PROTEİN HEDEFLEME EMRE YÖRÜK

Transkript

1 PROTEİN HEDEFLEME EMRE YÖRÜK

2 PROTEİN TRAFİĞİ Hücrede sentezlenen proteinler bulunması gereken işlevleri ile ilgili bölgelere / hücre içi veya hücre dışı taşınırlar Deneysel süreçler bir yana Doğal bir süreç Sürecin doğru işlememesi hastalıklara yol açabilir

3 Taşınacak protein -- reseptör protein arasında sinyaller ile etkileşim sinyal diziler 1) Proteinlerin bir ucunda bulunan amino asit uzunluğundaki sinyal peptid yapısı. Sinyal peptid çoğunlukla görevi sona erdiğinde sinyal peptidaz ile uzaklaştırılır. 2) Proteinin katlanması sırasında proteinin üzerinde bulunan atomların etkilenmesi ile üç boyutlu yapısının oluşmasını sağlayan protein üzerindeki sinyal yama olarak adlandırılan aminoasit dizilerinin oluşturduğu yapı

4 Mitokondri ve kloroplasta protein taşınması

5 Heterolog Proteinler ve Protein Hedefleme Bir organizmaya ait bir proteinin, o proteini kodlayan gen veya cdna nın bir vektör sistemi aracılığıyla farklı bir sisteme aktarılıp üretilmesi heterolog protein üretimi. Heterolog protein üretimi ilk olarak insan insülin hormonunun 1978 yılında E. coli ye sentezlettirilmesiyle başlar. Aracı sistemler bakteri, maya, böcek, memeli, transgenik bitki/hayvan bitki hücre ve doku kültürleri

6 Yabancı bir proteinin ticari amaçla üretilmesinde önemli bazı kilit noktalar: maliyet, pazar hacmi, yüksek miktarda üretim deneysel (transformasyon) kolaylık ve başarı yüzdesi ürünün etkin, güvenli ve stabil oluşu dikkate alınmalıdır.

7 Diğer üretim sistemlerine göre BİTKİ kültürlerinin kullanımının bazı avantajları vardır: Geniş ölçekli üretim için güvenli, kolay ve ucuzdur. Memeli virüs ve patojen kontaminasyonunun olmaması, Protein için BENZER glikolizasyon, fosforilasyon ve düzgün katlanma post translasyonel modifikasyonlar, Etik açıdan sorun olmaması diğer yöntemlere göre tercih nedenidir. Bitkide üretilen ilk insan proteini büyüme hormonu 1986 transgenik tütün

8 Farklı bitkilerde üretilen farklı proteinler: Enzimler terapotik proteinler (aşılar) İnsan plazma proteinleri Hormonlar Antikorlar büyüme düzenleyicileri Vb

9 Çeşitli bitkilerde üretilen proteinler ' ' '

10 Bazı bitkilerde üretilen rekombinant antikorlar ' ' '

11 Bazı bitkilerde üretilen rekombinant aşılar

12 Protein ürünün izolasyonu Bitkilerde heterolog protein üretiminde iki yaygın gen aktarım sistemi kullanılır: Heterolog protein üretimi 3 aşamadan oluşur İstenen proteini sentezleyen genin cdna nın elde edilmesi Genin ekspresyon sistemine aktarılması

13 Bitkilerde heterolog protein üretimi ve hedefleme Bitkilerde diğer organizmalara ait proteinlerin üretimi günümüzde standart bir uygulama haline gelmiştir insan interferon, serum albümini ve antikorlar Sadece antikorun tamamı değil, ayrıca Antijen bağlayan (Fab) fragment ve tek zincir fragmentleri (scfvs) nin tütün ve Arabidopsis te yüksek seviyede üretimleri sağlanmıştır. Rekombinant antikorların (rabs) anlatımı ve hedeflenmesi çeşitli bitki hücrelerinin çeşitli bölümlerinde başarılı olarak gerçekleştirilmiştir: Sitosol, ER, kloroplast ve intraselüler alan.

14 Bitkilerde rabs hedefleme çalışmalarının umut verici olması çeşitli araştırmalara olanak sağlamıştır: Virionlara bağlanan rabs üretimi ile transgenik bitkilerde virüslere direnç kazanımı Transgenik bitkilerde üretilen rabs ler ayrıca çevresel kirlilik ajanlarının uzaklaştırılması pollutan-spesifik antikor hedefleme rabs lerin terapatik ve tanı amaçlı olarak kitlesel üretimi için biyoreaktörler olarak bitki kullanımı Rekombinant protein ve transgenik bitkilerin karakterizasyonu önemlidir; kültür koşulları ve çevresel konumdaki değişimler farklı glikoformlarının oluşumuna yol açabilir. HANGİ BİTKİ, HANGİ PROTEİN İLE ÇALIŞILACAK? KARAR?

15 Bitki türevli antikorların karakterizasyonu, saptanması ve lokalizasyonu: Örnek Metodoloji Transgenik tütün tarafından üretilen TMV spesifik rabs ler sitosole birikir. Süspansiyon kültürlerden protein izolasyonu yapılır ELISA temelli uygulamalar ile Antikorun varlığı, miktarı ve spesifikliği tayin edilir. İzole edilen antikorlar SDS-PAGE ve immünoblot analizlerine tabi tutulur ve saflığı, tamlığı ve kararlılığı araştırılır. İmmünoblot, lektin analizleri ve IEF teknikleri glikolizasyon ve ürünün üç boyutlu yapısının doğrulanması için kullanılır.

16

17 Bitkilerde Rekombinant Proteinlerin Stabilitesi Tüm organizmalarda proteolitik enzimler sadece endojen metabolik reaksiyonlar için değil ayrıca anormal ve yabancı/eksojen proteinlerin yıkımıyla da ilişkilidir. Gen anlatımı ve ürün elde edilmesini ön gören çalışmalarda rekombinant proteinlerin bu enzimlerce yıkımı minimize edilmeli hatta kaçınılmalıdır. Bazı proteinler sentezi esnasında veya hemen sonrasında yıkılırlar, diğer bazıları hücrelerden ekstraksiyon esnasında kaybolur. Her ne kadar günümüzde bitki, hayvan ve mikrobiyal sistemlerde ekstraksiyonla ilişkili hidrolitik durumlar minimize edilebilse de, in vivo proteoliz konak organizmada rekombinant gen anlatımı için önemli bir engeldir.

18 Maya ve E. coli de bazı ekso ve endoproteazlar rekombinant/anormal proteinler için tehlike teşkil eder Ve bu potansiyel veya aktif hidrolitik süreçleri etkisiz hale getirmek için stratejiler geliştirilmiştir. Maya ve diğer ökaryotik hücrelerde anormal olarak tanımlanan yabancı proteinlerin posttranslasyonel ubikitinasyonu eş zamanlı olarak ubikitin aracılı proteoliz yolağıyla ilişkili olarak multi-katalitik proteazom kompleksi tarafından hızlıca yıkılmalarına neden olabilir, Bu da maya ve diğer memeli hücrelerinde rekombinant protein üretimi istendiğinde ubikitin bağlanmasının önemi göz önünde bulundurulmalıdır. Bunu engelleyici sistemler kurulmalıdır.

19 Günümüzde rekombinant proteinlerin stabilitesi hakkında az bilgi bulunmaktadır. Bitki hücrelerinde vakuollerdeki proteazlar ve yüksek konrunmuşluk gösteren ubikitin sistemlerinin temel bileşenleri bitkilerde belirlenmiştir. Bitki hücresinde vakuolde mevcut olan ve özellikle hafif asidik ph da aktif olan proteazlar anlatımı yapılan yabancı proteinlerin stabilitesi üzerinde negatif etkisi vardır. Bu nedenle ki anlatımı yapılacak proteinin stabilitesini değiştiren potansiyel veya aktif proteolitik olayların belirlenmesi, yüksek miktarda üretim ve ilgili proteinin bitki hücresinde istenen lokasyonda birikmesi için hayatidir.

20 Geçici protein anlatımı: Transgenin aktarımı stabil bir genetik transformasyonla sonuçlanmaması ve kısa süreli bir transgen anlatımı süreçleri. Geçici gen anlatım sistemleri üç şekilde gerçekleşir: i) Partikül bombardımanı, protoplast transformasyonu ve mikroenjeksiyon gibi direkt yöntemler ii) Viral vektör sistemleri iii) Bakteriyel enfeksiyon sistemleri Bitkilerde Geçici Gen Anlatımı Agroinfiltrasyon yöntemi hızlı, ucuz ve yüksek miktarda protein üretimi için günümüzde kullanılan bir yöntemdir. Aşı ve terapatik üretim için uygundur tütünde başarılı şekilde uygulanmıştır.

21 Bitki protoplastlarında geçici anlatım proteinlerin analizi ve görüntülenmesi için önemli bir tekniktir. PEG uygulaması ; Elektroporasyon Geçici anlatım teknikleri zaman alıcı ve yorucu değil ayrıca kısa sürede çok sayıda örnek analiz olanağı sağlar. Hızlı, elverişli ve esnek olmasından dolayı transkripsiyon ve translasyon süreçlerindeki promotor ve düzenleyici (DNA) elementlerinin, eksojen uyarı ile gen anlatımının indüklenmesinin ve klonlanan gen veya cdna ların işlevselliğinin kontrolünün analizinde yaygın olarak kullanılır.

22 Nicotiana benthamiana bitkisinde C5-1 fare antikorunun üretimi pcambia 2300 binary plazmidi A. tumefaciens AGLI ırkı Metodoloji Bitki rejenerasyonu Ekspresyon kasetinin birleştirilmesi ve Agrobacterium transformasyonu Bakteriyel kültür ve süspansiyon hazırlanımı Şırınga İnfiltrasyonu ve Bitki İnkübasyonu Protein Ekstraksiyonu, Analizler ve Antikor Saflaştırımı i) Protein izolasyonu-western blot ii) Antikor Saflaştırımı

23 Bitki süspansiyon kültürlerinde rekombinant antikorların üretimi Ucuz, güvenilir ve yüksek kalite ve miktarda rekombinant farmasötik protein üretimi. Biyofarmatiklerin üretimi için umut vericidir. Bitki süspansiyon kültürlerinin diğer bitki temelli antikor üretim yöntemlerine kıyasla aşırı çevresel koşullara (hava, toprak vb.) ve gen geçişi ile ilişkili problemlerden kaçınma açısından daha avantajlıdır. Bitki biyokütlelerinden rekombinant protein geri kazanımı ve izolasyonu çok pahalı ve zordur. Buna karşın (h.dışı için) sinyal diziyi taşıyan rekombinant proteinin anlatımı yaptırılır ve kültür medyumuna salgılanır bu yüzden de yüksek miktarda saflaştırma gerçekleştirilebilir.

24 Nicotiana tabacum, A. thaliana ve Oriza sativa bitkilerinin sıvı hücre kültürlerinde farmasötik protein üretimi. A. tumefaciens transformasyonu Metodoloji Rekombinant tütün hücre hatlarının üretimi Rekombinant pirinç hücre hatlarının rejenerasyonu kallusun başaltılması transformasyon süspansiyon kültür başlatımı Köklerden rekombinant Arabidopsis hücre hatlarının rejenerasyonu Western emdirimi Konfokal mikroskobu ile Rekombinant proteinlerin saptanması

25 A-F: transgenik süspansiyon kültürlerinde rekombinant proteinlerin hedeflenmiş anlatımı, B, D ve F : GFP anlatımı A, B: Sinyal peptid rekombinant proteine eklenmediği zaman, protein sitosolde birikir (A ve B). C, D: Sinyal peptidi ve ER retention dizisi eklendiğinde ise, rekombinant protein çoğunlukla veya sadece ER de bulunurlar. E, F: Proteinler ayrıca Golgi aygıtında da görülebilir, pirinçte. Bars = 8 μm, ve 20 μm N, nucleus.

26 Bitkilerde Aşı Üretimi Bitkiler aşı üretimi için uygun biyoreaktörlerdir. Buna karşın günümüzde hala Faz II ve Faz III e geçen bitki kökenli biyofarmasötik örnek sayısı azdır. Bitkilerdeki anlatım sistemleri arasında: Stabil nuklear transgen sistemleri Viral vektörlerle geçici anlatım Kloroplast-türevli anlatım sistemleri sıklıkla uygulanmaktadır.

27 Schematic representation of vaccine antigens and biopharmaceuticals production in plants and their functional evaluation in animal models. Explants are tissues that have the potential for regeneration into mature plants. Here, we provide lettuce and tobacco as examples.

28 Nicotiana benthamiana bitkisinde şarbon hastalığıyla ilişkili insan-türevli antikor üretimi. Agroinfiltrasyonu ile geçici anlatım yapılıyor Bacillus anthracis in insanda hastalık oluşturan antijenine (PA) karşılık koruma amaçlı tütün bitkisinde antikor üretiliyor. Ve toksin aktivite ortadan kaldırılıyor. Çalışmada bitkide antrax antijeni PA ya karşılık antraks aşısıyla aşılanmış insan türevli spesifik-toksin nötralize edici monoklonal antikor pp-mab üretimi, ölçümü ve değerlendirimi gerçekleştiriliyor. Kontrol amaçlı olarak hibridoma tekniğiyle üretilen eş antikorla hp-mab karşılaştırılıyor sonuçlar

29 Antraks hastalığının antijenine karşı geliştirilen antikorun saflaştırılması ve karakterizasyonu: a) Markır ve agroinf. Aracılı üretilen antikor pp-mab, antikorun ağır ve hafif zincirleri b) Antraks antijenine (PA) bağlanan özgün antikor pp-mab. c) ELISA yöntemi ile angroinf. ve hibridoma tekniğiyle üretilen antikorların antijene bağlanması.

30 İki teknik aracılığıyla üretilen antikorların antijene bağlanması ile birlikte hücre ölüm oranında düşüş gösteriliyor Farklı monoklonal antikor konsantrasyonları toksin etkinin ortadan kalkması için deneniyor. Düşük konsantrasyonda ölüm yüzdesi daha da düşüyor

31 Transgenik bitkilerde tek-zincir antikor anlatımı İnsan epidermal büyüme faktör reseptörü-2 (HER2) göğüs kanserinde anormal hücre çoğalmasında iş gören bir onkogendir Ve yeni kanser terapi geliştirilmesi için umut vericidir. Çalışmada, scfv-αher2 klonlanması ve anlatımı E. coli ve tütün ile N. benthamiana da hem kalıcı hem de geçici sistemler kullanılarak yapılıyor. E. coli ve bitki dokularından saflaştırılan tek-zincir antikorların (ScFvs) işlevselliği ve özgüllüğü test ediliyor Ve göğüs kanserli insan dokuları üzerinde denendiğinde pozitif sonuçlar elde ediliyor.

32 Bitkilerde insandakilere benzer N-glikanları içeren antikorların hızlı ve yüksek miktarda üretimi ve geçici anlatımı Monoklonal antikorlar da dahil olmak üzere pek çok farmasötik proteinler biyolojik aktiviteleri için co-translasyonel ve post-translasyonel modifikasyonlara gereksinim gösteren komepleks proteinlerdir. Bitkilerde ne kadar N-glikolizasyon da dahil olmak üzere bu modifikasyonlar gerçekleşse de bitki ve memeli kompleks N-glikanları arasındaki yapısal farklılıklar, bitkilerde üretilen glikozillenmiş farmasötik proteinlerin ticari olarak üretimini kısıtlamaktadır. Bu kapsamda bitki N-glikanlarının bu problemini aşmak için çeşitli stratejiler geliştirildi: Monoklonal antikorun ağır veya hafif zincirinin C ucuna ER yönlendirim sinyalinin eklenmesi. Veya bitkilerde bazı genlerin knock-outları.

33 Çalışmada agroinfiltre edilmiş N. benthamiana yapraklarında eş zamanlı olarak antikor ve insan b-1,4-galaktosiltransferaz ın geçici anlatımları yapılıyor. Fare C5-1 antikoru kendi sinyalini taşıyan (salgı yolu) ve ER a yönlendirimi sağlayan sinyali taşıyan formları şeklinde çalışmada kullanılıyor. Şırınga ve vakum infiltrasyonu yapılan bitki ekstrelerinde C5-1 birikim analizi: C1-C2-C3 ticari kontroller 1 C5-1 salgı yoluna 2 C5-1 ER e yönlendirilen

34 Bitkilerde antikor üretimi ile farede Doğu Nil virüs enfeksiyonunun tedavi edilmesi Doğu Nil virüsü çok sayıda ülkede etkisini göstermiş ve günümüzde insan için etkin aşı veya terapötik bir ajan kullanımı yoktur. Hu-E16 monoklonal antikoru virüsün kılıf proteinine bağlandığı ve viral füzyonu engellediği bildirildi. Bu çalışmada antikor bitkilerde ticari amaçla fazla miktarda üretime yönelik olarak üretiliyor. İnfiltrasyona maruz bırakılan 8 günlük N. benthamiana bitkilerinde yüksek seviyede Hu-E16 üretildi ve viral aktivite nötralize edildi. Farenin virüsle enfeksiyonundan sonra tek dozajda verilen Hu-16E başarılı şekilde fareyi koruyor.

35 Hu-E16 nın western emdirim analizi: 1. Kuyu: fare Hu-E16 standart olarak kullanılıyor 2. Kuyu: filtre edilmemiş yapraklardan elde edilen ekstreler 3. Kuyu: Hu-E16 ağır ve hafif zincirleriyle infiltre edilmiş yaprak ekstreleri N. benthamiana da Hu-E16 nın anlatımı ve saflaştırılması: A) Protein ekstreleri ELISA ile analiz ediliyor ve Hu-E16 nın birleşmiş formu saptanıyor. Farklı infiltrasyon deneylerinin ortalama SD değerleri veriliyor B) SDS-PAGE de farklı koşullarda protein ekstrelerinin analizi. Hafif (LC), ağır (HC) ve her iki zincirin analizi (HL2)

36

37