Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Genel Bakış

Transkript

1 Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler I. Genel Bakış

2 Canlı organizmalar yaşamları boyunca kendini idare edebilen ve kendini çoğaltabilen kimyasal sistemlerdir. Viroidler, virüsler gibi bazı ayrıcalıklı gruplar dışında tüm canlılar kimyasal maddelerin yoğun solüsyonlarıyla dolu ve küçük birimler olan hücrelerden oluşur. Buna göre, canlılık olayları hücreler içerisindeki biyolojik moleküllerin yapı ve işlevlerine bağlı olarak ortaya çıkar. Bir hücrenin ağırlığının yaklaşık %99 u sadecedört çeşit element (C,H,N ve O) ile sınırlıdır. Hücreyi oluşturan temel organik moleküller başlıca iki grupta toplanabilir: küçük moleküller hücrenin temel kimyasal yapı taşlarının sentezinde ve enerji elde edilmesinde kullanılırlar; küçük moleküllerin kovalent bağlarla bağlandığı polimerleri olan büyük moleküller ise biyolojik süreçlerin özgüllüğünden ve biyolojik bilginin transferinden sorumludurlar.

3 Küçük organik moleküllerin ağırlıkları arasında değişir ve 30 ya da daha fazla sayıda C atomu içerirler. Bunlar genellikle solüsyon içerisinde serbest durumda bulunurlar ve bunların bir kısmı daha sonra makromoleküllerin meydana geleceği bir ürün havuzu oluştururlar. Küçük moleküller aynı zamanda, besin kaynaklarından türev edilen enerjiyi hücre tarafından kullanılabilecek biçime dönüştüren kimyasal reaksiyonların da temel aracılarıdır.

4 Küçük moleküllerin miktarı hücredeki toplam organik maddenin yaklaşık onda birini oluşturur ve aşağı yukarı bin kadar farklı çeşidi bulunur. Küçük moleküllerden sentezlenen tüm biyolojik makro moleküller yıkıldıklarında aynıbasit moleküllere dönüşürler. Hücrelerde küçük moleküllere ait başlıca dört temel aile vardır; basit şekerler, yağ asitleri, aminoasitler ve nükleotidler. Bu ailenin hepsi ortak kimyasal özellikleri olan çok farklı üyeleri içerirler. Makromolekül; küçük molekül ağırlıklı alt birimlerin birbirine eklenmesi ile meydana gelen uzun ve zincir biçimde polimerdir.

5 Doğada milyonlarca farklı canlı türü bulunur. Bununla beraber canlılar hücre ve molekül düzeyinde araştırıldığında organizasyonda tek bir kalıp planı bulunduğu ortaya çıkar. Buna göre moleküler biyolojinin temel amacı; canlı formlarında hücre yapısını oluşturan moleküllerinyapısal ve işlevsel analizini yapmaktır. Tüm organizmalarda hücreleri oluşturan temel moleküllerin yapı, çeşit ve oranları yaklaşık olarak aynıdır. Genelde her tür için aynı olan, C temelli küçük moleküllerin belirleyici ve sınırlayıcı bir serisinden oluşurlar. Hepsinde gerçekleştirilen biyokimyasal mekanizmalaraynıdır ve aynı genetik şifreyi paylaşırlar.

6 Moleküler biyolojideki hızlı gelişmeler, büyük ölçüde moleküllerin araştırılmasına olanak veren yeni yöntemlerin geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu yöntemler, temelde biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerin hücre ve dokulara uygulanmalarının sonucudur. Ayrıca son yılın olağanüstü teknolojisi olan genetik mühendisliği (rekombinant DNA teknolojisi) nükleik asit ve protein moleküllerinin hücrelerden bol miktarda elde edilmelerine olanak vermesi nedeniyle bu moleküllerleyapılacak çalışmalara büyük kolaylıklar sağlamış ve moleküler biyolojideki bilgi birikiminin hız kazanmasına büyük ölçüde yardımcı olmuştur. Zaten moleküler biyolojide önceleri birbirinden ayrı olarak düşünülen biyokimya, hücre biyolojisi ve genetik gibi bilim dallarındaki gelişmeler ve bunların birbirine karışması sonucu ortaya çıkmıştır.

7 Moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde saflaştırılmış moleküller ile yapılan analitik çalışmalara dayanmaktadır. Çalışılacak biyolojik molekül grubunun yalıtımı (izolasyonu) amacıyla gerçekleştirilen işlemlere özütleme (ekstraksiyon) adı verilir. Özütleme; parçalama, ayırma ve saflaştırma ardışık aşamalardan oluşur. Daha sonra tam ya da kısmen saflaştırılmış (nükleik asitler, proteinler gibi) makro moleküllerin yapısal ve işlevsel analizlerine yönelik yöntemler uygulanır.

8 1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri Bu aşamada, çalışılacak molekül grubunu (nükleik asit ya da protein) içeren doku ve ya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir. Elde edilen karışıma homojenat adı verilir. Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta, serbest ya da organeller içerisindeki hücre bileşenleri (membran parçaları ve bir miktarda parçalanmamış hücrelerle birlikte) parçalamanın yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon halinde bulunurlar.

9 1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri Hücreleri parçalayarak fraksiyonlarına ayırma yöntemleri temelde hücre sınırlarının çeşitli fiziksel ya da kimyasal tekniklerle yok edilmesini kapsar. Hücre elemanlarının işlevlerini kaybetmeden parçalama sağlayan çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bir dokudaki farklı hücre tiplerini birbirinden ayırmak mümkün olduğu gibi, hücrelerde işlevleri bozulmadan organellerine ve makromoleküllerine ayrılabilir. Eğer dikkatli bir uygulama yapılırsa nukleus, mitokondri, kloroplast gibi organeller oldukça sağlam durumda kalabilirler.

10 Fiziksel Yöntemler

11 Mekanik İşlemler Bu tip tekniklerin en basit ve ilkel şekli materyali bir havan içinde kumla öğütmektir. Ezerek parçalama daha gelişmiş şekilde, doku ve ya hücrelerin sıvı azotta (- 196 C) ya da (- 20) - (- 70) ºC da dondurulduktan sonra soğuk havanlarda yapılır. Donma sonucu kristal hale geçen yapılar toz haline gelene kadar kolaylıkla parçalanabilmektedir. İşlemin çözünme olmadan kısa sürede bitirilmesi gerekmektedir. Ezme sırasında alümina (Parlatmalarda, aşındırıcı olarak kullanılan alüminyum oksit.), kum ya da cam tozu katılacak olursa parçalama etkinliğiartar.

12 Mekanik İşlemler Günümüzde mekanik olarak parçalamada daha çok homojenizatör adı verilen aletler kullanılmaktadır. Çeşitli tipte homojenizatörler geliştirilmiştir. Karıştırıcı tipinde olanlar (waring blender) evlerde kullanılanların daha güçlü olanlarıdır. ( waring blender )

13 Mekanik İşlemler Metal ya da camdan yapılmış özel bir kap içinde bulunan, yüksek hızda dönen bıçaklar yardımıyla biyolojik materyaller kesilerek parçalanır. Bu tip aletler daha çok hayvan ve bitki doku veya organlarının parçalanması için kullanılmakta olup bakteri gibi küçük boyuttaki organizmalar için uygun değildir.

14 Milli homojenizatörler ( ultra turrax ) ucunda özel dişleri bulunan metal bir milin çok yüksek devirde dönmesiyle parçalama yapar. ( ultra turrax )

15 Pistonlu homojenizatörler ise, basınç etkisiyle parçalama yapan ve ucunda genellikle teflondan yapılmış bir pistonu bulunan aletlerdir. Özellikle yumuşak dokuların parçalanmasında çok etkindir. (Pistonlu homojenizatör)

16 Basınç yardımıyla parçalama yapan diğer bir homojenizatör; Fransız basınç hücresidir. Çelik bir kap, piston ve silindir üzerindeki basıncın giderilmesi için kullanılan bir vanadan oluşur. ( French Press )

17 Balistik homojenizatörlerde dayanıklı cam veya metal bir kap içine konulan hücre süspansiyonu çalkalanır. Bu yöntem özellikle diğer parçalama yöntemlerine dirençli mikroorganizmaların (örneğin kok biçimindeki bakteriler, mayalar gibi) parçalanmasında kullanılır. (Balistik homojenizatör)

18 Ultrasonikasyon İnsanın duyma sınırının üzerindeki frekanslarda (18kHz üstü) ses dalgaları (ultrases, ultrason) sıvı bir ortamdaki hücrelere uygulandığında parçalanmaya yol açar. Bu uygulama süspansiyondaki su moleküllerinin kinetik enerjilerini arttırır; basınç farkları çok fazla sayıda mikro hava kabarcığının oluşumuna yol açar. Bu kabarcıklar hızla hareket edip ve bir süre sonra patlayarak yoğun şok dalgaları yaratırlar. Patlama sırasında ses enerjisinin mekanik parçalama enerjisine dönüşümüyle ortamdaki hücreler (özellikle bakteri hücreleri) parçalanır.

19 Ozmatik Şok Hücrelerin yüksek ozmatik basınçlı bir çözeltiden hipotonik bir ortama geçirilmesi durumunda, suyun hücrelerin içine girmesi zarlarda patlamaya yol açar. Bu yöntem hücre duvarı bulunmayan ya da yok edilmiş hücreler için uygundur.

20 Dondurma- çözme Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde (örneğin, - 20 C) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar. İşlemin temelli, donan su moleküllerinin hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan buz kristallerinin hücre zarına zarar vererek parçalanmayı sağlamasıdır.

21 1.1.2 Kimyasal Yöntemler

22 Çözücülerin Kullanılması Bu uygulamaların prensibi: hücre zarındaki bileşiklerin çözündüğü uygun çözücü (solvent) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir. Bu amaçla kullanılan; Organik çözücüler (örn, etil asetat, toluen vb) zardaki lipitler çözerek yapıyı bozarlar. Deterjanlar (sodyum dodesil sülfat) ise uygun ph koşullarında zardaki protein ve lipoproteinlerle etkileşime girerek onları uzaklaştırır. Bazik çözeltiler (ph 11-12,5) ise hücre duvarının hidrolizini sağlar.

23 Enzimlerin Kullanılması Lizozim: bakterilerin peptidoglikan tabakasındaki β- 1,4- glikozidik bağları hidroliz etmektedir. Bu enzim, özellikle Gram (+) bakteriler üzerine etkilidir. Gram(- ) bakterilerin parçalanması için hücrelerin bir süre EDTA uygulamasında tutulması gerekir. EDTA, lipopolisakkarit moleküllerini birbirine bağlayan Ca+² iyonlarının ortamdan çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozim içteki peptidoglikan tabakasına ulaşmasını kolaylaştırmaktadır. Ayrıca, tripsin, proteinaz K, gibi proteazlar ve zimoliyaz da (maya hücreleri için) bu amaçla kullanılan enzimlerdir. Enzimatik parçalama genelde mekanik parçalamaya dayanıklı yapılar için uygulanmaktadır.

24 Kullanılacak parçalama yöntemi; - Amaçlanan çalışmaya, - Kullanılan biyolojikmateryalin tipine(organizma, doku veya hücre tipine) - İzole edilecekmolekül grubuna, - Eldeki olanak ve kabul edilebilir etkinliğe bağlıdır. Böylece ya tek bir yöntem yada fiziksel ve kimyasal işlemlerden karma olarak yararlanılabilir.

25 Ayırma (Seperasyon), Saflaştırma (Pürifikasyon) Ve Analiz Yöntemleri

26 Parçalamadan Sonra Uygulanacak Yöntemler; Ayırma (Seperasyon): Çalışılacak molekül grubunun homojenattaki diğer moleküllerden ayırma Saflaştırma (Pürifikasyon): Homojenattan çalışılacak molekülün saf olarak elde edilmesi Ham Özüt (Crude Extract): Homojenattaki zar parçalarını, parçalanmamış doku veya hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ön ayırma işleminden sonra elde edilen ve çalışılacak molekülle birlikte birçok molekülüde içeren karışımdır.

27 Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri Ham özüt ya direkt olarak kullanılabilir yada çalışılacak molekül, hedeflenen saflık derecesine göre uygulanılan yöntemlerle ham özütteki diğer moleküllerden ayrılır. Bu yöntemler, karışımdaki; - molekül gruplarının çözünmeözellikleri yada - kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel karakterlerine veya da - diğer moleküllere afinitesine göre birbirlerinden ayrılmasını sağlayan işlemlerdir. Bu tekniklere HAZIRLAYICI (PREPARATİVE) TEKNİKLER de denir.

28 Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri Ayırma, saflaştırma işlemlerinden sonra üzerinde çalışılan molekülün kalitatif veya kantitatif analizi (örn miktar tayini, alt tiplerinin saptanması, yapısal analiz, aktivite belirlenmesi gibi) yapılabilir. Bu amaçla kullanılan tekniklere de ANALİTİK TEKNİKLERdenilir. Bir makromolekülün homojenattan ayrılması, saflaştırılması ve analizi için kullanılan teknikler basitten karmaşığa doğru sıralanabilir.

29 1. Süzme (Filtrasyon) Homojenatın filtre edici bir materyalden geçirilerek, süspansiyonda bulunan partiküllerin sıvı kısımdan ayrılmasıdır. Bu yolla, kullanılan filtre edici materyalin gözeneklerinin çapına göre, filtreden geçen kısımda belli büyüklükte partikül bulunabileceği gibi bunların tamamı da filtrenin üzerinde kalabilir.

30 1. Süzme (Filtrasyon) En çok kullanılan filtre edici materyaller filtre kağıdı, sinterli cam huni ve zar (membran) filtrelerdir. Kullanılan sisteme vakum veya basınç uygulanarak süzme işlemi hızlandırılabilir.

31 Filtre kağıtları Süzme işleminde geniş çapta kullanılır. Homojen por çapına sahip olmayan kaba filtre kağıtlarından, çok duyarlı ayırım yapan çeşitli boyutlara kadar farklı amaca uygun tipleri vardır.

32 Membran Filtreler Çok küçükgözenekleri olan polimer yapıdaki filtrelerdir. Biyolojik olarak eylemsiz(inert) ve çoğunlukla saf selüloz esterlerinden yapılırlar. Por çapları nm arasında değişebilir. Akışkanlık değerine, ilgilenilen molekülün özelliğine ve ağırlığına göre seçim yapılabilir.

33 Membran FiltrelerinKullanım Amaçları; Mikrometre boyutundaki partikülleri ortadan kaldırarak solüsyonlarınbulanıklığını yok etmek Otoklavlanamayan solüsyonların sterilizasyonunu sağlamak Çok az miktardaki örnekleri (özellikle radyoaktif çökeltileri) toplamak Biyomolekülleri (pr,na) içeren solüsyonları konsantre etmek Tamponlardaki ve diğer solüsyonlardaki tuz vb küçük molekülleri yok etmektir.

34 Ultrafiltrasyon Membran filtrelerle yapılır ve moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılmaları sağlanır. Ayırımı yapılacak molekülleri içeren solüsyon dışarıdan oluşturulan kuvvetle yarı geçirgen zardan geçmeye zorlanır. Filtrelerden sıvının geçişini sağlamak için emme, basınç ya da santrifüj kuvveti gerekir. Kullanılan porların çapları 1-20 nm arasında değişir. Zarın por çapı çalışılacak molekülün geçişine izin vermeyecek boyutta seçilmelidir.

35 NMWC (NominalMolecular Weight Cut- Off); Zarlara özgü bir değerdir. NMWC değeri zardan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eşdeğerdir. Ultrafiltrasyonda kullanılan NMWC değeri genelde arasında değişir. Bu filtrelerin genellikle iki tabakalı olanları kullanılır; birinci tabaka yüzeyde bulunan ince ( µm), selüloz asetat, naylon veya polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka daha kalın, inert bir destek tabanıdır. Bu tip filtreler partiküllerin yüzeyde kalmasını sağlar. Kısaca çalışma prensibi, filtre tarafından partikül veya moleküllerin fiziksel yakalanması sonucu ayrılmalarına dayanır.

36 Ultrafiltrasyon Özütleme ve çeşitli saflaştırma aşamalarında elde edilen nükleik asit ve protein solüsyonları daha sonraki aşamalar için genellikle fazla seyreltiktir. Çözücünün yüksek sıcaklıkta uçurulması yoluyla konsantre edilemedikleri için, bu tip çözeltilerin hacimlerini azaltmakta genellikle ultrafiltrasyondan veya liyofilizasyondan yararlanılır. Her iki yöntemde nazik ve oldukça etkili yöntemlerdir.

37 2. Diyaliz Biyolojik moleküllerin ayırımında kullanılan en eski yöntemlerinden biridir. Bu teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarınagöre ayrılması temeline dayanır. Tekniğin uygulaması değişik büyüklüklerdeki molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri geçirmeyen fakat su vb. küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zardan yapılmış diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılması şeklinde gerçekleştirilir.

38

39 Zarların porları genellikle molekül ağırlığı den fazla olan makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle, diyaliz tüpünün içindeki su(ve küçük iyonlar) dışarı çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün konsantre bir çözeltisi kalır. Küçük moleküllerin çıkışı tüpün içi ile dıştaki tamponun konsantrasyonları eşit oluncaya kadar devam eder. Dengeye, çalışılan hacme bağlı olmak kaydıyla genellikle 4-6h de ulaşılır. Dengeye ulaşıldıktan sonra, eğer dışarıdaki solüsyon taze tamponla yenilenince diyalizin devam etmesiyle tüpün içindeki küçük moleküllerin konsantrasyonundaki azalma devam eder. Böylece istenilen ayırım yapılıncayakadar diyaliz1-2 gün sürdürülebilir.

40 Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri) çeşitli materyallerden(kollodyon, sellofon, selüloz gibi) yapılmış, 1-20 nm por çapına sahip malzemelerdir. Por çapı zardan geçecek moleküllerin büyüklüğünü belirler. NMWC değeri arasında olan tipleri geniş çapta kullanılmaktadır. Diyaliz, iyonik olan ve olmayan, tüm küçük molekülleri yok etmek veçözeltileri konsantre etmek için basit, ucuz ve etkin bir yöntemdir. Genellikle solüsyonlardaki tuzları ve küçük molekülleri ortamdan uzaklaştırmakta kullanılır. Ayrıca biyolojik moleküllere zayıf şekilde bağlı küçük iyonlar ve molekülleri (NAD, FAD gibi kofaktörler veya metal iyonları) de bu yöntemle ortadan kaldırmak mümkündür.

41 3. Liyofilizasyon (Dondurarak Kurutma) Liyofilizasyon, donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir dondurma tekniğidir. Genellikle, yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin yöntemlerden biridir. Biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı kolaylıktan dolayı oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır.

42 Liyofilizasyon Uygulaması Dondurma işlemi için, örnekle yarıya kadar doldurulmuş kap kuru buz- aseton banyosuna yerleştirilerek 45 açı yapacak pozisyonda tutularak yavaşça döndürülür. Sulu çözelti kabın çeperinde tabakalar halinde donar; buda suyun buharlaşması için geniş bir yüzey sağlar. Kap daha sonra soğutma ünitesi ve bir vakum pompasından oluşan liyofilizatöre bağlanır. Biyolojik materyalin stabilitesini korumak amacıyla, - 40ºC civarında tutulan örneğe yaklaşık 5-25 mm Hg vakum uygulaması yapılır. Sulu çözeltiden oluşan buz süblimasyona uğrar. Böylece uçucu olan tüm materyal ortamdan uzaklaşırken, uçucu olmayanlar (pr, n.a) konsantre halde bazende tüysü şekilde çökelirler.

43 Avantaj- Dezavantajları Biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı kolaylıktan dolayı oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu şekilde dondurularak kurutulan örnekler çok uzun süre stabil halde kalabilir ve yıllarca canlılıklarını korurlar. Sıvı ortama alındıklarında yeniden çözünürler. Liyofilizasyonun sadece sulu çözeltiler için uygun olması bu tekniğin kullanımında bazı kısıtlamalara yol açar. Organik çözücüler sulu çözeltilerin erime (melting) noktasını düşürür ve örneğin erime olasılığını artırarak işlem esnasında denatürasyona yol açar. Yine organik buharların vakum pompası içerisine girerek zarar vermeleri tehlikesi de vardır.

44 Vakum altında santrifüjleme Pek çok biyolojik örneğin kurutulmasında kullanılır. Öncelikle örnek organik bir çözücüde veya suda çözündürülür. Çözücüde santrifüjde vakum altında uçurulur ve örneğin tüpün dip kısmında çökelmesi sağlanır. Hızlı olması, ön dondurma işlemine gerek olmaması, örneğin tamamen kazanılması ve sudan başka çözücülerin de kullanılabilmesi bakımından dondurarak kurutmadan daha kullanışlıdır.

45 4. Çöktürme Su veya başka bir çözücü içeren bir ortamda istenilen yada istenmeyen moleküllerin çöktürülerek katı halde ayrılması temeline göre yapılır. Amonyum ve sodyum sülfat, proteinleri çöktürmede oldukça yaygın kullanılan anorganik tuzlardır. İzoproponal, etanol da genellikle nükleik asitleri çöktürmede kullanılır.

46 5. Enzim Uygulaması Ayırma işlemi enzim uygulaması ile yapılır. Örn: Proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin de nükleazlarla parçalanarak ortamdan uzaklaştırılması mümkündür.

47 6. Santrifüjleme Bu teknik, Santrifüj adı verilen aletler yardımıyla, yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışı temeline dayanır.

48 Santrifüjleme sonunda Üst faz (sıvı faz) süpernatant Alt faz (çökelti) pellet

49

50 Santrifüj kuvveti Makromolekül halindeki bir partikül veya bir hücre organeli yüksek hızda döndürüldüğünde bir santrifüj kuvvetinin etkisinde kalır. F = m x ω2 x r F = sanrifüj kuvvetinin derecesi m = çöken partikülün kütlesi ω = açısal hız r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı

51 Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF) Çökelen bir partikül üzerindeki kuvvet, dönüm hızı ve partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile artar. F değerinin, yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili olarak, daha genel bir ifade Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF) dir. RCF değeri: RCF = x 10-5 x rpm 2 x r rpm = örneğin dakikadaki dönüm sayısı (devir/dakika) r = çökelen partikülün dönüm eksenine uzaklığı (cm)

52 Santrifüjleme Genellikle ortalama RCF nin hesaplanmasında, santrifüj tüpünün tepesi ile dibi arasındaki uzaklığın ortasındaki r ort değeri kullanılır. RCF, sayısal bağıntı çizelgesinden (nomogram) yararlanılarak da kolaylıkla saptanabilir. RCF değeri, x g olarak gösterilir.

53 RCF hesaplama Örn; devir/dakikada ortalama r değeri 7cm. ise, RCF=32.000xg Resim A : RCF değerinin, çökelen partiküllerin dönüm eksenine olan uzaklıkları r ile değişimi Resim B :RCF tayini için sayısal bağlantı çizelgesi.

54

55

56 Santrifüjleme Santrifüjleme temelde biyolojik materyain hazırlanmasında, moleküllerin yalıtımı ve saflaştırılmasında kullanılan etkin bir teknik olduğu gibi saflaştırılmış moleküllerin hidrodinamik özelliklerinin (biçim, boyut, yoğunluk vb) analitik olarak ölçülmesinde de oldukça kullanışlıdır. Temelde dönmeyi sağlayan bir motor ile tüplerin konduğu bir rotor dan oluşur. Düşük devirliden karmaşık donanıma sahip ve analitik işlemler de yapabilen pek çoksantrifüj tipi geliştirilmiştir.

57 Düşük Hızlı Santrifüjler Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde düşük hızlı (devirli) santrifüjlerin en yüksek hızları devir/dakikadır (3000xg). Bu aletler genelde oda sıcaklığında çalışırlar ve sıcaklık kontrolleri yoktur. Rotorları, sabit açılı ( fixed angle ) veya açılan kova ( swinging bucket ) tipindedir.

58 Düşük Hızlı Santrifüjler Genellikle 12 veya 50 ml lik santrifüj tüpleri kullanılır. Daha çok sıvı besi ortamları ya da süspansiyonlardaki hücrelerin hızlı şekilde çöktürülmesinde yararlanılır. Santrifüjleme sonunda tüpün dibinde hücreleri içeren bir çökelti (pellet) oluşur; çökeltinin üstündeki üst sıvı (supernatant) dökülerek uzaklaştırılır.

59

60 Düşük Hızlı Santrifüjler Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde kullanılır. En yüksek hızları dev/dak dır. Genellikle oda sıcaklığında çalışırlar, sıcaklık kontrolleri yoktur.

61 Yüksek Hızlı Santrifüjler Daha duyarlı uygulamalar için, yüksek devirli ve ısı kontrollü santrifüjler gereklidir. Sıcaklığı (4 C civarında ) ve hızın kontrol altında tutulması, özellikle yüksek sıcağa duyarlı biyolojik materyalin santrifüjlenmesi sırasında önemlidir. Yüksek hızda santrifüjleme de başlıca 3 tip rötor kullanılır: 1. Sabit açılı 2. Açılan kova 3. Dikey rötorlar

62 Rotor Çeşitleri Sabit açılı rotor Açılan kova Dikey

63 Yüksek Hızlı Santrifüjler Günümüzde rotorlar daha çok karbon- fiber karışımı malzemelerden imal edilmektedir. Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma süreleri kısadır. Bu santrifüjler içinde en çok kullanılan orta hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir. Maksimum hızları genellikle rpm dir.( xg)

64 Yüksek Hızlı Santrifüjler Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı gereklidir. Bu santrifüjlerde, parçalama sürecinden sonra hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre organelleri (nukleus, mitokondri, kloroplast gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında makromoleküller (nükleik asit, proteinlerv.b.) çöktürülebilir.

65 Ultrasantrifüjler En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir. Ultrasantrifüjlerle çok yüksek devirlere ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede ısı artışı oluşacağından çalışma sırasında cihazın cihazın içinin soğutulması ve sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması gerekir. Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de olsa parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi çeliktabaka ilekaplıdır.

66

67 Ultrasantrifüjler Hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel veya moleküllerin) Saflaştırılmış moleküllerin analitik ölçümlerinin yapılmasında kullanılır. Örneğin; saflık derecesi, molekül ağırlığı, yoğunluğu, biçimi, bileşenlerin özellikleri ve oranların belirlenmesi gibi.

68 Santrifüjleme Uygulamaları Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir süre uygun hızda döndürülmesiyle elde edilen iki ayrı fazda (çökelti ve üst sıvı) preparatif amaçlı olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak üzere hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır. Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre organellerine ve makromoleküllere kadar farklı boyuttaki partiküller birbirinden ayrılır.

69 Santrifüjleme Uygulamaları Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha özgül biçimde ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa bağlı (differantial) santrifüjleme geliştirilmiştir. Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık santrifüjleme uygulanır. Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller homojen şekilde dağılmıştır. İşlem devam ederken partiküller sedimentasyon derecelerine göre çökerler.

70 Santrifüjleme Uygulamaları Diferansiyel santrifüjleme Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin çökelme hızını ifade eden çökelme katsayıları(s) hesaplanabilir. Birimi saniye olan s terimi genellikle standart koşullarda, 20 0 C de ortam olarak su kullanarak yapılır. S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre organellerini sınıflandırmada kullanılan bir özelliktir. Bir molekülün ya da organelin boyutunu (molekül ağırlığı, baz çifti v.b.) hesaplamakta kullanılır.

71

72 Santrifüjleme Uygulamaları Çökelme katsayıları 1x x10-13 arasında değişir. Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme katsayıları Svedberg birimi(s) ile ifade edilir. 1S= 1x10-13 saniyedir.

73 Santrifüjleme Uygulamaları Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme (density gradient ) Örnek yoğunluk tüpün tepesinden dibine doğru giderek artan akışkan bir ortamda santrifüjlenir. Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu yöntemde değişik boyuttaki partiküllerin tek bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur.

74 Santrifüjleme Uygulamaları Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme( density gradient ) Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir. Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanılmasıyla ayrıntılı şekilde araştırılabilmektedir. DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve DNA nınfarklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir. Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi hücre bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da kullanılmaktadır.

75 Yoğunluk derecelemesi santriifüjleme (density gradient) Yoğunluk derecelenmesinde başlıca iki yöntem kullanılır: 1. Hız- bölgesel (rate- zonal) santrifüjleme İşlemden önce, otomatik derecelenme karıştırıcısı yardımıyla, sakkaroz veya gliserol gibi küçük molekül ağırlıklı solüsyonlarla bir yoğunluk derecelenmesi hazırlanır. Örnek derecelenme tabakasının tepesine yayılır ve tüpler açılan kova tipindeki rotora yerleştirilir. İşlem sırasında partiküller s değeriyle bağlantılı bir hızda hareket ederler.

76 Yoğunluk derecenlemesisantriifüjleme (density gradient ) 1. Hız- bölgesel (rate- zonal) santrifüjleme Partiküller bölgeler (zonlar) halinde çökerler ve birbirlerinden ayrılmış olarak kalırlar. İşlem partiküller tüpündibine ulaşmadan sona erdirilir. Tüpteki değişik bölgeler ayrı ayrı toplanır.

77

78 Yoğunluk derecenlemesisantrifüjleme( density gradient ) 2. Eşityoğunluk (Isopycnic) santrifüjleme Bu yöntemde yoğunluk derecelenmesi işlem sırasında oluşur. Ayırımı yapılacak olan molekülü içeren karışım, sezyum klorür veya sezyum sülfat gibi ağır metal tuzu çözeltisi içinde çözülür Ultrasantrifüj tüpüne doldurulur ve santrifüjlenir.

79

80 Kromatografi

81 Kromatografi, katı veya sıvı bir durağan (stationary) fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli faz aracılığıyla hareket ederken birbirlerinden ayrılmaları temeline dayanmaktadır. Bu ayrılmaya yol açan etkenler, moleküllerin tutunma (adsoption), dağılma(partition), iyon değişimi, ilgi (afinite) özellikleriya damolekül ağırlıklarındaki farklılıklardır. Bu farklılıklar nedeniyle karışımdaki bileşenlerden bazıları durağan fazda daha uzun süre kalırlar ve kromatografi sistemindeki hareketleri yavaş olur. Diğerleri ise hareketli faza daha çabuk geçer ve sistemden daha hızlı ayrılır.

82 Kromatografi Kromatografi, bir karışımdaki çeşitli maddeleri, maddelerin özelliklerindeki farklılıklara dayalı olarak ayıran analitik tekniktir. Polarite, çözünürlük, affinite (ilgi) iyonik güç ve/veya çap farklılıklarına bağlı olarak karışımdaki maddeler ayrılabilir. Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yöntemininkullanımıilebaşarılı sonuçlar eldeedilmektedir. Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir.

83 Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. 1. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmişbirsıvı tabakasından" oluşur. 2. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. 3. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşimtürlerini oluştururlar.

84 Kromatografi yöntemleri, çözünen moleküllerin durağan faza bağlanma veya onunla etkileşime girme biçimine göre iki tipe ayrılır. Dağılım (partition) kromatografisi çözünen materyalin iki sıvı faz arasındaki dağılımına dayanır. Uygulamada doğrudan iki sıvı kullanılabildiği gibi, (ince tabaka ve gaz- sıvı kromatografilerinde) sıvılardan biri katı bir destek (matris,matriks) üzerinde sabitleştirilmiş olabilir. Araştırılan örneğin bileşenlerinin iki faz arasındaki dağılımı temelde onların çözünürlükfarklarından kaynaklanır.

85 Tutunma (adsorbsiyon) kromatografisinde, örnekteki moleküller için sınırlı sayıda özgül bağlanma yerleri içeren (iyon değiştirici reçine gibi) bir durağan faz ya da destek bulunur. Bu kromatografi tipi moleküller ile durağan fazın yüzeyindeki bağlanma yerleri arasındaki özgül etkileşimlere dayanır. Moleküllerle destek arasındaki çekim kuvvetleri iyonik, hidrojen bağları oluşumu veya hidrofobik etkileşimler olabilir ve bu reaksiyonlar geri dönüşümlüdür.

86 Adsorpsiyon (Tutunma) Kromatografisi Sabit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı polaritelere (kutuplaşmalara) sahip maddelerin, farklı derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır. Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile anılırlar. Tutunmaya dayalı olanlar (örneğin iyon değişimi kromatografisi) nükleik asitler ve proteinler gibi makromoleküllerin ayırımında daha etkindir.

87 Dağılım Kromatografisi Sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur. Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön plana geçmektedir. Buna bağlı olarak hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "dağılım kromatografisi" genel adı ile anılırlar. Dağılım esasına dayalı kromatografi yöntemleri özellikle aminoasitler, karbonhidratlar ve yağ asitleri gibi küçük moleküllerin ayrımı ve tanımlanmasında çok etkindir.

88 İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi; bitki pigmentlerinin (klorofil A, klorofil B ve ksantofil) renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi (renkli yazmak) adını vermiştir.

89 Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız kısım su hizasının üstünde kalacak şekilde su tankına batırınız ve dik bir şekilde tutunuz. Su, kapiler etkisiyle kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken mürekkebi çözer ve sürüklemeye başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek ayrılmış olur.

90 Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yöntemininkullanımıilebaşarılı sonuçlar eldeedilmektedir. Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir. Kromatografi

91 Kromatografi nin Sınıflandırılması 1-Uygulama Biçimine Göre 2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre 3-Faz Tiplerine Göre

92 1-Uygulama Biçimine Göre - Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) -Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Süperkritik akışkan kromatografisi

93 2- Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Dağılma kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi İyon çifti kromatografisi Afinite kromatografisi

94 3-Faz Tiplerine Göre -Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi -Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi

95 Kolon Kromatografi

96 Kolon Kromatografisi

97 Protein karışımı depo (tampon) mobil faz (tampon) sabit faz (katı porlu matriks) elüent Kolon kromatografisi: biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır. Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur. è SABİT FAZ biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir. è HAREKETLİ FAZ Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler è önce adsorbe edilenler è daha geç kolonu terkeder.

98 Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. Alumina: Genellikle nötr ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. Selüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Petrol eteri, Dietil eter, CCl 4, Benzen, Toluen, CHCl 3, CH 2 Cl 2, Etil asetat, Aseton, n-butanol, İzopropanol, Etanol, Metanol olabilir.

99 1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı. Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina kullanılmaktadır. Resi Resim şu anda görüntülenemiyor.

100 Kolon Kromatografisi En kullanışlı ve yararlı kromatografi tekniklerinden biri olan kolon kromatografisi katı bir durağan faz ile sıvı bir hareketli fazdan oluşur. Durağan faz cam veya plastik bir çubuk içerisine konur ve hareketli faz katı tutucudan geçirilir. Kolonun tepesine uygulanan az miktardaki karışım kolondan geçerken karışım oluşturan moleküller iki fazdaki tutunma veya dağılma özelliklerindeki farka göre kolonda farklı hızda ilerlerler. Kolondan çıkan sıvı fazın fraksiyonlar halinde toplanmasıyla değişik moleküllerin ayrımı yapılabilir.

101 Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: i. Jel filtrasyonu è büyüklük i. İyon değişim è yük i. Affinite è (bağlanma)

102 Jel Geçirgenlik Kromatografisi Jel filtrasyonu veya moleküler elek kromatografisi olarak da adlandırılan jel geçirgenlik kromatografisinde şimdiye kadar açıklanan tekniklerden farklı olarak ayırma molekülün büyüklüğüne göre yapılır. Bu teknik binlerce protein, nükleik asit, polisakkarit ve diğer biyolojik moleküllerin saflaştırılmasında önem taşır. Jel filtrasyonu için kullanılan bir kolonda durağan faz kontrollü boyutta küçük porlu inert partiküllerden oluşur. Farklı boyutlarda moleküller içeren solüsyon devamlı bir çözücü akışıyla kolondan geçirilir. Porlardan daha büyük olan moleküller jeldeki partiküllerin içerisine girmezler ve partiküllerin arasında sınırlı bir alanda kalırlar. Sonuçta bu moleküller yavaşlamazlar ve kolondan hızla çıkarlar. Partiküllerin içinde ve dışında yayılabilen küçük moleküllerin kolondaki hareketleri ise daha yavaş olur.

103 Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir Küçük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar. Büyük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.

104 Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik moleküllerinbirbirinden ayrılmasıiçin kullanılır. Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin edilebilir. Avantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilir. Dezavantaj: Yavaş ayırım

105 İyon Değişim Kromatografisi Bu teknik iyon molekülleri yüklü bir durağan faz ile geriye dönüşebilen elektrostatik etkileşime girebildikleri bir tutunma kromatografi biçimidir. İyon değişimi kromatografisi kolon iyonik işlevsel gruplarla etiketlenmiş sentetik reçineden oluşan durağan fazla doldurulur. İşlemin ilk aşaması kolondaki çözünmeyen özellikteki pozitif yüklü reçinenin tampondaki zıt yüklü iyonla çevrilmesidir. İkinci aşamada ayrılacak karışımın kolona yüklenmesiyle farklı yüklü moleküllerin iyon değiştirici ortama girmesi sağlanır.

106 İyon exchange (değiş- tokuş) Kromatografi Biyomolekül karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla [(+) - > (+) veya (- ) - > (- ) ile] yer değiştirerek kolona bağlanırlar. Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar. Daha sonra, iyonik gücü/ph sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı moleküllerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır.

107 İlgi (Affinite) Kromatografisi Bundan önce açıklanan kromatografik ayrımlar durağan destekler ile moleküller arasında özgül olmayan fizikokimyasal etkileşimlere dayanır. Büyük boyut ve polarite gibi moleküler özellikler biyolojik moleküllerin ayrım ve izolasyonunda yüksek bir seçicilik sağlamaz. İlgi kromatografisi ise biyolojik etkileşim temeline dayanır. Bu nedenle son derece özgül ayrımların yapılabilmesini sağlar. Makromoleküllerin çoğunun meydana getirdikleri biyolojik işlevler ligand adı verilen özgül moleküllerle etkileşimlerinin sonucudur. A (makromolekül) + B (ligand) Biyolojik Yanıt

108 Affinite Kromatografisi Enzim, hormon vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır. Kolonun dolgu maddesine (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır. Ligand ile kompleks yapan spesifik protein, katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinlerkolonu terkederler. Bağlı protein, daha sonra, ph değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir. Seçiciliği fazla olan bu yöntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen Antikor Enzim Substrat Reseptör İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.

109 Kolon Kromatografisi a)gaz Kromatografi (GC) b)yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC)

110 Gaz Kromatografisi (Gas Chromatography- GC) Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda bu tekniğe gaz- sıvı kromatografisi ya da kısaca gazkromatografisi denir. Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik ve ya camdan bir tüp içerisine doldurulur. İnert bir gaz halindeki hareketli faz yüksek basınç altında kolondan geçirilir. Çalışan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.

111 Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan, basit, hızlı, çok yönlü bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte bu kromatografideki en önemli kısıtlama kullanılan örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayrımında kullanılabilir.

112 Gaz Kromatografi (Gas Chromatography- GC) Bu teknik laboratuvarda basit aletlerle yürütülemez. Yöntemin uygulanmasında çok gelişmiş otomatik cihazlar gereklidir. Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir.

113 Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) Son yıllarda yeni kolon dolgu maddelerinin değiştirilmesiyle biyomoleküllerin ayrılmasında kullanılır. Böylece birçok molekülün yapısal ve işlevsel analizlerini yapmak üzere çok kısa sürede ve etkin biçimde saflaştırılmalarımümkün olmaktadır. Aminoasitler, karbonhidratlar, lipitler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, steroidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrımının yapılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknikte otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografisidir. Ayrıştırma ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir, kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir, ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebilindiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir. HPLC ve GC sistemleri arasında da büyük benzerlik vardır. Sadece GC deki gazın yerine HPLC de çözücü almıştır.

114 Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) Ayırma tekniği olan bir HPLC cihazının temel bileşenleri; Çözücü deposu Yüksek basınçpompası Ticari olarak hazırlanmış kolon Algılayıcı (dedektör) Yazıcı GC deki taşıyıcı gazın yerini HPLC de çözücü almıştır.

115 HPLC Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmeleregirerek, kolon içindedeğişikhızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilipmiktarıyla orantılıolarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir

116 Maddelerin tanımlanması tüm HPLC uygulamalarında en kritik kısımdır. Bunun için detektör seçimi çok önemlidir. Kolon ve hareketli fazın seçimi de kritik noktalardır. Miktar analizi ise, bir maddenin çözelti içindeki yoğunluğunun bulunmasıdır. Öncelikle standart bileşiklerin madde konsantrasyonlarının ölçülmesi gerekir. Bu bileşiklerin kromatografisiyle elde edilen grafikler (kromatogram) bilinmeyenmaddeyle karşılaştırılırve miktar tayini yapılabilir. HPLC Avantajları; HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir. HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Nitel ve nicelanalizlerde kullanılabilir. Ayrıştırma ve analiz hızı yüksektir. Duyarlık yüksektir. Aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir. Büyük boyuttaki ayırım süreçlerine uygulanabilir.

117 Düzlemsel Kromatografi (Kağıt ve ince Tabaka Kromatografileri) Kağıt kromatografisinde destek ortamı suyla yüksek derecede doyurulmuş durumdaki selüloz tabakasından oluşur. İnce tabaka kromatografisinde ise ince bir silika jel, alumina veya selüloz ile kaplanmış cam, aluminyum ya da plastik bir tabaka olabilir. Araştırılan örnek genellikle uçucu bir çözücü içerisinde çözündürülür, destek ortamına çok az miktarda damlatılır ve kurumaya bırakılır. Damlatma işlemine uygun miktarda örnek uygulanana kadar birkaç kez devam edilir. Daha sonra, kağıt ya da ince tabaka içinde az miktarda çözücü bulunan bir kaba konur ve çözücünün kılcal hareketi ile ayırım başlar.

118 Örnekteki moleküllerin renkli olmadığı durumlarda bunların kromatogram üzerindeki yerleşim yerlerini saptamak için renk meydana getirmek üzere fluoresans, radyoaktivite veya kimyasal madde gibi çeşitli uygulamalar yapılabilir. Renk oluşumu, görünür ışıkyada UV altında gözlenebilir. Karışımdaki her bir molekülün yerleşim durumu, molekülün hareketinin çözücünün hareketine oranlanmasıyla ölçülebilir. Bu ölçüm değerine göreceli hareketlilik (relative mobility) adı verilir ve Rƒ simgesiyle gösterilir. Rƒ değerinden, moleküllerin nitel olarak tanımlanmalarında yararlanılır.

119 Yu ru me hızı, Rf deg eri ile ifade edilir ve substansın yu ru me mesafesinin, c o zu cu nu n yu ru me mesafesine oranından hesaplanır. Rf degĕri 0 ile 1 arasında bulunur ve dogăl olarak hızlı yu ru yen komponentler ic in alınan mesafe buÿu k olacagĭndan Rf degĕri buÿu k daha yavas yu ru yenler ic in daha ku c u ktu r

120 Kağıt ve ince tabaka kromatografileri için çok az miktarda örnek yeterlidir, analiz hızlı ve ucuzdur, saptama çok belirgindir. Bununla birlikte, bu tekniklerinduyarlılığı pek yüksek değildir. Günümüzde, ince tabaka kromatografisi kağıt kromatografisinden daha yaygın şekilde kullanılmaktadır; çünkü çözücü gücünün daha fazla olmasına ek olarak, daha hızlı sonuç vermektedir.

121 İnce Tabaka Kromatografi (Thin Layer Chromatography- TLC) İnce tabaka kromatografisi, bir "katı- sıvı adsorpsiyon kromatografisidir." Bu yöntemde sabit faz, çeşitli boyutlardaki "cam plakalar üstüne, ince bir tabaka halinde sıvanmış katı adsorban maddedir. Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina, siliko jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. Bu işlem sırasında, plakanın alt kesimlerine bir damlalıklaöncedendamlatılmışolankarışımı dafarklı hızlarlayukarıya sürükler.

122 Elektroforez

123 Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin, kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarla elektriksel alanda hareket etmeleri prensibine dayanır. Bu sistemde analiz yapılacak örnek bir destek ortamına uygulanır. Modern elektroforez tekniklerinden destek ortamı olarak daha çok jeller tercih edilmektedir. Jeller içerisinde uygun bir tampon bulunan bir elektroforez aygıtına yerleştirilerek işlem gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek jele bir leke ya da ince bir bant halinde uygulanır. Katı jel desteğiyle ayrımı yapılacak moleküllerin hareketi moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine, kimyasal içeriğine ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır.

124 Oldukça hızlı ve kullanışlı bir teknik olan elektoroforezin bir homojenattaki farklı molekülleri ayırma kapasitesi genellikle fazla yüksek değildir. Bu nedenle bu teknikten preparatif olarak sınırlı ölçüde yararlanılmaktadır. Buna karşılık az miktardaki protein ya da nükleik asit karışımlarını saflaştırmakta ve analizlerini yapmakta geniş çapta kullanılmaktadır. Ohm yasasına göre, elektrik alanı, akım ile direncin çarpımına eşittir. (V=I.R) Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen tamamı jel tarafından ortaya konulur.

125 İkinci eşitliğe göre sistemin ürettiği güç direnç ile akımın karesinin çarpımına eşittir. Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektroforez aygıtı jelin sıcaklığını arttırmaksızın, ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Belli bir noktanın üstünde voltajdaki ufak artışlar bile jelin sıcaklığında önemli ve zararlı bir yükselmeye yol açar. Kullanılan aygıtın kolaylıkla dağıtabileceği gücü miktarının iyi bilinmesi ve buna göre jelin sıcaklığının dikkatle izlenmesi gerekir.

126 Elektroforez Yöntemleri Tüm elektroforez tiplerinin temeli, elektriksel eşitliklere dayanır. Aralarındaki başlıca fark destekortamının tipi ve konumudur. Dikey ya da yatay konumdaki destek ortamı selüloz ya da ince jellerden hazırlanmış olabilir. Selüloz, aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı olan moleküller için, jeller ise daha büyük olanlar için destek ortamı olarak kullanılır.

127 Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Akrilamidin polimerizasyonuyla hazırlanan poliakrilamid jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri vardır. küçük ya da orta boydaki nükleik asit ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir; oldukça büyük boyuttaki örnekler için uygundur; göç eden moleküllerle destek materyali arasındaki etkileşim en düşük düzeydedir; destek materyali fiziksel olarak oldukça kararlı ve dayanıklıdır. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik ayırıma dayanır. PAGE nin, jel geçirgenlik kromatografisinden farkı poliakrilamid jelde küçük molekülerin büyük moleküllerdendaha hızlı hareket etmeleridir.

128 Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N - metilen- bis- akrilamidin serbest radikal polimerizasyonuyla hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı- katalizör sistemi tarafından kontrol edilir. Fotokimyasal polimerizasyon, UV ışık altında riboflavin tarafından başlatılır. Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jelde genelde %7,5 poliakrilamidjel içerir. Bir jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamidin ve bis akrilamidin konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir; yüksek konsantrasyonlarda ise, daha küçük porların oluşumu düşük molekül ağırlıklı olanların analizine izinverir.

129 Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk biçiminde veya düzlemsel biçimde hazırlanmış jellerle gerçekleştirilir. Çubuk tipinde, cam tüpler jel materyaliyle doldurulur; polimerizasyon dakikada tamamlanır. Jel tüpü, iki ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir. Üstteki depoda genellikle katod, alttakinde anod bulunur. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru hareket edeceklerinden, jel elektroforezi genellikle bazik ph da gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek, bir izleme boyasıyla birlikte, jelin tepesine uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme boyası jelin bitimine ulaştığında akım kesilir, jel tüpten çıkarılır ve boyanır.

130 Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta tutulan iki cam tabaka arasında hazırlanır. Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak belli küçük kuyucukların oluşmasını sağlar. Kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır. Jel kasedi iki tampon deposu arasına yerleştirilir; kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir. Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel genellikle uygun şekilde boyanır. Akrilamid monomeri bir nörotoksindir. Kanser oluşturma tehlikesi olan bir maddedir. Bu nedenle eldivenle çalışılması gerekir.