ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Vahap Aykut AKSOY β-glikozidaz ENZİMİNİN BORNOVA MİSKETİ ÜZÜMÜNDEN İZOLASYONU, SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ β-glikozidaz ENZİMİNİN BORNOVA MİSKETİ ÜZÜMÜNDEN İZOLASYONU, SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Vahap Aykut AKSOY YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../... tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu İle kabul edilmiştir. İmza... İmza İmza.... Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2008 YL36 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 . ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ β-glikozidaz ENZİMİNİN BORNOVA MİSKETİ ÜZÜMÜNDEN İZOLASYONU, SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Vahap Aykut AKSOY ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. M.Ümit ÜNAL Yıl : 2010, Sayfa : 38 Jüri : Doç. Dr. M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Bu çalışmada, Bornova Misketinden izole edilen ve kısmen saflaştırılan β- glikozidazın (βg, EC ) bazı biyokimyasal özellikleri (optimum ph, optimum sıcaklık, termal inaktivasyon ve inhibitörlerin etkisi) araştırılmıştır. Enzimin optimum ph değeri 5.0 olarak bulunmuş, ph aralığında yüksek aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır. Enzimin optimum sıcaklığı 55 C dir. Enzim C arasındaki sıcaklıklarda yapılan kinetik çalışmalarda % 70 in üzerinde aktivite göstermiştir. Termal inaktivasyon çalışmalarına göre sıcaklık arttıkça enzimin k D değeri artmış buna rağmen yarı ömür süresi ve D değeri azalmıştır. Enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değeri sırasıyla kj/mol (r²=0.9776) ve C (r²=0.9750) olarak hesaplanmıştır. İnhibitörlerin (Ca +2, D- glikoz, etil alkol) enzim üzerine etkileri incelenmiş farklı inhibisyon oranlarının inhibitörlerin konsantrasyonlarına bağlı olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Üzüm, Bornova Misketi, β-glikozidaz, kinetik, termal stabilite. I

4 . ABSTRACT MSc THESIS ISOLATION, PURIFICATION AND DETERMINATION OF SOME BIOCHEMICAL PROPERTIES OF β-glucosidase FROM GRAPE (MUSCAT OF BORNOVA) Vahap Aykut AKSOY DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Dr. M.Ümit ÜNAL Year : 2010, Pages: 38 Jury : Assoc. Prof. Dr. M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU This research was undertaken to determine some of the biochemical properties (optimum ph, optimum temperature, heat inactivation, and effect of inhibitors) of β-glucosidase (βg, EC ) which was isolated from Muscat of Bornova grape and partially purified. The optimum ph for β-glucosidase activity was found to be 5.0 and the enzyme showed high activity over a broad ph range of The optimum temperture for β-glucosidase activity was 55 C. Enzyme activity was more than 70% between C. According to thermal inactivation studies k D values increased as the temperature increased whereas half-life and D values decreased. Energy of activation (Ea) and Z values were found to be kj/mol (r²=0.9776) and C (r²=0.9750), respectively. Ca +2, D-glucose and ethyl alcohol inhibited the enzyme at varying degrees depending the concentration. Key Words: Grape, Muscat of Bornova, β-glucosidase, kinetics, thermal stability. II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Doç. Dr. M.Ümit ÜNAL a teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmama katkı ve eleştirileri ile destek veren, tez jürisinde bulunan değerli hocalarım Sayın Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ e ve Sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU na teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın her aşamasında, tez materyalimin temini konusunda bana yol gösteren, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım değerli hocam Sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU na, laboratuar alet ve ekipmanlarını kullanabilmem konusunda yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Sayın Prof. Dr. Sadık DİNÇER e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, deneyimlerinden faydalandığım Sayın Araştırma Görevlisi Aysun ŞENER e, Desteklerini her zaman hissettiğim değerli arkadaşlarım Ender BELLUR, Ümit KAYA ve Muzaffer AKBAŞ a, Tez materyalim olan Bornova Misketi Üzümünü temin ettiğim ve derin yardımlarını gördüğüm Sevilen Şarapları A.Ş. kurumuna, İzmir in Menderes ilçesi yöre halkına, İlgi, sabır, maddi ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen aileme, Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi ve Gıda Mühendisliği bölüm personeline teşekkürlerimi borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Misket Üzümü Üzerine Yapılan Çalışmalar β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar Bitkisel β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar Mikrobiyel β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar MATERYAL ve METOT Materyal Üzüm Örnekleri Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Metot Enzim Ekstraktının Hazırlanması Enzimin Kısmi Saflaştırılması İyon Değişim ile Saflaştırma Enzim Aktivitesinin Ölçümü Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi K m ve V m değeri Optimum ph Optimum Sıcaklık Termal İnaktivasyon İnhibitörlerin β-glikozidaz Enzimine Etkileri ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Enzimin Saflaştırılması IV

7 4.2. Optimum ph Optimum Sıcaklık Kinetik Parametreler Termal İnaktivasyon İnhibitörlerin Etkisi SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR 33 ÖZGEÇMİŞ. 38 V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Bornova Misketi β-glikozidazının saflaştırma çizelgesi Çizelge 4.2. Farklı bitki ve mikroorganizmalardan izole edilen β-glikozidazların optimum ph değerleri Çizelge 4.3. Farklı bitki ve mikroorganizmalardan izole edilen β-glikozidazların optimum sıcaklık değerleri Çizelge 4.4. Farklı bitki ve mikroorganizmalardan izole edilen β-glikozidazların K m değerleri Çizelge 4.5. Bornova misketi β-glikozidazının termal inaktivasyon parametreleri Çizelge 4.6. İnhibitörlerin Bornova Misketi β-glikozidaz enzimine etkileri. 30 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Diglikozid yapıdaki öncül aroma maddelerinin iki aşamalı ve bir aşamalı enzimatik hidroliz mekanizmaları 2 Şekil 2.1. Bornova Misketi üzümü... 4 Şekil 2.2. β-d-glikozidazın katalizlediği bir hidroliz reaksiyonu.. 6 Şekil 3.1. p-nitrofenol-β-d-glukopiranozidin β-glikozidaz ile hidrolizi Şekil 4.1. DEAE-Toyopearl 650 M iyon değişim kromatografisi ile Bornova Misketi β-glikozidazının saflaştırılması Şekil 4.2. ph nın Bornova Misketi β-glikozidaz aktivitesine etkisi.. 24 Şekil 4.3. Sıcaklığın Bornova Misketi β-glikozidaz aktivitesine etkisi. 26 VII

10 1. GİRİŞ Vahap Aykut AKSOY 1. GİRİŞ Meyvelerde olgunlaşma sırasında meydana gelen renk, aroma, yumuşaklık, sertlik derecesi gibi biyokimyasal ve fiziksel değişimlerde hidrolitik enzimlerin etkili olduğu bildirilmiştir. Hidrolitik enzimler meyve hücre duvarındaki yapısal bileşiklere etki ederek hücre duvarı modifikasyonuna ve meyvelerin yumuşamasına neden olmaktadır. Bitki hücre duvarını parçalayabilen β-glikozidaz (β-d-glikozid glikohidrolaz EC ) da bu değişimler de etkilidir (Whitaker ve ark., 2003). β-glikozidaz büyüme, gelişme, lignifikasyon ve çimlenme sırasında endospermde hücre duvarı yıkımı gibi birçok biyolojik olayda etkin rol oynamaktadır. Ayrıca, gıda detoksifikasyonu, biyokütle dönüşümü ve son yıllarda alkollü içkilerde aroma gelişiminin sağlaması gibi biyoteknolojik uygulamalarda da önemli bir yere sahiptir. β-glikozidaz glikozid bağlı öncül aroma bileşiklerini serbest hale geçirerek aroma potansiyelini arttırmaktadır (Sarry ve Günata, 2004). Glikozidazlar bir karbonhidrat ve bir karbonhidrat olmayan bileşik (aglikon) ya da iki veya daha fazla karbonhidrat bileşiği arasındaki glikozid bağını hidrolize ederler. β-glikozidaz, β-d-glikozid bağlarını hidrolize ederek indirgen olmayan β-dglikoz birimlerinin ve son aglikonun serbest kalmasını sağlar (Li ve ark., 2005). β-glikozidaz enziminin etkisi ile β-d-glikozidlerden serbest kalan uçucu aroma maddeleri, monoterpenler (geraniol, nerol, linalool, 2,6-dien1,8-diol gibi), norizoprenoidler (3-okzo-α-ionol, vomifoliol, 3-hidroksi-β-damaskon gibi) ve benzen türevleri (benzil alkol, 2-feniletil alkol, vanilin gibi) şeklindedir (Sarry ve Günata, 2004). Glikozidaz enzimleri glikozid bağlı aroma bileşiklerinin şeker yapılarına göre farklı reaksiyon mekanizmalarına sahiptir. Şekere bağlı aroma maddeleri monoglikozid, diglikozid ve nadiren de triglikozid yapıda olduğu için etki eden enzim spesifiktir. Genel olarak aroma maddeleri meyvelerde diglikozid yapıdadır. Diglikozidik aroma maddelerinin enzimatik hidrolizi iki yolla gerçekleşmektedir. i. İki aşamalı (ardışık enzimatik hidroliz) ii. Tek aşamalı (diglikozidaz etkisi) 1

11 1. GİRİŞ Vahap Aykut AKSOY Şekil 1.1 de görüldüğü gibi her iki reaksiyon mekanizmasında, diglikozidler veya glikozidlerden aglikonların (R-OH ile belirtilen) serbest kalması sağlanır. İki aşamalı ardışık hidrolizde, α-l-arabinofuranozidaz, α-l-ramnozidaz, β-d-ksilozidaz veya β-apiozidazlar gibi ekzoglikozidazlar, şekerler arasındaki bağın hidrolizini katalizlemektedir. İkinci aşamada β-glikozidazlar β-d-glikozidlerin hidrolizini katalizler, aglikon ve şeker serbest kalır. Tek aşamalı hidrolizde ise diglikozidazlar, diglikozidlerin aglikon bağını parçalar. Böylece aglikon ve disakkarit serbest kalır (Whitaker ve ark., 2003). (R-OH= monoterpenler, norisoprenoidler, benzen türevleri) Şekil 1.1. Diglikozid yapıdaki öncül aroma maddelerinin iki aşamalı ve tek aşamalı enzimatik hidroliz mekanizmaları (Sarry ve Günata, 2004). Misket üzümleri, Vitis vinifera çeşitleri içerisinde en aromatik üzümlerdir. Yapılarında serbest aroma bileşiklerinin yanı sıra glikozid bağlı uçucu olmayan terpen bileşikleri de mevcuttur. Bağlı yapıdaki terpenler uygun koşullar altında 2

12 1. GİRİŞ Vahap Aykut AKSOY serbest hale geçip üzümlerin misket aromasını zenginleştirmektedir (Williams ve ark., 1980). Bornova Misketi ülkemizin Ege bölgesinde yetişen Vitis vinifera ssp. Sativa çeşididir. Bu üzüm çeşidi bölgede yetişen diğer bütün üzüm çeşitlerine oranla çok erken (Ağustos ayının ilk günleri) olgunlaşmaktadır. Oldukça hoş aroması olan ve kaliteli beyaz şarap veren bu çeşitten genellikle sek ve tatlı şaraplar yapılmaktadır (Aktan, 1976). Bornova Misketi, yeşil-sarı renkli, küçük, yuvarlak şekilli ve çekirdekli tane özelliklerine sahip olup salkımı sık yapıdadır (Çelik, 2002). Bornova Misketi Ege bölgesinin en kaliteli yerli beyaz şaraplık çeşidi olup bölgede kaliteli beyaz şarap üretiminde kullanılmaktadır (Kalkan, 1995). Serbest aroma bileşiklerince zenginliğinin yanı sıra yapısında terpen glikozidlerinin bulunması aroma potansiyelini arttırmaktadır. Glikozidazların etkisi ile bağlı olan aroma maddeleri, koku veren serbest aroma bileşiklerine dönüşmektedir. Bornova Misketi üzümündeki β-glikozidaz enziminin biyokimyasal özellikleri üzerine yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada Bornova Misketi üzümünden saflaştırılan β-glikozidaz enziminin bazı biyokimyasal özellikleri belirlenmiştir. 3

13 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Misket Üzümü Üzerine Yapılan Çalışmalar Misket üzümleri sahip oldukları karakteristik tat ve aromalardan dolayı Vitis vinifera çeşitleri içerisinde önemli bir yere sahiptir. Bu nedenle şarap üreticisi birçok ülke tarafından kullanılmaktadır. Yapısında bulunan serbest haldeki monoterpenlerden linalol ve jeraniol bileşiklerinin miktarı arttıkça aroması zenginleşmekte ve misket karakteri daha ön plana çıkmaktadır. Ayrıca, serbest halde bulunan bu bileşiklerin yanı sıra glikozid bağlı aroma bileşenleri de uygun koşullarda serbest hale geçip misket aromasını arttırmaktadır (Williams ve ark., 1980). Amerine ve Roessler (1983) in bildirdiğine göre misket üzümlerinin en belirgin özelliği kendilerine özgü bir aromaya sahip olmalarıdır ve bu özellik terpen bileşiklerinden ileri gelmektedir. Araştırıcılar misket aromasında etkili bileşiklerin linalol, nerol, α-terpineol, jeraniol, hortineol olduğunu ve bu bileşiklerin üzüme çiçeksi, gül, bal, ıhlamur kokusu kazandırdıklarını ifade etmişlerdir. Ülkemizin Ege Bölgesi, Bornova ve Menderes ilçelerinde yetişen Bornova misketi (Şekil 2.1.) bölgenin en kaliteli beyaz şarabını veren yerli çeşididir. Bu çeşidin dömisek şarap üretimine daha uygun olduğu bilinmektedir (Kalkan, 1995). Şekil 2.1. Bornova Misketi üzümü. 4

14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY Aktan (1976) Bornova misketi üzümünde olgunluğun şarap kalitesi üzerine etkisini incelediği bir çalışmasında, 1971, 1972, 1973 yıllarına ait üç farklı olgunluk seviyesinde üzümleri hasat etmiş ve en yüksek kaliteli şarabın elde edilmesi için üzümlerin öksele derecesinde hasat edilmesi gerektiğini bildirmiştir. Ayrıca Bornova misketinden hoş kokulu sek ve tatlı şarapların yapılabileceğini ifade etmiştir. Cabaroğlu ve ark. (1997) Bornova misketi şarabının aroma maddeleri üzerine yapmış oldukları bir çalışmada, serbest halde bulunan terpen bileşikleri miktarını 2216 μg/l olarak hesaplamışlardır. Ayrıca 72 adet serbest aroma maddesi ile 42 adet bağlı durumda bulunan aroma maddesi içerdiğini belirtmişlerdir β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar Sistematik adı β-d-glikozid glikohidrolaz (EC ) olan β-glikozidazlar bitki, hayvan ve mikroorganizmalarda yaygın olarak bulunan bir enzim olup bir çok araştırmaya konu olmuştur. Genel olarak işlevleri aril ve alkil β-glikozidler ile sellobiozdaki β-glikozid bağlarının hidrolizini kataliz etmeleridir (Yılmaz, 2005). β- glikozidaz hidrolaz grubu bir enzimdir. Hidrolazlar C-C, C-N, C-O ve diğer bazı bağları,su molekülü ilave ederek parçalayan enzimlerdir. β-glikozidazlar da glikon, glikoz, alkiller arasındaki β-glikozid bağlarının hidrolizini katalizlerler. Beta glikozidazlar sellülazlar grubuna ait enzimler olup iki glikon kalıntısı (ör. Sellobiyoz ve diğer beta bağlı oligosakkaritler) arasındaki veya glikoz ve aril veya alkil aglikon arasındaki beta glikozidik bağları hidrolize ederler (Esen, 2003). β-glikozidazlar doğada yaygın olarak mikroorganizmalarda, bitkilerde ve hayvanlarda bulunur ve bu enzim biyoteknoloji alanında, gıda sanayisinde ve farmokolojide de kullanılmaktadır. Örneğin β-glikozidazlar bitki zararlıları ile mücadelede, çimlenme sırasında endospermin hücre zarının zayıflamasında ve şarabın, çayın, meyve suyunun kalitesini iyileştirmede rol oynarlar. β-glikozidazlar alkollü içkilerde aroma gelişiminin sağlanması bakımından çok önemlidir. β- glikozidazların meyvelerde bağlı haldeki glikozidik yapıyı hidrolize ederek aroma maddelerini serbest hale getirdiği düşünülmektedir. β-glikozidazların ve çeşitlerinin 5

15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY özgün fizyolojik fonksiyonları bir organizmanın substratlarındaki aglikon,ve glikon miktarına, çeşitliliğine ve yapısına bağlıdır (Esen, 2003). Son yirmi yıl içerisinde meyvelerde glikozidik aroma maddelerinin enzimatik hidrolizini katalizleyen glikozidazlar üzerine pek çok araştırma yapılmıştır. Bu araştırmalar, glikozidaz enzimlerinin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ve bağlı aroma maddelerinin (glikozidik yapıda olan) kimyasal bileşiminin aydınlatılması bakımından büyük öneme sahiptir (Whitaker ve ark., 2003). Meyvelerde aroma maddeleri genellikle kabukta toplanmıştır ve bunlar serbest ya da bağlı durumda bulunurlar. Serbest kısım uçucu ve koku veren özelliktedir. Serbest aroma maddeleri meyvenin kendine özgü aromasını oluşturur. Bağlı kısım ise glikozid yapıda ve şekerlere bağlı durumda olduğu için uçucu değildir ve kokusuzdur (Whitaker ve ark., 2003). Bitki ve meyvelerdeki uçucu glikozidler genel olarak o-β-d-glikozidler veya o-diglikozidler olarak tanımlanmış, trisakkarit bağlı glikozidler ise nadiren gözlenmiştir (Sarry ve Günata, 2004). Üzümdeki uçucu olmayan glikozidik yapıdaki öncül bileşenleri hidrolize eden glikozidazlar, şarabın aroma ve tat özelliklerini geliştirirler. β-glikozidaz, β- ksilozidaz, β-apiozidaz, α-ramnozidaz ve α-arabinozidaz gibi glikozidazların, aroma bileşenlerinin açığa çıkmasında etkin rol oynadıkları belirtilmektedir. Bu enzimler içerisinde β-glikozidazlar bitkilerde, küf ve mayalarda daha yaygın olarak bulunduklarından, daha fazla ilgi çekmektedirler (Esteve-Zarzos ve ark., 1998). Neril-β-D-glikopiranozid β-d-glikoz Nerol Şekil 2.2. β-d-glikozidazın katalizlediği bir hidroliz reaksiyonu (Hemingway, 1999). 6

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY Bitkisel β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar Hartmann ve Schreier (1987), papaya meyvesinden (Carica papaya) saflaştırdıkları β-glikozidaz enziminin özellikleri üzerinde çalışmışlar, jel filtrasyonu ve poliakrilamid jel elektroforez teknikleri kullanarak enzimin moleküler ağırlığının ve olan iki alt üniteden oluştuğunu saptamışlardır. Enzimin aktivite gösterdiği optimum ph değerini 5.0 ve optimum sıcaklığı 50 C olarak belirlemişlerdir. Ca 2+, Mn 2+, Mg 2+ ve EDTA nın enzimi aktive ettiğini ve Ag +, Hg 2+ iyonları ile enzimin inhibisyona uğradığını ifade etmişlerdir. Günata ve ark. (1988) üzümün aromatik glikozidlerinin ardışık enzimatik yolla hidrolizlenmesi konulu çalışmalarında, α-l-arabinofuranozidaz, α-l-ramnopiranozidaz, β-d-glikopiranozidaz enzimlerinin p-nitrofenil ve üzümün monoterpenil disakkaritglikozidleri üzerine etki mekanizmalarını incelemişlerdir. β-d-glikozidaz enziminin etkimesinden sonra monoterpenollerin serbest kalabileceğini, üzüm suyu ve türevi olan içeceklerin aroma zenginliği için bu glikozidazların kullanımının mümkün olacağını vurgulamışlardır. Lecas ve ark. (1991), olgun Alexandria üzümünden izole ettikleri β- glikozidaz enzimini kısmen saflaştırmışlardır. Jel kromatografisinde (Ultragel AcA 44 ve DEAE-sepharose CL-6B) β-glikozidaz enzimine ait iki pik elde etmişler ve bunları β-glikozidaz 1 ve β-glikozidaz 2 şeklinde isimlendirmişlerdir. β-glikozidaz 1 in molekül ağırlığını Da ve β-glikozidaz 2 nin ise Da olarak bulmuşlardır. Her iki enzim aktivitesi için optimum ph değerini 5.0, enzimin stabil olduğu optimum ph aralığını ve optimum sıcaklığını 45 C olarak belirlemişlerdir. Glikoz ve glikolaktonun Ki değerlerinin 170 ve mm olduğunu ve yarışmalı inhibisyon gösterdiklerini belirlemişlerdir. Ayrıca, Ca 2+,Cu 2+ ve p- kloromerküribenzoatın enzimi inhibe ettğini ifade etmişlerdir. Vasserot ve ark. (1993), Misket üzümünden ekstrakte ettikleri monoterpenol glikozidleri, maya (Canadian molischiana 35) kaynaklı bir β-glikozidaz enzimi kullanarak hidrolize etmişlerdir. Enzimi serbest ve immobilize (sodyum alginat ile) olarak kullanmışlar, her iki durum için bağlı halden serbest hale geçen monoterpenol miktarlarını karşılaştırmışlardır. Serbest enzimli uygulamada, prosesin sonuna doğru 7

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY monoterpenollerin miktarının önemli ölçüde arttığını, buna rağmen bağlı aroma maddelerinin bir kısmının hidrolize edilemediğini saptamışlar, immobilize enzim uygulamasında ise monoterpenollerin oluşmadığını ifade etmişlerdir. Drider ve ark. (1994), mango ve bazı egzotik meyvelerden ekstrakte ettikleri monoterpen glikozidlerini, asit (H 3 PO 4 çözeltisi) ve ticari β-glikozidaz enzimi kullanarak hidrolize etmişlerdir. Su buharı damıtması ile ortamdaki serbest terpenolleri uzaklaştırmış, kalan glikozidik bağlı terpenollere ise enzimatik hidrolizleme işlemi uygulamışlardır. Enzimatik hidrolizleme işlemini serbest ve kalsiyum alginata kovalent bağlı immobilize β-glikozidaz kullanılarak gerçekleştirmişlerdir. Araştırmacılar, β-glikozidaz enzimi sayesinde terpenol birimlerinin serbest kalmasının başarıyla sonuçlandığını ifade etmişlerdir. Ayrıca serbest enzimin immobilize enzime göre daha olumlu sonuç verdiğini belirlemişlerdir. Akiyama ve ark. (1998) pirinçden izole edip saflaştırdıkları β-glikozidaz enzimi üzerine yapmış oldukları bir çalışmada, β-glikozidaz enzimlerinin hidrolitik enzim özelliğinin yanı sıra transglikolizasyon işlevinin de olduğunu vurgulamışlardır. Araştırmacılar pirinç β-glikozidazının β-1,3 ve β-1,4 bağlı oligosakkaritlerine karşı glikozil transfer etme işlevinin de olduğunu saptamışlardır. Zabetakis ve ark. (2000), yüksek hidrostatik basıncın çilek meyvesinin aroma maddeleri ve β-glikozidaz enziminin aktivitesi üzerine etkilerini incelemişlerdir. 200, 400, 600, 800 MPa basınç uygulamalarından sonra örnekleri, 24 saat boyunca 4, 20, 30 C sıcaklıklarda tutmuşlardır. β-glikozidaz enziminin 200 ve 400 MPa basınç sonrasında aktivitesini sürdürdüğünü, fakat 600 ve 800 MPa basınç sonrası inaktive olduğunu belirlemişlerdir. Cabaroğlu ve Canbaş (2001) glikozidaz enzimlerinin üzüm şarabında aroma bileşikleri üzerine etkisini inceledikleri çalışmada, ticari glikozidaz enzimi kullanarak bağlı ve serbest aroma maddelerindeki değerlerini araştırmışlardır. Fermantasyon işleminin sonuna doğru şırayı iki kısma ayırarak enzimli ve enzimsiz örnekler oluşturmuşlardır. Her iki örnekteki aroma maddelerini Amberlit XAD-2 reçinesi ile ekstrakte etmişler ve tanımlanmalarını GC-MS yöntemiyle yapmışlardır. Enzim uygulanan örneklerde terpen bileşikleri, uçucu fenoller, norizoprenoidler ve 8

18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY aromatik alkollerin miktarının arttığını glikozidik yapıdaki aroma maddelerinin miktarının ise azaldığını saptamışlardır. Zhang ve ark. (2001) yaptıkları bir çalışmada, ginseng bitkisinden saflaştırdıkları ginsenoid-β-glikozidaz enziminin bazı kinetik özelliklerini saptamışlardır. SDS poliakrilamid jel elektroforez tekniği kullanarak enzimin moleküler ağırlığını 59 kda olarak belirlemişlerdir. Enzimin aktivite gösterdiği optimum ph değerinin 5.0, optimum sıcaklığının da 60 C olduğunu ifade etmişlerdir. Çalışmalarında Cu 2+ iyonlarının enzim üzerinde negatif, Ca 2+ iyonlarının ise pozitif etki gösterdiğini belirtmişlerdir. Hsieh ve Graham (2001), soya fasulyesinden kısmen saflaştırdıkları ve karakterize ettikleri β-glikozidaz enziminin daha çok dimerik halde bulunduğunu ve bunların 75 ve 80 kda molekül ağırlığında olduğunu bildirmişlerdir. Enzimin optimum ph ve sıcaklık değerleri 6.0 ve 30 C olarak bulunmuştur. Enzimin yüksek sıcaklık stabilitesine sahip olduğunu bildirmişler, Cu 2+ ve Hg + iyonlarının enzimi inhibe ettiğini, glukono-δ-laktonun ise çok fazla inhibe etmediğini saptamışlardır. Enzimin izoflavon bileşiklerine karşı oldukça aktif olduğu ve flavonol glikozidlere karşı aktivite göstermediği bildirilmiştir. Gerardi ve ark. (2001) olgun kirazdan (Prunus avium L.) β-glikozidaz ın saflaştırılması ile ilgili yaptıkları çalışmada, enzimi saflaştırmak için amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi yöntemlerini kullanmışlar ve bu yolla elde ettikleri enzimin molekül ağırlığının 68 kda olduğunu bildirmişlerdir. Enzimin en yüksek hidrolitik aktivitesinin o-nitrofenil-β-d-glikopiranozid substratına karşı gösterdiğini ifade etmişlerdir. Kaba enzim ekstraktında spesifik aktivite değerini U mg -1 protein, amonyum sülfat çökeltmesi sonrası spesifik aktivite değerini ise U mg -1 protein ve iyon değişim kromatografisi sonrası spesifik aktivite değerini ise U mg -1 protein olarak belirlemişlerdir. Pontoh ve Low (2001), bal arılarının sindirim organından izole edip saflaştırdıkları β-glikozidaz enziminin bazı özelliklerini belirlemek için sırasıyla iyon değişim kromatografisi, jel-geçirgenlik kromatografisi, SDS-PAGE, IEF-PAGE yöntemlerini kullanmışlardır. SDS-PAGE yöntemi kullanarak enzimin tek alt birimden oluştuğunu ve moleküler ağırlığının 72 kda olduğunu belirlemişlerdir. 9

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY Enzimin optimum ph değerini 5.0, optimum sıcaklık değerini 50 C olarak saptamışlardır. Ayrıca, enzimin gibi geniş bir ph aralığında stabil olduğunu bildirmişlerdir. Dignum ve ark. (2004) vanilya (Vanilla planifolia) bitkisinin yeşil çekirdeklerinden elde ettikleri doğal vanilya üzerine yapmış oldukları çalışmada, β-glikozidaz enziminin bazı kinetik özelliklerini belirlemişlerdir. Çalışmalarında, vanilya yapısında doğal olarak bulunan sekiz çeşit glikozid ve sentetik p-nitrofenol e karşı β-glikozidaz aktivitesini araştırmışlardır. p-nitrofenol, vanilin ve ferulik asit glikozidleri için enzimin K m değerini yaklaşık 5 mm., diğer glikozidler (vanilik asit, guaikol ve kreozol) için K m değerinin 20 mm. dan yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Enzimin tüm glikozidlerdeki V m değerinin 5-10 IU/mg protein aralığında olduğunu ve p-feniletanol ile p-krezol ün glikozidlerinin hidrolizlenemediğini ifade etmişlerdir. Ayrıca, sentetik p-nitrofenol glikozidlerine kıyasla, doğal olarak bulunan glikozidler için β-glikozidaz enziminin yüksek substrat spesifikliğinin olmadığını belirlemişlerdir. Palazon ve ark. (2004) ahududu ve çilek üzerine yapmış oldukları bir çalışmada, bu meyvelerin yapısında bulunan β-glikozidaz, peroksidaz ve polifenol oksidaz enzimlerinin yüksek hidrostatik basınç altında aktivitelerini incelemişlerdir. Meyve örneklerini 400, 600 ve 800 MPa basınç altında, 5, 10, 15 dakika süre ile C arasında değişen kontrollü sıcaklıkta bekletmişlerdir. Örneklerin uygulama öncesi ve sonrası enzim aktivitelerini kıyaslamışlardır. Ahududu β-glikozidaz enzimi aktivitesinde bu uygulama sonucunda çok büyük bir değişimin olmadığını fakat çilek için 400 MPa basınç altında 15 dakika sonunda β-glikozidaz aktivitesinin % 76 oranında arttığını bildirmişlerdir. Her iki meyvede de enzimlerin inaktivasyonunun antosiyaninlerin stabilitesine bağlı olduğunu ifade etmişlerdir. Li ve ark. (2005) çay yapraklarından izole ettikleri β-glikozidaz enziminin saflaştırılması ve kısmi karakterizasyonu ile ilgili yaptıkları çalışmada, saflaştırma için amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi yöntemlerini kullanmışlar ve saflaştırdıkları enzimin optimum sıcaklığının 50 C, optimum ph sının 5.5 olduğunu saptamışlardır. Enzimin pnpg substratına karşı yüksek 10

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY aktivite, p-nitrofenil-galaktoz için düşük aktivite ve p-nitrofenil-ksiloz için hiç aktivite göstermediğini ifade etmişlerdir. Barbagallo ve ark. (2007) kan portakalından β-glikozidazın karakterizasyonu ile ilgili yaptıkları çalışmada, enzimin optimum ph sını 4.5, optimum sıcaklığını 60 C, K m ve V m değerlerini 2.67x10-4 M ve 2.1x10-2 nmol/dak. mg protein olarak belirlemişlerdir. Yu ve ark. (2007) elma kabuklarından β-glikozidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu ile ilgili yaptıkları çalışmada, saflaştırma için amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografi tekniklerini kullanmışlar ve saflaştırdıkları enzimin K m ve V m değerlerinin 1.2 mm ve 52.4 µmol/dak. mg protein olduğunu bildirmişlerdir. Enzimin stabil olduğu ph aralığını , aktivite gösterdiği optimum ph değerini de 6.0 olarak belirlemişlerdir. Ayrıca enzimin optimum sıcaklığının 50 C olduğunu ifade etmişlerdir Mikrobiyel β-glikozidaz Üzerine Yapılan Çalışmalar Canal-Llauberes (1990) yapmış olduğu bir çalışmada, farklı glikoz konsantrasyonlarında Aspergillus niger den elde edilen β-glikozidaz enziminin aktivitelerini karşılaştırmıştır. Araştırıcı 100 g/l glikoz konsantrasyonunda β- glikozidaz aktivitesini % 15, 10 g/l glikoz konsantrasyonunda ise β-glikozidaz aktivitesini % 80 olarak bulmuş ve ortamda glikoz miktarı azaldıkça β-glikozidaz enzimi aktivitesinin arttığını ifade etmiştir. Bu nedenle şarap yapımı sırasında β- glikozidaz enzimi uygulamasının alkol fermantasyonunun sonuna doğru yapılması gerektiğini belirtmiştir. Günata ve ark. (1990), üzüm ve badem monoterpenil β-d-glikozitlerinin çeşitli mikrobiyal β-glikozidaz enzimleri ile parçalanma derecelerini incelemişlerdir. Araştırıcılar, küf (Aspergillus niger) ve maya (Candida molischiana, Candida wickerhamii) dan sağlanan β-glikozidazlarla yaptıkları çalışmalar sonucunda bitki kaynaklı β-glikozidazların jeraniol, nerol, sitronelol gibi birincil alkollerin β-d-glikozidlerini parçalarken küf kaynaklı β-glikozidaz enziminin aglikon yapısına daha az etki ettiğini saptamışlarlardır. Maya kökenli β-glikozidaz enzimlerinin ise 11

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY linalol, α-terpineol gibi tersiyer alkollerin β-d-glikozidlerinin parçalanmasında etkili olduğunu ifade etmişlerdir. Birk ve ark. (1997) yapmış oldukları bir çalışmada, endüstriyel mikroorganizmalar arasında en verimli β-glikozidaz enzimi üreten mikroorganizmanın Aspergillus niger olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, diğer küf kaynaklı β-glikozidazlara göre Aspergillus niger den izole edilen β-glikozidaz enziminin daha yüksek sıcaklıklarda, daha düşük ph değerlerinde stabil olduğunu ve bir diğer avantajının da Aspergillus niger in toksin etkisinin olmaması ile gıda endüstrisinde güvenle kullanılabildiğini ifade etmişlerdir. Riou ve ark. (1998), Aspergillus oryzae den elde ettikleri enzimi kısmen saflaştırmışlar ve kinetik özelliklerini belirlemişlerdir. Enzim, jel (Ultrogel AcA) ve iyon değişim (TSK DEAE-5PW) kromatografisi ile saflaştırılmış ve substrat olarak p-nitrofenil-β-d-glikozid kullanılarak kinetik ölçümler yapılmıştır. Enzimin optimum sıcaklığı 50 C, optimum ph değeri 5.0, K m değeri 0.55 mm spesifik aktivitesi μmol/dak.mg protein olarak bulunmuştur. Enzim glikoz inhibisyonuna kısmen dirençli bulunmuş ve glikozun inhibisyon sabiti 1.36 M ve glukono-δ-laktonun inhibisyon sabiti ise 12.5 M olarak belirlenmiştir. Hernandez ve ark. (2003), şarap endüstrisinde fermantasyon sırasında Saccharomyces cerevisiae β-glikozidazının aroma potansiyeli üzerine etkilerini incelemişlerdir. Enzimin optimum sıcaklığının C aralığında, optimum ph değerinin 4.0 olduğunu belirtmişlerdir. Şarap yapımında fermantasyon sıcaklığında (20-30 C) enzim aktivitesinin % 40 seviyesinde olduğunu ifade etmişlerdir. Üzümde bulunan glikozidazların, hammaddeden gelen çeşit aromasının zenginleştirilmesi üzerine etkileri, glikoz inhibisyonu ve düşük ph da stabil kalamamaları nedeniyle, yetersizdir. Glikozidaz enzim aktivitesine sahip pek çok maya türü tanımlanmış olup, bu mayaların, üzümdeki yetersiz glikozidazlara alternatif olabilecekleri belirtilmektedir (Rodriguez ve ark., 2004). Yang ve ark. (2008) Paecilomyces thermophila dan β-glikozidazın saflaştırılması ve karakterizasyonu ile ilgili yaptıkları çalışmada, enzim DEAE 52 ve Sephacryl S-200 ile yapılan kromatografik uygulama ile %21.7 verimle 105 kat saflaştırılmış, saflaştırılmış enzimin optimum sıcaklığı 75 C ve optimum ph sı ise 12

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Vahap Aykut AKSOY 6.2 olarak bulunmuş, enzim 65 C ye kadar ve ph aralığında stabilite göstermiştir. Enzim geniş bir substrat spesifikliğ göstermiş ve p-nitrofenil-β-d glikopranozid (pnpg), sellobioz, gentiobioz, sophoroz, amigladin, salisin, daidzin ve genistini önemli derecede hidroliz etmiştir. Fungal β-d-glikozidazlar terpenil-β-d-glikozitleri terpenollere hidrolize ederek, şarap aromasını geliştirmektedirler. S. cerevisiae nın enzimlerinin, bağlı aroma bileşiklerinin uçucu aromatik bileşiklere dönüşümünü sağlayacak düzeyde olmadığı ve bu mayaların iyi birer hücre dışı enzim üreticileri olmadıkları kabul edilmektedir. Glikozidazların potansiyel kaynaklarının Saccharomyces dışındaki mayalar olduğu, üzüm glikozidazlarının aksine, fungal β-glikozidazlarda glikoz inhibisyonunun görülmediği belirtilmektedir (Bağder ve Özçelik, 2009). 13

23 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Üzüm Örnekleri Bu çalışmada Ülkemizin Ege bölgesi İzmir yöresinde yetiştirilmekte olan Bornova Misketi kullanılmıştır. Bornova Misketi üzümü, 2008 yılında Ağustos ayının ikinci haftası Menderes ilçesinden sağlanarak -25 C de muhafaza edilmiştir Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Aseton tozu elde edilmesinde Torrington HGBTWTS3 (Amerika Birleşik Devletleri) marka Waring blender, ph ölçümlerinde cam elektrodlu Inolab (Almanya) marka ph-metre kullanılmıştır. Enzim ekstraktının elde edilmesinde Nüve NM 110 marka magnetik karıştırıcı ve Kubota 7780 (Japonya) ve Bechmann Couter J30İ marka soğutuculu santrifüjler kullanılmıştır. İyon değişim kromatografisinde kullanılan cam kolonun boyutu 2.5 x 30 cm dir. Enzim ve tampon çözeltisi kolona Watson Marlow Alitea (İngiltere) marka peristaltik pompa ile verilmiştir. Faksiyonları zaman ve hacim ayarlı olarak toplamak için Atto AC-5750 (Japonya) marka fraksiyon kollektörü kullanılmıştır. Enzimin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi sırasında yapılan spektrofotometrik ölçümler, sıcaklık kontrol ünitesi olan Shimadzu UV-1700 marka spektrofotometrede gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık kontrolü için Memmert WB14 ve Nüve BM402 marka su banyoları kullanılmıştır. p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid, p-nitrofenol, triton X-100, PVPP (polivinilpolipirolidon), askorbik asit, commasie brillant blue (CBB), glikoz, etil alkol, kalsiyum klorür, tampon çözeltiler için disodyum hidrojen fosfat, sığır serum albumin Merck (Darmstadt, Almanya) firmasından temin edilmiştir. PEG (polietilen glikol), PMSF (fenilmetilsülfonil florid), aseton, amonyum sülfat, sellüloz membran (76 mm x 49 mm), sitrik asit, sodyum karbonat Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika Birleşik Devletleri) firmasından temin edilmiştir. 14

24 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY 3.2. Metot Enzim Ekstraktının Hazırlanması Enzim ekstraktının hazırlanması için çekirdeği çıkarılmış 600 g üzüm 3.33 g polietilen glikol içeren 400 ml soğuk (-25 C) aseton içerisinde 2 dakika düşük hızda homojenize edilmiştir. Homojenat vakum filtreden geçirilerek filtre üzerinde kalan kısım yeniden 200 ml soğuk aseton ile ekstrakte edilmiştir. Bu işlem beyaz renkli aseton tozu elde edilene kadar tekrarlanmış ve elde edilen aseton tozu kuruması için bir gece oda sıcaklığında bekletilmiştir (Lecas ve ark., 1991). Bu yolla elde edilen kaba ekstraksiyon işleminin dört defa tekrarlanması sonucunda toplam 60 g beyaz aseton tozu elde edilerek 25 C de muhafaza edilmiştir Enzimin Kısmi Saflaştırılması 60 g aseton tozu 10 mm askorbik asit, % 4.0 polivinilpoliprolidon, % 1.0 Triton X-100 ve 1mM PMSF içeren 600 ml 0.1 M ph 6.8 fosfat-sitrat tamponunda 4 saat +4 C de magnetik karıştırıcı ile karıştırılmış ve daha sonra x g de 45 dakika +4 C de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası berrak kısıma % 85 doygunlukta amonyum sülfat çökeltmesi uygulanmıştır. Çökeltilen fraksiyonlar x g de 30 dakika +4 C de santrifüj edilerek ayırma işlemi uygulanmıştır. Elde edilen çökelti küçük hacimde 0.01 M ph 6.8 fosfat-sitrat tamponu kullanılarak çözündürülmüş ve +4 C de yine aynı tampona karşı bir gece boyunca diyalize bırakılmıştır. Diyaliz edilmiş örnek iyon değişim kromatoğrafisine verilmiştir (Riou ve ark., 1998; Garcia-Palanzon ve ark., 2004; Mazzuca ve ark., 2006) İyon Değişim ile Saflaştırma Diyaliz edilmiş enzim çözeltisi DEAE-Toyopearl 650M ile hazırlanmış ve 0.01 M ph 6.8 fosfat-sitrat tamponu ile dengelenmiş iyon değişim kolonuna 0.5 ml/dak. hızla verilmiştir. Enzim çözeltisi verildikten sonra 0.5 ml/dak. hızla yaklaşık 15

25 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY 200 ml başlangıç tamponu geçirilmiş ve aynı hızla M ph 6.8 fosfat-sitrat tamponu kullanılarak gradient elüsyon işlemi başlatılmıştır. Fraksiyonlar 4.5 er ml toplanmış olup elde edilen fraksiyonlarda 280 nm de absorbans ölçümü ve 400 nm de enzim aktivite ölçümü gerçekleştirilmiştir (Riou ve ark., 1998) Enzim Aktivitesinin Ölçümü Enzim aktivitesi p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid den serbest kalan p- nitrofenol ün (Şekil 3.1.) 400 nm de spektrofotometrik olarak ölçümü yoluyla saptanmıştır. 0.1 M fosfat-sitrat tamponunda hazırlanmış 0.9 ml 5 mm substrat (p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid) üzerine 0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilerek 50ºC deki su banyosunda 15 dakika bekletilmiş, süre sonunda 1.0 ml 1.0 M sodyum karbonat çözeltisi ilave edilerek tepkime sonlandırılmış ve hemen sonra 400 nm dalga boylu ışıkta absorbans ölçümü yapılmıştır. Absorbans ölçümlerinde fosfatsitrat tamponu ile hazırlanmış 0.9 ml 5 mm substrat, 0.1 ml 0.1 M fosfat-sitrat tamponu ve 1.0 ml 1.0 M sodyum karbonat karışımı kör olarak kullanılmıştır. Enzim aktivitesi μm p-nitrofenol ile hazırlanmış olan kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır. Ölçümler üç paralelli olarak yapılmış, 1 ünite β-glikozidaz aktivitesi dakikada 1 μm p-nitrofenolü serbest bırakan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Lecas ve ark., 1991). Şekil 3.1. p-nitrofenol-β-d-glikopiranozidin β-glikozidaz ile hidrolizi. 16

26 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Enzimin optimum ph ve sıcaklığı, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri Barbagallo ve ark. (2007) na göre belirlenmiştir K m ve V m değeri Michaelis katsayısı (K m ) ve maksimum hız (V m ) değerlerini belirleyebilmek için değişen p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid konsantrasyonlarında ( mm) reaksiyon hızı ölçümleri yapılmıştır. K m ve V m değerleri Lineweaver-Burk grafiğine göre hesaplanmıştır Optimum ph Enzimin optimum ph sını belirleyebilmek için substrat olarak p-nitrofenol-β- D-glikopiranozid içeren standart reaksiyon karışımında değişik ph larda ( ) tamponlar kullanılarak enzim aktiviteleri belirlenmiş ve sonuçlar nispi aktivite olarak tanımlanmıştır Optimum Sıcaklık Enzimin optimum sıcaklığını belirleyebilmek için C arasında enzim aktivitesi belirlenmiştir. Ölçümlerde standart reaksiyon karışımı kullanılmıştır. Sonuçlar nispi aktivite olarak ifade edilmiştir Termal İnaktivasyon Sıcaklığın enzim stabilitesine etkisini belirlemek için enzim değişik sıcaklıklarda (60, 65 ve 70 C) değişik sürelerde (2, 5, 8 ve 10 dk) su banyosunda tutulmuştur. Vidalı kapaklı deney tüpleri, ilgili sıcaklıktaki su banyosunda 5 dakika 17

27 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY tutularak tüplerin bu sıcaklığa gelmesi sağlanmıştır. Süre sonunda üzerine 0.5 ml enzim ilave edilip, tekrar su banyosuna konulup belirtilen sürelerde tutulduktan sonra buz banyosunda hızla soğutulmuştur. Soğutulan enzim oda sıcaklığına geldiğinde standart reaksiyon karışımı kullanılarak belirlenen optimum sıcaklık ve ph değerlerinde enzim aktivitesi ölçülmüştür. Kontrol olarak sıcaklık uygulanmayan enzim kullanılmıştır. Sıcaklık uygulanan enzimlerdeki kalıntı aktivite (Et), sıcaklık uygulanmamış enzimin aktivitesi (Eo) ile kıyaslanarak birinci dereceli inaktivasyon sabiti (k d ), yarı ömür (t 1/2 ), aktivasyon enerjisi Ea, sabit bir sıcaklıktaki enzim aktivitesinin % 90 ını inaktive etmek için gereken süre (D değeri) ve D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı (Z değeri) hesaplanmıştır. Bu değerlerin hesaplanması aşağıda özetlenmiştir. Belli bir zaman süreci içerisinde doğal enzimin aktivitesindeki kayıplar ya da konsantrasyonundaki azalmalar birinci dereceden reaksiyon kinetiğine uyar ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir. Burada N doğal enzimi, D denatüre olmuş enzimi ve kd ise (1/zaman) enzim için birinci dereceli inaktivasyon katsayısını göstermektedir. Enzimlerin termal inaktivasyonu genellikle birinci dereceden reaksiyonla ifade edilir: Et= Eo. e -kdt Et, t anındaki enzim aktivitesi ve Eo başlangıçtaki aktiviteyi, t ise ısıl işlem uygulama süresini ifade eder. Sabit sıcaklıkta ln(et/eo) ın süreye karşı grafiği çizildiğinde, kurvenin eğimi k d dir. Yarı ömür (t 1/2 ) değeri, enzim stabilitesinin belirlenmesinde yaygın bir şekilde kullanılan bir parametredir. Belli bir sıcaklıkta enzim aktivitesinin yarı yarıya azalması için gereken süredir. Enzimlerin ısıl yolla inaktivasyonu çoğunlukla birinci dereceden kinetiğe uyduğundan aşağıdaki formülden kolaylıkla hesaplanabilir: (t 1/2 )=0.693/ k d Sabit bir sıcaklıktaki orijinal enzim aktivitesinin % 90 ını inaktive etmek için gereken süre olarak tanımlanmaktadır. D değeri aşağıdaki formülden hesaplanabileceği gibi, 18

28 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY D=ln(10)/ kd log 10 (Et / Eo) ın zamana karşı grafiğinin eğiminden de hesaplanabilir. Eğer hız sabitleri farklı sıcaklıklarda elde edilirse denatürasyon için aktivasyon enerjisi hesaplanabilir. Aktivasyon enerjisi aşağıda verilen Arrhenius modeli yardımıyla hesaplanabilir. -( Ea /RT) ln kd = lna A (1/zaman), kimyasal reaksiyonlar sırasında meydana gelen çarpışmaların toplam sayısı ile ilgili bir parametredir. Ea (kj.mol -1 ), aktivasyon enerjisidir. R (kj.mol -1.K -1 ), üniversal gaz sabiti ve T (K) mutlak sıcaklıktır. Aktivasyon enerjisi ile yakından ilişkili bir parametre olan Z değeri, desimal azalma süresinin (D) sıcaklığa bağımlılığını ifade eder ve enzimin ısıl direncini yansıtan bir parametredir. Z değeri, D değerinde bir log 10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışıdır. Log 10 D nin sıcaklığa karşı grafiği çizildiğinde, doğrunun eğimi 1/Z dir (Marangoni, 2003). Sıcaklığa maruz kalan enzimlerdeki kalıntı aktivite (Et), sıcaklığa maruz kalmamış enzimin aktivitesi (Eo) ile kıyaslanarak k D, t 1/2, E a, Z, D değerleri hesaplanmıştır İnhibitörlerin β-glikozidaz Enzimine Etkileri Bu araştırmada kullanılan inhibitörler ve denenen konsantrasyonları aşağıda verilmiştir: Glikoz (% 20, % 10, % 5) Etil alkol (% 100, % 75, % 50) CaCl 2 (20 mm, 10 mm, 5 mm) Optimum ph değerindeki tamponla hazırlanmış 0.8 ml, 5 mm p-nitrofenol-β- D-glikopiranozid üzerine yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda ve enzimin optimum ph değerindeki tamponla hazırlanmış 0.1 ml inhibitör çözeltisi ve 0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilmiştir. Karışım 55 C de 15 dakika tutulduktan sonra absorbans ölçümü yapılmıştır. Kullanılan tüm inhibitörlerin konsantrasyonları reaksiyon 19

29 3. MATERYAL VE METOT Vahap Aykut AKSOY karışımı hazırlandığında 1/10 oranında seyrelmiştir. İnhibisyon yüzdesi ise aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır: İnhibisyon (%) = [(Ao Ai)/Ao)]*100 Ao : İnhibitör kullanmadan belirlenen enzim aktivitesi Ai : İnhibitör varlığında enzim aktivitesi 20

30 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Enzimin Saflaştırılması İyon değişim kromatografisinde elde edilen fraksiyonların her birinde absorbans (280 nm) ve enzim aktivitesi (400 nm) ölçümleri yapılmıştır. Enzim aktivitesi ölçümleri ph sı 6.80 olan 0.1 M fosfat-sitrat tamponunda hazırlanmış 5 mm p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid substratı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İyon değişim kromatografisi sonrasında toplanan fraksiyonların absorbans ve enzim aktiviteleri Şekil 4.1 de verilmiştir. Grafikten de görüldüğü gibi absorbansın yüksek olduğu fraksiyonlarda enzim aktivitesi de yüksek bulunmuş ve en yüksek aktiviteye sahip ( fraksiyonlar) fraksiyonlar birleştirilerek biyokimyasal testlerde kullanılmıştır. DEAE-Toyopearl 650 M iyon değişim kromatoğrafisinde β-glikozidaz absorblanmadan kolonu terk etmiştir. Saflaştırma basamakları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1 de görüldüğü gibi β-glikozidaz % 6.69 verimle 7.20 kat saflaştırılmıştır. Absorbans (280 nm) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Fraksiyon Sayısı 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 β-glikozidaz aktivitesi (Ünite) Absorbans (280 nm) β-glikozidaz aktivitesi Şekil 4.1. DEAE-Toyopearl 650 M iyon değişim kromatografisi ile Bornova Misketi β-glikozidazının saflaştırılması. 21

31 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY Çizelge 4.1. Bornova Misketi β-glikozidazının saflaştırılma çizelgesi ÖRNEK HACİM (ml) TOPLAM PROTEİN (mg) TOPLAM AKTİVİTE (ünite) KABA EKSTRAKT AMONYUM SÜLFAT ÇÖKELTMESİ VE DİYALİZ DEAE TOYOPEARL 650M SPESİFİK AKTİVİTE (ünite/mg protein) SAFLAŞTIRMA KATSAYISI VERİM (%)

32 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY Yu ve ark. (2007) elma kabuklarından saflaştırdıkları β-glikozidazın saflaştırma aşamalarında amonyum sülfat çökeltmesi, DEAE-selüloz, Bütil- Toyopearl iyon değişim kromatoğrafileri ve sephadex G150 jel kromatoğrafisi yöntemlerini denemişlerdir. Enzimi Butil-Toyopearl iyon değişim kromatoğrafi aşamasında %13.10 verimle kat saflaştırmışlardır. Lecas ve ark. (1991) ise, Alexendria üzümünden saflaştırdıkları β-glikozidazı iki ayrı izoenzim olarak (A ve B) elde etmişlerdir. DEAE-Sepharose CL-6B reçinesi kullanarak A enzimini 4.04, B enzimini ise 6.87 kat saflaştırmışlardır. Bornova misketi β-glikozidazının saflaştırma verimi ve derecesi literatüre yakın değerlerdedir Optimum ph Her enzimin aktivitesinin en yüksek olduğu bir ph veya ph aralığı vardır. Enzimatik tepkimenin gerçekleştiği ortam ph sındaki aşırı olmayan değişiklikler enzimin ve çoğu kez de substratın iyonik durumunda değişikliklere neden olmaktadır. Enzimlerin maksimum tepkime hızına sahip oldukları ph değerine optimum ph denir. Optimum ph değerinin altında ve üstündeki ph larda enzim veya substrata ait fonksiyonel grupların yapılarında değişimler oluşmaktadır. Düşük asidik ve yüksek alkali ph larda enzimin aktif merkezindeki prototropik grupların iyonlaşmalarındaki değişmeler aktif merkezin uygun konformasyonunu, substratın bağlanmasını ve tepkimenin katalizine etki etmektedir (Koolman ve Roehm, 2005; Yoruk ve Marshall, 2003). Kovalent olmayan elektrostatik bağlar, hidrojen bağları, hidrofobik bağlar ve kovalent disülfit bağları enzimlerin üçüncül ve dördüncül yapılarını stabilize eder. Enzim üzerindeki pozitif ve negatif gruplar arasında oluşan elektrostatik bağlar ph dan etkilenirler. Nötral ph larda iyonlaşabilen yan gruplar COO -, H 3 N + ve NH 2 -C gruplarıdır ve bunlar kuvvetli elektrostatik bağlar oluşturabilirler. ph 3 ün altında karboksil (-COOH) grupları protonlanırlar ve elektrostatik bağ oluşturamazlar. ph 10 un üzerinde ise amino (-NH 2 ) grupları protonlanırlar ve elektrostatik bağlar oluşturamazlar (Whitaker, 2003). 23

33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY Bornova Misketi β-glikozidazının en yüksek aktivite gösterdiği optimum ph değerini belirleyebilmek için standart reaksiyon karışımında ph değerleri arasında değişen fosfat-sitrat tamponları kullanılarak enzim aktiviteleri ölçülmüş ve sonuçlar % nispi aktivite olarak Şekil 4.2 de gösterilmiştir. Şekil 4.2 den de görüleceği gibi ph 3.0 den ph 5.0 e kadar enzim aktivitesi artmış ve en yüksek aktivite ph 5.0 de gözlenmiştir. Optimum ph değerinden sonra aktivitede düşme görülmüş ve ph 7.0 deki aktivite optimum ph daki aktiviteye göre yaklaşık 4 kat azalmıştır Nispi aktivite (%) ,5 5 5,5 6 7 ph Şekil 4.2. ph nın Bornova Misketi β-glikozidaz aktivitesine etkisi. Farklı bitkiler ve mikroorganizmalardan elde edilen β-glikozidazın optimum ph değerleri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi, farklı kaynaklardan izole edilen β-glikozidaz enziminin optimum ph değerleri gibi geniş bir aralıktadır. Bu çalışmada elde edilen optimum ph değeri, Lecas ve ark. (1991) nın Misket üzümü β-glikozidazı optimum ph değeri ile aynıdır (Çizelge 4.2). 24

34 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY Çizelge 4.2. Farklı bitki ve mikroorganizmalardan izole edilen β-glikozidazların optimum ph değerleri Optimum ph Enzim kaynağı Substrat Kaynak 5.0 papaya pnpg* Hartman ve Schreier, misket üzümü pnpg Lecas ve ark., ginseng pnpg Zhang ve ark., soya fasülyesi pnpg Hsieh ve Graham, bal arısı pnpg Pontoh ve Low, çay pnpg Li ve ark., kan portakalı pnpg Barbagallo ve ark., elma pnpg Yu ve ark., Aspergillus oryzae pnpg Riou ve ark., Saccharomyces cerevisiae pnpg Hernandez ve ark., Paecilomyces thermophila pnpg Yang ve ark., 2008 *pnpg, p-nitrofenol-β-d-glikopiranozid Optimum Sıcaklık Enzimatik reaksiyonların hızları sıcaklıktaki artışla beraber artmakla birlikte, yüksek sıcaklıklarda enzimler protein yapılarındaki değişimden dolayı aktivitelerini kaybederler. Yüksek sıcaklıklar enzimatik reaksiyonda rol oynayan fonksiyonel grupların disosiye olma durumunu, enzimin aktivatörlere ve inhibitörlere olan ilgisini ve reaksiyonda substrat olabilecek oksijeninin çözünürlüğünü etkileyebilir. Bunların dışında, yüksek sıcaklıklar enzimlerin üç boyutlu yapısını bozarak onları inaktive edebilir. Reaksiyon hızının maksimuma eriştiği noktadaki sıcaklık derecesine optimum sıcaklık denir. Enzimlerin büyük çoğunluğunun optimum aktivitesi C dir ve 45 C nin üzerinde denatürasyon başlar (Richarson ve Hyslop, 1985). Bornova misketi β-glikozidazının en yüksek aktivite gösterdiği optimum sıcaklık değerini belirleyebilmek için C aralığındaki sıcaklıklarda enzimin aktivite değerleri ölçülmüş ve en yüksek aktivitenin görüldüğü sıcaklık değerine göre % nispi aktivite değerleri hesaplanmıştır. Sonuçlar Şekil 4.3 de verilmiştir. Şekil 4.3 den de görüleceği gibi Bornova misketi β-glikozidazının en yüksek aktivite değerine ulaştığı sıcaklık değeri 55 C dir. Enzim, C arasında % 70 in 25

35 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Vahap Aykut AKSOY üzerinde aktivite göstermiş, 75 C de ise enzimin nispi aktivite değeri %50 e düşmüştür Nispi aktivite (%) Sıcaklık ( C) Şekil 4.3. Sıcaklığın Bornova Misketi β-glikozidaz aktivitesine etkisi. Farklı bitkiler ve mikroorganizmalardan izole edilen β-glikozidaz üzerine yapılan araştırmalarda elde edilen optimum sıcaklık değerleri Çizelge 4.3 de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi, farklı kaynaklardan izole edilen β- glikozidazın optimum sıcaklık değerleri C gibi geniş bir aralıktadır. Bitki ve maya kökenli β-glikozidaz enzimlerinin optimum sıcaklık değerleri genellikle C aralığındadır. Aspergillus niger den izole edilen β-glikozidazlar ise, C aralığında maksimum aktivitelerini gösterebilmektedir. Maya kökenli glikozidazlar, üzüm suyunun fermantasyon sıcaklığında (20 C) yalnızca % aralığında aktivite gösterebilmektedir. Bazı fungal kökenli β-glikozidazlar 65 C ve üzerindeki sıcaklıklarda inaktive olsalar da bunda ortamın ph değerinin de önemli rolü bulunmaktadır (Whitaker ve ark., 2003). Bu çalışmada elde edilen optimum sıcaklık değeri (55 C), Lecas ve ark. (1991) nın Misket üzümünden izole ettikleri β-glikozidazın optimum sıcaklık değerinden (45 C) daha yüksek bulunmuştur. 26