 1 μl polimeraz enzimi), 1µL temizlenmiş PCR ürünü, 2 pmol sağ veya sol oligonükleotid ve hacmi 20 µl ye tamamlayacak kadar distile su konularak cycle sequencing gerçekleştirilmiştir. Bu program 94 C de 5 dakika ilk denatürasyon, 30 siklus 96 C de 20 sn denatürasyon, 50 C de 20 sn yapışma ve 60 C de 4 dk lık uzama evresi içermektedir. Cycle sequencing sonlandıktan sonra örneklerin içine reaksiyonun durdurulması için 5 µl durdurma solüsyonu (1,5 M C2H3O2Na, 50 mm EDTA, 20 mg/ml lik gikojen) ve 60 µl %95 lik soğuk etanol eklenerek +4 C de 4000 rpm de 4 dk santrifüj edilmiştir (Hettich, Almanya). Üstteki kısım dökülerek %70 lik alkolden 200 µl eklenmiş, +4 C de 4000 rpm de 2 dk santrifüj edilerek üstteki kısım dökülmüştür. Bu işlem bir kez daha tekrarlandıktan sonra örnekler liyofilizatör cihazına (Christ, Almanya) yerleştirilmiş ve yüksek vakum altında 45 dk kurutulmuştur. Kuruyan örneklerin üzerine 25 µl formamid içeren solüsyon eklenerek DNA zincirlerinin birbirlerinden ayrı tutulması sağlanmıştır. Her bir kuyucuk mineral yağ ile kapatıldıktan sonra plak DNA dizi analizi cihazına yerleştirilmiş ve cihazın bağlı bulunduğu bilgisayardaki CEQ Sequencing Software programı aracılığı ile sonuçlar görünür hale getirilmiştir. Çalışmada kullanılan moleküler yöntemler özetlenirse PCR işlemi sonrasında poliakrilamid jel elektroforezi ile örnekler 200 volt akımda +4 C de 16 saat 32

42 yürütülmüştür. Delesyon ve insersiyon tespit edilen örneklerde, jel görüntülerinin doğrulanması amacıyla DNA dizi analizi yapılmıştır. Bant boylarına bakılarak delesyon taşıyan 2 örnek ve insersiyon taşıyan 2 örnek seçilerek dizi analizi yapılmıştır. Bu çalışmada istenen DNA parçacığının nükleotit dizisinin belirlenmesi için Sanger in enzimatik yöntemi esasına dayalı, tam otomatik kapiller sistemli çalışan bir DNA dizi analizi cihazı kullanılmıştır İSTATİKSEL ANALİZ AS tanılı hastalar tutulum bölgelerine göre aksiyel, periferik ve aksiyel+periferik AS olarak gruplandırıldı. Hastalar; AS tutulum bölgeleri, aile öyküsü, anterior üveit, entezopati, HLA-B27, ESR ve CRP düzeyi, BASDAİ skoru, antitnf ilaç kullanım durumu ile HLA-G gen polimorfizmi arasında ilişki araştırıldı. Bütün istatistiksel işlemler bilgisayar ortamında hazır istatistik paket programı kullanılarak yapıldı. Verilerin analizi SPSS for Windows 15 paket programında yapılmıştır. Tanımlayıcı istatikler, dağılımı normal olan değişkenler için ortalama± standart sapma, dağılımı normal olmayan değişkenler için median (minimummaksimum), nominal değişkenler için ise vaka sayısı ve yüzde olarak gösterilmiştir. Grup sayısı iki olduğunda gruplar arasında ortalamalar yönünden farkın önemliliği t testi ile; ortanca değerler yönünden farkın önemliliği mann whitney testi ile araştırıldı. Grup sayısı ikiden fazla olduğunda gruplar arasında ortalamalar yönünden farkın önemliliği Anova varyans analizi testi ile; ortanca değerler yönünden farkın önemliliği kruskal wallis testi ile araştırıldı. Nominal değişkenler Pearson Ki-Kare veya Fisher exact testi ile değerlendirildi. Ankilozan spondilit hastalığı varlığında, HLA-G polimorfizminin bağımsız risk faktörü olup olmadığını belirlemek için çok değişkenli logistik regresyon analizi yöntemi kullanılarak risk katsayıları belirtildi. Güvenlik aralığı %95 olarak belirlendi ve p<0,05 için sonuçlar istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 33

43 4. BULGULAR AS hasta grubu ve sağlıklı kontrol grubu arasında HLA-G polimorfizm ilişkisi araştırıldı. Hastalar spondiloartrit tipine göre aksiyel tutulumlu, periferik tutulumlu ve aksiyel+ periferik tutulumlu olmak üzere gruplandırıldı. HLA-G polimorfizmi ise ins (ins/ins), del (del/del) ve het (ins/del) olacak şekilde gruplandırıldı. Polimorfizm grupları ile HLA-B27, aile öyküsü, anterior üveit, entezopati, ESR, CRP, BASDAİ (tedavi öncesi ve sonrası), spondiloartrit tipi ve anti TNF ilaç kullanımı arasında ilişki araştırıldı. Tablo 6. AS hastaları ve sağlıklı kontrol grubunda HLA-G polimorfizm oranları Gruplar Del/del polimorfizmi Del/ins polimorfizmi İns/ins polimorfizmi Toplam Sağlıklı kontrol grubu AS tanısı olanlar 46 (%29,1) 67 (%42,4) 45 (%28,5) (%38,5) 78 (%47) 24 (%14,5) hastanın 64 ünde (%38,5) del/del, 78 inde (%47) del/ins ve 24 ünde ins/ins polimorfizmi mevcuttur. 158 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda ise 46 (%29,1) del/del polimorfizmi, 67 (%42,4) del/ins polimorfizmi, 45 (%28,5) ins/ins polimorfizmi mevcuttur. 34

44 Grafik 2. Sağlıklı kontrol grubunda HLA-G polimorfizm dağılımı Grafik 3. AS hastalarında HLA-G polimorfizm dağılımı 35