ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Candida rugosa DAN LİPAZ ÜRETİMİNDE BİYOPROSES PARAMETRELERİNİN ENZİM AKTİVİTE VE SEÇİMLİLİĞİNE ETKİSİ Banu ERDEM KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Candida rugosa DAN LİPAZ ÜRETİMİNDE BİYOPROSES PARAMETRELERİNİN ENZİM AKTİVİTE VE SEÇİMLİLİĞİNE ETKİSİ Banu ERDEM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Serpil TAKAÇ Candida rugosa dan lipaz ve esteraz enzimleri üretiminde, enzimlerin hücre içi ve hücre dışı aktiviteleri bulunarak istenilen enzimin üretimini ve hücre dışına salgılanmasını sağlayan uygun koşulların belirlenmesi amacıyla; yağ asitlerinin, yağ asidi esterlerinin, bitkisel yağların, glukozun, organik azot kaynaklarının, sıcaklığın ve oksijen aktarımının etkileri incelenmiştir. Karbon kaynağı etkisi, ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki ayrı tür sistem ile; azot kaynağı ve sıcaklık etkileri ölçek büyütmesiz sistem ile, çalkalamalı hava banyosunda erlenlerde gerçekleştirilmiştir. Belirli zaman aralıkları ile üretim ortamlarından alınan örneklerde hücre derişimi ile hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz enzimlerinin aktiviteleri ölçülmüştür. Hücre derişimi kuru ağırlık olarak, lipaz aktivitesi titrimetrik yöntemle, esteraz aktivitesi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Deney verileri, incelenen her bir parametre için C. rugosa enzimlerinin aktivitelerinin, verimliliklerinin ve verimlerinin karşılaştırılmasında da kullanılmıştır. Triolein başlangıç derişiminin etkisi üç ayrı değer ile incelenmiş; lipaz ve esteraz üretimleri açısından 2 g/l derişiminin ve ölçek büyütmesiz sistemin uygun olduğu belirlenmiştir. 3 g/l oleik asit, ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde triolein ile aynı lipaz aktivitesini sağlamış, ancak triolein ile elde edilenden daha düşük lipaz verimi elde edilmiştir. C. rugosa, 3 g/l glukoz varlığında lipaz ve esteraz enzimleri üretebilmesine karşın glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) ile daha yüksek enzim aktiviteleri elde edilmiştir. Bitkisel yağların C18 içeriğinin artması ile lipaz, C16 içeriğinin artması ile de esteraz aktivitesinin arttığı bulunmuştur. En yüksek lipaz aktivitesine fındık yağı ile, esteraz aktivitesine zeytin yağı ile ulaşılmıştır. İncelenen azot kaynakları arasında en yüksek lipaz aktivitesi üre ile, en yüksek esteraz aktivitesi ise soy-pepton ile elde edilmiştir. 30 o C lipaz ve esteraz enzim aktiviteleri açısından en uygun sıcaklık olarak belirlenmiştir. C. rugosa dan lipaz üretimi için biyoreaktörde kesikli işletimle gerçekleştirilen deneylerde, %100 doygun oksijen ile başlayan ve daha sonra doygunluk değeri % 30 da sabit tutulan oksijen aktarım stratejisinin lipaz üretimi için; % 60 da sabit tutulan oksijen aktarım stratejisinin ise esteraz üretimi için uygun olduğu belirlenmiştir. Şubat 2008, 110 sayfa Anahtar Kelimeler : Candida rugosa, Candida rugosa lipazı, esteraz, enzim aktivitesi i

3 ABSTRACT Master Thesis EFFECTS OF BIOPROCESS PARAMETERS ON THE ENZYME ACTIVITY AND SELECTIVITY IN THE PRODUCTION OF LIPASE FROM Candida rugosa Banu ERDEM Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Prof.Dr. Serpil TAKAÇ The effects of fatty acids, fatty acid esters, vegetable oils, glucose, organic nitrogen sources, temperature and oxygen transfer strategy on the extracellular and intracellular lipase and esterase activities of Candida rugosa were investigated. The effect of carbon sources was investigated by employing one-step and two-step inoculation strategies whereas those of nitrogen sources and temperature were investigated by employing one-step inoculation strategy. The experiments were carried out in shake flasks; and the changes in the activities of extracellular and intracellular enzymes as well as biomass with time were followed. Biomass, lipase activity and esterase activity were determined as dry weight, by titrimetric analysis and by spectrophotometric analysis, respectively. The data were also compared in terms of activity, productivity and yield of each enzyme. The effect of triolein was investigated for three different initial concentrations; and 2 g/l was found to be the best for lipase and esterase activities regardless of the inoculation strategy employed. 3 g/l oleic acid provided the same lipase activity with triolein for both inoculation strategies; however, lower yield of lipase was obtained. C. rugosa could produce lipase and esterase enzymes in the presence of 3 g/l glucose; however, a mixture of glucose (2 g/l) and oleic acid (0.5 g/l) yielded higher enzyme activities. High C18 and C16 ester contents of vegetable oils promoted lipase and esterase productions, respectively. Hazelnut oil and olive oil provided the highest extracellular lipase and esterase activities, respectively. Urea provided considerably higher lipase activity when compared to other nitrogen sources tested; and soy-peptone provided the highest esterase activity. Temperature of 30 o C yielded the highest lipase and esterase activities. The fermentation starting with full oxygen saturation and continuing with the level of 30% saturation provided the highest lipase activity whereas continuing with the level of 60% provided the highest esterase activity. February 2008, pages 110 Key Words: Candida rugosa, Candida rugosa lipase, esterase, enzyme activity ii

4 TEŞEKKÜR Sadece yüksek lisans çalışmamda değil tüm üniversite eğitimim boyunca ilgisini hissettiğim, bilgisinden yararlandığım ve hayata dair birçok şey öğrendiğim sayın hocam Prof. Dr. Serpil TAKAÇ a teşekkür ederim. Deneylerimi yaparken bilgisini benden esirgemeyen, deneyimleriyle bana yol gösteren çalışma arkadaşım, derdimi yüzüme baktığı anda anlayan ve ortak olan canım arkadaşım Araş. Gör. A. Ezgi ÜNLÜ BÜYÜKTOPÇU ya teşekkür ederim. Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı nda gerçekleştirilen deneylerimde bana yardımcı olan başta Buket GÜLTEKİN olmak üzere; Çağrı GÜMÜŞTEKİN ve Dr. Duygu DEMİRALP e teşekkür ederim. Ankara ya geldiğim günden itibaren nerede olursa olsun ihtiyacım olan her an yanımda olan ablam Şule EMİROĞLU na teşekkür ederim. Bu tez çalışmasını 105M052 nolu ve Proteomiks Teknikleri Kullanılarak Endüstriyel Bir Enzimin Üretimi İçin Biyoteknolojik Proses Koşullarının Geliştirilmesi konulu proje ile maddi olarak destekleyen TÜBİTAK a teşekkür ederim. İşleyen demir ışıldar, Benim kızım bunun da üstesinden gelir sözleriyle ve her an hissettiğim sevgileriyle pes etmeyi düşündüğüm anlarda beni tekrar ayağa kaldıran, hayattaki en değerli hazinem, canım babam Özcan ERDEM ve canım annem İhsan ERDEM e çok teşekkür ederim. Banu ERDEM Ankara, Şubat 2008 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET.i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ v ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ vii 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ Enzimler Lipazlar ve Esterazlar Candida rugosa Lipazı (CRL) CRL nin kullanım alanları Candida rugosa Lipazı nın yapısı ve izoenzimlere göre değişkenliği CRL nin katalitik mekanizması CRL Üretimine Etki Eden Parametreler ve İzoenzimlerin Dağılımı Karbon ve azot kaynaklarının etkisi İşletim sistemlerinin etkisi MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamları Katı çoğalma ortamı Ön çoğalma ortamı Lipaz üretim ortamı Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemler Hücre parçalanması Biyoreaktörde üretim SDS-PAGE yöntemi Analizler Lipaz aktivitesi tayini Esteraz aktivitesi tayini 32 iv

6 3.3.3 Proteaz aktivitesi tayini Hücre derişimi Bitkisel yağ analizleri BULGULAR VE TARTIŞMA Karbon Kaynakları Etkisi Triolein etkisi Oleik asit etkisi Glukoz ve glukoz + oleik asit etkisi Doymuş yağ asitleri etkisi Farklı karbon kaynaklarındaki üretimlerin SDS-PAGE analizi Bitkisel yağların etkisi Azot Kaynakları Etkisi Sıcaklık Etkisi Oksjen Aktarımı Stratejisi SONUÇLAR...88 KAYNAKLAR...96 EKLER...98 EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler.99 EK 2 Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı.101 EK 3 Esteraz Aktivitesi Örnek Hesabı..102 EK 4 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı..103 EK 5 Farklı Karbon Kaynakları İle Yapılan Üretimlerin SDS-PAGE Analizi 104 EK 6 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi..105 EK 7 Oksijen Aktarım Stratejileri İçin Cihazdan Alınan Veriler..106 ÖZGEÇMİŞ v

7 SİMGELER DİZİNİ A Absorbans b Işının çözelti içinde aldığı yol (cm) C S0 N pi Q/V Başlangıç substrat derişimi Karıştırma hızı (rpm) İzoelektrik nokta Birim hacim gönderilen gaz akış hızı (vvm) T Sıcaklık ( o C) U Ünite (µmol/dk) U/mg kuru hücre Hücre miktarı başına aktivite V Hacim (ml) Y E/No Y L/No Y X/No Y E/So Y L/So Y X/So Azot kaynağı derişimi başına maksimum esteraz verimi (U/mg) Azot kaynağı derişimi başına maksimum lipaz verimi (U/mg) Azot kaynağı derişimi başına maksimum hücre verimi (U/mg) karbon kaynağı derişimi başına maksimum esteraz verimi (U/mg) karbon kaynağı derişimi başına maksimum lipaz verimi (U/mg) karbon kaynağı derişimi başına maksimum hücre verimi (mg/mg) ε λ Molar absorptivite katsayısı (L/mol.cm) Dalga boyu (nm) Kısaltmalar CRL SDS PAGE pnf PNFA TCA TEMED UV Candida rugosa Lipazı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez p-nitrofenol p-nitrofenil asetat Trikloroasetik asit Tetra Etil Metilen Diamin Ultraviyole vi

8 UY ortamı L E Universal Yeast ortamı Lipaz Esteraz vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Candida rugosa nın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü.4 Şekil 2.2 CRL katalizörlüğünde trigliserol substratın sentezi ya da hidrolizi...6 Şekil 2.3 Candida rugosa nın beş izoenziminin karşılaştırılması...9 Şekil 2.4 Kapağın açık ve kapalı konumları 11 Şekil 2.5 Kapağın açık ve kapalı durumlarında Pro 92 deki cis-trans izomerizasyonu.12 Şekil 2.6 Lip 1, Lip 2 ve Lip 3 ün hidrofobik tünelinde aminoasit kalıntılarının sırası...14 Şekil 2.7 Kapağın açık (a) ve kapalı (b) konumunda Lip 1 in üç boyutlu görünümü..15 Şekil 2.8 CRL nin katalitik mekanizması 16 Şekil 4.1 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre derişimine etkisi Şekil 4.2 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi...35 Şekil 4.3 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre içi lipaz ve esteraz Aktivitelerine etkisi. 36 Şekil 4.4 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre derişimine etkisi Şekil 4.5 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre dışı lipaz ve esteraz Aktivitelerine etkisi.38 Şekil 4.6 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi.. 39 Şekil 4.7 Ölçek büyütmeli sistemde 3 g/l oleik asit derişiminin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 44 Şekil 4.8 Ölçek büyütmesiz sistem 3 g/l oleik asit derişiminin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi...45 Şekil 4.9 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre Derişimine etkisi.. 50 viii

10 Şekil 4.10 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi Şekil 4.11 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 51 Şekil 4.12 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre derişimine etkisi..53 Şekil 4.13 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi..53 Şekil 4.14 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi...54 Şekil 4.15 Katı yağ asitlerinin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi..58 Şekil 4.16 Bitkisel yağların C18:1 ve C18:n yüzdeleri ile hücre dışı lipaz aktivitesinin değişimi..64 Şekil 4.17 Bitkisel yağların C16:1 yüzdeleri ile hücre dışı esteraz aktivitesinin değişimi. 64 Şekil 4.18 Azot kaynaklarının hücre derişimine etkisi Şekil 4.19 Azot kaynaklarının hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi...67 Şekil 4.20 Azot kaynaklarının hücre içi lipaz aktivitesine etkisi Şekil 4.21 Sıcaklığın hücre derişimine etkisi.. 74 Şekil 4.22 Sıcaklığın hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi Şekil 4.23 Sıcaklığın hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi.. 75 Şekil 4.24 Oksijen aktarım stratejisi I in hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 79 Şekil 4.25 Oksijen aktarım stratejisi I in hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 79 Şekil 4.26 Oksijen aktarım stratejisi II de sistem tarafından takip edilen ph, ve çözünmüş O 2 değerleri..81 ix

11 Şekil 4.27 Oksijen aktarım stratejisi II nin hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 81 Şekil 4.28 Oksijen aktarım stratejisi II nin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 82 Şekil 4.29 Oksijen aktarım stratejisi III de sistem tarafından takip edilen ph, ve çözünmüş O 2 değerleri..83 Şekil 4.30 Oksijen aktarım stratejisi III ün hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 83 Şekil 4.31 Oksijen aktarım stratejisi III ün hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi. 84 Şekil 4.32 Oksijen aktarım stratejisi IV de sistem tarafından takip edilen ph, ve çözünmüş O 2 değerleri..85 Şekil 4.33 Oksijen aktarım stratejisi IV ün hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi 85 Şekil 4.34 Oksijen aktarım stratejisi IV ün hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi...86 x

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 CRL izoenzimleri arasındaki benzerlikler (%) 10 Çizelge 2.2 İzoenzimler arasındaki farklılıklar...10 Çizelge 2.3 Lip 1, Lip 2 ve Lip 3 arasındaki önemli amino asit farklılıkları 13 Çizelge 4.1 Ölçek büyütmeli sistemde triolein varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri..36 Çizelge 4.2 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri.39 Çizelge 4.3 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde farklı derişimlerde triolein ile elde edilen maksimum verimlilik ve verimler...42 Çizelge 4.4 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri...45 Çizelge 4.5 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde 3 g/l oleik asit ile elde edilen maksimum verimlilik ve verimler.48 Çizelge 4.6 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz+oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri..51 Çizelge 4.7 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz+oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri Çizelge 4.8 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde glukoz ve glukoz+oleik asit varlığında elde edilen maksimum verimlilik ve verimler...57 Çizelge 4.9 Palmitik ve stearik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri...59 Çizelge 4.10 Farklı bitkisel yağlarla elde edilen maksimum hücre derişimleri, lipaz ve esteraz aktiviteleri.61 Çizelge 4.11 Farklı bitkisel yağlarla üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri..61 Çizelge 4.12 Farklı bitkisel yağlarla elde edilen verimlilikler 63 Çizelge 4.13 Azot kaynaklarının üretimlerin son saatlerindeki hücre dışı ve hücre içi proteaz aktivitelerine etkisi 68 xi

13 Çizelge Farklı azot kaynakları ile elde edilen maksimum verimlilik ve verimler 72 Çizelge 4.15 Sıcaklığın üretimlerin son saatlerindeki hücre dışı ve hücre içi proteaz aktivitelerine etkisi..75 Çizelge 4.16 Farklı sıcaklıklarda elde edilen maksimum verimlilik ve verimler 77 Çizelge 4.17 Farklı O 2 aktarım stratejileri ile elde edilen maksimum verimlilik ve verimler 89 xii

14 1. GİRİŞ Lipazlar, birçok reaksiyonda katalizör olarak kullanılan endüstriyel enzimlerdir. Bitki, hayvan ve mikrobiyal kaynaklı olarak gerçekleşen lipaz üretiminde tek hücreli bir maya olan Candida rugosa yaygın olarak kullanılmaktadır. Candida rugosa lipazı (CRL) geniş substrat spesifikliği nedeniyle lipazların kullanım alanlarının hemen hepsinde yer alır. CRL nin başlıca kullanım alanları; gıda endüstrisi, karbonhidrat ester sentezi, biyosensörler, biyolojik temizleme, biyodeterjanlar, kozmetik ve parfümeri, pestisitler, deri endüstrisi, farmasötik endüstri ve organik sentezlerdir. CRL, özellikle stereospesifikliğinden dolayı farmasötiklerin üretiminde oldukça fazla kullanılmaktadır. Kiral merkezli ilaçlar, kimyasal üretimleri sonucu iki enantiyomeri birlikte bulundururlar. Ancak tedavi edici etki sadece bir enantiyomerde bulunmaktadır. CRL istenilen enantiyomerin yüksek saflıkta üretiminde önemli rol oynar. Candida rugosa lipazının bazı biyokimyasal özellikler açısından farklılık gösteren yedi izoformu bulunmaktadır (Lip1, Lip2, Lip3, Lip4, Lip5, Lip6 ve Lip7). Bu izoformların ilk beşinin yapısı açıklanmış ve Lip2 ve Lip4 ün esteraz aktivitesi gösterdiği görülmüştür. Bu izoformların her biri farklı substrata etki edebilmektedir. Örneğin; Lip1 ketoprofen, naproksen ve kısa zincir yağ asitlerinin hidrolizinde etkinken, Lip2 kısa zincir tat esteri üretiminde etkindir. Her izoenzim farklı bir gen tarafından üretilmekte; tüm genler aynı sayıda amino asiti şifrelemekte ve yüksek dizi homologluğuna rağmen her izoenzim, şeker bileşimi, izoelektrik noktası ve hidrofobite gibi farklı biyokimyasal özellikler göstermektedir. Literatürde yer alan çalışmalarda, farklı izoformların translasyon sonrası modifikasyonlarla değil de, ifadesi çoğalma koşuluyla değişebilen farklı genlerin varlığı nedeniyle olduğu ileri sürülmektedir. Ancak, C. rugosa universal olmayan bir genetik koda sahip olduğu için başka bir mikroorganizma içinde lipaz genini ifade etmek mümkün olmamıştır. Bu nedenle, başlıca karbon ve azot kaynağı, yağ asidi türü ve sıcaklık gibi biyoproses koşullarının optimizasyonu ile C. rugosa nın lipaz üretimini yönlendirmesine ve artırılmasına çalışılmaktadır. 1

15 Bu çalışmada Candida rugosa nın ürettiği lipaz ve esteraz enzimlerinin aktivitelerinin artırılması için; karbon kaynağı ve hızlandırıcı (indükleyici) olarak çeşitli yağ asitlerinin, yağ asidi esterlerinin, bitkisel yağların, glukozun, basit ve kompeks organik azot kaynaklarının, sıcaklığın ve oksijen aktarım stratejisinin etkilerinin sistematik olarak incelenmesi; incelenen parametreler ile hücre derişiminin, üretilen enzimlerin hücre içi ve hücre dışı dağılımlarının, aktivitelerinin, verimlilik ve verimlerinin belirlenerek her bir enzimin üretimini ve hücre dışına salgılanmasını sağlayan uygun biyoproses koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. 2

16 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Enzimler Enzimler canlı hücreler tarafından sentezlenen, protein yapısında olan ve biyokatalizör olarak kullanılan moleküllerdir. Endüstriyel önemi bulunan pek çok reaksiyon, biyolojik ortamda çok daha kolay ve ılımlı koşullarda oluşabilmektedir. Enzimlerin endüstride kullanılması, çok yüksek basınç ve sıcaklık gibi fazla enerjiye ihtiyaç duyan koşulları gerektirmediğinden ekonomik ve pratik yararlar sağlar. Bu nedenle enzimler; gıda, tekstil, farmasötik, deterjan, kağıt ve deri endüstrisi, kozmetik, parfümeri ve biyosensör üretimi gibi birçok alanda kullanılmaktadırlar. Enzimler hücre içinde meydana gelen binlerce reaksiyonun hızını ve özgünlüğünü düzenlerler ve hücre dışında da aktivitelerini korurlar. Aynı enzim farklı hücre veya doku tiplerinde de katalizör görevi üstlenebilir. Bu durumda, aynı mikroorganizma tarafından farklı genlerle kodlanan, ancak görevi aynı ya da benzer olan izoenzimler den söz edilebilir. Bu farklı enzim formlarının tümü aynı reaksiyonu katalizlerler ve bu nedenle de aynı enzim gibi sınıflandırılırlar. İzoenzimler ph, ısı ve ışık gibi değişik şartlarda bile aynı etkiyi gösterirler. İzoenzimlerin protein yapısı birbirlerinden küçük farklar gösterir, dolayısıyla bazı fiziksel ve kimyasal özellikleri de farklıdır. Ancak elektroforez ve kromatografik yöntemler ile birbirlerinden ayrılabilirler. 2.2 Lipazlar ve Esterazlar Birbirinin izoformu olan lipazlar (EC ) ve esterazlar (EC ) ester gruplarının esterleşme, transesterleşme ve hidrolizlerini katalizleyen enzimlerdir. Esterazlar çözünebilir substratlara, lipazlar ise suda çözünemeyen substratlara karşı su / lipid arayüzeyi varlığında etkindirler. Trigliseridlerin hidrolizlerinde katalizör olarak rol almaları nedeniyle memeliler, bitkiler ile bakteri ve maya gibi mikroorganizmalarda bulunurlar. Ticari lipazlar ise genellikle mikroorganizmalardan elde edilirler (Candida rugosa, Bacillus sp.) (Ünlü 2004). 3

17 Lipazlar diğer enzimlere göre daha ucuz ve kolay elde edilebilir olmaları nedeniyle endüstride sıklıkla biyokatalizör olarak kullanılmaktadırlar. Oldukça geniş bir substrat seçimliliğine sahiptirler. Kimyasal proseste spesifik olmayan bir tepkimeye spesifiklik gösterebilirler. Lipazlar; deterjan, süt ürünleri, unlu mamüller, içecek, et ve balık, yağ, kimyasal, kağıt, farmasötik, kozmetik ve deri endüstrilerinde kullanılabilmektedirler. 2.3 Candida rugosa Lipazı (CRL) Candida rugosa (eski adı: Candida cylindracea); lipaz enzimi üretiminde yaygın olarak kullanılan, sporsuz, patojen olmayan, tek hücreli bir mayadır (Şekil 2.1) C. rugosa, salgıladığı lipazlardan dolayı en çok çalışılan mikroorganizmalar arasındadır. C. rugosa, lipaz izoenzimleri karışımı sentezler ve salgılar. Şekil 2.1 Candida rugosa nın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü C. rugosa lipazının geniş bir spesifiklik spektrumu vardır. Lipazın spesifikliği, enzimin moleküler özellikleri, substratın yapısı ve enzimin substrata bağlanmasını etkileyen faktörler tarafından kontrol edilir. CRL nin spesifiklik türleri; 4

18 i. Substrat Spesifikliği: Trigliserit, digliserit veya monogliseritlere karşı spesifiklik ii. iii. iv. Yer Spesifikliği: Primer esterler, sekonder esterlere karşı spesifiklik Yağ Asidi Spesifikliği: Spesifik yağ asitlerinin tercih edilmesi Stereospesifiklik: Bir enantiyomerin diğerine göre daha fazla tercih edilmesi v. Yukarıda bahsedilen dört spesifikliğin kombinasyonu olarak verilmektedir ve bu nedenle birçok endüstride kullanımı vardır (Benjamin and Pandey 1998) CRL nin kullanım alanları CRL; hidroliz, sentez ve esterleşme reaksiyonlarında katalizör olarak kullanılmaktadır. Yağlara etki edebilmesi, lezzet ve aroma verici özellikleri nedeniyle yiyecek endüstrisinde, yüzey aktif madde olarak deterjan ve deri endüstrisinde kullanılabilmektedir. Son yıllarda hız kazanan çevre dostu politikalar sayesinde, özellikle biyofarmasötiklerin üretiminde CRL nin kullanımı için yeni olanaklar ortaya çıkmaktadır. Hidroliz ve sentez reaksiyonları CRL nin endüstriyel uygulamaları; yağlar ve sıvı yağlardan hidroliz ile yağ asidi ve gliserol üretimini, interesterleşme ile trigliserit karışımlarının fiziksel özelliklerinin ve bileşiminin modifikasyonunu ve organik çözücülerde kimyasalların sentezini kapsamaktadır. Lipazlar, su ve organik fazların arayüzeyine etki etmektedirler ve böylece hidroliz reaksiyonlarını katalizlemektedirler. Yağların hidrolizi bir denge reaksiyonudur. Reaksiyon koşullarının değiştirilmesiyle hidroliz tepkimesi ester sentezine dönüştürülebilmektedir (Şekil 2.2). Alkoliziz ve gliserolizizde, açil grubun trigliseritten, alkol ya da gliserole transferi söz konusudur. İnteresterleşmede ise, açil grup trigliserit ya da yağ asidi esteri arasında değiştirilir (Benjamin and Pandey, 1998). 5

19 Trigliserit Gliserol Yağ Asidi Şekil 2.2 CRL katalizörlüğünde trigliserol substratın sentezi ya da hidrolizi (Benjamin and Pandey 1998) Yiyecek ve tatlandırıcılar Birçok kullanım alanı olan CRL, modern yiyecek endüstrisinde de kullanılmaktadır. Çeşitli ürünler ve proseslerde (pişirilebilir yiyecekler, fermente sebzeler vb.) Candida rugosa lipazları serbest ya da tutuklanmış olarak kullanılmaktadırlar (Benjamin and Pandey, 1998). Farmasötik endüstri CRL, stereospesifikliğinden dolayı farmasötik endüstri ve tarım kimyasalları üretiminde oldukça fazla kullanılmaktadır. Optikçe aktif, steroidal olmayan, antiimflamatuar ilaçların (iboprofen, naproksen, ketoprofen), HIV e karşı kullanılan potansiyel virüsit karbovilin üretiminde ve alkolidlerin, sekonder alkollerin, antibiyotiklerin, biyokimyasal inhibitörlerin sentezinde kinetik rezolüsyon proseslerinde kullanılır. Karbonhidrat ester sentezi Karbonhidrat esterleri kimyasalların üretiminde önemli yer tutmaktadır. Disakkaritlerin veya analoglarının ve bir C 8-22 yağ asidinin (mistrik, stearik asit vb.) tepkimeye girmesi 6

20 ile üretilen, maltoz ve laktoz benzeri şeker yağ asidi esterleri CRL kullanılarak üretilmektedir. Aminler ve amidler Homokarbametlerin simetrik yapısı, tek karbamet ürünü verir. Karbamet kolay bir prosesle LiAlH 4 n-metil e dönüştürülebilir ancak, kemoenzimatik amin metilasyonu için yeni bir yöntem bulunmaktadır. Örneğin, rasemik metil 2-klorpropiyonatın hidrolizi ve aminolizinde amid verimi ve enantiyomerik aşırılık, lipaz katalizli eş zamanlı hidroliz ve amidasyon ile arttırılmaktadır. Biyosensörler Biyosensörler, kimyasal, biyokimyasal ya da elektronik kaynaklı olabilirler. Biyokimyasal biyosensörler; enzimleri, antikorları ve diğer proteinleri içerebilirler. Yağ endüstrisinde, gıda teknolojisinde ve klinik teşhislerde triaçilgliserollerin belirlenmesinde analiz için kullanılan kimyasal yöntemler pahalı olduğundan lipazlar, biyosensör olarak kullanılmaktadır. Gliserol dehidrojenaz ile yükseltgenmenin sağlandığı, lipaz hidrolizi sırasında gliserol açığa çıkan yeni bir yöntemde lipazlar kullanılmaktadır. Tepkime sırasında açığa çıkan NADH floresans spektroskopi ile ölçülür. Yüksek spesifik aktiviteye sahip lipaz, gliserolün hızlı salınmasını sağlamaktadır. Biyolojik temizleme Biyolojik temizleme, atıkların yok edilmesi ve yararlı ürünlere dönüştürülmesi için kullanılmaktadır. CRL atık arıtımında diğer hidrolitik enzimlerle (proteazlar, amilazlar, selülazlar vb.) birlikte kullanılır. Atık arıtımında CRL, hem hücre dışı (saflaştırılmış olarak) hem de hücre formunda kullanılmaktadır. CRL, hayvansal ve bitkisel yağların ya da yüksek yağ asitlerinin yükseltgenmesinde kullanılabilir. Bu özelliği sayesinde yağ üretiminde ve gıda endüstrisinde açığa çıkan lipid içeren atık sularda doğrudan kullanılabilmektedir. Doymamış poliester atıklarının, ince parçalara ayrıldıktan sonra, 7

21 CRL ile indirgenmesi de yeni bir alandır. Bu şekilde elde edilen düşük molekül ağırlıklı yeniden kullanılabilir ürünler, kalıplama malzemelerinde cam fiberlerle takviye edilerek kullanılabilir (araba parçaları, mutfak lavaboları vb.). Biyodeterjanlar Deterjanlar, sürfaktant (yüzey aktif ajanlar) ve sürfaktantların etki edebilmeleri için uygun kimyasal zemin hazırlayan inorganik maddeleri içerirler. Eski sürfaktantlar artık yerini aktif biyosürfaktantlara bırakmıştır. Yıkama formülasyonunun değişken içeriğinin (lipaz proteinlerini ve sürfaktantları aktivitelerini ve kararlılıklarını yitirmeden parçalayabilen proteazlar gibi) varlığında çalışmaya yatkın, alkalofilik (ph 7-11) ve yaklaşık 60 C ye kadar dayanabilme özelliklerinden dolayı lipazlar deterjanlar için uygun katkı maddeleridirler. Ayrıca lipazlar; depolama sırasında ve makine içinde aktifken surfaktantlar içinde kararlılıklarını koruyabilmektedirler. Kozmetik ve parfümeri Lipazlar sürfaktant ve aroma üzerindeki etkileri nedeni ile bu endüstride kullanılmaktadırlar. Kozmetik endüstrisinde lipazlar; yumuşatıcı ve koku verici olarak kullanılmaktadırlar. Gliserit esterleri, çoklu doymamış yağ asitleri ve poliesterler, CRL katalizli kozmetiklerin ana bileşenleridir. Deri endüstrisi Deri endüstrisi, enzimlerin kullanımı için yeni gelişmekte olan bir alandır. Deterjanlarda olduğu gibi burada da; lipaz, pepsin, papain, elastaz gibi hidrolaz karışımları kullanılmaktadır. Tabaklama için hazır derinin üretimi de enzimatik proses, enzim karışımı içeren sulu çözelti ile ıslatmayı ve yıkamayı kapsamaktadır. 8

22 Kağıt endüstrisi Odun ya da ziftin hidrofobik bileşenleri (trigliseridler, mumlar vb.) kağıt ve kağıt hamuru üretiminde çeşitli problemlere neden olur. Lipazlar, kağıt yapmak için üretilen kağıt hamurundan zifti uzaklaştırmak amacıyla kullanılır. Japonya daki Nippon Kağıt Endüstrisi C. rugosa lipazı katalizörlüğünde odun trigliseritlerinin hidrolizine dayanan bir yöntem geliştirmiştir (Sharma et al. 2001) Candida rugosa Lipazı nın yapısı ve izoenzimlere göre değişkenliği Candida rugosa bilinen yedi farklı izoenzim salgılamakta; ancak bunlardan sadece üç tanesi (Lip 1, Lip 2 ve Lip 3) iyi bilinmektedir. İki tanesi için de (Lip 4 ve Lip 5) çalışmalar devam etmektedir (Akoh et al., 2004). Bu izoenzimler aynı sayıda (534) amino asitten oluşmaktadırlar. Molekül ağırlıkları 60 kda civarındadır ve aralarında büyük oranda benzerlik vardır (Çizelge 3.1). Ancak bu izoenzimlerin glikolizasyon konumları, izoelektrik noktaları, N-terminal dizileri ve karbonhidrat yüzdeleri farklıdır (Şekil 2.3, Çizelge 3.1) (Benjamin and Pandey 1998). Şekil 2.3 Candida rugosa nın beş izoenziminin karşılaştırılması(benjamin and Pandey 1998). (İnce çizgiler; her enzimde farklı olan amino asitler, dallar; glikolizasyon bölgeleri, kalın çizgiler; aktif konum.) 9

23 Çizelge 2.1 CRL izoenzimleri arasındaki benzerlikler (%) (Benjamin and Pandey 1998) LİP1 LİP2 LİP3 LİP4 LİP5 LİP LİP LİP LİP LİP Ticari CRL içinde iki izoenzim bulunmaktadır. Bunlar Lip A ve Lip B olarak adlandırılır. Bu izoenzimlerin özellikleri diğerlerinden farklılık gösterir. Yapılan araştırmalar Lip A nın Lip 3, Lip B nin ise Lip 1 ve Lip 2 karışımı ile benzerlik gösterdiğini ortaya koymuştur ( (Çizelge 2.2). Ayrıca ticari lipazda 43 kda molekül ağırlığında esteraz bulunduğu da bildirilmiştir (Sanchez et al. 1999) Çizelge 2.2 İzoenzimler arasındaki farklılıklar ( Protein Molekül Ağırlığı İzoelektrik Nokta Glikolizasyon N-terminal dizini A) Nükleotid sıralamasından tahmin edilen proteinler Lip bölge APTATLANGD Lip APTATLANGD Lip APTAKLANGD Lip APTATLANGD Lip APTATLANGD B) Ticari enzimden saflaştırılan proteinler LipA % APTAKLANGD LipB % APTATLANGD % APTATLANGD % APTATLANGD % APTATLANGD 10

24 Tüm hidrolazların yapısında en az 5 adet β yaprak, katalitik üçlü ve nükleofilik dirsekle tanımlanan α/β kıvrımların bulunduğu bilinmektedir. Genel yapı dahilinde, tüm C. rugosa izoenzimleri hidrojen bağlarıyla bağlı katalitik üçlü bulundururlar (Ser 209 Glu (Asp) 341 His 449) ve bu üçlüyü (aktif konum) örten bir kapağa sahiptirler (Şekil 2.4). Kapağın aktif bölgeye bakan yüzeyi hidrofobik, diğer yüzeyi ise hidrofiliktir. Hidrofobik kısım çoğunlukla alifatik yan zincirlerden oluşur. Hidrofilik kısımda ise kapak açıldığında, protein yüzeyi ile etkileşimler kararlı hale gelir. Kapalı formda aktif bölge içeride kaldığından enzimin aktivasyonu düşüktür. Kapağın açılması enzimin aktivasyonunu arttırır (Grochulski et al. 1994, Benjamin and Pandey 1998, Mancheno et al. 2003). Şekil 2.4 Kapağın açık ve kapalı konumları (mavi bölge; kapalı konum, pembe bölge; açık konum, sarı bölge; aktif bölge) Candida rugosa lipazının içindeki aktif konum, α-sarmal yapısı tarafından kapanır. Kapak amfifilik özellikli aminoasitlerden (31 amino asit) oluşmaktadır. Bu amino asitler izoenzimler arasında farklılık gösterirler, ancak hidrofilik ve hidrofobik özelliklerini korurlar (Benjamin and Pandey 1998). Tüm kapak yapısı disülfit bağları ile bağlanmıştır (Cys 60-Cys 97) ve Glu 96 ve Arg 37 arasında iyonik etkileşim vardır. Kapağın açılması sırasında iki amino asidik kalıntı rotasyona uğrar, bunlar Glu 66 ve Pro 92 dir. Bunun gerçekleşebilmesi için de, Pro 92 deki peptit bağlarının cis trans izomerizasyonu gereklidir (Şekil 2.5). Bununla 11

25 bağlantılı olarak, açık kapak formu, kapalı forma göre termodinamikçe kararlıdır. Çünkü, kapağın hidrofobik amino asitleri lipofilik ortamda iyi etkileşim gösterir. (Mancheno et al. 2003, Dominguez de Maria et al. 2006). Grochulski et al. (1994), çalışmalarında amino asidik kapağın açık ve kapalı formlarını incelemişler ve kristal yapısını ortaya koymuşlardır. Bu çalışmanın sonucunda kapağın sabit hareket etmediğini, hareketi sırasında açığa çıkan amino asidik kalıntılarda (Glu 66 ve Pro 92) belirli dönme noktalarına sahip olduğunu gözlemlemişlerdir. Pirolindeki bu cis-trans izomerizasyonunun, yeniden yapılandırma için gerekli olduğu görülmüştür. Şekil 2.5 Kapağın açık (ince çizgi) ve kapalı (kalın çizgi) durumlarında Pro 92 deki cistrans izomerizasyonu (Grochulski et al. 1994) Kosolvent gibi parametreler ve mikroçevrenin ph sındaki modifikasyonlar ya da aktif bölgenin dielektrik sabiti, kapağın hareketinde rol oynar. Örneğin; Lip 1 ve Lip 3 ün kapakları arasında polietilenglikol varlığında farklı arayüzey aktivasyonu gözlenmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda izoenzimlerin kapaklarındaki farklılıkların biyokatalitik performansı etkilediğini ortaya konmuştur. Lip 1 ve Lip 3 ün kapaklarındaki yapısal farklılıklar incelenmiş ve Lip 1 için oluşabilen arayüzeylerin Lip 3 için mümkün olmayabileceği ortaya konmuştur. Lip 1 in kapağı açıkken aktivite, Lip 3 ünkine göre oldukça kararlıdır. Bu bilgi Lip 3 ün biyokimyasal karakterizasyonu ile 12

26 kolaylıkla kontrol edilebilir. Lip 3, kolesterol esteraz gibi tanımlanır ve literatürdeki biyokatalitik sonuçlara göre, Lip 3 ün yüksek esteraz aktivitesi gösterdiği gözlenmiştir. Bununla beraber, yüksek sterik engellenmiş alkoller için çok iyi afinite gösterdiği söylenmektedir. Lip 4 ile yapılan çalışmalar ise bu izoenzimin arayüzey aktivasyonu bulunmadığını göstermektedir. Lip 4, kapak alanında oldukça hidrofobiktir (Dominguez de Maria et al. 2006). Mancheno et al. (2003), çalışmalarında Lip2 nin kapak bölgesindeki amino asit farklılıklarını bulmuşlar ve Lip2 nin kapağının, Lip3 ve Lip1 inkilerden daha hidrofobik, ancak Lip4 ünkine göre hidrofobikliğinin daha düşük olduğunu görmüşlerdir (Çizelge 2.3). Lip 2 nin Lip3 ve Lip1 den daha yüksek esteraz davranışı gösterdiğini gözlemlemişlerdir. Lip 2 ve Lip 3 ün kapak bölgesi yapısal olarak karşılaştırıldığında yüksek benzerlik bulunmuştur. Bazı yapısal veriler karşılaştırıldığında ise Lip 2 ve Lip 4 ün benzer esteraz aktivitesine sahip olduğu görülmüştür. Çizelge 2.3 Lip 1, Lip 2 ve Lip 3 arasındaki önemli amino asit farklılıkları (Mancheno et al. 2003) Kalıntı Lip 1 Lip 2 Lip 3 69 Tyr Phe Phe 127 Val Leu Ile 132 Thr Leu Ile 296 Phe Val Phe 344 Phe Leu Ile 450 Ser Gly Ala CRL nin yapısının aydınlatılmasına yönelik çalışmalarda simulasyon programlar ve farklı yöntemler kullanılarak üç boyutlu veya iki boyutlu molekül yapıları elde edilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda, CRL nin bağlanma bölgesinde hidrofobik bir tünel olduğu anlaşılmıştır. Bu tünel, sadece Candida rugosa ve Candida candidum lipazları için bulunmuştur. Tünel, 25Å toplam boyuta sahiptir ve proteinin orta bölgelerine doğru uzanır, sonra proteinin yüzeyine doğru L şeklinde kıvrılarak Ser 209 ile başlayan ve Tyr 13

27 361 ve Ser 365 ile sonlanan kapak boyunca uzanır. Tünelin ağız kısmı Met 213, Leu 304, Phe 345 ve Phe 415 den oluşmaktadır. Tünel, alifatik amino asitlerce zengin bölge ve aromatik amino asitlerce zengin bölge olmak üzere iki bölgeden oluşmaktadır. Bu bölgelerdeki amino asit kalıntıları izoenzimlere göre küçük farklılıklar gösterebilir (Şekil 2.6). Özellikle katalitik üçlü ve substratla doğrudan bağlantılı olmaları nedeniyle aromatik amino asitlerce zengin bölgede bulunan amino asit kalıntılarındaki değişimler önemlidir. Bu amino asitlerdeki değişimler sonucunda enzimin lipaz/esteraz davranışı belirlenmektedir. Tünele 6, 12 ya da 16 karbonlu bir zincir bağlandığında, bağlanma bölgesinin şekli ve boyutları değişmemektedir. Tünelin en sonunda gerçekleşen küçük değişiklikler ile 18 karbonlu zincirlerin, hatta daha uzun alkil zincirlerinin de bağlanma bölgesine yerleştiği gözlenmiştir (Schmitt et al. 2002, Mancheno et al. 2003). Şekil 2.6 Lip 1 (yeşil), Lip 2 (mavi) ve Lip 3 ün (turuncu) hidrofobik tünelinde amino asit kalıntılarının sırası(mancheno et al. 2003). (Katalitik üçlü kırmızı ve kolesteril linoleat sarı ile gösterilmiştir) Tüm lipazlarda asit substratların (aktif konumdaki tünel) dışında alkol tanımlamak için de ikincil bir konum bulunmaktadır Candida rugosa lipazı için alkol bağlanma bölgesi Å genişliğinde ve 10 Å boyundadır. Alkol bağlanma bölgesi alkol-asit ekseni boyunca uzanır (Akoh et al. 2004). 14

28 İzoenzimler arasındaki diğer bir farklılık glikolizasyon noktalarındaki amino asitlerde (Asn) görülmektedir. N-Glukanlar proteinlerin fizikokimyasal özelliklerinde ve biyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynarlar. Glukozlanmış enzimler, sıcaklığa dayanıklıdır (52-58 C) ve biyokatalitik görünümleri farklıdır. Ayrıca uzun zincirli lipidlere spesifiklikleri vardır. Glukoz bağlanma bölgesinde üç farklı Asn vardır. Bu asparajin üçlüsü izoenzimlere göre farklılık gösterebilir; ancak Asn 351 tüm izoenzimlerde bulunmaktadır (Akoh et al. 2004, Brocca et al. 2000). Brocca et al. (2000) çalışmalarında Lip 1 için şeker zincirlerinin, biyokimyasal ve katalitik özellikleri açısından önemi ile ilgilenmişlerdir. Bu amaçla glukolizasyon bölgelerini modifiye ederek farklı Lip 1 mutantları oluşturmuşlardır. Asn 291 deki mutasyonlar aktiviteye önemli bir etki yapmazken, Asn 314 ve Asn 351 deki değişimlerle aktivitede önemli bir azalma görmüşlerdir. Bu çalışma sonucunda özellikle Asn 351 in kapak hareketiyle doğrudan ilişkili olduğunu görmüşlerdir (Şekil 2.7). (a) Şekil 2.7 a. Kapağın açık, b. kapalı konumunda Lip 1 in üç boyutlu görünümü (Brocca et al. 2000) (b) 15

29 2.2.3 CRL nin katalitik mekanizması Lipazların substratla etkileşimi iki basamaktan oluşmaktadır. Birinci basamak, tetrahedral etkileşim ile açil-enzim kompleksinin meydana gelmesidir. Bu sırada, etkileşim bölgesindeki oksijen atomları negatif yüklenerek peptit zincirindeki iki NH grubunun kararlı hale gelmesini sağlar. Bu şekilde oluşan yapıya oksianyon deliği denir. İkinci adım ise açil-enzim kompleksinin hidrolizidir. His kalıntısı nükleofilik su molekülünü aktive eder ve reaksiyon ikinci etkileşim ile devam eder. Oluşan asidik ürün ayrılır ve enzim serbest kalır (Şekil 2.8) (Monecke et al. 1998). Şekil 2.8 CRL nin katalitik mekanizması (Monecke et al. 1998) 16

30 2.4 CRL Üretimine Etki Eden Parametreler ve İzoenzimlerin Dağılımı Üretimde kullanılan karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimleri ve işletim koşulları değiştirilerek lipazın aktivitesinin arttırılması ve istenilen izoformun üretilmesi sağlanabilmektedir Karbon ve azot kaynaklarının etkisi Obradors et al. (1993) Candida rugosa dan lipaz üretiminde farklı yağ asitlerinin etkisini incelemişlerdir. Bu kapsamda karbon kaynağı olarak g/l arasında değişen üç farklı derişimde - bütirik asit (C 4 ), valerik asit (C 5 ), kaproik asit (C 6 ), n- heptanoik asit (C 7 ), kaprilik asit (C 8 ), kaprik asit (C 10 ) ve oleik asit (C 18 ) kullanılmıştır. Deneyler erlenlerde ve ayrıca 5 L çalışma hacmindeki kesikli fermentörde 30ºC sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir. Erlen ve fermentöre, kültür ortamındaki çözünmüş oksijen düzeyi %20 nin altına düşmeyecek şekilde hava beslenmiştir. Lipaz aktivitesi modifiye Monotest lipaz yöntemi ile belirlenmiştir. Erlenlerde gerçekleştirilen deneylerde en yüksek lipolitik aktivite değerine kaprilik ve kaprik asitler kullanıldığında ulaşılmıştır. Ancak bu substratlar toksik etkileri nedeniyle yüksek derişimlerde kullanılamamaktadırlar. Biyokütle için en yüksek değerlere ise bütirik asit kullanılarak ulaşılmıştır. Kaproik asit de çoğalma için iyi olmasına rağmen lipaz üretimi için kaprik ve kaprilik asitler kadar indükleyici değildir. Valerik ve n-heptanoik asitler kullanıldığında hücrenin az da olsa çoğaldığı, ancak lipaz üretiminin oldukça az olduğu görülmüştür. Yüksek oleik asit derişiminde (2 g/l) elde edilen sonuçlar ile düşük kaprilik asit derişiminde (0.5 g/l) ile elde edilen sonuçların da yaklaşık aynı olduğu bulunmuş; ancak kaprilik asitin toksik etkisi nedeniyle oleik asitin lipaz üretimi için daha iyi bir karbon kaynağı olduğu düşünülmüştür. Sonuçta, kaprilik asit, kaprik asit ve oleik asitin lipaz üretimi için iyi birer karbon kaynağı olduğuna karar verilmiş ve bu yağ asitleri kullanılarak deneyler fermentörde gerçekleştirilmiştir. Kaprilik asitin (0.5 g/l) karbon kaynağı olarak kullanıldığı kesikli işletimde 40. saatte lipolitik aktivite ve biyokütle değerleri sırasıyla 6 U/ml ve 0.35 g/l olarak elde edilmiştir. Karbon kaynağı olarak 0.5 g/l kaprik asit kullanılan kesikli fermentasyon ile elde edilen biyokütle ve lipaz aktivitesi değerlerinin, kaprilik asit kullanımıyla elde edilen değerler ile yaklaşık 17

31 aynı olduğu görülmüştür. Oleik asit (2 g/l) kullanılan kesikli fermentasyonda ise biyokütle ve lipolitik aktivite için en yüksek değerler 20. saatte 2.2 g/l ve 7.4 U/ml olarak elde edilmiştir. Fermentörde gerçekleştirilen deneylerle elde edilen sonuçlar, erlenlerde gerçekleştirilen deneylerde elde edilen sonuçlarla uyumludur. Kaprik asit ve kaprilik asit fermentasyonlarında verimin (U/g biyokütle ) oleik asit kullanımı ile elde edilenden daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Ancak endüstriyel üretiminde lipaz üretim hızı da (U/ml st) önemlidir. Substrat olarak oleik asit kullanıldığı zaman lipaz üretim hızının 1.42 U/ml st olduğu ve bu değerin kaprik asit ve kaprilik asit kullanımı ile elde edilenlerden yüksek olduğu görülmüştür. Bu nedenle çalışmada C.rugosa dan endüstriyel lipaz üretiminde oleik asitin iyi bir karbon kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Dalmau et al. (2000) tarafından gerçekleştirilen çalışmada, Candida rugosa nın çoğalması ve lipaz salgılamasında farklı karbon kaynaklarının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla yapılan birinci grup deneylerde karbon kaynağı olarak 2 g/l derişiminde glukoz, galaktoz, mannitol, gliserol, sodyum laktat, palmitik asit, oleik asit, triolein ve Tween 80 kullanılmıştır. Deneyler 30 C sıcaklıkta gerçekleştirilmiş; lipaz aktivitesi trioleinin substrat olarak kullanıldığı türbidimetrik yöntemle belirlenirken, esteraz aktivitesi p- nitrofenilpropiyonatın substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Yapılan analizler sonucunda, hücre dışı ve hücre içi lipaz aktiviteleri ile hücre dışı esteraz aktivitesinin en yüksek değerlerine palmitik asit kullanımı ile ulaşıldığı belirlenmiştir. Bu değerler hücre dışı lipaz aktivitesi için 5.3 U/ml, hücre içi lipaz aktivitesi için 52 U/g hücre ve hücre dışı esteraz aktivitesi için U/ml dir. En yüksek hücre dışı protein derişimi galaktoz kullanımında 52.7 µg/ml, biyokütle derişimi ise triolein kullanımında 1.61 g/l olarak elde edilmiştir. Tween-80, lipaz üretimini ve hücre dışına çıkmasını stimüle etmiştir. Çalışmadaki ikinci grup deneylerde, yağ asitleri ile yağ içermeyen substratlar birlikte karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Bu deneylerde biyokütle için en iyi değer 1.57 g/l olarak mannitol + oleik asit içeren ortamda elde edilmiştir. Hücre dışı lipaz aktivitesinde en iyi sonuç sodyum laktat + palmitik asit içeren ortamda 0.7 U/ml olarak bulunmuştur. Çalışmada ayrıca C. rugosa lipazı üretiminde glukoz etkisi üç ayrı deney ile incelenmiştir. Birinci deneyde, C.rugosa glukoz ile oleik asitin birlikte bulunduğu ortamda çoğaltılmış ve bu durumda 18

32 hücrelerin glukozu oleik asite tercihli olarak kullandığı belirlenmiştir. Lipaz aktivitesi ise glukoz tamamen tükendikten ve oleik asit kullanımı başladıktan sonra görülmektedir. İkinci deneyde, oleik asit içeren ortamda çoğalan hücre örnekleri farklı zamanlarda ortamdan uzaklaştırılarak glukoz içeren ortamda çoğaltılmaya devam edilmiştir. 18. saatte alınan örnekte ortamda oleik asit varken, 19.saatte alınan örnekte oleik asit tamamen tükenmiş durumdadır. Glukozlu ortamda iki saatlik inkübasyondan sonra, her iki örnekte de hücre dışı lipaz aktivitesinin arttığı; ancak ikinci ortamdaki toplam aktivitenin -muhtemelen hücrelerin oleik asit ortamında daha uzun süre çoğalmaları nedeniyle- birinciden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Yarı-kesikli sistemde gerçekleştirilen üçüncü deneyde ise, başlangıçta oleik asit tek karbon kaynağı olarak kullanılmış ve 6. saatte oleik asit beslemesi kesilip glukoz eklenmiştir. Glukoz eklemeden az önce biyokütle derişimi 7.8 g/l, glukoz eklendikten 3 saat sonra -glukoz tükendiği zaman- yapılan ölçümlerde 10.9 g/l olarak saptanmıştır. Hücre içi ve hücre dışı lipaz aktivitelerinin zamanla değişimi benzer, ancak ters yöndedir. Çalışmada, karbonhidratlar ve yağ içermeyen asitlerin hücre çoğalmasını pozitif yönde etkilerken, elde edilen lipaz aktivitesinin düşük olduğu; lipidik substratların lipaz üretimini olumlu yönde etkilediği ve glukozun geriletici etki gösterdiği sonucuna varılmıştır. Wei et al. (2004), C. rugosa dan lipaz üretimini artırmak amacıyla karbon kaynağı olarak yağ asitleri ve yağ asidi esterlerini kullanmışlar; bunlara ek olarak yardımcı çözücü etkisini de incelemişlerdir. Tüm deneyler 30 C de, 10 g/l karbon kaynağı başlangıç derişiminde gerçekleştirilmiş ve lipaz aktivitesi titrimetrik yöntem ile belirlenmiştir. Yağ asitlerinin lipaz üretimindeki etkisini incelemek amacıyla yapılan deneylerde, asetik asit ve kaprilik asit dışında kullanılan yağ asitleri ortamda çözünmemiş ve yüzeyde asılı kalmışlardır. Çözünmelerine rağmen asetik asit ve kaprilik asit, hücre çoğalmasını ve lipaz üretimini sağlamamışlardır. Çözünmeyen yağ asitleri ise (oleik, dodekanoik, miristik, palmitik ve stearik asitler) hücre çoğalmasını ve lipaz üretimini sağlamışlardır. Uzun zincirli yağ asitlerinde yüksek lipaz aktiviteleri ve protein derişimleri elde edilmiştir. Oleik asit ve stearik asit aynı sayıda karbon içermelerine rağmen, sonuçların oleik asit için daha iyi olduğu bulunmuştur. Bu da doymamış yağ asitlerinin lipaz üretimi için daha uygun karbon kaynağı olduğunu göstermektedir. Yağ asidi esterlerinin (gliserol tribütirat, metil stearat, gliserol 19

33 monostearat, etil oleat, gliserol trioleat) lipaz üretimi ve hücre çoğalmasına etkisi incelenirken, yağ asitleri arasında en iyi sonucu veren oleik asit ile karşılaştırma yapılmıştır. Kısa zincirli gliserol bütiratın iyi bir karbon kaynağı olmadığı; gliserol trioleatın ise lipaz üretiminde oldukça iyi olduğu görülmüştür. Gliserol trioleat ile oleik asitten % 65.3 daha yüksek lipaz aktivitesi elde edilmiştir. Aynı çalışmada yardımcı çözücü olarak etanol ve dodekan kullanımı ile, substratların ortamda iyi bir şekilde dağıtılması amaçlanmıştır. Etanol hücre çoğalmasını inhibe etmekte; dodekan ise mikroorganizmaya toksik etki yapmadığı gibi, fermentasyonda oksijen taşıyıcı olarak kullanılabilmektedir. Metil stearat, gliseril trioleat ve oleik asitin dodekanda çözünerek tek karbon kaynağı olarak kullanıldığı deneylerde elde edilen sonuçlarda, yağ asiti esterlerinin yağ asitlerinden daha iyi sonuç verdiği bulunmuştur. Oksijen beslemeli olarak gerçekleştirilen fermentör deneylerinde ise en yüksek aktiviteyi sağlayan gliserol trioleat karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Yapılan tüm deneyler karşılaştırıldığında, en iyi sonuçların gliseril trioleatın karbon kaynağı ve dodekanın oksijen taşıyıcı olarak kullanıldığı fermentör deneylerinde elde edildiği görülmektedir. Lakshimi et al. (1999), Candida rugosa dan lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak bitkisel yağların kullanımı incelenmişlerdir. Bu amaçla; yerfıstığı, susam, palmiye, hint, hindistancevizi ve ayçiçek yağları 0-14 g/l arasında değişen derişimlerde kullanılmıştır ve deneyler ph 5.5, 28 ºC koşullarında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan azot kaynağı üredir. Biyokütlenin ve substrat olarak p-nitrofenilstearatın kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle belirlenen lipaz aktivitesinin zamanla değişimi izlenmiş ve en yüksek değerlere tüm bitkisel yağlar ile 48. saat sonunda ulaşılmıştır. Bulgulara göre en yüksek lipolitik aktivite 14 g/l derişiminde susam yağı ile 5 U/ml olarak gözlenmiştir. En yüksek biyokütle ise 4.9 g/l olarak 14 g/l derişimindeki yerfıstığı yağı ile elde edilmiştir. Kullanılan bitkisel yağların C18:n yağ asidi içerikleri ile elde edilen lipaz aktiviteleri karşılaştırıldığında; en fazla C18:n yağ asidi içeren susam yağında en yüksek lipaz aktivitesi elde edildiği görülmektedir. Fadıloğlu vd. (2002) çalışmalarında, Candida rugosa lipazı üretiminde farklı karbon ve azot kaynaklarının etkisini incelemişlerdir. Bu kapsamda iki farklı çalışma yapılmıştır. Birincisi; zeytin yağı olduğu ve olmadığı durumlarda, ikincisi ise; buğday unu, soya unu 20

34 ve beyaz peynir üst altı suyu içeren ortamlarda biyokütle ve lipaz aktivitesinin karşılaştırılmasıdır. Birinci çalışmada, ilk olarak % 3 zeytin yağı içeren temel ortamda farklı karbon ve azot kaynakları incelenmiştir. Bu amaçla azot kaynağı olarak maya özütü, tripton, proteoz pepton ve bunlara ilave olarak karbon kaynağı olarak glukoz ve laktoz kullanılmıştır. Bu sonuçlara göre en iyi lipaz aktivitesi ve biyokütle miktarı sırasıyla; 5.58 U/ml ve 2.05 mg/ml olarak sadece maya özütü içeren ortamda zeytinyağı varlığında elde edilmiş; ancak en iyi spesifik aktivite U/mg olarak zeytin yağı bulunmayan ortamda maya özütü ve glukoz varlığında elde edilmiştir. Yapılan ikinci çalışmada buğday unu, soya unu ve beyaz peynir altı suyu içeren ortamlar incelenmiş ve en iyi değerler buğday ununda, en düşük değerler ise beyaz peynir altı suyunda elde edilmiştir İşletim sistemlerinin etkisi Montesinos et al. (2003), farklı seyrelme hızlarıyla gerçekleştirilen sürekli işletimde farklı derişimlerde tek ya da karışım halindeki karbon kaynaklarının C. rugosa dan lipaz üretimine etkilerini incelemişlerdir. Kesikli sistemde gerçekleştirilen ve karbon kaynağı olarak glukoz kullanılan deneyler 1 L çalışma hacmindeki fermentörde, oleik asit içeren ve sürekli sistemde gerçekleştirilen deneyler ise 5 L çalışma hacmindeki fermentörde gerçekleştirilmiştir. Tüm deneyler; 500 rpm karıştırma hızında, 30 C de ve ph 6.2 de sabit tutularak gerçekleştirilmiştir. Lipaz aktivitesi, trioleinin substrat olarak kullanıldığı modifiye Monotest Lipaz yöntemi ile ölçülmüştür. Ayrıca deneyler süresince glukoz, laktik asit ve oleik asit derişimleri izlenmiş ve oluşan hücrenin kimyasal bileşimi analizlenmiştir. Karbon kaynağı olarak oleik asit (2 g/l) kullanılan deneylerde 0.03 st -1 ve 0.15 st -1 arasında farklı seyrelme hızlarının etkisi incelenmiş ve lipaz aktivitesinin seyrelme hızı ile ters orantılı olarak değiştiği görülmüştür. Lipaz aktivitesinin en yüksek değerine 0.03 st -1 seyrelme hızında ulaşılmıştır (27 U/ml). Karbon kaynağı olarak oleik asit ve azot kaynağı olarak amonyum sülfat kullanılan deneylerde C/N mol oranının ve farklı vitamin çözeltilerinin lipolitik aktivite ve biyokütleye etkisi incelenmiştir. Deneylerde 28/1 ve 2/1 olmak üzere iki C/N oranı incelenmiştir. Farklı vitaminlerin kullanımı önemli değişimlere neden olmazken, C/N oranının 28/1 olduğu durumda hücre içi ve hücre dışı aktivitelerde azalma görülmüş ve 21

35 en yüksek aktiviteler 2/1 C/N oranında elde edilmiştir. Ancak protein derişimlerinde önemli bir değişim olmamıştır. Azot kısıtlaması olduğu zaman hücre derişiminde artış görülmüş ve bu durum lipidik maddelerin hücre içinde birikimi ile açıklanmıştır. Ayrıca çalışma sonunda C/N mol oranının biyokütlenin kimyasal bileşimini de etkilediği de görülmüştür. C/N oranı 2/1 den 28/1 e yükseltildiğinde kimyasal formüldeki stokiyometrik katsayılar; azot için 0.14 den 0.08 e, oksijen için 0.57 den 0.48 e indirgenmiştir. Bu azalma indirgenen maddelerin de lipidik maddeler gibi hücre içinde birikmesiyle açıklanmıştır. Azot kısıtlaması olmayan deneylerde elde edilen lipaz aktiviteleri arasında önemli bir fark gözlenmezken, azot kısıtlamasının olduğu deneyde azot kısıtlaması olmayan deneylere göre daha düşük değerler elde edilmiştir. Bu da C/N oranının lipaz üretimi için oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Çalışmada ayrıca lipidik ve lipit içermeyen substratlar birlikte kullanılarak aktivite ve biyokütle oluşumuna etkileri incelenmiştir. Glukoz ve oleik asit birlikte kullanılarak gerçekleştirilen deneylerde çeşitli seyrelme hızları sınanmış ve seyrelme hızı 0.08 st - 1 den 0.2 st -1 e artırıldığında hücre derişiminin azaldığı görülmüştür. Deney süresince karbon kaynakları analizlendiğinde, glukozun tamamen tükendiği ancak oleik asitin önemli derecede ölçülebildiği görülmüştür. Glukoz yerine laktik asit kullanıldığında ise oleik asitin kullanıldığı, laktik asitin bir kısmının ortamda kaldığı görülmüştür. Ancak laktik asit kullanımı ile aktivite değerleri de artmıştır. Çalışmada en yüksek lipolitik aktivite ve verimlilik değerlerine karbon kaynağı olarak laktik asit ve oleik asitin birlikte kullanıldığı, 0.08 st -1 seyrelme hızında ve vitamin B ile gerçekleştirilen deney sonucunda ulaşılmıştır. Yazarlar, daha önceki çalışmalarda elde edilen, farklı işletim koşullarında gerçekleştirilen oleik asit ve glukoz ile oleik asitin birlikte kullanıldığı deney verileri ile bu çalışmada elde ettikleri verileri karşılaştırılmışlardır. Lipolitik aktivite, verim ve verimlilik için en yüksek değerler Gordillo et al. (1998) ın kesikli işletim sisteminde ve sabit spesifik çoğalma hızında elde ettiği değerlerdir. Gordillo et al. (1998) çalışmalarında, sabit substrat besleme hızı ve sabit spesifik çoğalma hızı olmak üzere iki farklı yarı kesikli işletim stratejisi incelemişlerdir. Karbon kaynağı olarak oleik asitin kullanıldığı deneyler 5 L çalışma hacminde 30 C de ve 500 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilmiş; 0.5 ile 3 L/dk arasında değişen hava akış hızları kullanılmıştır. Hava %20 çözünmüş oksijen içermektedir ve ph 6.3 değerinde 22

36 sabit tutulmuştur. Lipaz aktivitesi trioleinin substrat olarak kullanıldığı Modifiye Monotest lipaz yöntemi ile; esteraz aktivitesi substrat olarak p-nitrofenil propiyonatın kullanıldığı spektrofotometrik yöntem ile ölçülmüştür. Oluşan izoenzimler hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ile ayrılmıştır. Sabit substrat besleme hızı stratejisinde üç farklı sabit besleme hızının etkisi incelenmiştir (1, 2 ve 3.4 g oleik asit/st). Tüm besleme hızlarında, lipazın ortama salgılanmasının yarı kesikli işletim boyunca hücre çoğalmasıyla bağlantılı olduğu görülmüştür. İşletim sonunda ise hücre dışı lipolitik aktivite yaklaşık sabit kalmıştır. Düşük ya da orta besleme hızlarında çalışıldığında işletim sonunda verim hemen hemen aynıdır (Y P/S =6.5 U/mg oleik asit). Yüksek besleme hızlarında çalışıldığında ise verim 2.5 U/mg oleik asit değerine düşmüştür. Biyokütle başına en yüksek hücre dışı lipolitik aktivite düşük substrat besleme hızında elde edilmiştir. Hücre içi lipolitik aktivitenin en yüksek değerine yüksek besleme hızında ulaşılmıştır. Ancak biyokütle başına toplam lipolitik aktiviteye bakıldığında, tüm besleme hızlarında elde edilen değerlerde benzerlik olduğu görülmüştür. Sabit substrat besleme hızında gerçekleştirilen yarı kesikli işletimde, farklı besleme hızlarının toplam lipaz sentezine önemli bir etkisi olmadığı görülmektedir. Ancak düşük besleme hızında enzim hücre içinde daha az miktarda birikirken yüksek besleme hızında üretilen enzimin büyük bölümü hücre içinde kalmaktadır. Sabit spesifik çoğalma hızı stratejisinde ise deneyler, µ = 0.015, 0.04 ve 0.08 st -1 değerlerindeki spesifik çoğalma hızlarında gerçekleştirilmiştir. Düşük µ değeri (0.015 st -1 ) için lipolitik aktivite hücre içinde artış göstermezken, hücre dışı lipolitik aktivite yarı kesikli işletimin 40. saatinden sonra 117 U/ml değerinde kararlı hale gelmiştir. Orta spesifik çoğalma hızında (0.04 st -1 ) ise sulu lipolitik aktivite 10. saatten sonra 94 U/ml değerinde kararlı hale gelmiştir. Bu µ değerinde elde edilen hücre içi lipolitik aktivite değerinin düşük µ de elde edilen ile kıyaslandığında daha düşük olduğu görülmüştür. Yüksek µ değerinde çalışıldığında ise, hücre dışı lipolitik aktivitede bir kararlılık gözlenmemiştir. Her iki stratejide elde edilen ürünler FPLC de ayrılarak iki temel izoenzim karakterize edilmiştir. Lipolitik ve esteraz spesifik aktiviteleri ölçülmüş ve izoenzimlerin oranları belirlenmiştir Her iki izoenzimin molekül ağırlıkları literatür ile uyumlu olarak 60 kda civarında bulunmuştur. Sabit spesifik çoğalma hızında gerçekleştirilen yarı kesikli işletim deneyleri için gösterilen değerlerde iki izoenzimin oranının tüm spesifik çoğalma hızlarında yaklaşık aynı olduğu görülmektedir. Aynı davranış spesifik lipolitik aktivite / 23

37 esteraz aktivitesi oranları için de geçerlidir. Sabit besleme hızında gerçekleştirilen deneylerde lipolitik aktivite / esteraz aktivitesi oranları için elde edilen değerlerin, sabit spesifik çoğalma hızı stratejisi ile elde edilen değerlerden daha düşük olduğu görülmüştür. En yüksek mg protein başına aktivite değerine sabit spesifik çoğalma hızı stratejisi ile ulaşılmıştır. Sanchez et al. (1999) çalışmalarında farklı fermentasyon koşullarında üretilen lipaz izoformlarını, substrat olarak triolein ve tribütirin kullanılan hidroliz reaksiyonlarında gösterdikleri farklı enzimatik aktiviteler ile belirlemişlerdir. Deneyler, karbon kaynağı olarak 2 g/l derişiminde oleik asit, azot kaynağı olarak ise 4 g/l derişiminde (NH 4 ) 2 SO 4 kullanılarak, sabit besleme hızında, 30 ºC de, ph 6.3 de sabit tutularak 5 ve 50 L hacimlerindeki iki fermentörde yarı kesikli işletimlerle gerçekleştirilmiştir. Fermentörlerde elde edilen enzimler sırasıyla UAB ve UAB-1000 olarak adlandırılmıştır. Deneylerde lipolitik aktivite Modifiye Monotest lipaz yöntemi ile belirlenmiştir. Üretilen enzime etanol çöktürmesi, liyofilizasyon ve kromatografik yöntemlerden oluşan bir dizi saflaştırma işlemi de uygulanmıştır. En yüksek lipolitik aktivite ve biyokütle başına lipolitik aktivite değerlerine düşük besleme hızı ile çalışıldığında ulaşılmıştır. UAB-1000 etanol eklenerek çöktürülmüş ve bu işlem sonrasında elde edilen lipolitik aktivite değeri ticari lipazın lipolitik aktivite değeri ile karşılaştırıldığında % 30 civarında daha yüksek verim elde edilmiştir. Lipaz UAB ise laktoz varlığında liyofilize edilmiş ve bu işlem sonrasında elde edilen lipolitik aktivite değeri ticari lipazın lipolitik aktivite değeri ile karşılaştırıldığında % 90 civarında daha yüksek verim elde edilmiştir. Farklı şekillerde üretilen fermentasyon ürünleri anyon değişim kromatografi ile de ayrılmıştır. Tüm kromatogramlarda, lipolitik aktivite gösteren iki final fraksiyonu (F1 ve F2) olduğu görülmüştür. UAB lipaz her iki fraksiyonda da benzer oranda açığa çıkarken, UAB-1000 ikinci fraksiyonda biraz daha baskındır. Ticari lipaz ise F1 de daha baskındır. Lipolitik aktivite göstermeyen proteinlerin büyük bölümü ticari lipazda görülmüştür. Bu da fermentasyonla elde edilen izoenzimlerin oranının ticari lipazdan farklı olduğunu göstermektedir. Ayırmadan sonra elde edilen iki lipaz ve ticari CRL farklı substratlar kullanılarak karakterize edilmiştir. Uzun (triolein) ve kısa (tribütirin) zincir trigliseritler kullanılarak belirlenen enzimatik aktiviteler UAB > CRL (ticari lipaz) > UAB-1000 olarak sıralanmıştır. UAB, triolein kullanılarak belirlenen aktivitede en yüksek değeri göstermiştir (20 U/mg enzim). 24

38 Dominguez de Maria et al. (2005), C. rugosa nın farklı karbon kaynakları ve farklı işletim sistemlerinde üretilmesi ile elde edilen izoenzim profilinin belirlenmesini çalışmışlardır. Bu amaçla deneyler kesikli işletimde, 4 L çalışma hacminde ve 28 ºC de gerçekleştirilmiştir. En az %30 oksijen içeren hava 0.42 L/dk hız ile sisteme gönderilmiş ve karıştırma hızları 240 ve 480 rpm arasında değiştirilmiştir. Deneylerde beş farklı karbon kaynağı kullanılmıştır ve elde edilen enzimler UCM-I (oleik asit), UCM-II (zeytin yağı), UCM-III (ayçiçek yağı), UCM-IV (n-dodekanol) ve UCM-V (gliserol) şeklinde adlandırılmıştır. Ayrıca çalışmada iki ticari C. rugosa lipazı (Sigma ve Roche) ve oleik asitin tek karbon kaynağı olarak kullanıldığı yarı kesikli fermentasyon ile elde edilen UAB-II, UAB-III (düşük oleik asit besleme hızı), UAB-IV (yüksek oleik asit besleme hızı) lipazları da incelenmiştir. Fermentasyondan elde edilen hücre dışı lipaz santrifüj ile hücreden ayrılmış ve kültür sıvısı konsantratör ile deriştirilmiştir. 72 saat süren liyofilizasyondan sonra ham lipaz elde edilmiştir. Fermentasyon sonunda elde edilen ham protein örnekleri, SDS-PAGE ve PVDF membranlar kullanılarak ayrılmıştır. Elektroforez jellerinin görüntü analizleri yapılmış ve N-Terminal dizilimleri belirlenmiştir. Her örnekteki gerçek aktif lipaz derişiminin belirlenmesi için biyokatalitik test olarak enzimatik heptil oleat sentezi gerçekleştirilmiş ve ürünler GC ile analizlenmiştir. Ticari örnekler analizlendiğinde izoenzim profilinde çok az farklılık olduğu görülmüştür. Bitkisel yağların kullanıldığı kesikli proses ile elde edilen örneklerde (UCM-II ve UCM-III) Lip2 ve Lip3 ün benzer oranlarda bulunduğu Lip1 in ise bulunmadığı görülmüştür. Bu nedenle yağın doğal bileşiminin izoenzim profiline etki etmediği düşünülmüştür. UCM-I örneğinin izoenzim profili ile UAB-II ve UAB-III ile elde edilen izoenzim profilinin benzer olduğu görülmüştür. Bu iki örnekte de indükleyici olarak oleik asit kullanılmıştır. UCM-IV örneğinde UAB-IV de olduğu gibi üç izoenzim elde edilmiştir. Tüm koşullarda Lip2 ve Lip3 ün salgılandığı görülmüştür. Lip1 sadece doğal olmayan substratlar kullanıldığında ve yüksek besleme hızı ile oleik asit kullanılan yarı kesikli işletimle elde edilmiştir. İndükleyici olarak n- dodekanolün farklı izoenzimlerin gen düzenine etki ettiği düşünülmektedir. Her liyofilize enzim içindeki biyokatalizör derişimi heptil oleat sentezi başlangıç hızı ölçülerek gösterilmiştir. Ölçülen başlangıç hızlarının, enzim derişimi ile doğru orantılı olduğu -yazarların önceki çalışmalarına dayanarak- kabul edilmiştir. En yüksek 25

39 derişimde lipaz üretimi, oleik asit varlığında yarı kesikli işletimde düşük besleme hızında çalışıldığı durumda elde edilmiştir. Puthli et al. (2005) çalışmalarında, C. rugosa dan lipaz üretiminde oksijen derişiminin ve gaz-sıvı kütle aktarım katsayısının hücre çoğalması ve lipaz üretimine etkisini incelemişlerdir. Fermentasyon, 2 L çalışma hacminde üç bıçaklı karıştırıcılı bir biyoreaktörde, 600 rpm karıştırma hızında ve farklı havalandırma hızlarında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada karbon kaynağı olarak 1 ml/l (%0.1) zeytin yağı kullanılmıştır. Lipaz aktivitesi substrat olarak zeytin yağının kullanıldığı titrimetrik yöntem ile belirlenmiştir. Proteaz aktivitesi ise kazeinin substrat olarak kullanıldığı yöntemle ölçülmüştür. Fermentasyon prosesini iyi anlamak ve fermentasyon sonucunda proses değişenlerinin etkisini analizleyebilmek için deneysel veriler Monod kinetiği ve Luedking Piret modeline uydurulmuştur. Gaz akış hızı cm 3 /s arasında değiştirilerek deneyler gerçekleştirilmiş ve en yüksek hücre derişimi (5.82 mg/ml) ve lipaz aktivitesi (1.84 U/ml) cm 3 /s gaz akış hızında elde edilmiştir. Ayrıca ortamda üstel fazın sonuna doğru proteaz enziminin ortaya çıktığı ve lipaz aktivitesine önemli bir etkisi olduğu görülmüştür. Yüksek oksijen derişiminin lipaz üretimini azalttığı gözlenmiş ve en uygun oksijen derişimin 2-3 mg/l olduğu bulunmuştur. 26

40 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmada lipaz üretimi için ticari olarak sağlanan ve bir maya türü olan Candida rugosa (DSMZ 2031) kullanılmıştır. Deneylerde kullanılan kimyasal ve biyokimyasal maddeler EK 1 de verilmiştir Yöntem Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamları Candida rugosa dan lipaz üretimi, mikroorganizmanın katı ortamda çoğaltılmasının ardından ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki farklı sistemde gerçekleştirilmiştir Katı çoğalma ortamı Mikroorganizmanın uzun süre saklanabilmesi için agar içeren katı besi ortamları kullanılmaktadır. Çalışmada bu amaçla, Candida rugosa nın çoğalması için uygun olan UY ortamı (Universal Yeast Medium) kullanılmıştır. UY ortamı; 5 g/l pepton (soybean), 3 g/l maya özütü, 3 g/l malt özütü, 10 g/l dekstroz, 15 g/l agardan oluşmaktadır. Hazırlanan UY ortamı 121 C de 20 dakika süreyle otoklavda (ALP CL- 40M Sterilizatör) sterillendikten sonra tüplere dökülmüş ve tüpler eğik konuma getirilerek oda sıcaklığında agarın donması beklenmiştir. Daha sonra mikroorganizma, öze yardımıyla stok agar ortamından alınarak laminer akış kabinde (BIOLAB Faster BHG 2004) steril koşullarda taze agar ortamına aktarılmış ve 30 C de 22 saat süreyle inkübe edilmiştir (Shel Lab S16R-2). 27

41 Ön çoğalma ortamı Ön çoğalma ortamı, mikroorganizmanın lipaz üretim ortamına aktarılmadan önce daha fazla çoğaltılması için kullanılan ortamdır. Çalışmada, ölçek büyütmeli sistemde gerçekleştirilen deneylerde ön çoğalma ortamı olarak agar içermeyen UY ortamı kullanılmıştır. Mikroorganizma ön çoğalma ortamında, 30 C de 150 rpm de 22 saat süreyle inkübe edilmiştir (SHELLAB SI6/SI6R). 10 ml lik ön çoğalma ortamında çoğalmış olan hücreler, steril koşullarda 1/10 aşılama oranı ile lipaz üretim ortamına aktarılmıştır Lipaz üretim ortamı Lipaz üretim ortamında mikroorganizma çoğalırken aynı zamanda lipaz enzimlerini üretmektedir. Lipaz üretimi için kullanılan temel ortamda 15 g/l KH 2 PO 4, 5.5 g/l K 2 HPO 4, 1 g/l MgSO 4.7H 2 O, 10 mg/l FeCl 3.6H 2 O ve 10 ml/l vitamin çözeltisi vardır. Vitamin çözeltisi, 1 L damıtık su içinde; 400 mg tiyamin, 2 mg biyotin ve 2 g inositol içermektedir. Lipaz üretim ortamında ayrıca, türü ve derişimi parametre olarak incelenen karbon ve azot kaynakları bulunmaktadır. Lipaz üretim ortamı sterilizatörde (ALP CL-40) sterillenmiş; vitamin çözeltisi ise 0.45 µm filtreden (Milipore Millex-HV Hydrophilic PVDF 0.45 µm) geçirilerek steril ortama eklenmiştir. Ortamın ph sı sterilizasyon öncesinde 6.2 dir. Lipaz üretim sıcaklığı ise sıcaklığın parametre olduğu deneyler dışında 30 ± 0.1 o C dır Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemler C.rugosa dan lipaz üretimi, ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki farklı sistem ile incelenmiştir. Ölçek büyütmeli sistem, mikroorganizmanın ön çoğalma ortamında çoğaldıktan sonra lipaz üretim ortamına aktarıldığı sistemdir. Ön çoğalma ortamında da önemli ölçüde enzim aktivitesi belirlendiği için toplam üretim süresi ön çoğalma ortamında ve lipaz üretim ortamında geçen sürelerin toplamı olarak kabul edilmiştir. Ölçek büyütmesiz sistem ise; mikroorganizmanın katı agar ortamından doğrudan enzim üretim ortamına aktarıldığı sistemdir. 28

42 3.2.2 Hücre parçalanması Mikroorganizmanın hücre dışına salgılamayıp içinde tuttuğu enzim aktivitesinin belirlenmesi için hücre duvarının parçalanması gerekmektedir. Hücre duvarı; fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerle parçalanabilmektedir. Çalışmada mayalar için uygun olan fiziksel parçalama yöntemlerinden cam boncuklar yardımıyla parçalama yöntemi uygulanmıştır. Parçalanmanın tam olarak gerçekleşip gerçekleşmediğini anlamak amacıyla parçalama sonrası hücreler mikroskop altında incelenmiştir (OLYMPUS CX21FS1). Parçalama işlemi öncesinde +4ºC de rpm de (12000 x g) 10 dakika santrifüjlenerek (Hettich Rotina 35R) lipaz üretim ortamından ayrılan hücreler, 1 ml 10 mm ph 8 Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkanmıştır. İkinci yıkamadan sonra hücre 1.5 ml Tris-HCl tamponunda çözülmüş ve parçalayıcı cihaza ait konik dipli tüplere alınarak tüp dolana kadar cam boncuk ilave edilmiştir. Hücre rpm de çalıştırılan cihazda 30 s lik 8 periyotta parçalanmıştır. Her periyot arasında tüpler, parçalama sırasında açığa çıkan ısının enzimin aktivitesini düşürmesini önlemek için buzda bekletilmiştir. Parçalanan hücreler, +4ºC de rpm de (12000 x g) 10 dakika santrifüjlenerek çöktürülmüş ve enzim aktivitelerinin ölçüleceği üst faz hücre kalıntılarından arınması için 0.45 µm filtreden (Milipore Millex-HV Hydrophilic PVDF 0.45 µm) geçirilmiştir Biyoreaktörde üretim Candida rugosa dan lipaz ve esteraz üretimi için Sartorius Biostat B Plus V= 2 L hacimli biyoreaktör kullanılmıştır. Soğutma suyu, sıcaklığı 15ºC ye ayarlanan (Polyscience) soğutmalı sirkülatör ile sağlanmıştır. Biyoreaktörün sterilizasyonundan önce ph kalibrasyonu ph=7 ve ph=4 tamponları ile yapılmıştır. ph elektrodu kalibrasyonu yapıldıktan ve enzim üretim ortamı biyoreaktöre konulduktan sonra biyoreaktörün tüm girişleri kapatılarak otoklavda 121 C de 20 dakika süreyle (ALP CL-40M Sterilizatör) sterillenmiştir. Sterilizasyondan sonra ortam sıcaklığı 30 C ye ayarlanmış ve O 2 elektrodunun kalibrasyonu, N 2 ve O 2 gazları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 29

43 Biyoreaktör için gerekli hazırlıklar yapıldıktan sonra 100 ml ön çoğalma ortamında çoğaltılan mikroorganizmalar, 1 L çalışma hacmindeki biyoreaktöre steril koşullarda aktarılmış ve üretim başlatılmıştır (t=0). Köpük giderici olarak %1 lik (h/h) Antifoam 204 (Sigma) kullanılmıştır. Enzim üretimi T=30 C de, N= 500 rpm karıştırma hızında ve 0.6 vvm havalandırma hızında gerçekleştirilmiştir. Biyoproses süresince ph kontrol edilmemiştir SDS-PAGE analizi Karbon kaynaklarının C. rugosa nın ürettiği enzimlerin molekül ağırlığına etkisini belirlemek amacıyla SDS-PAGE analizleri yapılmıştır. Bu amaçla, üretimlerin maksimum noktalarında ortamlardan alınan örneklerin hücreleri +4ºC de rpm de (12000 x g) çöktürülmüş ve sıvı kısım 0.45 µm filtreden geçirilmiştir. Daha sonra 35 dk 5000 x g de ultrafiltre edilen (Amicon Ultra-15) örneklerdeki proteinler TCA ile çöktürülmüştür. TCA ile protein çöktürülmesi Örnek üzerine % 10 hacminde %100 TCA eklenmiş ve 15 dk boyunca buz banyosunda bekletilmiştir. 10 dk rpm de santrifüjlenerek (Beckman Coulter Microfuge 18), üst faz atılmış, pellet 200 µl hacminde %25 lik soğuk aseton ile yıkanarak yeniden 10 dk boyunca rpm de çöktürülmüştür. Jelin koşturulması Elde edilen pellet halindeki proteinler uygun miktarlardaki yükleme tamponu (Fermentas) ve indirgeme reaktifi (Fermantas) eklenerek 90ºC de 5 dk boyunca inkübe edilmiştir. Primer yapılarına indirgenen proteinler %10 luk SDS jel kuyularına 20 şer µl hacminde yüklenerek mini jel elektroforez sisteminde (Mini Protean 3Cell # ) molekül ağırlıklarına göre ayrılmaları sağlanmıştır. Ayırma işlemi sırasında 50 V dan başlanarak voltaj kademeli olarak 125 V a kadar artırılmış, boya jelin sonuna 30

44 ulaştığında analiz sonlandırılmıştır. Daha sonra jel, gümüş boyama ile protein bantları görünür hale getirilmiş ve jel görüntülenmiştir (Syngene Genius Bioimaging Systems). 3.3 Analizler Çalışmada, hücre dışı ve hücre içi lipaz, esteraz ve proteaz enzim aktiviteleri ile hücre derişimi tayin edilmiştir. Enzim aktiviteleri için; lipaz üretim ortamından alınan örnek rpm de (12000 x g) +4 ºC de 10 dk süreyle santrifüjlenerek hücreler çöktürülmüş ve üst faz hücre dışı enzim aktivitesi tayininde, alt faz ise hücreler parçalandıktan sonra hücre içi enzim aktivitesi tayininde kullanılmıştır Lipaz aktivitesi tayini Lipaz aktivitesi, zeytinyağının substrat olarak kullanıldığı titrimetrik yöntem ile belirlenmiştir. Yöntemde, 2.5 ml 0.1 M ph 7.2 fosfat tamponu, 500 µl zeytin yağı ve 100 µl hücresi çöktürülmüş lipaz üretim ortamı bir balona konularak 37 C de su banyosunda 30 dakika karıştırılmıştır. Bu süre sonunda 2.5 ml etanol:aseton karışımı (1:1) eklenerek tepkime sonlandırılmış ve karışıma indikatör olarak 2 damla fenolftalein eklenerek 0.1 N NaOH ile titre edilmiştir. Enzim aktivitesi harcanan NaOH miktarından yararlanılarak hesaplanmıştır. 1 Ünite (U) lipaz aktivitesi, bir dakikada 1µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Wei et al. 2004). Lipaz aktivite tayini için örnek hesaplama EK 2 de verilmiştir Esteraz aktivtesi tayini Esteraz aktivitesi tayini için p-nitrofenil asetatın (PNFA) enzimatik hidrolizi sonucu oluşan p-nitrofenolün (PNF) üretim hızının temel alındığı spektrofotometrik yöntem kullanılmıştır. Hidroliz tepkimesi, hücresi çöktürülmüş lipaz üretim ortamından 375 µl alınarak 1125 µl 4 mm PNFA çözeltisi (% 80 ph 7, 50 mm potasyum fosfat tamponu ve % 20 asetonitril ile hazırlanmış) ile oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Substrat eklendikten hemen sonra, 348 nm de t=0 ve t=6 dakikalardaki absorbans değerleri arasındaki fark alınarak aktivite hesaplanmıştır. 1 Ünite (U) esteraz aktivitesi, 1 31

45 dakikada 1 µmol PNF açığa çıkmasını sağlayan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Dalmau et al. 2000). Esteraz aktivite tayini için örnek hesaplama EK 3 de verilmiştir Proteaz aktivitesi tayini Proteaz aktivitesi, kazeinin enzimatik hüdrolizi sonucu açığa çıkan hidrolizat absorbanslarının spektrofotometrik olarak ölçülmesi temeline dayanmaktadır. 2 ml ph 10 borat tamponunda hazırlanmış % 0.5 (a/h) kazein + % (a/h) EDTA karışımı ile 1 ml hücresi çöktürülmüş lipaz üretim ortamı, 37 C ve 100 rpm karıştırma hızında çalkalamalı hava banyosunda karıştırılarak tepkime gerçekleştirilmiştir. 20 dakika sonunda 2 ml % 10 (a/h) TCA ile tepkime durdurulmuş ve 15 dakika tuz-buz banyosunda bekletilmiştir. Ardından karışım +4 C de rpm de (12000 g) 10 dakika santrifüjlenmiş ve üst faz alınarak 275 nm dalga boyunda absorbans okunmuştur. Bu yöntemle 1 Ünite (U) proteaz aktivitesi, 1 dakikada 4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Takaç vd 2000). Çalışmada kullanılan kalibrasyon grafiği ve örnek aktivite hesabı EK 4 de verilmiştir Hücre derişimi Hücre derişimleri kuru hücre ağırlığı olarak belirlenmiştir. Bu amaçla üretim ortamından 5 ml örnek alınarak 0.45 µm filtreden (Milipore Millex-HV Hydrophilic PVDF 0.45 µm) geçirilerek süzülmüştür. Daha sonra filtre, önce 5 ml propiyonik asit : dioksan (1:1) karışımı, ardından da 20 ml saf su ile yıkanmıştır ve 85 ºC de 24 saate süre ile kurutulmuştur. Kurutulan filtreler tartılıp boş filtre ağırlığı çıkarıldıktan sonra kuru hücre miktarları ve derişimleri hesaplanmıştır Bitkisel yağ analizleri Ticari olarak sağlanan bitkisel yağların yağ asidi bileşimleri gaz kromatografi cihazı kullanılarak belirlenmiştir. Analiz sonuçları EK 5 de verilmiştir. Bitkisel yağ analizleri Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü nde yapılmıştır. 32

46 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Üretim ortamında bulunan karbon kaynakları, azot kaynakları, ortam sıcaklığı ve oksijen aktarımı gibi parametreler Candida rugosa dan üretilen lipaz ve esteraz enzimlerinin aktivitelerini ve dağılımlarını etkilemektedir. Bu çalışmada, yukarıda sözü edilen her bir parametrenin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktiviteleri üzerine etkileri incelenerek, üretimlerindeki uygun koşullar belirlenmiştir. 4.1 Karbon Kaynakları Etkisi Üretim ortamına eklenen karbon kaynakları lipaz üretimi için en önemli parametredir. Bu amaçla oleik asit, palmitik asit, stearik asit gibi yağ asitleri; yağ asidi esteri olarak triolein; zeytin yağı, susam yağı, fındık yağı, soya yağı, keten yağı gibi bitkisel yağlar; ve glukoz karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Yüksek lipaz aktivitesinin gözlendiği trioleinin farklı derişimlerinin de lipaz aktivitesine etkisi incelenmiştir. Karbon kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisinin incelendiği deneyler T=30ºC sıcaklıkta, N=150 rpm karıştırma hızında, azot kaynağı olarak 4 g/l derişiminde üre kullanılarak, 100 ml çalışma hacminde gerçekleştirilmiştir. Deneylerde üretim ortamından belirli saatlerde 3 er ml örnek alınarak hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktiviteleri ile deneylerin son saatlerindeki hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri belirlenmiştir Triolein etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde trioleinin (C18:1) karbon kaynağı olarak farklı derişimlerinin, hücre derişimi ile hücre dışı ve hücre içi enzim aktiviteleri üzerine etkisi ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki ayrı sistemde incelenmiştir. Ölçek büyütmeli sistem Ölçek büyütmeli sistemde 2, 3 ve 5 g/l başlangıç derişimlerindeki trioleinin hücre derişimine etkisi Şekil 4.1 de; hücre dışı lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi 33

47 Şekil 4.2 de; hücre içi lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi ise Şekil 4.3 de gösterilmiştir. Hücre derişimi incelenen tüm triolein derişimlerinde zamanla artarak sabit kalmış; en yüksek hücre derişimine 5 g/l triolein derişimi varlığında toplam 62. saatte 3.57 mg/ml olarak ulaşılmıştır (Şekil 4.1). Hücre dışı lipaz aktiviteleri de hücre çoğalmasına paralel olarak zamanla artmış; ancak sonra azalmıştır. Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi 2 g/l derişiminde triolein varlığında toplam 50. saatte U/ml (6.41 U/mg kh) olarak; en yüksek esteraz aktivitesi ise 2 g/l triolein derişiminde 62. saatte U/ml (1.19x10-3 U/mg kh) olarak elde edilmiştir (Şekil 4.2). Trioleinin başlangıç derişiminin artması ile hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri azalmaktadır. 5 g/l triolein derişiminde ise hücre dışında esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Hücre içinde en yüksek lipaz aktivitesi tüm triolein derişimlerinde ön çoğalma ortamından üretim ortamına geçildiği 22. saatte ölçülmüştür (Şekil 4.3). En yüksek hücre içi lipaz aktivitesi 2 g/l triolein derişiminde 7.25 U/mg kh değerindedir. Hücre içi lipaz aktivitesi, lipaz üretim ortamında zamanla azalmıştır; bu da hücre dışı lipaz aktivitesinin zamanla artmasına karşılık gelmektedir. Hücre içinde 2 g/l triolein derişimi için esteraz aktivitesi ise hücre içi lipaz aktivitesinin azalmaya başlamasından sonra görülmektedir (Şekil 4.3). 3 g/l triolein derişiminde ise esteraz aktivitesi deneyin ilk saatlerinden itibaren gözlenmiştir. En yüksek hücre içi esteraz aktivitesi 2 ve 3 g/l triolein varlığında 5.5x10-4 U/mg kh olarak sırasıyla toplam 50 ve 22. saatlerde elde edilmiştir. 5 g/l triolein derişiminde hücre içinde de esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Gerçekleştirilen üretimlerde lipaz ve esteraz aktivitelerinin azalmasının bir nedeninin ortamda proteaz enziminin varlığı olabileceği düşünülmüş ve deneylerin son saatlerinde hücre içi ve hücre dışı proteaz aktiviteleri ölçülmüştür. Proteaz aktiviteleri hücre dışında en yüksek 3.24 U/ml olarak 5 g/l triolein derişiminde görülürken, hücre içinde 1.39 U/mg kh olarak 2 g/l triolein derişiminde görülmüştür. Hücre içi proteaz aktiviteleri, hücre dışı değerlerden büyüktür (Çizelge 4.1). 34

48 hücre derişimi, mg/ml Ön çoğalma ortamı Üretim ortamı zaman, st 2 g/l 3 g/l 5 g/l Şekil 4.1 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre derişimine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) L-2 g/l L-3 g/l L-5 g/l E-2 g/l E-3 g/l h.d. lipaz aktivitesi, U/ml Ön çoğalma ortamı Üretim ortamı zaman, st 0,0040 0,0035 0,0030 0,0025 0,0020 0,0015 0,0010 0,0005 0,0000 h.d. esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.2 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 35

49 L-2 g/l L-3 g/l L-5 g/l E-2 g/l E-3 g/l h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh Ön çoğalma ortamı Üretim ortamı zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.3 Ölçek büyütmeli sistemde triolein derişiminin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Çizelge 4.1 Ölçek büyütmeli sistemde triolein varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Triolein derişimi (C S0,g/L) Hücre dışı Proteaz aktivitesi (U/ml, U/mg kh) Hücre içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) ; ; Ölçek büyütmesiz sistem Ölçek büyütmesiz sistemde 2, 3 ve 5 g/l başlangıç derişimlerindeki trioleinin hücre derişimine etkisi Şekil 4.4 de; hücre dışı enzim aktivitelerine etkisi Şekil 4.5 de; hücre içi enzim aktivitelerine etkisi ise Şekil 4.6 da gösterilmiştir. 36

50 İncelenen tüm triolein derişimleri için hücre derişimi zamanla önce artmakta; sonra yaklaşık sabit kalmaktadır (Şekil 4.4). En yüksek hücre derişimi 3.13 mg/ml olarak 5 g/l triolein derişiminde elde edilmiştir. Hücre dışı lipaz aktiviteleri, bütün triolein derişimleri için önce zamanla artmış, bir süre sabit kaldıktan sonra azalmıştır (Şekil 4.5). Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi U/ml (11.5 U/mg kh) olarak 31. saatte 2 g/l triolein derişiminde ve 46. saatte 3 g/l triolein derişiminde elde edilmiştir. Hücre dışı esteraz aktiviteleri, lipaz aktivitelerinin düşmeye başlamasıyla görülmüş ve en yüksek hücre dışı esteraz aktivitesi U/ml ( U/mg kh) olarak 56. saatte 2 g/l triolein derişiminde elde edilmiştir (Şekil 4.5). Hücre içi lipaz aktivitesi üretimin hemen başlarında düşmeye başlamış ve en yüksek hücre içi lipaz aktivitesi U/mg kh olarak 3 g/l triolein derişiminde elde edilmiştir (Şekil 4.6). Hücre içinde lipaz aktivitesi düştükten sonra esteraz aktivitesi gözlenmeye başlanmıştır. En yüksek hücre içi esteraz aktivitesi U/mg kh olarak 3 g/l triolein derişiminde ölçülmüştür. Üretim sonunda ölçülen proteaz aktiviteleri ise hücre dışında en yüksek 5.5 U/ml olarak 2 g/l triolein derişiminde ölçülürken, hücre içinde U/mg kh olarak 5 g/l triolein derişiminde ölçülmüştür (Çizelge 4.2). 37

51 2 g/l 3 g/l 5 g/l 3.5 hücre derişimi, mg/ml zaman, st Şekil 4.4 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre derişimine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) L-2 g/l L-3 g/l L-5 g/l E-2 g/l E-3 g/l E-5 g/l h.d.lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st h.d.esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.5 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 38

52 L-2 g/l L-3 g/l L-5 g/l E-2 g/l E-3 g/l E-5 g/l h.i.lipaz aktivitesi, U/mg kh h.i.esteraz aktivitesi, U/mg kh zaman, st Şekil 4.6 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein derişiminin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Çizelge 4.2 Ölçek büyütmesiz sistemde triolein varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Triolein derişimi (Cs 0, g/l) H. dışı Proteaz aktivitesi (U/ml;U/mg kh) H. içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) ; ; 0, ; 0,

53 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin karşılaştırılması Farklı triolein başlangıç derişimlerinde ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde gerçekleştirilen deneylerde en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesine 2 g/l triolein derişiminde U/ml olarak ulaşılmıştır. En yüksek esteraz aktivitesi ölçek büyütmeli sistemde 2 g/l triolein derişimi ile U/ml olarak elde edilmiştir. Deney verileri; maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.2 de karşılaştırılmıştır. Lipaz için en yüksek spesifik verimlilik 0.37 U/mg kh/st olarak; esteraz için ise 2.8x10-5 U/mg kh/st olarak ölçek büyütmesiz sistemde 2 g/l başlangıç triolein derişiminde elde edilmiştir. En yüksek lipaz verimliliği 0.53 U/ml/st olarak 2 ve 5 g/l triolein derişimlerinde ölçek büyütmesiz sistemde elde edilmiştir. Ancak 2 g/l triolein derişiminde elde edilen esteraz verimliliği daha yüksek olduğundan bu derişimin hem lipaz hem de esteraz üretimi için daha iyi olduğu düşünülmüştür. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, lipaz verimi 2g/L triolein derişiminde ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin ikisinde de aynı değerdedir (8.33 U/mg). En yüksek esteraz verimi 1.7x10-3 U/mg olarak 2 g/l triolein derişiminde ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir. En yüksek hücre verimi ise 1.45 mg/mg olarak ölçek büyütmeli sistemde 2 g/l triolein derişiminde elde edilmiştir. Sonuç olarak aktivite, verimlilik ve verimler açısından bir değerlendirme yapılırsa ölçek büyütmesiz sistemde 2 g/l triolein derişiminin hem lipaz hem de esteraz üretimi için uygun olduğu görülmektedir. Ancak ölçek büyütmeli sistemde 2 g/l triolein derişimi ile de yüksek esteraz verimliliği ile verimine ve yüksek hücre verimine ulaşılabileceği de göz önüne alınmalıdır. Ölçek büyütmeli sistemde, ön çoğalma ortamında önemli sayılabilecek bir değerde lipaz aktivitesi gözlenmesi (Şekil 4.2) C. rugosa nın ortamda yağ asidi veya esteri gibi indükleyici olmadan da lipaz üretebildiğini göstermektedir. Buna karşın, lipaz üretim ortamı olarak da ön çoğalma ortamı bileşimi kullanılarak yapılan kontrol deneyinde, hücrelerin bu ortamda lipaz üretimine kısa bir süre daha devam ettiği, ancak ulaşılan lipaz aktivitesinin oldukça düşük olduğu görülmüştür. Bu sonuç, C. rugosa dan lipaz üretiminde bir indükleyicinin gerekliliğini ortaya koymaktadır. 40

54 Literatürde triolein kullanılarak kesikli, sürekli ve yarı kesikli sistemlerde C. rugosa dan lipaz üretimine yönelik çalışmalar bulunmaktadır. Ancak burada, sadece kesikli sistemde gerçekleştirilen çalışmalar ile karşılaştırma yapılmıştır. Dalmau et al. (2000) tarafından gerçekleştirilen çalışmada C. rugosa nın çoğalması ve lipaz salgılamasında farklı karbon kaynaklarının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla 2 g/l triolein derişimi ile gerçekleştirilen deneyde hücre derişimi 1.61 g/l, hücre dışı lipaz aktivitesi 0.3 U/ml, hücre dışı esteraz aktivitesi ise U/ml olarak bulunmuştur. Hücre içi lipaz aktivitesi ise 72 U/g hücre olarak elde edilmiştir. Yağ asidi esterlerinin Candida rugosa dan lipaz üretimine etkisinin incelendiği bir diğer çalışmada ise en yüksek lipaz aktivitesi triolein ile elde edilmiştir 10 g/l triolein kullanılarak gerçekleştirilen deneyde hücre derişimi mg/ml, hücre dışı lipaz aktivitesi U/ml, hücre içi lipaz aktivitesi ise 44.1 U/g hücre olarak elde edilmiştir (Wei et al. 2004). Literatürde triolein kullanılarak ölçek büyütmeli ve büyütmesiz sistemlerde C. rugosa da enzim üretimini inceleyen ve karşılaştıran bir çalışma yoktur. Ayrıca triolein ile hücre dışı ve hücre içi enzimlerin aktivite dağılımını veren bir yayına da rastlanmamıştır. 41

55 Çizelge 4.3 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde farklı başlangıç triolein derişimlerinde elde edilen maksimum spesifik verimlilik, verimlilik ve verimler (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Başlangıç triolein derişimi (C S0, g/l) Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz ÖLÇEK BÜYÜTMELİ SİSTEM Maks Maks Maks lipaz esteraz hücre verimi verimi verimi Y L/So Y E/So Y X/So (U/mg) (U/mg) (mg/mg) x x x x x x ÖLÇEK BÜYÜTMESİZ SİSTEM x x x x x x x x x

56 4.1.2 Oleik asit etkisi Candida. rugosa dan lipaz üretiminde 3 g/l oleik asit (C18:1) derişiminin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktiviteleri üzerine etkisi ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde ayrı ayrı incelenmiştir. Ölçek büyütmeli sistem 3 g/l derişiminde oleik asit kullanılarak ölçek büyütmeli sistemde gerçekleştirilen deneyde en yüksek hücre derişimi toplam 50. saatte 1.83 mg/ml olarak elde edilmiştir. Deney süresince hücre derişiminin önce arttığı, daha sonra yaklaşık sabit kaldığı görülmüştür (Şekil 4.7). En yüksek hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri sırasıyla 46. saatte U/ml (10.04 U/mg kh) ve 80. saatte U/ml (0.015 U/mg kh) olarak elde edilmiştir (Şekil 4.7). Lipaz aktivitesi hücre derişimi ile önce paralel olarak artmakta; ancak daha sonra azalıp sabit kalmaktadır. Esteraz aktivitesinin ise lipaz aktivitesinin azalmaya başlamasıyla arttığı gözlenmiştir. Hücre içinde elde edilen en yüksek lipaz aktivitesi 22. saatte 10 U/mg kh dir (Şekil 4.7). Hücre içinde ilk saatlerde artış gösteren lipaz aktivitesinin, hücre dışı lipaz aktivitesinin artmaya başlamasıyla azaldığı görülmüştür. Deney süresince hücre içinde esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Deneyin son saatinde ölçülen hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri Çizelge 4.4 de verilmiştir. Hücre dışında 2.67 U/ml (1.60 U/mg kh), hücre içinde 4.97 U/mg kh proteaz aktivitesi gözlenmiştir. 43

57 hücre derişimi h.içi lipaz aktivitesi h.dışı lipaz aktivitesi h. dışı esteraz aktivitesi hücre derişim i, m g/m l h.d. ve h.i. lipaz aktivitesi, U/m l Ön çoğalma ortamı Üretim ortamı h.d. esteraz aktivitesi, U/m l zaman, st Şekil 4.7 Ölçek büyütmeli sistemde 3 g/l oleik asit derişiminin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Ölçek büyütmesiz sistem 3 g/l derişiminde oleik asit ile gerçekleştirilen deneyde en yüksek hücre derişimi 1.43 mg/ml olarak 25. saatte elde edilmiştir. Lipaz aktivitesinin önce hücre derişimine paralel olarak zamanla arttığı, ancak daha sonra azaldığı belirlenmiştir (Şekil 4.8). Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi 25. saatte U/ml (11.65 U/mg kh) olarak elde edilmiştir. Hücre dışında esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Hücre içinde elde edilen en yüksek lipaz aktivitesi 8. saatte 7.72 U/mg kh dir. Hücre içi lipaz aktivitesinin deneyin başlarında arttığı ancak hücre dışında lipaz aktivitesinin artmasıyla birlikte azaldığı görülmüştür (Şekil 4.8). Deneyin son saatinde yapılan proteaz aktivitesi analizinde ise hücre dışında aktivite 4.86 U/ml olarak gözlenirken hücre içinde 0.67 U/mg kh proteaz aktivitesi gözlenmiştir (Çizelge 4.4). 44

58 Çizelge 4.4 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde 3 g/l oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Sistem H. dışı proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H. içi proteaz aktivitesi (U/mg kh) Ölçek büyütmeli 2.67; Ölçek büyütmesiz 4.86; hücre derişimi h.dışı lipaz aktivitesi h.içi lipaz aktivitesi hücre derişimi, mg/ml h. i. ve h. D. lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st Şekil 4.8 Ölçek büyütmesiz sistemde 3 g/l başlangıç oleik asit derişiminin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin karşılaştırılması 3 g/l oleik ait kullanılarak ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde gerçekleştirilen deneylerde ulaşılan en yüksek hücre dışı lipaz aktiviteleri aynıdır (16.67 U/ml). En yüksek hücre dışı esteraz aktivitesi U/ml olarak ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir; ölçek büyütmesiz sistemde ise hücre dışında esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. En yüksek aktivite değerlerine ulaşılan toplam süreler de göz önüne alındığı zaman sistemler arasında farklılıklar daha iyi görülmektedir. Ölçek büyütmeli 45

59 ve ölçek büyütmesiz sistemler, hücre dışı maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.5 de karşılaştırılmıştır. Lipaz enzimi için en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik ve verimlilik sırasıyla 0.46 U/mg kh/st ve 0.66 U/ml/st olarak ölçek büyütmesiz sistemde elde edilmiştir. Esteraz için ise en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik ve verimlilik sırasıyla 1.86x10-4 U/mg kh/st ve 3.08x10-4 U/ml/st dir ve ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, lipaz verimi ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin ikisinde de aynı değerdedir (5.55 U/mg). En yüksek esteraz verimi 8.23x10-3 U/mg olarak; en yüksek hücre verimi ise 0.61 mg/mg olarak ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir. Sonuç olarak aktivite, verimlilik ve verimler açısından bir değerlendirme yapılarak ölçek büyütmesiz sistemin lipaz üretimi için uygun olduğu ve esteraz üretiminde ölçek büyütmeli sistemin kullanımının uygun olduğu düşünülmüştür. Literatürde oleik asit kullanılarak kesikli, sürekli ve yarı kesikli sistemlerde C. rugosa dan lipaz üretimine yönelik çalışmalar bulunmaktadır. Burada sadece kesikli sistemde gerçekleştirilen çalışmalar ile karşılaştırma yapılmıştır. Obradors et al. (1993) C. rugosa dan lipaz üretiminde farklı yağ asitlerinin etkisini incelemişlerdir. 0.5, 1 ve 2 g/l oleik asit derişimleri ile gerçekleştirilen deneylerde en yüksek hücre derişimi ve lipaz aktivitesine 2 g/l oleik asit derişimi ile ulaşılmıştır (2.05 g/l ve 8 U/ml). Dalmau et al. (2000) tarafından gerçekleştirilen çalışmada, C. rugosa nın çoğalması ve lipaz salgılamasında farklı karbon kaynaklarının etkisi incelenmiştir. 2 g/l oleik asit ile gerçekleştirilen deneyde hücre derişimi 1.55 g/l, hücre dışı lipaz aktivitesi 0.4 U/ml, hücre içi lipaz aktivitesi 25 U/g hücre ve hücre dışı esteraz aktivitesi U/ml olarak elde edilmiştir. Yağ asitlerinin karbon kaynağı olarak kullanıldığı başka bir çalışmada ise diğer çalışmalarda olduğu gibi uzun zincirli yağ asitlerinde yüksek lipaz aktivitesi gözlenmiştir (Wei et al. 2004). 10 g/l oleik asit ile gerçekleştirilen deneyde hücre derişimi g/l, hücre dışı lipaz aktivitesi U/ml ve hücre içi lipaz aktivitesi ise 31.2 U/g hücre olarak elde edilmiştir. Oleik asitin % 0.5 derişimde kullanıldığı bir çalışmada ise hücre derişimi 219x10 6 hücre/ml, lipaz 46

60 aktivitesi U/10 6 hücre, esteraz aktivitesi ise 0.56 U/10 6 hücre olarak elde edilmiştir (Alcantara et al. 2004). Literatürde oleik asitin kullanılarak ölçek büyütmeli ve büyütmesiz sistemlerde C. rugosa da enzim üretimini inceleyen ve karşılaştıran bir çalışma yoktur. Ayrıca oleik asit ile hücre dışı ve hücre içi enzimlerin aktivite dağılımını veren bir yayına da rastlanmamıştır. 47

61 Çizelge 4.5 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde 3 g/l başlangıç oleik asit derişimi ile elde edilen maksimum spesifik verimlilik, verimlilik ve verimler (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Maksimum hücre dışı Maksimum hücre dışı Maks Maks esteraz Maks Sistem spesifik verimlilik verimlilik lipaz verimi verimi hücre verimi (U/mg kh/st) (U/ml/st) Y L/So (U/mg) Y E/So (U/mg) Y X/So (mg/mg) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Ölçek büyütmeli x x x Ölçek büyütmesiz

62 4.1.3 Glukoz ve glukoz + oleik asit etkisi C. rugosa dan lipaz üretiminde glukozun tek ve oleik asit ile birlikte karbon kaynağı olarak kullanılmasının, hücre derişimi ile hücre dışı ve hücre içi enzim aktiviteleri üzerine etkisi ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki ayrı sistemde incelenmiştir. Ölçek büyütmeli sistem Glukoz (3 g/l) ve glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) kullanılarak ölçek büyütmeli sistemde gerçekleştirilen üretimlerde ulaşılan hücre derişimleri çok farklı olmamasına karşın, en yüksek değer toplam 50. saatte 1.15 mg/ml olarak glukoz + oleik asit varlığında elde edilmiştir (Şekil 4.9). Glukoz varlığında bu değerler 50. saatte 1.13 mg/ml dir. Deneyler süresince hücre derişiminin önce zamanla arttığı, daha sonra sabit kaldığı görülmüştür. Her iki ortamda da lipaz ve esteraz aktiviteleri hücre derişimi ve birbirleri ile paralel olarak önce zamanla artmakta; daha sonra azalmaktadır (Şekil 4.10). Hücre dışı enzim aktiviteleri glukoz varlığında, glukoz + oleik asit ile yapılan üretime göre daha erken azalmaya başlamıştır. En yüksek hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri sırasıyla 50. saatte 8.33 U/ml (7.24 U/mg kh) ve 0.03 U/ml (0.026 U/mg kh) olarak glukoz + oleik asit varlığında elde edilmiştir. Glukoz varlığında ulaşılan en yüksek hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri ise sırasıyla 26. saatte 6.67 U/ml (7.75 U/mg kh) ve 32. saate U/ml ( U/mg kh) dir. Hücre içinde elde edilen en yüksek lipaz aktivitesi glukoz ile 22. saatte U/mg kh, glukoz+oleik asit ile 22. saatte U/mg kh olarak elde edilmiştir (Şekil 4.11). Hücre içinde en yüksek esteraz aktivitesi ise 9.05x10-4 olarak 50. saatte 3 g/l glukoz varlığında elde edilmiştir. Glukoz + oleik asit ile bu değer 50. saatte 9.05x10-4 U/mg kh olarak elde edilmiştir. Hücre içinde ilk saatlerde yüksek değerde olan lipaz aktivitesinin, hücre dışı lipaz aktivitesinin artmaya başlamasıyla azaldığı görülmüştür. Glukoz+oleik asit ile hücre içi esteraz aktivitesi daha erken azalmaya başlamıştır. 49

63 Üretimlerin son saatinde ölçülen hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri Çizelge 4.6 da verilmiştir. Hücre dışında en yüksek proteaz aktivitesi U/ml (0.88 U/mg kh) olarak glukoz+oleik asit varlığında elde edilmiştir. Hücre içinde en yüksek proteaz aktivitesi ise 4.16 U/mg kh olarak glukoz varlığında elde edilmiştir. glukoz glukoz+oleik asit hücre derişimi, mg/ml Ön çoğalma ortamı Üretim oramı zaman, st Şekil 4.9 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz+oleik asitin hücre derişimine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) L-glukoz E-gukoz L-glukoz+oleik asit E-glukoz+oleik asit h.d lipaz aktivitesi, U/ml Ön çoğalma ortamı Üretim oramı zaman, st h.d. esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.10 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz + oleik asitin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 50

64 L-glukoz E-glukoz L-glukoz+oleik asit E-glukoz+oleik asit h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh Ön çoğalma ortamı Üretim ortamı zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.11 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz + oleik asitin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Çizelge 4.6 Ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve glukoz + oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Karbon kaynağı H. dışı proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H. içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) Glukoz (3 g/l) 0.324; ,16 Glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) 0.989; ,724 Ölçek büyütmesiz sistem Glukoz (3 g/l) ve glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) kullanılarak ölçek büyütmesiz sistemde yapılan deneylerde en yüksek hücre derişimi 1.02 mg/ml olarak 25. saatte glukoz + oleik asit varlığında elde edilmiştir (Şekil 4.12). Bu değer glukoz varlığında 22. saatte 0.8 mg/ml olarak elde edilmiştir. Her iki üretimde de hücre derişimi zamanla önce atmış, sonra sabit kalmıştır. 51

65 Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesine de 25. saatte U/ml (11.44 U/mg kh) olarak glukoz + oleik asit kullanımı ile ulaşılmıştır. Lipaz aktivitesi zamanla önce artmış, sonra azalmıştır (Şekil 4.13). Hücre dışında en yüksek esteraz aktivitesi U/ml (0.012 U/mg kh) olarak glukoz varlığında elde edilmiştir. Hücre içinde elde edilen en yüksek lipaz aktivitesi 9.26 U/mg kh olarak 8. saatte glukoz varlığında elde edilmiştir (Şekil 4.14). Hücre içi lipaz aktivitesinin deneyin başlarında arttığı ancak hücre dışında lipaz aktivitesinin artmasıyla birlikte ani olarak azaldığı görülmüştür. Hücre içinde en yüksek esteraz aktivitesi 4.13x10-4 olarak glukoz + oleik asit varlığında elde edilmiştir. Deneyin son saatinde yapılan analizlerde, hücre dışında proteaz aktivitesi gözlenmezken hücre içinde glukoz varlığında 4.16 U/mg kh, glukoz+oleik asit varlığında ise 2.36 U/mg kh proteaz aktivitesi gözlenmiştir (Çizelge 4.7). Çizelge 4.7 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz + oleik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Karbon kaynağı H. dışı proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H. içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) Glukoz (3 g/l) Glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l)

66 glukoz glukoz+oleik asit hücre derişimi, mg/ml zaman, st Şekil 4.12 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz + oleik asitin hücre derişimine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) L-glukoz L-glukoz+oleik asit E- glukoz E- glukoz+ oleik asit h.d. lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st h.d. esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.13 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz + oleik asitin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 53

67 L-glukoz E-glukoz L-glukoz+oleik asit E-glukoz+oleik asit h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.14 Ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz + oleik asitin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin karşılaştırılması Glukoz (3 g/l) ve glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) kullanılarak ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerin her ikisinde de daha yüksek hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri glukoz + oleik asit ile elde edilmiştir. En yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi ölçek büyütmesiz sistemde U/ml, en yüksek esteraz aktivitesi ölçek büyütmeli sistemde 0.03 U/ml olarak elde edilmiştir. Hücre dışı maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.8 de karşılaştırılmıştır. Lipaz enzimi için en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik 0.56 U/mg kh/st olarak glukoz varlığında ölçek büyütmesiz sistemde elde edilmiş; en yüksek hücre dışı verimlilik ise glukoz ve glukoz + oleik asit varlığında sistemler arasında fazla bir fark olmaksızın gene ölçek büyütmesiz sistemde elde edilmiştir (0.47 U/ml/st). Esteraz enzimi için ise en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik 5.45x10-4 U/mg kh/st olarak glukoz varlığında ölçek büyütmesiz sistemde, en yüksek hücre dışı verimlilik ise 6x10-4 U/ml/st olarak glukoz + oleik asit varlığında ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir. 54

68 Genel olarak ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde glukoz varlığında elde edilen lipaz aktivitesinin glukoz + oleik asit ile elde edilenden daha düşük olmasına rağmen, hücre dışı spesifik lipaz verimliliklerinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Bunun nedenin mikroorganizmanın öncelikli olarak glukozu kullanması ve glukoz tükendikten sonra oleik asiti kulanarak lipaz üretimini arttırması olduğu düşünülmüştür. Bu durum Şekil 4.19 da da görülmektedir. Çünkü glukoz ortamda çözündüğü için mikroorganizma tarafından daha kolay kullanılmakta ve ulaşılabilecek en yüksek lipaz aktivitesine daha erken ulaşılmaktadır. Ancak glukoz, tek başına kullanıldığında lipaz üretimi için yeterli bir indükleyici değildir. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, en yüksek lipaz verimi 4.66 U/mg olarak glukoz + oleik asit varlığında ölçek büyütmesiz sistemde elde edilmiştir. En yüksek esteraz verimi 3.2x10-3 U/mg olarak glukoz varlığında gene ölçek büyütmesiz sistemde; en yüksek hücre verimi ise 0.46 mg/mg olarak glukoz + oleik asit varlığında ölçek büyütmeli sistemde elde edilmiştir. Sonuç olarak aktivite, verimlilik ve verimler açısından bir değerlendirme yapılırsa ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve oleik asitin birlikte kullanılmasının lipaz üretimi için uygun olduğu ve esteraz üretiminde ise ölçek büyütmeli sistemde glukoz ve oleik asitin birlikte kullanımının uygun olduğu görülmektedir. Literatürde glukoz ve glukoz + oleik asit kullanımının karşılaştırıldığı tek bir çalışma bulunmaktadır. Dalmau et al. (2000) C. rugosa dan lipaz üretiminde farklı karbon kaynaklarının etkisini inceledikleri çalışmalarında 2 g/l derişiminde glukozu tek başına karbon kaynağı olarak kullanıldıkları zaman hücre çoğalması gözlerken, lipaz ve esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Ancak glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) kullanıldığında hücre çoğalmasının sadece glukoz kullanımı ile olduğundan daha fazla olduğu gözlenmiş ve 0.1 U/ml lipaz aktivitesi elde edilmiştir. Çalışmada ayrıca C. rugosa lipazı üretiminde glukoz etkisi üç ayrı deney ile incelenmiştir. Birinci deneyde, hücreler glukoz ile oleik asitin birlikte bulunduğu ortamda çoğaltılmış ve bu durumda hücrelerin glukozu oleik asite tercihli olarak kullandığı belirlenmiştir. Lipaz aktivitesi ise glukoz tamamen tükendikten ve oleik asit kullanımı başladıktan sonra görülmektedir. İkinci deneyde, oleik asit içeren ortamda çoğalan hücre örnekleri farklı zamanlarda ortamdan 55

69 uzaklaştırılarak glukoz içeren ortamda çoğaltılmaya devam edilmiştir. 18. saatte alınan örnekte ortamda oleik asit varken, 19.saatte alınan örnekte oleik asit tamamen tükenmiş durumdadır. Glukozlu ortamda iki saatlik inkübasyondan sonra, her iki örnekte de hücre dışı lipaz aktivitesinin arttığı; ancak ikinci ortamdaki toplam aktivitenin birinciden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Yarı-kesikli sistemde gerçekleştirilen üçüncü deneyde ise, başlangıçta oleik asit tek karbon kaynağı olarak kullanılmış ve 6. saatte oleik asit beslemesi kesilip glukoz eklenmiştir. Glukoz eklemeden az önce biyokütle derişimi 7.8 g/l, glukoz eklendikten 3 saat sonra -glukoz tükendiği zaman- yapılan ölçümlerde 10.9 g/l olarak saptanmıştır. Hücre içi ve hücre dışı lipaz aktivitelerinin zamanla değişiminin benzer ancak ters yönde olduğu görülmüştür. Literatürde C. rugosa dan lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak glukoz ile glukoz + oleik asit etkisini ölçek büyütmeli ve büyütmesiz sistemlerde inceleyen ve karşılaştıran bir çalışma yoktur. 56

70 Çizelge 4.8 Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemlerde glukoz ve glukoz + oleik asit varlığında elde edilen maksimum spesifik verimlilik, verimlilik ve verimler (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) ÖLÇEK BÜYÜTMELİ SİSTEM Karbon kaynağı Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Maks lipaz verimi Y L/No (U/mg) Maks esteraz verimi Y E/No (U/mg) Maks hücre verimi Y X/No (mg/mg) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Glukoz (3 g/l) Glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) x x x x x ÖLÇEK BÜYÜTMESİZ SİSTEM Glukoz (3 g/l) Glukoz (2 g/l) + oleik asit (0.5 g/l) x x x x x x

71 4.1.4 Doymuş yağ asitleri etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak doymuş yağ asitlerinin etkisi ölçek büyütmeli sistemde 5 g/l derişimlerinde stearik asit (C18:0) ve palmitik asit (C16:0) kullanılarak incelenmiştir. Hücre dışı lipaz ve esteraz aktiviteleri zamanla artmış ve daha sonra azalarak sabit kalmıştır. Hücre dışında en yüksek lipaz ve esteraz aktivitesine palmitik asit varlığında sırasıyla U/ml olarak 43. saatte ve 0.03 U/ml olarak 40. saatte ulaşılmıştır (Şekil 4.15). Deney süresince hücre derişimi ile hücre içi enzim aktiviteleri de izlenmiş; ancak ortamda çözünmeyen doymuş yağ asitlerinin, analiz sırasında ortamdan uzaklaştırılmasının zor olması nedeniyle doğru sonuçlar elde edilemediği düşünüldüğü için burada verilmemiştir. Üretimin son saatinde ölçülen hücre dışı proteaz aktiviteleri Çizelge 4.9 da yer almaktadır. En yüksek proteaz aktivitesi- 1.1 U/ml olarak stearik asit varlığında elde edilmiştir. L-palmitik asit L-stearik asit E-palmitik asit E-stearik asit h.d. lipaz aktivitesi, U/ml ön çoğalma ortamı üretim ortamı ,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 h.d. esteraz aktivitesi, U/ml zaman, st Şekil 4.15 Doymuş yağ asitlerinin hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 58

72 Çizelge 4.9 Palmitik asit ve stearik asit varlığında üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Doymuş yağ asiti H. dışı proteaz aktivitesi (U/ml) Stearik asit (5 g/l) Palmitik asit (5 g/l) Literatürde C. rugosa dan lipaz üretiminde katı yağ asitlerinin etkisini inceleyen üç çalışma bulunmaktadır. Dalmau et al. (2000) C. rugosa dan lipaz üretiminde farklı karbon kaynaklarının etkisini incelemek amacıyla yaptıkları çalışmada 2 g/l palmitik asit kullanmışlar ve bu karbon kaynağı ile en yüksek lipaz (5.3 U/ml) ve esteraz (0.036 U/ml) aktivitelerini elde etmişlerdir. Wei et al. (2004) farklı yağ asitlerinin C. rugosa dan lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak kullanımını inceledikleri çalışmalarında 10 g/l palmitik asit ve stearik asit kullanmışlar; ve ikisini karşılaştırdıklarında en yüksek lipaz aktivitesinin 4.25 U/ml olarak stearik asit varlığında elde edildiğini bildirmişlerdir. %1 derişiminde palmitik asitin karbon kaynağı olarak kullanıldığı bir diğer çalışmada ise 2.5 U/10 6 hücre spesifik esteraz aktivitesi elde edilmiş; ancak lipaz aktivitesi yok denecek kadar az (<10-5 ) görülmüştür (Alcantara et al. 2004) Farklı karbon kaynaklarındaki üretimlerin SDS-PAGE analizi Candida rugosa nın ürettiği enzimlerin molekül ağırlıklarını belirlemek amacıyla yapılan SDS-PAGE analizi için kuyulara, sırasıyla marker (1), oleik asit (2), palmitik asit (3), triolein (4), glukoz + oleik asit (5) ve glukoz (6) ile gerçekleştirilen deneylerden alınan örnekler ve ticari CRL yüklenmiştir. Analiz sonucu elde edilen fotoğraf EK 5 de verilmiştir. Tüm kuyularda 60 kda civarında ortak bir bant olduğu görülmektedir. 7 nolu ticari CRL içeren kuyuda da bu bantın yoğun olarak gözlenmesi, ortamlarda molekül ağırlıkları yaklaşık aynı ve 60 kda civarında olan (Benjamin and Pandey, 1998) lipaz izoformlarının varlığını göstermektedir. Tüm kuyularda ortak olan bir diğer 59

73 bant da 40 kda civarındadır. Bu bantın molekül ağırlığı 43 olarak bildirilen karboksil esteraz enzimi (izoformları) olduğu düşünülmektedir (Sanchez et al. 1998). Ayrıca, tüm örneklerde 40 kda dan biraz küçük molekül ağırlığında belirgin bir bant daha vardır; ancak bu bant ticari CRL de çok belirgin değildir, oleik asit örneğinde ise daha da küçük bir değerdedir. Bu bant ile ilgili literatürde herhangi bir bilgi yoktur. Sanchez et al. (1998) tarafından ticari lipazda ve oleik asit ile üretilen lipaz örneğinde olduğu belirlenen ancak aktivitesi bilinmeyen 50 kda civarındaki protein çalışmamızda da ticari lipaz ve oleik asit örneklerinde görülmektedir. Ticari CRL preparatında lipaz dışında başka proteinlerinde bulunduğu belirlenmiştir Bitkisel yağların etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak 10 g/l derişiminde bitkisel yağların (susam yağı, zeytin yağı, soya yağı, fındık yağı ve keten yağı) hücre derişimi ile hücre dışı ve hücre içi enzim aktiviteleri üzerine etkisi ölçek büyütmeli sistemde, 30ºC de ve 150 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilen deneylerle incelenmiştir. Deneylerde azot kaynağı olarak 4 g/l derişiminde üre kullanılmıştır. Farklı bitkisel yağların varlığında ulaşılan en yüksek hücre derişimi ile enzim aktiviteleri Çizelge 4.10 da yer almaktadır. En yüksek hücre derişimi susam yağı varlığında toplam 104. saatte 9.06 mg/ml olarak elde edilmiştir. Susam yağını sırasıyla zeytin, soya, fındık ve keten yağları izlemektedir. Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi fındık yağı varlığında U/ml (13.18 U/mg kh) olarak 50. saatte elde edilmiştir. Fındık yağını sırasıyla zeytin, susam, soya ve keten yağları takip etmektedir. En yüksek hücre dışı esteraz aktivitesine ise zeytin yağı varlığında U/ml (6.5x10-3 U/mg kh) olarak 128. saatte ulaşılmıştır. Hücre içinde en yüksek lipaz aktivitesi 46. saatte 7.2 U/mg kh ve en yüksek esteraz aktivitesi ise 50. saatte U/mg kh olarak fındık yağı varlığında elde edilmiştir. 60

74 Bitkisel yağlar ile lipaz üretiminin incelendiği deneylerin son saatlerinde hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri de ölçülmüştür (Çizelge 4.11). Tüm bitkisel yağların varlığında proteaz aktivitesi gözlenmesine karşın, en yüksek proteaz aktivitesi susam yağı varlığında (hücre dışı 4.74 U/ml; hücre içi 1.78 U/ mg kh); en düşük proteaz aktivitesi ile fındık yağı varlığında (hücre dışı 1.93 U/ml; hücre içi 0 U/ mg kh) elde edilmiştir. Çizelge 4.10 Farklı bitkisel yağlar ile elde edilen maksimum hücre derişimleri, lipaz ve esteraz aktiviteleri (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Bitkisel yağ (10 g/l) Maksimum hücre derişimi, (mg/ml) Maksimum hücre dışı aktivite ( U/ml) Maksimum hücre içi aktivite (U/mg kh) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Soya x x10-4 Susam x x10-4 Zeytin x x10-4 Fındık x x10-4 Keten x Çizelge 4.11 Farklı bitkisel yağlar ile üretim sonunda elde edilen proteaz aktiviteleri (T=30 o C,N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Bitkisel yağ (10 g/l) H. dışı Proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H. içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) Soya 2.32; Susam 4.74; Zeytin 3.84; Fındık 1.93; Keten 2.22;

75 Farklı bitkisel yağlar kullanılarak gerçekleştirilen üretimler, hücre dışı maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.12 de karşılaştırılmıştır Lipaz için en yüksek spesifik verimlilik 0.26 U/mg kh/st olarak, esteraz için ise 8.84x10-5 U/mg kh/st olarak fındık yağı ile elde edilmiştir. En yüksek lipaz verimliliği 0.46 U/ml/st olarak fındık yağı varlığında, esteraz için en yüksek verimlilik ise soya yağı varlığında 4.2x10-5 U/ml/st olarak elde edilmiştir. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, en yüksek lipaz verimi 2.33 U/mg olarak fındık yağı varlığında elde edilmiştir. Fındık yağını 1.67 U/mg değerleri ile susam ve zeytin yağları izlemektedir. En yüksek esteraz verimi 2.54x10-3 U/mg olarak zeytin yağı varlığında elde edilmiştir ve bunu 1.17x10-3 U/mg değeri ile fındık yağı izlemektedir. En yüksek hücre verimi ise 0.91 mg/mg olarak susam yağı ile elde edilmiştir. Sonuç olarak fındık yağının lipaz, zeytin yağının ise esteraz üretimini indüklediği görülmektedir. Çalışmada kullanılan bitkisel yağların, lipaz ve esteraz enzimlerinin üretimi üzerine önemli etkileri olduğu belirlenmiştir. Bunun başlıca nedenleri; içerdikleri yağ asitlerinin farklılığı (Ek 6) ve C. rugosa nın ortam bileşimine göre ifadeleri değişen farklı izoenzim genlerini içermesidir (Lotti and Alberghina 1996). 62

76 Çizelge 4.12 Farklı bitkisel yağlarla elde edilen verimlilikler (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Bitkisel yağ (10 g/l) Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Maks lipaz verimi Y L/So (U/mg) Maks esteraz verimi Y E/So (U/mg) Maks hücre verimi Y X/So (mg/mg) Soya x x x Susam x x x Zeytin x x x Fındık x x x Keten x x x Bitkisel yağlardan susam, zeytin, soya, fındık ve keten yağı ile gerçekleştirilen enzim üretimleri, maksimum hücre dışı lipaz aktiviteleri açısından kıyaslandığında en yüksek lipaz aktivitesinin elde edildiği fındık yağını zeytin, susam, soya ve keten yağları izlemektedir. Şekil 4.16 de bitkisel yağların C18:1 ve C18:n (toplam C18) yüzdeleri ile lipaz aktivitesinin değişimleri verilmiştir. Buna göre, lipaz aktivitesi bitkisel yağın C18:1 ve C18:n içeriği ile artmaktadır. Ancak keten yağında toplam C18:n yüzdesi yüksek olmasına rağmen en düşük lipaz aktivitesi gözlenmiştir. Bunun nedeni olarak keten yağının C18:3 (linoleik asit) içeriğinin diğer yağlara göre daha fazla olması (~%55) düşünülmüştür. C. rugosa lipazının yapısında kapak boyunca uzanan bir tünel yer almaktadır ve bu tünelin C18:1 gibi substratların yapısına uyduğu bildirilmiştir (Dominguez de Maria et al. 2006). Diğer yandan, C. rugosa ortama indükleyici konulmadan da az da olsa lipaz üretebilmektedir (EK 6) ve bu şekilde oluşan CRL, bu tünele uyum sağlayan indükleyicileri daha kolay kullanabildiğinden lipaz üretimi ve hücre derişimi C18:1 içeren indükleyiciler ile artmıştır. 63

77 Çalışmada ayrıca esteraz aktivitesinin bitkisel yağların C16:1 (palmitoleik asit) yüzdesine bağlı olarak arttığı da belirlenmiştir (Şekil 4.17). Bu sonuç, Alcantara et al. (2004) ın % 0.5 oleik asit (C18:1) ve palmitik asit (C16:0) ile gerçekleştirdikleri çalışmada esteraz aktivitesinin palmitik asit varlığında oleik asit varlığındakinden daha yüksek olduğu bulgusunu desteklemektedir. 30 h.d.lipaz aktivitesi, U/ml keten soya susam zeytin fındık soya zeytin susam keten fındık 0 C18:1 C18:n Şekil 4.16 Bitkisel yağların C18:1 ve C18:n yüzdeleri ile hücre dışı lipaz aktivitesinin değişimi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) 0,03 h.d. esteraz aktivitesi, U/ml 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 susam keten soya C16:1 fındık zeytin Şekil 4.17 Bitkisel yağların C16:1 yüzdeleri ile hücre dışı esteraz aktivitesinin değişimi (T=30 o C, N=150 rpm, azot kaynağı: 4 g/l üre) Literatürde, C. rugosa dan lipaz üretiminde bitkisel yağlardan zeytin yağının incelendiği çalışmalar yer almaktadır. Benjamin and Pandey (1996) zeytin yağının farklı 64

78 derişimleri ile gerçekleştirdiği çalışmada en yüksek lipaz aktivitesi %10 derişiminde 8.36 U/ml olarak elde edilmiştir. 10 g/l zeytin yağı derişimi ile gerçekleştirilen başka bir çalışmada ise en yüksek hücre derişimi 5.5 g/l ve en yüksek lipaz aktivitesi ise 5 U/ml olarak elde edilmiştir (Sokolovska et al 1998). Muralidhar et al. (2001) C. cylindrace dan yüzey cevap yöntemi kullanarak optimize ettikleri ortamda 33.7 g/l zeytin yağı varlığında U/ml lipaz aktivitesi elde edilmiştir. Alcantara et al. (2004), karbon kaynağı olarak zeytin yağı ve ayçiçek yağını kullanmışlar ve elde edilen spesifik esteraz aktiviteleri (2 U/10 6 hücre) benzerlik gösterirken, ayçiçek yağında zeytin yağına göre daha düşük spesifik lipaz aktivitesi gözlenmiştir (ayçiçek yağı; < 10-5 U/10 6 hücre ve zeytin yağı; 0.14 U/10 6 hücre). Çalışmada zeytin yağının daha yüksek lipaz aktivitesi göstermesinin nedeni olarak daha yüksek oleik asit içeriği gösterilmiştir. Farklı bitkisel yağların CRL üretimine etkisinin incelendiği tek çalışma Lakshimi et al. (1999) tarafından yapılmıştır. Araştırıcılar karbon kaynağı olarak 10 g/l derişiminde yerfıstığı, susam, palmiye, hint, hindistancevizi ve ayçiçek yağlarını kullanmışlar ve en yüksek lipolitik aktiviteyi C18:n değeri yüksek olan susam yağında 4.8 U/ml olarak elde etmişlerdir. Çalışmada bitkisel yağlarda bulunan C18:n yağ asit esteri yüzdesinin artması ile ulaşılan lipolitik aktivitenin de arttığı; ancak hint yağında doymamış yağ asit esterleri miktarının az olması nedeniyle düşük aktivite elde edildiği ileri sürülmüştür. 4.2 Azot Kaynakları Etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde basit ve kompleks organik azot kaynaklarının etkisi, üre (4 g/l), kepek unu (4 g/l), peynir altı suyu (4 g/l), maya özütü (3 g/l) soypepton (1 ve 3 g/l) ve soy-pepton (3 g/l) + maya özütü (3 g/l) kullanılarak ölçek büyütmesiz sistemde, 30ºC de ve 150 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilen deneylerle incelenmiştir. Deneylerde karbon kaynağı olarak 2 g/l derişiminde triolein kullanılmıştır. Azot kaynaklarının hücre derişimine etkisi Şekil 4.18 de; hücre dışı lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi Şekil 4.19 da; hücre içi lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi ise Şekil 4.20 de gösterilmiştir. Hücre derişimi, incelenen tüm azot kaynaklarında zamanla artarak sabit kalmış; en yüksek hücre derişimine soy-pepton + maya özütü varlığında 28. saatte 2.5 mg/ml 65

79 olarak ulaşılmıştır (Şekil 4.18). Hücre dışı lipaz aktiviteleri de hücre çoğalmasına paralel olarak zamanla önce artmış; ancak sonra azalmıştır. Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi üre varlığında 31. saatte U/ml (11.49 U/mg kh) olarak; en yüksek esteraz aktivitesi ise soy-pepton (3 g/l) varlığında 52. saatte U/ml (2.5x10-3 U/mg kh) olarak elde edilmiştir (Şekil 4.19). Hücre dışında kepek unu, peynir altı suyu ve soy-pepton + maya özütü varlığında esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Hücre içi lipaz aktivitesi, üre ve soy-pepton (1 g/l) hariç tüm azot kaynaklarında üretimin hemen başlarında düşmeye başlamış ve en yüksek hücre içi lipaz aktivitesi U/mg kh olarak maya özütü varlığında elde edilmiştir (Şekil 4.20). Ancak tüm üretim süresi göz önüne alındığı zaman, hücre içi lipaz aktivitesi üre varlığında diğer azot kaynakları ile ulaşılandan daha yüksektir. Soy-pepton + maya özütü varlığında ise hücre içinde lipaz aktivitesi gözlenmemiştir. Ayrıca kullanılan tüm azot kaynakları ile hücre içinde esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Üretimlerin son saatlerinde ayrıca, enzim aktivitelerindeki düşmeye etkisinin olup olmadığını anlamak amacıyla, hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri ölçülmüş ve hücre dışında en yüksek proteaz aktivitesi 5.5 U/ml (5.0 U/mg kh) olarak üre varlığında, hücre içinde en yüksek proteaz aktivitesi ise 3.65 U/mg kh olarak soypepton + maya özütü varlığında elde edilmiştir (Çizelge 4.13). 3.0 üre kepek unu peynir altı maya öz soy-pep 1-soy-pep soy-pep+maya öz hücre derişimi, mg/ml zaman, st Şekil 4.18 Azot kaynaklarının hücre derişimine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein) 66

80 L-üre L-kepek unu L-peynir altı L-maya öz L-1-soy-pep L-soy-pep+maya öz L-soy-pep E-üre E-maya öz E-1-soy-pep E-soy-pep h.d. lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st h.d. esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.19 Azot kaynaklarının hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein) h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh L-üre L-kepek unu L-peynir altı L-maya öz L-soy-pep L-1-soy-pep zaman, st Şekil 4.20 Azot kaynaklarının hücre içi lipaz aktivitesine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein) 67

81 Çizelge 4.13 Azot kaynaklarının üretimlerin son saatlerindeki hücre dışı ve hücre içi proteaz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein) Azot kaynağı H.dışı Proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H.içi Proteaz aktivitesi (U/mg kh) Üre (4 g/l) 5.5; Kepek unu (4 g/l) - - Peynir altı suyu (4 g/l) 0.632; Maya özütü (3 g/l) - - Soy-pepton (3 g/l) 0.82; Soy-pepton (1 g/l) Soy-pepton (3 g/l)+ maya özütü(3 g/l) Farklı azot kaynakları ile gerçekleştirilen üretimler hücre dışı maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.14 de karşılaştırılmıştır. Lipaz enzimi için en yüksek spesifik verimlilik 1.55 U/mg kh/st olarak kepek unu varlığında, esteraz için ise 0.5x10-4 U/mg kh/st olarak soy-pepton (3 g/l) varlığında elde edilmiştir. En yüksek lipaz verimliliğine de kepek unu varlığında 1.66 U/ml/st olarak, en yüksek esteraz verimliliğine soy pepton (3 g/l) varlığında 11x10-5 U/ml/st olarak ulaşılmıştır. Başlangıç azot kaynağı derişimi temel alınarak verimlilikler karşılaştırıldığında ise, en yüksek lipaz verimliliği 4.16 U/mg olarak üre varlığında elde edilmiştir. Üreyi 2.22 U/mg değeri ile maya özütü izlemektedir. En yüksek esteraz verimliliği 30x10-4 U/mg olarak 1 g/l soy-pepton varlığında elde edilmiştir ve bunu 19.3x10-4 U/mg değeri ile 3 g/l soy-pepton izlemektedir. En yüksek hücre verimliliği ise 2.49 mg/mg olarak 1 g/l soy-pepton ile elde edilmiştir. En yüksek verimlilik ve spesifik verimliliğin kepek unu varlığında elde edilmesine karşın ulaşılan lipaz aktivitesinin düşük olması nedeniyle aktivite ve verim açısından iyi sonuç veren ürenin lipaz üretimi için uygun azot kaynağı olduğuna karar verilmiştir. Tüm aktivite, verimlilik ve verimler karşılaştırıldığında soy-peptonun (3 g/l) esteraz üretimi için uygun olduğu sonucuna varılmıştır. 68

82 Çalışmada kullanılan organik azot kaynaklarının, lipaz ve esteraz enzimlerinin üretimi üzerine önemli etkileri olduğu belirlenmiştir. Bunun başlıca nedenleri; içerdikleri azot miktarı, ortamdaki çözünürlükleri ve C. rugosa nın ortam bileşimine göre ifadeleri değişen farklı izoenzim genlerini içermesidir. Düşük maliyetli bir azot kaynağı olarak lipaz üretiminde kullanımı araştırılan kepek ununun yapısında başlıca % 4.6 şeker, % 4.74 yağ ve % 14.9 protein vardır (Soysal vd 2004). Kepek ununun üretim ortamındaki çözünürlüğünün düşük olması sonucu oluşturduğu heterojen ortam nedeniyle mikroorganizmanın kendisine zor ulaşması lipaz aktivitesinin düşük olmasına neden olmuştur. Lipaz aktivitesinin oldukça düşük olmasının bir diğer nedeni, karbon kaynağı olarak ortamda bulunan trioleinin kepek ununa tutunmasıyla, mikroorganizmanın karbon kaynağına da ulaşımının engellenmesi olabilir. Kepek ununun yapısında bulunan yağın da lipaz oluşumunu indükleyeceği beklenilse de miktarı az olduğu için fazla bir etkisi olmamıştır. Mikroorganizmanın kepek ununu kullanmaya başladığı ilk saatlerde elde edilen lipaz aktivitesinin daha sonraki saatlerde artmadığı görülmüş ve böylece en yüksek aktiviteye deneyin ilk saatlerinde ulaşılmıştır. Bu nedenle kepek unu varlığında yüksek lipaz aktivitesi elde edilememesine karşın yüksek verimlilik elde edilmiştir. İleri saatlerde ortamdaki azotun tükenmesi ile enzim aktivitesi de düşmektedir. Bir diğer doğal azot kaynağı olarak kullanılan tatlı peynir altı suyunun (ph=6.5) bileşimi kaynağına ve üretim prosesine göre değişmesine karşın, yaklaşık olarak % su, % kuru madde, % laktoz, % toplam protein, % peynir proteinleri, % 0.1 sitrik asit, eser miktarda laktik asit ve % mineral içermektedir (Öztürk, 2007). Peynir altı suyu, bu bileşimi ile aynı zamanda karbon kaynağı olarak da kullanılabilmektedir. Ancak, CRL nin indüklenebilir bir enzim olması ve üretimi için ortamda belirli miktarda yağ asidi veya esterlerinin olması gerekliliği nedeniyle peynir altı suyundaki laktoz, laktik asit ve sitrik asitin lipaz üretimine önemli bir etkisi olmadığı düşünülmektedir. Peynir altı suyunun azot miktarının yeterli olmaması ve bileşiminde bulunan karbon kaynaklarının da lipaz üretimine önemli bir katkısı olmaması nedeniyle ulaşılan lipaz aktivitesi oldukça düşüktür. Ancak peynir altı suyu, içerdiği proteinlerin özellikleri nedeniyle C. rugosa 69

83 tarafından ortamdaki derişiminin yüksek olduğu üretimin ilk saatlerinde lipaz üretiminde etkin olarak kullanılabilmiş ve kepek ununda olduğu gibi bu azot kaynağı ile de lipaz verimliliği yüksek bulunmuştur. Daha sonra azot kaynağının ortamda tükenmiş olmasından dolayı aktivite ve dolayısıyla verimlilik düşmüştür. Aktivite ve verimlilik değerlerini artırabilmek için daha yüksek derişimde peynir altı suyu veya derişik peynir altı suyu tozu kullanılabilir. Çalışmada, mikroorganizmanın çoğaltılmasında kullanılan UY ortamı bileşiminde bulunan soy-pepton ve maya özütünün de üretim ortamında, tek başlarına ve birlikte, azot kaynağı olarak kullanımı araştırılmıştır. Kullanılan ticari soy-peptonun yapısında % 12.5, maya özütünün yapısında ise % 10 azot bulunmaktadır. Soy-pepton için 3 g/l derişiminde gerçekleştirilen deneyde soy-peptonun ortamdaki çözünürlüğünün az olması nedeniyle mikroorganizmanın azot kaynağına kolay ulaşamadığı düşünülerek daha düşük derişimde (1 g/l) soy peptonun kullanıldığı bir deney daha yapılmıştır. Ancak bu derişimde yapılan deneyde yüksek aktivite elde edilememiştir. Soy-pepton (1 g/l) ile elde edilen lipaz aktivitesi, verimlilik ve spesifik verimlilik maya özütü ile elde edilenlerden daha yüksektir. Bunun soy-peptonun daha fazla azot içermesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Ancak başlangıç azot kaynağı derişimine göre hesaplanan verimler karşılaştırıldığında, maya özütünün lipaz aktivitesi açısından, soypeptonun ise esteraz aktivitesi ve hücre çoğalması açısından daha etkin olduğu anlaşılmaktadır. Ayrıca çalışmada, mikroorganizmanın çoğalması için uygun olan UY ortamında bulunan derişimlerde maya özütü ve soy-pepton üretim ortamında birlikte kullanılmıştır. Bu azot kaynaklarının birlikteliğinde en yüksek hücre derişimi değeri elde edilirken; lipaz aktivitesi deney süresince sadece 22 ve 28. saatlerde gözlenmiş, esteraz aktivitesi ise hiç gözlenmemiştir. Bunun başlıca nedeni iki azot kaynağının hücre çoğalması için iyi olması; ancak ortamdaki çözünürlüklerinin az olması nedeniyle oluşan heterojen ortamda mikroorganizmaların lipaz üretmek üzere trioleine ulaşmalarının zor olması gösterilebilir. Üre, C. rugosa dan lipaz üretimini amaçlayan çalışmaların hemen hepsinde kullanılan azot kaynağıdır ve bu çalışmada da yüksek azot içeriği ve ortamda kolay çözünebilmesi nedeniyle lipaz üretimi için uygun azot kaynağının üre olduğu sonucuna varılmıştır. 70

84 Ancak üre varlığında üretilen esteraz enziminin aktivitesi düşüktür. Ortamdaki çözünürlüğünün az olmasına rağmen 3 g/l soy-pepton ise esteraz üretimi için en uygun azot kaynağı olarak seçilmiştir. Literatürde, C. rugosa dan lipaz üretiminde azot kaynağının etkisi üzerine fazla çalışma yer almamaktadır. Fadıloğlu ve Erkmen (2002), azot kaynağı olarak kepek unu (50 g/l), soya unu (50 g/l) ve peynir altı suyunu karbon kaynağı olarak zeytin yağı varlığında kullandıkları çalışmalarında, en yüksek hücre derişimini ve lipaz aktivitesini kepek unu varlığında elde etmişler (sırasıyla 0.55 mg/ml ve 3.38 U/ml) ve bunun kepek ununun içerdiği yüksek mineral, azot ve şeker bileşiminden kaynaklandığını ileri sürmüşlerdir. 71

85 Çizelge Farklı azot kaynakları ile elde edilen maksimum spesifik verimlilik, verimlilik ve verimler (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein) Azot kaynağı Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Maks lipaz verimi Y L/No (U/mg) Maks esteraz verimi Y E/No (U/mg) Maks hücre verimi Y X/No (mg/mg) Üre (4 g/l) x x x Kepek unu (4 g/l) Peyniraltı suyu (4 g/l) Maya özütü (3 g/l) x x x Soy-pepton (3 g/l) x x x Soy-pepton (1 g/l) x x x Soy-pepton (3 g/l) + Maya özütü (3 g/l)

86 4.3 Sıcaklık Etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde, ölçek büyütmesiz sistemde, 25, 30 ve 35ºC lerde, gerçekleştirilen deneylerde elde edilen sıcaklıklığın hücre derişimine etkisi Şekil 4.21 de; hücre dışı lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi Şekil 4.22 de; hücre içi lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine etkisi ise Şekil 4.23 de gösterilmiştir. Deneyler 150 rpm karıştırma hızında yapılmış; karbon kaynağı olarak 2 g/l derişiminde triolein, azot kaynağı olarak ise 4 g/l derişiminde üre kullanılmıştır. Hücre derişimi incelenen tüm sıcaklıklarda zamanla önce artmış, daha sonra azalmış ve sabit kalmıştır. En yüksek hücre derişimine 35ºC sıcaklıkta 32. saatte 1.65 mg/ml olarak ulaşılmıştır (Şekil 4.21). Hücre dışı lipaz aktiviteleri de zamanla önce artmış ve sonra azalmıştır. Hücre dışında en yüksek lipaz aktivitesi 30 ºC de 31. saatte U/ml (11.49 U/mg kh) olarak; en yüksek esteraz aktivitesi ise 30ºC de U/ml (1.60x10-3 U/mg kh) olarak elde edilmiştir (Şekil 4.22). Hücre içi lipaz aktivitesi tüm sıcaklıklarda üretimin hemen başlarında düşmeye başlamış ve en yüksek hücre içi lipaz aktivitesi U/mg kh olarak 4. saatte 25ºC de elde edilmiştir (Şekil 4.23). Hücre içinde en yüksek esteraz aktivitesi 9.6x10-4 U/mg kh olarak 25 o C da 46. saatte elde edilmiştir. Deneylerin son saatlerinde ölçülen hücre dışı ve hücre içi proteaz aktiviteleri Çizelge 4.15 de verilmiştir. Hücre dışında en yüksek proteaz aktivitesi 5.50 U/ml olarak 30ºC de,hücre içinde en yüksek proteaz aktivitesi ise 2.19 U/mg kh olarak 25ºC de elde edilmiştir. 73

87 hücre derişimi, mg/ml zaman, st Şekil 4.21 Sıcaklığın hücre derişimine etkisi (N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein; azot kaynağı: 4 g/l üre) h.d. lipaz aktivitesi, U/ml L-25 L-30 L-35 E-25 E-30 E zaman, st Şekil 4.22 Sıcaklığın hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein; azot kaynağı: 4 g/l üre) h.d. esteraz aktivitesi, U/ml 74

88 h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh L-25 L-30 L-35 E-25 E-30 E zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.23 Sıcaklığın hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein; azot kaynağı: 4 g/l üre) Çizelge 4.15 Sıcaklığın üretimlerin son saatlerindeki hücre dışı ve hücre içi proteaz aktivitelerine etkisi (N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) Sıcaklık ( ºC) H. dışı proteaz aktivitesi (U/ml; U/mg kh) H. içi proteaz aktivitesi (U/mg kh) ; ; ; 0, Farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen deneyler, maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.16 da karşılaştırılmıştır. Lipaz için en yüksek spesifik verimlilik 0.37 U/mg kh/st olarak, esteraz için ise 0.3x10-4 U/mg kh/st olarak30ºc de elde edilmiştir. En yüksek lipaz verimliliği 0.53 U/ml/st, en yüksek esteraz verimliliği 3.20x10-5 U/mg kh/st olarak 30ºC elde edilmiştir. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, en yüksek lipaz verimi 8.33 U/mg olarak, en yüksek esteraz verimi de 8.70x10-4 U/mg olarak 30ºC de elde edilmiştir. En yüksek hücre verimi ise 35ºC de 0.82 mg/mg olarak elde edilmiştir. 25 o C de hücre dışında esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Bunun nedeni olarak 25ºC nin 75

89 esteraz üretimi için yetersiz olması düşünülmektedir. Gerçekleştirilen deneyler sonucunda, hem lipaz hem de esteraz üretimi için uygun sıcaklığın 30ºC olduğu sonucuna varılmıştır. Literatürde C. rugosa dan lipaz üretiminde sıcaklığın etkisini inceleyen bir çalışmaya rastlanmamıştır ve CRL üretim çalışmaları genellikle 30 o C de gerçekleştirilmiştir. 76

90 Çizelge 4.16 Farklı sıcaklıklarda elde edilen maksimum spesifik verimlilikler, verimlilik ve verimler (N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) Sıcaklık (ºC) Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Maks lipaz verimi Y L/So (U/mg) Maks esteraz verimi Y E/So (U/mg) Maks hücre verimi Y X/So (mg/mg) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz x x x x x x

91 4.4 Oksijen Aktarımı Etkisi Candida rugosa dan lipaz üretiminde oksijen aktarım etkisi dört farklı oksijen aktarım stratejisi ile incelenmiştir. Tüm deneyler karbon kaynağı olarak 2 g/l triolein, azot kaynağı olarak 4 g/l üre kullanılarak, T=30ºC sıcaklıkta, N=500 rpm karıştırma hızı ve Q/V=0.6 vvm gaz akış hızında, 1 L çalışma hacmindeki biyoreaktörlerde kesikli işletimle gerçekleştirilmiştir. Lipaz üretim ortamının başlangıç ph değeri 6.2 dir ve deneyler süresince ph kontrolü yapılmamıştıır. Oksijen Aktarım Stratejisi I Biyoreaktöre başlangıçtan itibaren sürekli olarak % 100 doymuş oksijen beslemesi ile gerçekleştirilen deneyde, işletim süresince sistem tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen değerleri (% doygunluk) Şekil 4.24 de verilmiştir. Yaklaşık 40 saat süren üretimde ph değerinin zamanla değişmediği görülmüştür. Cihazdan alınan orijinal çıktılar EK 7 de yer almaktadır. Hücre derişimi ve hücre dışı lipaz aktivitesi birbirine paralel olarak zamanla önce artmış, sonra azalmıştır (Şekil 4.25). En yüksek değerler hücre derişimi için 1.37 mg/ml olarak, hücre dışı lipaz aktivitesi için ise 10 U/ml (7.3 U/mg kh) olarak 20. saatte elde edilmiştir. Hücre içinde ise en yüksek lipaz aktivitesi 5.32 U/mg kh olarak 4. saatte elde edilmiş; daha sonra aktivite azalmış ve 20. saatten sonra sıfır değerine düşmüştür (Şekil 4.25). Deney süresince hücre dışında ve hücre içinde esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. Deneyin son saatinde yapılan analizde hücre dışında proteaz aktivitesi 1.81 U/ml (2.26 U/mg kh) olarak belirlenirken, hücre içinde proteaz aktivitesi bulunmamıştır. 78

92 % O O 2 ph ph zaman, st 4.0 Şekil 4.24 Oksijen aktarım stratejisi I de biyoreaktör tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen % doygunluk değerleri (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) lipaz aktivitesi hücre derişimi h.i. lipaz aktivitesi h.d lipaz aktivitesi, U/mL zaman, st Hücre derişimi, mg/ml Şekil 4.25 Oksijen aktarım stratejisi I in hücre derişimi ve hücre dışı ve hücre içi lipaz aktivitesine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre, Q/V=0.6 vvm) 79

93 Oksijen Aktarım Stratejisi II C. rugosa dan lipaz üretiminde, deneyin başında % 100 oksijen ile doyurulan üretim ortamına hücreler aktarıldıktan sonra oksijen beslemesi kesilmiştir. Çözünmüş oksijen değeri düşmeye başladığı anda, ortama çözünmüş oksijen değeri % 60 ın altına düşmeyecek şekilde hava ve oksijen karışımı gönderilmiştir. Deney süresince sistem tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen değerleri Şekil 4.26 da verilmiştir. Yaklaşık 40 saat süren üretimde ph değeri zamanla değişmemiştir. Cihazdan alınan orijinal çıktılar EK 7 de yer almaktadır. Oksijen aktarım stratejisi II ile gerçekleştirilen üretimde, hücre derişimi ve hücre dışı lipaz aktivitesinin başlangıçtan itibaren zamanla önce arttığı, daha sonra salınım göstererek azaldığı görülmektedir. Başlangıçta düşük değerlerde olan hücre dışı esteraz aktivitesi ise üretimin ileri zamanlarında artış göstermeye başlamış ve sonra sabit kalmıştır (Şekil 4.27). Ulaşılan en yüksek değerler; hücre derişimi için 2.04 mg/ml olarak 24. saatte, hücre dışı lipaz aktivitesi için 10 U/ml (5.55 U/mg kh) olarak 20. saatte, hücre dışı esteraz aktivitesi için ise 2.1x10-3 U/ml (1.1x10-3 U/mg kh) olarak 32. saatte elde edilmiştir. Hücre içinde ise lipaz aktivitesi üretimin ilk saatlerinde artışmış, sonra düşmeye başlamış; esteraz aktivitesi ise lipazın azaldığı andan itibaren artmış ancak sonra o da azalmıştır (Şekil 4.28). En yüksek hücre içi lipaz aktivitesi U/mg kh olarak 8. saatte; en yüksek hücre içi esteraz aktivitesi ise 1.04x10-3 U/mg kh olarak 28. saatte elde edilmiştir. Deneyin son saatinde yapılan analizde hücre dışında proteaz aktivitesi 3.5 U/ml (1.84 U/mg kh) olarak gözlenirken hücre içinde proteaz aktivitesi gözlenmemiştir. 80

94 ph % O2 60 O ph zaman, st 4.0 Şekil 4.26 Oksijen aktarım stratejisi II de biyoreaktör tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen % doygunluk değerleri (T=30 o C, N=500 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre, Q/V=0.6 vvm) lipaz hücre esteraz hücre derişimi, mg/ml h. d.lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st hücre içi ve hücre dışı esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.27 Oksijen aktarım stratejisi II in hücre derişimi ve hücre dışı lipaz aktivitesine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm,karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) 81

95 lipaz esteraz h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh zaman, st 0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.28 Oksijen aktarım stratejisi II nin hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) Oksijen Aktarım Stratejisi III Üretim ortamı deneyin başında % 100 oksijen ile doyurulduktan sonra hücreler aktarılmış ve oksijen beslemesi kesilmiştir. Çözünmüş oksijen değeri % 80 e düştüğü anda ikişer saat aralıklarla ortamdaki değer %80, %60, %40 ve son olarak da deney bitimine kadar %30 da olacak şekilde hava ve oksijen karışımı gönderilmiştir. Deney süresince sistem tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen değerleri Şekil 4.29 da verilmiştir. Yaklaşık 34 saat süren üretimde ph değerinin zamanla değişmediği gözlenmiştir. Cihazdan alınan orijinal çıktılar EK 7 de yer almaktadır. Oksijen aktarım stratejisi III ile gerçekleştirilen deneyde, hücre derişimi ve hücre dışı lipaz aktivitesinin başlangıçtan itibaren zamanla arttığı, sonra hücre derişimi yaklaşık sabit kalırken lipaz aktivitesinin azaldığı, hücre dışı esteraz aktivitesinin ise üretimin ortalarında önce arttığı ve sonra azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4.30). En yüksek değerler; hücre derişimi için 2.01 mg/ml olarak, hücre dışı lipaz aktivitesi için U/ml (8.3 U/mg kh) olarak 15. saatte, hücre dışı esteraz aktivitesi için ise 8.2x10-4 U/ml (4.08x10-4 U/mg kh) olarak yine 15. saatte elde edilmiştir. Hücre içinde lipaz aktivitesi 4. saatten itibaren azalmaya başlamış; esteraz aktivitesi ise zamanla artmıştır (Şekil 4.31). En yüksek hücre içi lipaz aktivitesi 7.32 U/mg kh olarak 4 saatte elde edilmiş; en 82

96 yüksek hücre içi esteraz aktivitesine U/mg kh olarak 18. saatte ulaşılmıştır. Deneyin son saatinde yapılan analizde hücre dışında ve hücre içinde proteaz aktivitesi gözlenmemiştir ph % O ph O zaman, st 4.0 Şekil 4.29 Oksijen aktarım stratejisi III de biyoreaktör tarafından izlenen ph ve çözünmüş O 2 % doygunluk değerleri (T=30 o C, N=500 rpm Q/V=0.6 vvm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) hücre derişimi, mg/ml h.d. lipaz aktivitesi, U/ml hücre t lipaz zaman, st h.d esteraz aktivitesi, U/ml Şekil 4.30 Oksijen aktarım stratejisi III ün hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre, Q/V=0.6 vvm) 83

97 lipaz esteraz h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.31 Oksijen aktarım stratejisi III ün hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) O 2 Aktarım Stratejisi IV Deneyin başında % 100 oksijen ile doyurulmuş olan lipaz üretim ortamına hücreler aktarıldıktan sonra oksijen beslemesi kesilmiş ve çözünmüş oksijen değeri düşmeye başladığı anda ortama çözünmüş oksijen değeri % 30 un altına düşmeyecek şekilde hava ve oksijen karışımı gönderilmiştir. Deney süresince sistem tarafından izlenen ph, çözünmüş oksijen değerleri Şekil 4.33 de verilmiştir. 24 saat süren üretimde, ph değerinin zamanla değişmediği gözlenmiştir. Cihazdan alınan orijinal çıktılar EK 7 de yer almaktadır. Oksijen aktarım stratejisi IV ile gerçekleştirilen üretimde, hücre derişimi ve hücre dışı lipaz aktivitesinin başlangıçtan itibaren zamanla arttığı, sonra hücre derişimi yaklaşık sabit kalırken lipaz aktivitesinin azaldığı, hücre dışı esteraz aktivitesinin ise üretimin sonlarına doğru artarak azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4.33). En yüksek değerler hücre derişimi için 2.07 mg/ml olarak, hücre dışı lipaz aktivitesi için U/ml (11.27 U/mg kh) olarak 20. saatte, hücre dışı esteraz aktivitesi için 6.1x10-4 U/ml (3.02x10-4 U/mg kh) olarak 28. saatte elde edilmiştir. Hücre içinde ise, lipaz aktivitesi 4. saatten itibaren azalmaya başlamış; esteraz aktivitesi de lipaz aktivitesinin azaldığı andan itibaren 84

98 artmaya başlamış ve daha sonra azalmıştır (Şekil 4.34). En yüksek hücre içi lipaz aktivitesi 6.87 U/mg kh olarak 4. saatte, en yüksek hücre içi esteraz aktivitesi ise U/mg kh olarak 20. saatte elde edilmiştir. Deneyin son saatinde yapılan analizde hücre dışında ve hücre içinde proteaz aktivitesi gözlenmemiştir. %O ph ph zaman, st O Şekil 4.32 Oksijen aktarım stratejisi IV de biyoreaktör tarafından izlenen ph ve çözünmüş oksijen % doygunluk değerleri (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) lipaz hücre esteraz hücre derişimi, mg/ml h.d. lipaz aktivitesi, U/ml zaman, st h.d. esteraz akivitesi, U/ml Şekil 4.33 Oksijen aktarım stratejisi IV ün hücre derişimi, hücre dışı lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, Q/V=0.6 vvm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre) 85

99 lipaz esteraz h.i. lipaz aktivitesi, U/mg kh zaman, st h.i. esteraz aktivitesi, U/mg kh Şekil 4.34 Oksijen aktarım stratejisi IV ün hücre içi lipaz ve esteraz aktivitelerine etkisi (T=30 o C, N=500 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı: 4 g/l üre, Q/V=0.6 vvm) Oksijen Aktarım Stratejilerinin Karşılaştırılması Farklı oksijen aktarım stratejileri ile biyoreaktörde gerçekleştirilen deneylerde, en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi Oksijen Aktarım Stratejisi IV ile 20. saatte U/ml olarak; en yüksek hücre dışı esteraz aktivitiesi ise Oksijen Aktarım Stratejisi II ile 2.1x10-4 U/ml olarak elde edilmiştir. Oksijen Aktarım Stratejileri I ve II ile elde edilen hücre dışı lipaz aktiviteleri birbirleri ile aynı değerdedir (10 U/ml). Tüm stratejilerde ortamdaki çözünmüş oksijen derişiminin azaldığı anda hücre derişimi ve lipaz aktivitesi değerlerinin artmaya başladığı görülmüştür. Farklı oksijen aktarım stratejileri hücre dışı maksimum spesifik verimlilik, maksimum verimlilik ve verimler açısından Çizelge 4.17 de karşılaştırılmıştır. Lipaz enzimi için en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik ve verimlilik sırasıyla 0.56 U/mg kh/st ve 1.16 U/ml/st olarak Oksijen Aktarım Stratejisi IV ile elde edilmiştir. Esteraz için ise en yüksek hücre dışı spesifik verimlilik ve verimlilik sırasıyla 3.42x10-5 U/mg kh/st ve 6.56x10-5 U/ml/st dir ve oksijen aktarım stratejisi II ile elde edilmiştir. Esteraz enzimi Oksijen Aktarım Stratejisi I de oluşmamıştır. Başlangıç substrat derişimi temel alınarak hesaplanan verimler karşılaştırıldığında ise, en yüksek lipaz ve hücre verimi Oksijen 86

100 Aktarım Stratejisi IV ile elde edilmiştir. Bu da fazla oksijenin lipaz enziminin üretimini kısıtladığı göstermektedir. Esteraz enziminin üretimi için ise daha fazla oksijen gerektiği görülmüştür. En yüksek esteraz verimi ise 1.05x10-3 U/mg olarak II nolu strateji ile elde edilmiştir. Sonuç olarak aktivite, verimlilik ve verimler açısından bir değerlendirme yapılarak IV nolu stratejinin lipaz üretimi için uygun olduğu ve esteraz üretiminde ise II nolu stratejinin kullanımının uygun olduğu düşünülmüştür. Çalışmada dört farklı oksijen aktarımı stratejisinden başka, ortamdaki çözünmüş oksijen değerinin başlangıçtan itibaren sadece % 30 ve sadece % 60 da tutulduğu deneyler de gerçekleştirilmiştir. Ancak her iki koşulda da hücre yeteri kadar çoğalamadığı ve bu nedenle lipaz aktivitesinin de oldukça düşük olduğu görülmüştür. Literatürde oksijen aktarım stratejilerini inceleyen birkaç çalışma bulunmaktadır. Wei et al. (2004) tarafından 10 g/l triolein kullanılarak %100 çözünmüş oksijen derişimi ile başlayıp ortamdaki oksijen derişiminin %20 nin altına düşmeyecek şekilde oksijen aktarımı ile kesikli sistemde gerçekleştirilen deneyde elde edilen en yüksek değerler hücre derişimi için 10 g/l, lipaz aktivitesi için 55 U/ml olarak elde edilmiştir. Çalışmada ayrıca ortamda oksijenin daha kolay taşınması için oksijen vektörü olarak dodekan kullanılmıştır. Bu şekilde gerçekleştirilen deneyde hem hücre derişimi hem de lipaz aktivitesinde artış gözlenmiştir. Dodekan varlığında elde edilen hücre derişimi ve lipaz aktivitesi değerleri sırasıyla 15 g/l ve 77 U/ml dir. C. rugosa dan lipaz üretiminde oksijen etkisinin incelendiği diğer bir çalışmada iki strateji izlenmiştir (Sokolovska et al. 1998) Ortamdaki oksijen derişiminin 1.16 mol/l değerinde sabit tutulduğu ilk stratejide 10 g/l zeytin yağı ile gerçekleştirilen deneylerde lipaz aktivitesi 5.6 U/ml olarak 41. saatte elde edilmiştir. % 100 oksijen doygunluğu ile başlatılarak ortamdaki O 2 derişiminin %20 nin altına düşmesine izin verilmediği ikinci stratejide ise lipaz aktivitesi deneyin 32. saatinde 5 U/ml olarak elde edilmiştir. Her iki stratejide de hücre derişimi yaklaşık aynıdır (5.7 g/l). Yüksek oksijen derişimi ile başlayan ikinci stratejide oksijenin hücre çoğalmasını desteklemesi ve lag fazı kısaltması nedeniyle deney süresinde yaklaşık 20 saattlik bir kısalma gözlenmiştir. 87

101 Puthli et al. (2006), karbon kaynağı olarak 1 ml/l oleik asit + 20 g/l dekstroz kullandıkları çalışmada, C. rugosa dan lipaz üretimini üç bıçaklı karıştırmalı bir reaktörde gerçekleştirmişlerdir. Çalışmada karıştırma hızı N=600 rpm de sabit tutulmuş, oksijen akış hızı cm 3 /s aralığında değiştirilmiştir. Sonuç olarak C. rugosa fermentasyonunda optimum hücre çoğalması için oksijenin gerekli olduğu; ancak yüksek oksijen derişiminin hücre oluşumunu ve lipaz aktivitesini azalttığı bildirilmiştir cm 3 /s gaz akış hızında 66. saat sonunda en yüksek lipaz aktivitesine ulaşılmıştır (1.84 U/ml). 88

102 Çizelge Farklı O 2 aktarım stratejileri ile elde edilen maksimum spesifik verimlilik, verimlilik ve verimler (T=30 o C, N=150 rpm, karbon kaynağı: 2 g/l triolein, azot kaynağı:4 g/l üre) Oksijen aktarım stratejileri Maksimum hücre dışı spesifik verimlilik (U/mg kh/st) Maksimum hücre dışı verimlilik (U/ml/st) Lipaz Esteraz Lipaz Esteraz Maks lipaz verimi Y L/So (U/mg) Maks esteraz verimi Y E/So (U/mg) Maks hücre verimi Y X/So (mg/mg) I II x x x III x x x IV x x x

103 5. SONUÇLAR Candida rugosa lipazının farklı izoformlarının, ifadesi çoğalma koşuluyla değişebilen farklı genlerin varlığı nedeniyle oluştuğu bilinmektedir. Ancak, Candida rugosa universal olmayan bir genetik koda sahip olduğu ve lipaz genini başka bir organizma içinde ifade etmek mümkün olmadığı için başlıca karbon ve azot kaynağı, yağ asidi türü, sıcaklık ve oksijen aktarımı gibi biyoproses koşullarının değiştirilmesi ile C. rugosa nın lipaz ya da esteraz aktivitesi gösteren farklı izoformlarının üretiminin gerçekleştirilebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada, yukarıda sözü edilen her bir parametrenin hücre derişimi, hücre dışı ve hücre içi lipaz ve esteraz aktiviteleri üzerine etkileri incelenerek üretimleri için uygun koşullar önerilmiştir. Triolein derişiminin C. rugosa dan lipaz üretimine etkisi ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki farklı sistemde incelenmiştir. Her iki sistemde de 2, 3 ve 5 g/l başlangıç triolein derişimleri incelenmiş ve triolein derişiminin artması ile ulaşılan hücre derişiminin arttığı, ancak lipaz ve esteraz aktivitelerinin azaldığı belirlenmiştir. Her iki sistem için de, hem lipaz hem de esteraz üretimi için 2 g/l başlangıç triolein derişiminin uygun bulunmuştur. Ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemler karşılaştırıldığında ise ulaşılan lipaz aktiviteleri aynıdır (16.67 U/ml). Ancak, ölçek büyütmeli sistemde ön çoğalma ortamında geçen süre sonunda önemli sayılabilecek değerde lipaz aktivitesi gözlendiği için toplam üretim süresi, ön çoğalma ortamındaki süre de katılarak hesaplanmıştır. Toplam üretim süresine bakılarak hesaplanan verimlilikler ve başlangıç substrat derişimine göre hesaplanan verimler değerlendirildiği zaman lipaz üretimi için ölçek büyütmesiz sistemin uygun olduğu görülmektedir. Esteraz üretimi için ise daha yüksek aktivite ve verimlilik değerlerine ulaşılan ölçek büyütmeli sistem daha uygundur ( U/ml). Oleik asitin C. rugosa dan lipaz üretimine etkisi, ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz olmak üzere iki ayrı sistemde incelenmiştir. Deneylerde kullanılan 3 g/l oleik asit başlangıç derişimi ön deneyler ile belirlenmiştir. Ölçek büyütmeli ve büyütmesiz sistemler karşılaştırıldığında her iki sistem de de elde edilen lipaz aktivitesi değerinin aynı olduğu görülmektedir (16.67 U/ml). Ancak, ölçek büyütmeli sistemde ön çoğalma 90

104 ortamında geçen süre sonunda önemli sayılabilecek değerde lipaz aktivitesi gözlendiği için toplam üretim süresi, ön çoğalma ortamındaki süre de katılarak hesaplanmıştır. Bu nedenle, toplam üretim süreleri göz önüne alınarak hesaplanan verimlilikler karşılaştırıldığında lipaz üretimi için ölçek büyütmesiz sistemin daha uygun olduğı sonucuna varılmıştır. Oleik asit varlığında estreaz enzimi ise sadece ölçek büyütmeli sistemde gözlenmiştir ( U/ml). Literatürde C.rugosa dan lipaz üretiminde en yaygın olarak kullanılan karbon kaynağı oleik asit olsa da, bu çalışmada kullanılan trioleinin, hem esteraz hem de lipaz enzimlerinin birlikte üretmesi ve daha yüksek lipaz verimi sağlaması nedeniyle oleik asitten daha uygun bir karbon kaynağı olduğu düşünülmüştür. Glukoz ve glukoz + oleik asitin karbon kaynağı olarak kullanıldığı deneyler de ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemler ile incelenmiştir. Her iki sistemde de hücre çoğalması, lipaz ve esteraz üretimleri açısından glukoz ve oleik asitin bir arada kullanılması daha iyi sonuç vermiştir. Ancak ölçek büyütmesiz sistemde esteraz üretimi için glukozun tek başına kullanımı daha uygundur. Hem ölçek büyütmeli hem de ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve glukoz + oleik asit varlığında lipaz aktivitelerinin zamanla attığı, ancak glukoz varlığında lipaz aktivitesinin aniden düştüğü anda glukoz + oleik asit varlığında aktivitenin biraz daha artarak devam ettiği görülmüştür. Bu da glukozun tek başına lipaz üretimi için yeterli olmadığını göstermektedir. Aktivite, verimlilik ve verimler açısından ölçek büyütmeli ve ölçek büyütmesiz sistemler için bir değerlendirme yapılırsa ölçek büyütmesiz sistemde glukoz ve oleik asitin birlikte kullanılmasının lipaz üretimi için uygun olduğu ve esteraz üretiminde ise glukoz ve oleik asitin birlikte kullanımında ölçek büyütmeli sistemde uygun olduğu düşünülmüştür. Elde edilen en yüksek lipaz ve esteraz aktiviteleri sırasıyla U/ml ve 0.03 U/ml dir. Karbon kaynağı olarak bitkisel yağlardan susam yağı, zeytin yağı, soya yağı, fındık yağı ve keten yağının 10 g/l derişimlerinin kullanıldığı deneyler ölçek büyütmeli sistemde gerçekleştirilmiştir. En yüksek hücre derişimi susam yağı varlığında; en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi fındık yağı varlığında (23.33 U/ml); en yüksek hücre dışı esteraz 91

105 aktivitesi ise zeytin yağı varlığında ( U/ml) elde edilmiştir. Lipaz aktivitesinin bitkisel yağların içerdiği C18:1 (oleik asit) yüzdesinin artışı ile; esteraz aktivitesinin ise C16:1 (palmitoleik asit) yüzdesinin artışı ile arttığı da bulunmuştur. Aktivite ve verimlilikler açısından bir değerlendirme yapılarak; lipaz üretimi için uygun olan ve lipaz enzimi ile birlikte esteraz enziminin de üretimini sağladığı için en iyi karbon kaynağı olarak 2 g/l başlangıç derişimindeki triolein belirlendikten sonra en iyi azot kaynağının belirlenmesini amaçlayan deneyler gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla azot kaynağı olarak üre (4 g/l), kepek unu (4 g/l), peynir altı suyu (4 g/l), maya özütü (3 g/l) soy-pepton (1 ve 3 g/l) ve soy-pepton (3 g/l) + maya özütü (3 g/l) kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan peynir altı suyu ve kepek ununda yüksek verimlilik elde edilmesine rağmen kepek ununun ortamda çözünmemesi ve peyniraltı suyunun da yeterli azot içermemesi nedeniyle oldukça düşük aktiviteler elde edilmiştir. Üre, C. rugosa dan lipaz üretimini amaçlayan çalışmaların hemen hepsinde kullanılan azot kaynağıdır ve bu çalışmada da yüksek azot içeriği ve ortamda kolay çözünebilmesi nedeniyle lipaz üretimi için uygun azot kaynağının üre olduğu sonucuna varılmıştır (16.67 U/ml). Ancak üre varlığında üretilen esteraz enziminin aktivitesi düşüktür. Ortamdaki çözünürlüğünün az olmasına rağmen 3 g/l soy-pepton ise esteraz üretimi ( U/ml ) için en uygun azot kaynağı olarak seçilmiştir. Lipaz ve esteraz aktivitelerine sıcaklığın etkisinin incelendiği deneylerde, karbon kaynağı olarak daha önceki çalışmalarda en yüksek aktivitenin gözlendiği 2 g/l başlangıç derişiminde triolein ve azot kaynağı olarak da 4 g/l başlangıç derişiminde üre kullanılmıştır. Ölçek büyütmesiz sistemde, 25, 30 ve 35ºC lerde gerçekleştirilen deneyler sonucunda hem lipaz hem de esteraz üretimi için 30ºC nin uygun sıcaklık olduğu bulunmuştur. Bu koşulda elde edilen en yüksek lipaz aktivitesi U/ml, en yüksek esteraz aktivitesi ise U/ml dir. C. rugosa dan enzim üretiminde oksijen aktarımının etkisi dört farklı strateji ile azot kaynağı olarak 2 g/l triolein, azot kaynağı olarak 4 g/l üre kullanılarak, 30ºC sıcaklıkta, 500 rpm karıştırma hızında ve 0.6 vvm gaz akış hızında biyoreaktörde 1 L çalışma hacminde gerçekleştirilmiştir. Aktivite, verimlilik ve verimler açısından bir 92

106 değerlendirme yapılarak; deneyin başında % 100 O 2 gazı ile doyurulmuş ve çözünmüş oksijen değeri düşmeye başladığı anda ortama çözünmüş oksijen değeri % 30 un altına düşmeyecek şekilde hava ve O 2 gaz karışımı gönderilerek gerçekleştirilen IV nolu stratejinin lipaz üretimi için uygun olduğu (aktivite = U/ml); esteraz üretiminde ise deneyin başında % 100 O 2 gazı ile doyurulmuş ve çözünmüş oksijendeğeri düşmeye başladığı anda ortama çözünmüş oksijen değeri % 60 ın altına düşmeyecek şekilde hava ve O 2 gaz karışımı gönderilerek gerçekleştirilen II nolu stratejinin kullanımının uygun olduğu sonucuna varılmıştır (aktivite = 2.10x10-3 U/ml). Farklı koşullarda gerçekleştirilen tüm deneylerde C. rugosa nın hücre dışına salgıladığı lipaz ve esteraz enzim aktivitelerinin, hücre içi enzim aktivitelerinden daha yüksek olduğu bulunmuştur. Örneğin, 2 g/l triolein için en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi U/mg kh olarak elde edilirken hücre içi lipaz aktivitesinin 9.19 U/mg kh olduğu belirlenmiştir. Aynı koşullarda hücre dışında esteraz aktivitesi 1.66x10-3 U/mg kh olarak elde edilirken hücre içinde esteraz aktivitesi gözlenmemiştir. İncelenen tüm koşullar için C. rugosa nın lipaz ve esteraz enzimlerini aynı anda üretmediği görülmüştür. C. rugosa, lipaz enzimini öncelikle çoğalmaya paralel olarak üretmekte; lipaz aktivitesinin azalmaya başlamasıyla da esteraz enzimi üretilmektedir. C. rugosa dan lipaz üretimi için yapılan tüm deneylerde, üretimin son saatlerinde yapılan analizlerde mayanın aynı zamanda proteaz enzimi de ürettiği belirlemiştir. İleri saatlerde lipaz ve esteraz aktivitelerinde gözlenen düşmenin bir nedeni de protaz aktivitesi olabileceği sonuıcuna varılmıştır. C. rugosa dan üretilen lipaz ve esteraz enzim aktivitelerine başlangıç ph ının etkisini incelemek amacıyla da çalışmalar yaılmış; ancak kullanılan tamponların üretim ortamı bileşenleriyle etkileşmesi nedeniyle bu parametrenin etkisi incelenememiştir. Çalışmada yapılan SDS-PAGE analizleri, C. rugosa nın farklı karbon kaynakları ile molekül ağırlığı birbirine eşit ve birbirinden farklı çok sayıda proteinler ürettiğini göstermiştir. Ancak, bazıları lipaz bazıları ise esteraz aktivitesi gösteren CRL 93

107 izoenzimlerinin molekül ağırlıklarının çok yakın olması nedeniyle izoenzimlerin koşullara göre dağılımları belirlenememiştir. İki boyutlu ayırma yöntemi ile (2D- PAGE) izoenzimlerin izoelektrik noktalarına göre de ayırılarak belirlenmesi önerilmektedir. Çalışmanın sonucunda en yüksek hücre dışı lipaz aktivitesi erlenlerde yapılan üretimde U/ml olarak 10 g/l fındık yağı varlığında (T=30 o C, ph=6.2, N=150 rpm, azot kaynağı= 4 g/l üre), biyoreaktörde yapılan üretimde gene U/ml olarak 2 g/l triolein varlığında (T=30 o C, ph=6.2, N=500 rpm, Q/V= 0.6 vvm; oksijen aktarım stratejisi =2, azot kaynağı= 4 g/l üre); en yüksek esteraz aktivitesi ise erlenlerde yapılan deneylerde 0.03 U/ml olarak palmitik asit ve ölçek büyütmeli sistemde glukoz + oleik asit varlığında (T=30 o C, ph=6.2, N=150 rpm, azot kaynağı= 4 g/l üre) elde edilmiştir. 94

108 KAYNAKLAR Anonymous Web Sitesi: Erişim Tarihi: Anonymous Web Sitesi: Erişim Tarihi: Akoh, C.C., Lee, G.C. and Shaw, J Protein engineering and applications of Candida rugosa lipase isoforms, Lipids, 39; Alcantara, R.A., Dominguez de Maria, P., Fernandez, M., Hernaiz, M.J., Sanchez- Montero, J.M. and Sinisterra, J.V Resolution of rasemic acids, esters and amines by Candida rugosa lipase in slightly hydrated organic media, Food Technol. Biotechnol., 42; Benjamin, S and Pandey, A Candida rugosa lipases: An overview, Yeast, 14, Brocca, S., Persson, M., Wehtje, E., Adlercreutz, P., Alberghina, L. and Lotti, M Mutants provide evidence of the importance of glycosydic chains in the activation of lipase 1 from Candida rugosa [In Process Citation], Protein Science., 9, Dalmau, E., Montesinos, J.L., Lotti, M. and Casas, C Effect of different carbon sources on lipase production by Candida rugosa, Enzyme and Microbial Technology, 26, Dominguez de Maria, P., Sanchez-Montero, J.M., Alcantara, A.R., Valero, F. and Sinisterra, J.V Rational strategy for the production of new crude lipases from Candida rugosa, Biotechnology Letters, 27, Dominguez de Maria, P., Sanchez-Montero, J.M., Sinisterra, J.V. and Alcantara, A.R Understanding Candida rugosa lipases: An overview, Biotechnology Advances, 24, Fadıloğlu, S. and Erkmen, O Effects of carbon and nitrogen sources on lipase production by Candida rugosa, Turkish J. Eng. Env. Sci., 26; Gordillo, M.A., Sanz, A., Sanchez, A., Valero, F., Montesinos, J.L., Lafuente, J. and Sola C Enhancement of Candida rugosa lipase production by using different control fed-batch operational strategies, Biotechnology and Bioengineering, 60,

109 Grochulski, P., Li, Y., Schrag J.D. and Cygler, M Two conformational states of Candida rugosa lipase, Protein Science, 3, Lakshmi, B.S., Kangueane, B., Pennathur, A. and Pennathur, G Effect of vegetable oils in the secretion of lipase from Candida rugosa (DSM 2031). Letters in Applied Microbiology 29, Lotti, M., Alberghina, L Candida rugosa lipase isozymes: cloning, sequencing, analysis of the substrate binding pocket, in Malcata, F. X.(Ed.), Engineering of/with Lipases. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp Mancheno, J.M., Pernas, M.A., Martinez, M.J., Ochoa, B., Rua M.L. and Hermoso, J.A., Structural insights into the lipase/esterase behavior in the Candida rugosa lipases family: Crystal structure of the lipase 2 ısoenzyme at 1.97 A resolution, Jounal of Molecular Biology, 332, Monecke, P., Friedemann, R., Naumann, S. and Csuk R Modelling studies on the catalytic mechanism of Candida rugosa lipase, Journal of Molecular Modeling, 4, Montesinos, J. L., Dalmau, E. and Casas, C Lipase production in continuous culture of Candida rugosa, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 78, Muralidhar, R.V., Chirumamila, R.R., Marchant, R. and Nigam, P A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon source, Biochemical Engineering Journal, 9; Obradors, N., Montesinos, J.L., Valero, F., Lafuente, J. and Sola, C Effects of different fatty acids in lipase production by Candida rugosa, Biotechnology Letters, 15, Puthli, S.M., Rathod, V.K. and Pandit, A.B Optimization of lipase production in a triple impeller bioreactor, Biochemical Engineering Journal, 27; Sanchez, A., De La Casa, R.M., Sinisterra, J.V., Valero, F. And Sanchez-Montero, J.M Effects of fermentation conditions in enzymatic activity and selectivity of crude lipase from Candida rugosa, Applied Biochemistry and Biotechnology, 80,

110 Schmitt, J., Brocca, S., Schmid, R. and Pleiss, J Blocking the tunnel: engineering of Candida rugosa lipase mutatnts with short chain lenght specifity, Protein Engineering, 15, Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee C. U Production, purification, characterization, and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, Sokolovska, I., Albasi, C., Riba, J. P. and Bales, V Production of extracellular lipase by Candida cylindracea CBS 6330, Bioprocess Engineering, 19; Ünlü, A.E Candida rugosa lipazının özellikleri ve enantiyoseçimliliğinin arttırılması. Seminer. Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, Ankara. Wei, D., Zhang, L. and Song, Q Studies on a novel carbon source and cosolvent for lipase production by Candida rugosa, Journal of Industrial Microbiology Biotechnology., 31,

111 EKLER EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler EK 2 Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı EK 3 Esteraz Aktivitesi Örnek Hesabı EK 4 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı EK 5 SDS-PAGE Fotoğrafı EK 6 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi EK 7 Farklı Oksijen Aktarım Stratejilerinde Biyoreaktörden Alınan Veriler 98

112 EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler Kimyasal / Biyokimyasal Madde Firma Katalog No Agar Scharlau Agaroz Merck Akrilamid Bio-Rad Antifoam Sigma A6426 Amonyum persülfat Bio-Rad Aseton Merck D-(+)-glukoz monohidrat AppliChem A1343 EDTA Sigma E9884 Etanol Merck Gümüş boyama kiti Bio-Rad (Silver Stain Plus) Hidroklorik asit Merck Kazein Sigma C5890 Malt özütü Scharlau Marker Fermantas SM1811 Maya özütü Scharlau Oleik asit Sigma O1630 Palmitik asit Sigma P5585 Soy-Pepton Sigma P643 Potasyum sülfat Merck p-nitrofenil asetat Sigma N2130 Proteaz Sigma P5380 SDS AppliChem A2263 Sodyum fosfat dibazik Fluka dodekahidrat Sodyum hidroksit AppliChem A1551 Sodyum tetraborat dekahidrat Sigma S9640 Stearik asit Sigma S4751 TCA Merck

113 TEMED Bio-Rad Triolein Sigma T7752 Trisma-baz Sigma T6066 Üre Merck

114 EK 2 Lipaz Aktivitesi Örnek Hesabı Bir ünite enzim (U), bir dakikada 1 µmol yağ asidi açığa çıkaran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Yağ asit esteri + H 2 O lipaz yağ asidi + gliserol U/ml = [( örnek, mlharcanan - kör, mlharcanan) NaOH * N(NaOH)*1000*1 (enzim ml)*30 dk U/ml = [( örnek, mlharcanan - kör, mlharcanan) NaOH (0.1ml)*30 dk *(0.1N)*1000*1 101

115 EK 3 Esteraz Aktivitesi Hesabı Bir ünite enzim (U), bir dakikada p-nitrofenil asetattan (PNFA) 1 µmol p-nitrofenol (PNF) açığa çıkarmak için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. PNPA + H 2 O esteraz PNF + asetik asit Lambert-Beer Kanuna göre: A =. b. C ε dk dk ε = m.m -1.cm -1 t = 6 dk b = 1 cm λ = 348 nm C t A = L 1mmol 6dk.6,517.1cm. mmol. cm 1000µ mol A µ mol 1L 1,5ml =.. 0,0391 L. dk 1000ml 0.375ml µ mol U / ml = A ml. dk t (reaksiyon süresi)= 6 dk V T (toplam hacim)=1.5 ml Örnek hacmi=0.375 ml 102

116 EK 4 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı Bir ünite enzim (U), bir dakikada 4 nmol tirozin açığa çıkaran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. (tirozin derisimi µ mol / ml)* F*(1000 nmol) U/ml = 4nmol * 20 dk *1µ mol F: Seyreltme faktörü = 1 U/ml = (( Absorbans / µ mol) / (1ml enzim) * F*1000 nm) 4* 20 dk *1µ mol U/ml = Absorbans x Proteaz Kalibrasyon Grafiği 1,8 1,6 1,4 Abs (275 nm) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,7705x R 2 = 0,9884 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Tirozin Derişimi,umol/ml 103

117 EK 5 Farklı karbon kaynakları ile yapılan üretimlerin SDS-PAGE Analizi kda Farklı karbon kaynakları ile yapılanüretimlerin SDS-PAGE analiz sonuçları (1: Marker, 2: Oleik asit, 3: Palmitik ait, 4: Triolein, 5: Glukoz + oleik asit, 6: Glukoz, 7: CRL) 104