T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRESİ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ. Hazırlayan Mehmet GEZER

Transkript

1 1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRESİ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ Hazırlayan Mehmet GEZER Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Eczacılık Temel Bilimler Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

2 i T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRESİ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ Hazırlayan Mehmet GEZER Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Eczacılık Temel Bilimler Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2012 KAYSERİ

3 ii BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kural ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Mehmet GEZER

4 iii Mehmet Gezer tarafından Yrd. Doç. Dr. Haydar Çelik danışmanlığında hazırlanan Endoplazmik Retikulum Stresi ve Hastalıklarla İlişkisi konulu bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından kabul edilmiştir Tezi Hazırlayan Mehmet GEZER Danışman Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK Temel Bilimler ABD Başkanı Yrd. Doç. Dr. Nalan İMAMOĞLU ONAY: Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın././. tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır.././.. Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

5 iv TEŞEKKÜR Bu çalışmamda öncelikle bilgi ve birikimiyle bana her daim yol gösteren hocam Haydar Çelik e, bu süreçte bana daima destek olan arkadaşlarım Mustafa Gökerik ve Harun Karaduman a ve maddi ve manevi desteklerini hiç esirgemeyen babam Ömer Gezer ve annem Fatma Gezer e teşekkür ediyorum. Mehmet GEZER Mayıs 2012, KAYSERİ

6 v ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRESİ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ Mehmet GEZER Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Bitirme Tezi, Mayıs 2012 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK ÖZET Zar ve salgı proteinlerinin katlanması, taşınması ve olgunlaşması işlevlerinden sorumlu olan endoplazmik retikulum (ER), proteinlerin kalite kontrolünü sağlayan önemli bir organeldir. Kalsiyum homeostazisindeki değişiklikler, salgı proteinlerinin sentezindeki artış, hatalı katlanmış proteinlerin ve mutant moleküler şaperonların ekspresyonlarında artış olması gibi hücresel stres durumlarında katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinler ER lümeninde birikim göstermektedir. ER de hatalı katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesi ve ER yapı ve fonksiyonunun bozulması durumunda ortaya çıkan hücresel cevap ER stresi olarak tanımlanmaktadır. Değişen çevreye adaptasyonu sağlamak ve normal ER işlevini yeniden kurabilmek amacıyla evrimsel süreçte korunmuş bir mekanizma olan UPR (Unfolded Protein Response) aktive olmaktadır. Ancak, değişen çevreye adaptasyon gerçekleştirilemediğinde fazla miktarda bulunan hatalı katlanmış ya da katlanmamış protein birikimleri çeşitli patolojik durumların ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Bugün, ER stresinin tetiklendiği hastalık grupları içerisinde nörodejeneratif hastalıklardan amiyotrofik lateral skleroz, parkinson, alzheimer ve huntington, iskemi/reperfüzyon hasarı olan hastalıklar, metabolik hastalıklardan tip 2 diyabet ve obezite ve bir kas hastalığı olan inklüzyon cisimcik miyoziti (IBM) yer almaktadır. Bu nedenle membran proteinlerinin ve ER stres yanıtın aktive edilmesinde önemli bir role sahiptir. Hastalıkların patolojisinde aktifleşen ER stres mekanizmasının aydınlatılması tedaviye giden süreci hızlandırmada son derece önemli olacaktır. Anahtar kelimeler: Endoplazmik retikulum, UPR, protein katlanması, diyabet

7 vi ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS AND RELATIONSHIP WITH DIASES Mehmet GEZER Erciyes University, Faculty of Pharmacy Thesis, May 2012 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Haydar ÇELİK ABSTRACT Endoplasmic reticulum (ER) that is responsible for folding, transport and maturation of membrane and secreted proteins is an important protein quality control organelle. A number of cellular stress conditions, such as perturbation in calcium homeostasis, elevated secretory protein synthesis, expression of misfolded proteins and mutated molecular chaperons lead to accumulation of unfolded or misfolded proteins in the ER lumen. Accumulation of misfolded or unfolded proteins and disturbances of the structure and funcion of ER can cause a cellular response that is called ER stress. To adapt the changing environment and reestablish normal function of ER an evolutionery conserved mechanism, termed the Unfolded Protein Response (UPR) is activated. However, when adaptation fails, excessive misfolded or unfolded protein accumulation cause some pathological conditions. Today, it is known that ER stress is activated in several group of disorders including amyothrophic lateral sclerosis, Parkinson, Alzheimer, and Huntington in terms of neurodegenerative disorders, ischemia/reperfusion injuries, type 2 diabet and obesity in terms of metabolic disorders and Inclusion Body Myositis (IBM) which is a muscle disorder. It will be very important to understand the mechanism of ER stress in pathology of diases. Key words: Endoplasmic reticulum, UPR, protein folding, diabetes

8 vii İÇİNDEKİLER İÇ KAPAK... i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... ii KABUL ONAY... iii TEŞEKKÜR... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii ŞEKİLLER LİSTESİ... ix KISALTMALAR... x 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİ ENDOPLAZMİK RETİKULUM Granüllü Endoplazmik Retikulum Düz Endoplazmik Retikulum ENDOPLAZMİK RETİKULUM (ER) STRES ER Stres Adaptasyonu Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve UPR Sinyal Yolu PERK Aktivasyonu ATF-6 Aktivasyonu IRE-1 Aktivasyonu ER`da Protein Katlanması ER STRES İLE HASTALIKLAR ARASINDAKİ İLİŞKİ ER Stres ve Diyabet İnsülin Duyarlılığın Azalması İnsülin Direnci ve Tip 2 Diyabet... 23

9 viii İnsülin Sinyal iletimi Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve Nörodejeneratif Hastalıklar Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve Parkinson Hastalığı Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve Alzheimer hastalığı Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve Amiyotrofik yanal skleroz (ALS) Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve Kanser Endoplazmik Retikulum (ER) Stresin Diğer Hastalıklar İle İlişkisi ER Stres ve Kalp ER Stres ve Böbrek Patofizyolojisi TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 46

10 ix ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. Endoplazmik retikulumun birbirleriyle bağlantılı kanal ve kese biçimindeki yapıları... 3 Şekil 2.2. Granüllü endoplazmik retikulum Şekil 2.3. Granüllü endoplazmik retikulum (kahverengi) ve mitokondrinin (mavi) elektron mikroskobik görüntüsü... 8 Şekil 2.4. ER stresle ilişkili sinyal iletim olayları Şekil 2.5. ER stresi ve katlanmamış protein cevabı UPR Şekil 2.6. ER stresi algılayıcı proteinlerinin primer yapılarının şematik gösterimi Şekil 2.7. ER`de protein katlanması Şekil 2.8. İnsülin etkisini engelleyen enflematuvar ve metabolik yolların entegrasyon modeli Şekil 2.9. İnsülinin karaciğer, adipoz ve kas dokularındaki metabolik etkileri Şekil İinsülin sinyal iletimi Şekil UPR nin üç mekanizmasının şematik sunumu, bu mekanizmaların sinyal yolakları ve Alzheimer hastalığının patolojisi ve inflamasyon ile alakalı patolojik yanıtları Şekil Kanserde ER stres yanıtın şematik gösterimi... 33

11 x KISALTMALAR ALS ATF-4 Ca CFTR ER ERAD ERSE FFA GEF GRP GSK IRE1 IRS IBM IKK JNK NAFL Nf-kB OHDA PERK : Amiyotrofik yanal skleroz : Activating transcription factor : Calcium ion : cystic fibrosis transmembrane conductance regulator : Endoplasmic reticulum : Endoplasmic reticulum associated degredation : Endoplasmic reticulum stress element : Free fatty acid : Guanin Nucleotide Exchange Factor : glucose-regulated protein : Glycogen synthase kinase : Inositol requiring enzyme-1 : Insulin receptor substrate : inclusion-body myositis : Inhibitor of. (kappa) B kinase : c-jun N-terminal kinase : Non-alcoholic fatty liver disease : Nuclear factor kappa B : hydroxydopamine : PKR (RNA-dependent protein kinase)-related ER kinase

12 xi PI3K PPAR SOD1 TNF TRAF2 UPR UPRE UPS VLDL XBP-1 : Phosphoinositol 3 kinase : Peroxisome proliferator activated receptor : superoxide dismutase : Tumor necrosis factor : TNF-alpha receptor associated factor : Unfolded protein response : Unfolded protein response element : ubiquitin proteasome system : Very low density lipoprotein : X-box binding protein-1 4E-BP1 : eif4e (eukaryotic initiation factor 4E)-binding protein 1

13 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Hücrenin gereksinim duyduğu proteinlerin ve lipidlerin (yağların) üretimi, karbonhidratların ve steroidlerin metabolize edilmesi ve kalsiyumun depolanması gibi pek çok işlevi yerine getiren, birbiriyle bağlantılı kanal ve kese biçimindeki yapılardan oluşan organele endoplazmik retikulum denir. ER stres konusundaki çalışmalar yapılmadan önce endoplazmik retikulum sadece protein trafiğinden sorumlu bir organel olarak biliniyordu. Vücudun temel yapılarından biri olan proteinin vücudun büyük bir kısmını oluşturduğunu biliyoruz. Bu sebeple ER metabolizmasının düzgün işleyişi vücut sağlığı açısından oldukça önemlidir. Fakat aşırı besin alımı gibi durumların ortaya çıkması ile protein oluşumu artmakta ve ER nin çalışma kapasitesi gelen talebi karşılayamamaktadır. Sonuçta ER de katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin birikmesi ve ER homeostazisinin bozulması durumunda ortaya endoplazmik retikulum stresi dediğimiz durum ortaya çıkmaktadır. ER stresin birçok hastalıkla ilişkilendirilmesi ile ER stres konusundaki çalışmalar artmıştır. ER fonksiyonu enfeksiyon, hipoksi, kimyasal toksinlere maruz kalma, aşırı lipit birikimi ve genetik bozukluklar sonucunda da bozularak strese neden olabilir. Vücut bu durumda stresi azaltmak için UPR (unfolded protein response) denilen katlanmamış protein yanıtı oluşturur. Bu yanıtın oluşmasının ardından protein metabolizmasında sentezin yavaşlatılması ve yıkımın artırılması suretiyle ER nin yükünü azaltıcı yönde bir sinyal ağı oluşturulur. UPR aktive edilmiş olur. UPR nin aktifleşmesi ile, ER membran proteinleri PERK, IRE-1 ve ATF-6 yolu ile stres cevabı oluşturulur. ER stresinin ilk yanıtı, PERK aktivasyonu yolu ile 4E-BP1 proteinini fosforile ederek global protein translasyon inhibisyonudur. Nükleusa transloke olan ATF-6 transkripsiyon faktörü, XBP-1s transkripsiyon faktörünün ekspresyonunu sağlar. XBP-1s, ERSE (endoplasmic reticulum stress element) ve UPRE

14 2 (unfolded protein response element) DNA bölgelerini içeren genlere bağlanarak ER genişlemesinde, katlama kapasitesinin artmasında ve ER ilişkili yıkım yolunun aktivasyonunda rol alan genlerin transkripsiyonunu uyarır ve ER un üzerine binen talep yükünün karşılanmasını sağlar. Böylece ER üzerine binen yük azalır ve ER homeostazisi korunmuş olur (1-2). Buna rağmen ER katlama kapasitesi yeterli olmaz ise hücrede ER şaperonları ve katlama mekanizması elemanlarının transkripsiyonunu artıracak UPR sinyalleri çekirdeğe ulaştırılır. Uzayan UPR sinyal iletimi bazı hücrelerin fenotipinin değişmesi, yani farklılaşması ile ilişkilidir. Bir hücre salgı hücresine dönüşeceği zaman aşırı protein sentezi ve modifikasyonu talebi ER un UPR yolu ile kapasitesini artırması ve sitoplazmada yayılması ile sonuçlanır. Bu nedenle UPR hücresel farklılaşmada rol oynar. ER stresi, hücrenin adapte olamayacağı kadar büyük olursa hücre ölebilir. UPR, ER stresinin azalmaması durumunda hücreyi apoptoza yönlendirir. ER stresine neden olan durumlar arasında mutant protein üretimine veya aşırı protein sentezine neden olan genetik bozukluklar önemli bir yer tutar. Örneğin; otozomal resesif geçişli genetik bir hastalık olan kistik fibroz, CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) genindeki bir mutasyon nedeni ile yanlış katlanması sonucunda ER stresi görülür ve mutant protein ERAD (Endoplasmic reticulum associated degredation) yoluyla yıkıma gider. Otozomal dominant geçişli huntington hastalığı, huntingtin proteinindeki poliglutamin tekrarlarındaki mutasyon sonucu, ERAD yoluyla yıkılamaz ve ER stresi uyarılır ve hücreler apoptoz yolu ile ölür. Bugün ER stresin tetiklendiği birçok hastalık grubu bilinmektedir. Bunlar arasında nörodejeneratif hastalıkları (amyotropik lateral skleroz, parkinson, alzheimer, huntington), iskemi/reperfüzyon hasarı olan hastalıkları, metabolik hastalıklar içerisinde ise tip 2 diyabet ve obeziteyi saymak mümkündür. Ayrıca alzheimer hastalığında beyinde görülen patolojinin kastaki homologu olarak bilinen ve bir dejeneratif kas hastalığı olan inklüzyon cisimcik miyoziti (IBM) de ER stresinin tetiklendiği hastalık grupları arasında bulunmaktadır (3). Bu çalışmada ki amacımız endoplazmik retikulum ve ER stresi hakkında genel bilgi vererek, ER stresi mekanizmalarını ve ER stresin hastalıklarla olan ilişkisini açıklamaktır.

15 3 2. GENEL BİLGİ 2.1. ENDOPLAZMİK RETİKULUM Hücrenin belli işlevleri gerçekleştirmek üzere özelleşmiş organellerinden biridir. Birbiriyle bağlantılı kanal ve kese biçimindeki yapılardan oluşan bu organel hücrenin gereksinim duyduğu proteinlerin ve lipidlerin (yağların) üretimi, karbonhidratların ve steroidlerin metabolize edilmesi ve kalsiyumun depolanması gibi pek çok işlev üstlenmektedir. Şekil 2.1. Endoplazmik retikulumun birbirleriyle bağlantılı kanal ve kese biçimindeki yapıları (4) Canlılığın en temel özelliklerinden biri canlı sistemin bir bariyerle çevreden ayrılmış olmasıdır. Tüm canlılar hücrelerden oluşur ve tüm hücreler bir zarla çevrilidir. Ancak bir zar aracılığıyla çevresinden ayrılma özelliği sadece hücrenin bütününde değil çeşitli işlevleri üstlenen alt birimler olan organellerde de görülebilen bir özelliktir. Hatta ökaryot hücrelerdeki toplam zar yüzeyinin çok büyük bir kısmını organeller oluşturur. Bu oranda en büyük paya sahip organel de hücrenin dış ve iç zarları toplamının yaklaşık yarısını oluşturan endoplazmik retikulumdur. ER, ökaryotik hücrelerde bulunan, yapısında çoklu kesecik ve kanal sistemleri içeren organel ya da başka bir tanımla,

16 4 hücrede hücre zarı ile çekirdek arasında madde taşıyan ince kanalcıklardır yılında Porter, elektron mikroskobu ile yaptığı çalışmalarda, hücre sitoplazmasının dantel şeklinde bir ağ manzarası görünümünde olduğunu saptamıştır. Bu ağ yapı hücrenin ektoplazmasında görülmediği için Porter ve arkadaşları buna endoplazmik retikulum (plazma içi ağı) adını vermişlerdir. Yapılan daha derin çalışmalar endoplazmik retikulumun sitoplazmada bulunan bir koful sistemi olduğu ve bu sistemin bir zarla çevrilmiş olduğu saptanmıştır. Endoplazmik matriks ise koful sisteminin dışında yani kofullar arasında kalan alanı doldurur. ER, golgi aygıtı ve lizozomun oluşturduğu yapıya endoplazmik vakuol sistemi adı verilir (4). ER zarı A kadardır. Kalınlığı hücre zarından az olduğu halde aynı yapıyı gösterir. Bu zar sistemin yüzey genişliği bazı dokularda ölçülmüştür. İzole bir yapı olmayan ER çekirdek zarı ile birleşerek adeta kapalı bir alan oluşturur. ER çekirdek zarı ile birleşik durumdadır ve sitoplazma içinde çok kıvrımlı yapıda, kapalı bir alan oluşturur. Elektron mikroskobuyla incelendiğinde ER nin sitoplazmaya bakan tarafında bazı bölgelerde granüllü yapılar olduğu görülür. Bu görüntüye dayanarak ER yi granüllü ve granülsüz (düz) olmak üzere ikiye ayırabiliriz. Bu iki yapının dış görünüşleri faklı olduğu gibi işlevleri de farklıdır. Yüzeyinde tutunmuş halde ribozomlar bulunan granüllü ER de ağırlıklı olarak protein sentezi gerçekleşirken düz endoplazmik retikulumda daha çok lipidler sentezlenir. Düz ve granüllü endoplazmik retikulum oranı hücrenin protein veya lipid sentezleme durumuna göre değişir. Örneğin; böbrek üstü bezi hücreleri gibi steroid sentezleyen hücrelerde sitoplazmanın büyük bir bölümünü düz endoplazmik retikulum kaplar. ER nin yapısı gereği hücredeki görevleri oldukça çeşitlidir. Genellikle zar proteinlerinin (transmembran reseptörleri ve integral zar proteinlerinin) üç boyutlu şekillerini almasında, üretilen zar proteinlerinin taşınması ya da hücre dışına yollanmasında (ekzositoz) (örn; mide iç yüzeyindeki hücrelerden salgılanan pepsin), kalsiyum iyonlarının hücre içinde depolanmasında, ayrıca steroidlerin, glikojenin ve birçok başka makromolekülün depolanmasında aktif görev alır (4).

17 5 Şekil 2.2. Granüllü endoplazmik retikulum. Koyu yeşil renkli noktalar protein sentezleyen ribozomları göstermektedir (5) Granüllü Endoplazmik Retikulum Özellikle protein sentezinin yoğun olduğu hücrelerde daha fazla bulunur. Sitoplazmaya bakan yüzünde çok sayıda granül vardır. Bu yapılar protein sentezleyen ribozom gruplarıdır. Burada sentezlenen proteinler sitoplazmadan yalıtılmış durumdadır. Hücrede proteinler ya serbest ribozomlarda ya da endoplazmik retikuluma bağlanan ribozomlarda sentezlenir. Bir proteinin hangi ribozomlarda sentezleneceği önemlidir. Çünkü sentez yeri aynı zamanda proteinin gideceği yer ve işlevleriyle de ilişkilidir. Sitoplazmadaki serbest ribozomlarda daha çok hücre içi işlevleri olan proteinler sentezlenirken, ER ye bağlanan ribozomlarda ise genellikle hücre dışına gönderilen veya hücre zarında ve bazı organellerde görev alan proteinler sentezlenir. ER ye yönlendirilecek proteinlerin şifresini taşıyan mrna ların bir ucunda proteinin gideceği yeri belirten ek bir baz dizisi var. Bu baz dizisine sahip mrna ları okuyan ribozomla ER deki özel bir bölgeye bağlanır ve sentezlediği proteinler ER nin iç kısmına geçer. Sentezlenen proteinler burada bazı işlemlerden geçirilir ve daha sonra gerekli yere gönderilir.

18 6 Ancak söz konusu protein olunca iş sentezle bitmez. Çünkü yaşamın devamı hücrelerdeki proteinlerin doğru işlev görmesine bağlıdır. Proteinlerde doğru işlev için doğru üç boyutlu yapı ön koşuldur. Dolayısıyla yaşamın varlığı ve devamı proteinlerin istenilen üç boyutlu yapıda olmasına bağlıdır. Proteinlerde sentez sonrası aşama bu nedenle çok önemlidir. Zincir seklinde sentezlenen proteinlerin sentez sırasında veya sentezden sonra kıvrılıp istenilen üç boyutlu yapıya geçmesi gerekir. Bu kıvrılma işlemi için genellikle şaperon denilen yardımcı proteinlere gereksinim duyulur. Proteinlerin katlanma işlemleri çok karmaşıktır ve hata olasılığı oldukça yüksektir. Çünkü zincir biçimindeki bir yapının üç boyutlu uzayda katlanabileceği sayısız şekil var ve bunların pek çoğu işlevsel değildir. Ayrıca oksidatif stres, enfeksiyonlar, hidrojen iyon konsantrasyonu, ortamın sıcaklığı gibi çok sayıda farklı etken de proteinlerin doğru katlanması üzerinde etkilidir. Yanlış katlanan proteinler aşağıda bahsedildiği gibi hücreye ciddi zararlar verebilir. Örneğin; yanlış katlanan proteinlerin hücrede birikmesi kanser ve alzheimer gibi ciddi hastalıklara neden olabilir. Bu durumda protein katlanması sırasında şaperonların yardımı çok önemlidir (5). Ancak şaperonların yardımına rağmen, olumsuz etkenlerden dolayı yine de endoplazmik retikulumda sentezlenen proteinlerin bir kısmı istenilen üç boyutlu şekilde katlanmayabilir. Bu durumda katlanamayan veya yanlış katlanan proteinlerin birikmesi hücre tarafından sıkı bir şekilde izlenmelidir. Katlanan proteinleri kontrol eden, katlanamayanları ve yanlış katlananları tespit eden ve ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan iyi organize olmuş bir kalite kontrol sistemi vardır. Bu sistem endoplazmik retikulumdaki tüm proteinleri kontrol ederek bir uyumsuzluğun veya şekil bozukluğunun olup olmadığını belirler. Yapılan kontrol sonucu eğer proteinin yapısında bir anormallik saptanmazsa görev yapacağı yere gönderilir. Eğer kontrol sırasında proteinin yapısının istenilen özelliklere sahip olmadığı görülürse protein sitozole geri gönderilir ve burada parçalanarak temel yapıtaşları olan amino asitlere ayrılır. Açığa çıkan amino asitler hücrenin ihtiyacına göre farklı amaçlar için kullanılır. Yani yanlış imalat sonucu oluşan proteinler yeniden kullanıma sunulur. Eğer herhangi bir bölgede yanlış katlanan proteinlerin miktarında artış varsa hücre bunları sadece ortamdan uzaklaştırmakla kalmaz, daha ciddi ek tedbirler de alır. Tüm bu işlemler protein biyokimyasının sadece sentezden ibaret olmadığının ve sentez sonrası işlemlerinde en az doğru sentez kadar önemli olduğunun bir göstergesidir (6).

19 Düz Endoplazmik Retikulum ER nin bu bölgesi, ribozomlar bulunmadığı için, granülsüz veya düz endoplazmik retikulum olarak bilinir. Hücreyi ve organelleri çevreleyen zarların yapısında bulunan lipidlerin büyük çoğunluğu düz ER de sentezlenir. Hücre dışına gönderilen proteinler granüllü ER de sentezlenirken karaciğerde sentezlenen lipoproteinlerde olduğu gibi, hücre dışına gönderilen lipidler de düz ER de sentezlenir. Düz ER de sadece lipid sentezi gerçekleşmez. Örneğin; karaciğer hücrelerinde, düz ER de bazı ilaçların ve yabancı maddelerin zararsız hale getirilmesi işlemleri de yürütülür. Endoplazmik retikulumun çok önemli bir işlevi de hücre içi kalsiyum deposu olarak işlev görmesidir. Ancak bu depolama işlevi dinamik bir biçimde gerçekleşir ve aslında hücre içi kalsiyum yoğunluğunun ayarlanmasını sağlar. Yani gereksinime göre sitozole kalsiyum verilir veya depolanmak üzere sitozolden kalsiyum geri alınır. Endoplazmik retikulumun bir bölümü kalsiyum depolayabilecek, özel bir yapıya sahiptir. Kalsiyum hücre içine verildiğinde birçok metabolik olay tetiklenir, bu nedenle hücre içine verilen kalsiyumun gereksinim olmadığında tekrar geri alınması gerekir (6). Düz ve granüllü endoplazmik retikulum başta seker metabolizması olmak üzere daha pek çok biyokimyasal süreçte görev alır. Ayrıca kanser, seker hastalığı, alzheimer gibi pek çok hastalık yanlış katlanan proteinlerle, damar sertliği ve obezite gibi bir takım hastalıklarda lipid metabolizmasıyla ilişkili olduğu için ER tüm bu hastalıkların odağında yer alır. Etkin tedaviler geliştirebilmek için ER de meydana gelen moleküler ve biyokimyasal süreçleri daha iyi anlamak durumundayız. Bundan sonraki kısımda ER stresi ve vücuttaki etkilerini ayrıntılı olarak işleyeceğiz.

20 8 Şekil 2.3: Granüllü endoplazmik retikulum (kahverengi) ve mitokondrinin (mavi) elektron mikroskobik görüntüsü. Kıvrımlı yapıya sahip olan endoplazmik retikulum üzerinde çok sayıda ribozom (granüllü yapılar) bulunmaktadır (5) 2.2. ENDOPLAZMİK RETİKULUM (ER) STRES ER, yeni sentezlenen proteinlerin katlanmasının, modifikasyonlarının ve lipit metabolizmasının yürütüldüğü özelleşmiş bir çevre oluşturan, membranla çevrili, ağsı bir hücre içi organeldir. ER üzerinde artan metabolik talep, organelin işlevini yerine getirememesine neden olabilir. İnfeksiyon, hipoksi, kimyasal toksinlere maruz kalma, aşırı lipit birikimi ve besin yetmezliği ve çeşitli genetik bozukluklar gibi biyolojik koşullar ER homeostazisini bozabilir ve katlanmamış ya da yanlış katlanmış proteinlerin ER lümeninde birikmesine, dolayısı ile ER stresine neden olabilir. ER stresini azaltmak için katlanmamış protein cevabı (UPR) denilen, protein sentezini yavaşlatan ve protein yıkımını artıran bir sinyal yolu aktive edilir (7-8). Aktive olan UPR, ER membran proteinleri PERK, IRE-1 ve ATF-6 yolu ile stres cevabı oluşturur. ER stresinin birincil cevabı, PERK aktivasyonu yolu ile 4E-BP1 proteinini

21 9 fosforilleyerek global protein translasyon inhibisyonudur. IRE-1, JNK ı aktive ederek etki gösterir. Nükleusa transloke olan ATF-6 (Activating transcription factor-6) transkripsiyon faktörü, XBP-1s transkripsiyon faktörünün ekspresyonunu sağlar. XBP-1s, ERSE ve UPRE, DNA bölgelerini içeren genlere bağlanarak ER genişlemesinde, katlama kapasitesinin artmasında ve ER ilişkili yıkım yolunun aktivasyonunda rol alan genlerin transkripsiyonunu uyarır ve ER un üzerine binen talep yükünün karşılanmasını sağlar. Böylece ER üzerine binen yük azalır ve ER homeostazisi korunmuş olur (1,2). ER stresine neden olan durumlar arasında mutant protein üretimine veya aşırı protein sentezine neden olan genetik bozukluklar önemli bir yer tutar. Örneğin; otozomal resesif geçişli genetik bir hastalık kistik fibroz, CFTR genindeki bir mutasyon nedeni ile yanlış katlanması sonucunda ER stresi görülür ve mutant protein ERAD yoluyla yıkıma gider. Otozomal dominant geçişli huntington hastalığı, huntingtin proteinindeki poliglutamin tekrarlarındaki mutasyon sonucu, ERAD yoluyla yıkılamaz ve ER stresi uyarılır ve hücreler apoptoz yolu ile ölür (1,9). UPR nin başlangıçtaki amacı değişen ortama uyum sağlayarak ER ye normal fonksiyonunu geri kazandırmaktır. Bu adaptasyon mekanizmaları ER nin protein katlama kapasitesini artıran genlerin etkinliğini hızlandıran transkripsiyonel programları içerir. Mekanizmaların devreye girmesi sonucunda ER ilişkili proteinlerin aktivasyonu ile katlanmamış proteinler ayrıştırılır. mrna ların translasyonu UPR proteinlerinin üretimini mrna ya kadar kodlar ve ER deki yeni proteinlerin akışını azaltarak inhibe eder. Adaptasyon başarısız olduğunda ise ER, NF-kB (Nuclear factor kappa B) aktivasyonu ile sinyal başlatır. Bu sinyalle oluşan faktörlerden birisi konuk savunma mediyatörlerinin salınmasını kodlayan genlerin aktif hale getirilmesidir. Bu genler sayesinde, aşırı ve uzun stres durumlarında çok hücreli organizmalar son çare olarak işlevsiz hücrelerini dağıtmak ve yok etmek için genellikle apoptoz formunda hücre intiharını tetikleyebilir. Bizim için gelişme sayılabilecek şey ise ER stresin rol oynadığı hastalıklardaki adaptasyon ve apoptoz fazlarının mekanizmalarını anlamak bize tedavi çalışmalarında önemli bilgiler verir.

22 ER Stres Adaptasyonu Endopazmik retikulumda katlanmamış proteinler biriktiği zaman ortamda bulunan şaperonlar görevini yerine getiremez hale gelir. Bu durum hücre için sağlıklı sonuçlar oluşturmayacağından hücre yönetimi bu duruma karşı çeşitli önlemler alır. Bunlardan bazıları: Yanlış katlanan proteinlerin üretiminin azaltılması veya durdurulması Proteinlerin doğru katlanmasına yardımcı olan şaperonların sentezinin artırılması Yanlış katlanan proteinlerin görev yapacakları yerlere gönderilmesinin durdurulması Yanlış katlanan proteinlerin yıkılmak üzere hızla ortamdan uzaklaştırılması Yanlış katlanan proteinleri endoplazmik retikulumdan sitozole gönderen proteinlerin sentezinin artırılması Sitozolde yıkımı gerçekleştiren proteinlerin sentezinin artırılması Transmembran proteinleri endoplazmik retikulumda uzun süre bekleyemez. Sentezlenen bir proteinin en kısa sürede görev yapacağı yere gönderilmesi gerekir. Aksi takdirde ise işe yaramaz protein muamelesi görür ve bulunduğu yerden parçalanmak üzere sitoplazmaya alınır (4). Bu transmembran proteinlerinin iki bölme arasındaki geçişlerde köprü görevi vardır ve ER lümeninde N-terminus, sitoplazmada ise C-terminus ile ER membranına bağlıdır. Normalde transmembran proteinlerinin agregasyonunu ER, Grp 78 ile önler fakat ortamda katlanmamış proteinler biriktiği zaman agregasyona Grp izin verir ve sinyal ile UPR başlatılır. UPR de yolakları bulunan önemli transmembran proteinlerinden bazıları; PERK, IRE1, ATF6 dır (10,11,12). PERK ökaryotlardaki 2α başlatma faktörlerinin Ser/Thr protein kinazıdır. Grp78 in kaldırılması kinaz etkiyi ve otofosforilasyonu indükler ve ER membranında PERK oligomeri oluşur. PERK elf2α yı fosforile ve inaktive eder. Böylece ER de mrna çevirisi durur ve protein yükü azaltılır. Ancak bazı mrna lar mrna çeviri faktörü ATF4 ün kodlanmasını indükleyerek bu koşullar altında bile çeviri için özel bir avantaj elde ederler.

23 11 Şekil 2.4: ER stresle ilişkili sinyal iletim olayları (10,11) Grp78 şaperonu, PERK, ATF6 ve IRE1 in N-terminisuna bunların aktivasyonunu önlemek için bağlanır. ER deki katlanmamış proteinler PERK, ATF6 ve IRE1 in salınması için Grp78 in salınmasına neden olurlar. Grp78 salındığında PERK ve IRE1 ER membranında oligomerize olur. Oligomerize olmuş IRE1, NF-kB ve c- Jun u aktive ederek alarm genlerinin uyarılmasına neden olan TRAF2 ye bağlanır. IRE1 in özgül aktivitesi protein katlanmasının düzenlenmesiyle alakalı genlerin ekspresyonunu indükleyen transkripsiyonel faktördür. Ayrıca XBP-1 in üretimiyle sonuçlanır. PERK in oligomerizyonu mrna translasyonun baskılanması ve elf2α nın fosforilasyonu ile sonuçlanan kinaz aktivitelerini artırır. Bu koşullar altında ATF4 dahil sadece seçilmiş mrna'lar çevrilir. ATF4 ER homeostazisinin düzenlenmesiyle alakalı genlerin ekspresyonunu indükler. ATF6 dan Grp78 salınması, prototeolitik işleme için golgi apereyine proteini değiştirmesi için izin verir.

24 Endoplazmik Retikulum (ER) Stresi ve UPR Sinyal Yolu ER, ribozomda sentezlenen proteinlerin hücreye ve görev yerlerine uyum sağlamaları, proteinlerin katlanması, translasyonu ve aktarımında görevli bir organeldir. Bu görevi doğrultusunda hücre tarafından talep edilen protein modifikasyonunu gerçekleştirir. Bu talebin ER nin çalışma kapasitesini aştığı zamanlar olur. Bu durum hipoksi, genetik bozukluklar, yetersiz besin alımı gibi farklı sebeplerden kaynaklanabilir. Sonuçta ER hemoostazisi bozulur ve katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinlerin ER lümeninde birikimi gerçekleşir ve sonuç olarak ER stresi dediğimiz hücresel tepki ortaya çıkar (2). ER streste hücrede bazı biyokimyasal olaylar gelişir. Bu durum hücrede istenmeyen değişikliklere neden olur. Hücre istenmeyen bu değişiklikleri önlemek için ER stresi azaltıcı ya da yok edici UPR (Unfolded protein respons- katlanmamış protein yanıtı) denilen sinyal yolunu başlatır. ER nin normal fonksiyonun bozulmaması için katlanmamış polipeptit zincir yükünün ER katlama kapasitesini aşmaması gerekir. Kapasitenin aşılma durumu kan koagülasyon faktörü VIII gibi yüksek moleküler ağırlıklı ve modifikasyonu zor olan veya antitrombin gibi küçük ve yapısal olarak basit bir proteinin aşırı ekspresyonu ile gerçekleşebilir. Bu proteinlerin ER şaperonları ile kompleks oluşturdukları veya yüksek moleküler agregatlar oluşturdukları gösterilmiştir. Yani ER şaperonlarının ekspresyonu mutant ve katlanamayan proteinlerin ekspresyonuna neden olmaktadır. Sonuçta bu durum birçok biyokimyasal hastalığın temelini oluşturmaktadır (2). ER oluşan strese karşı aşırı yük talebini karşılamak amacıyla katlama kapasitesini artırır ve UPR yoluyla protein katlama talebini azaltır. Protein katlama talebinin azaltılması için salgı proteinlerini kodlayan genlerin ekspresyonu ve translasyonu baskılanır. Ayrıca ER stresin oluşumuna neden olan katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinler yıkılır. Bu yıkım ERAD ile yapılır. ERAD bunun yanında hücre dışından gelen protein sentezi uyarımınıda bloke eder. Buna rağmen ER katlama kapasitesi yeterli olmaz ise hücrede ER şaperonları ve katlama mekanizması elemanlarının transkripsiyonunu artıracak UPR sinyalleri çekirdeğe ulaştırılır. Uzayan UPR sinyal iletimi bazı hücrelerin fenotipinin değişmesi, yani farklılaşması ile ilişkilidir. Bir hücre, salgı hücresine dönüşeceği zaman aşırı protein sentezi ve modifikasyonu talebi ER un UPR yolu ile kapasitesini artırması ve

25 13 sitoplazmada yayılması ile sonuçlanır. Bu nedenle UPR hücresel farklılaşmada rol oynar. ER stresi, hücrenin adapte olamayacağı kadar büyük olursa hücre ölebilir. UPR, ER stresinin azalmaması durumunda hücreyi apoptoza yönlendirir (13). Şekil 2.5. ER stresi ve katlanmamış protein cevabı UPR (13) Katlanmamış proteinler ERAD a gönderilir. ER a binen yük katlama kapasitesini aşarsa UPR sinyal ağı aktive edilir. UPR sinyal ağı translasyonu durdurur, ER katlama kapasitesini artıran ve stresin azalmasında görevli genlerin transkripsiyonunu uyarır. ER, protein yüküne cevap veremezse, yani UPR nin ER stresini azaltamadığı durumlarda hücre apoptoza yönlendirilir (13). Aşağıda UPR sinyal yolunun mekanizmasında yer alan yolaklar ayrıntılı bir şekilde ele alınmaya çalışılmıştır PERK Aktivasyonu ER transmembran proteini olan PERK tüm hücrelerde sentezlenir. Fakat salgı hücrelerinde sentezi daha fazladır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda PERK in ER stresi tarafından aktive edildiği gösterilmiştir. PERK, lüminal bölgesinde protein katlanma döngüsünde rol oynayan bir şaperon olan GRP78/BiP proteini ile bağlanma bölgesi içerir. Katlanmamış ya da yanlış katlanmış proteinlerin lümende birikmesi GRP78 in PERK ten ayrılmasına ve PERK in oligomerize olmasına neden olur. Oligomerizasyon sonucunda PERK otofosforile olur ve kendini aktive eder. Aktive olan PERK

26 14 translasyon başlangıç faktörü eif2α yı fosforiller. eif2α fosforile durumda iken GEF görevi gören eif2b ye bağlı kalır ve böylece translasyon başlangıç kompleksi eif2α/gtp/met-trna i oluşumu engellenir ve translasyon durdurulur. Böylece ER a binen iş yükü azalır. eif2α fosforilasyo sonucu global olarak translasyonu azaltırken belirli mrna ların translasyonunu uyarmaktadır. ER stresi durumunda eif2α nın fosforilasyonu, ER stresi cevabında rol oynayan ATF-4 transkripsiyon faktörünün translasyonunu ve dolayısı ile aminoasit metabolizması ve transportunda, ERAD da, ER un genişlemesinde görev alan genlerin transkripsiyonunu uyarır (1,9,14,15) ATF-6 Aktivasyonu ATF-6, sitozolik bölgesi bzip transkripsiyon faktörü olarak görev yapan tip II ER transmembran proteinidir. Memelilerde ATF-6α ve ATF-6β/CREB-RP olmak üzere iki homoloğu bulunur. ER da protein katlanması inhibe olduktan sonra ATF-6 golgi kompleksine göç eder. ATF-6 nın golgi ye göç etmesinde, GRP78 in rolü vardır. ATF- 6 nın luminal bölgesinde GLS1 ve GLS2 olarak adlandırılan golgi lokalizasyon dizisi mevcuttur. GRP78, GLS1 e bağlanır ve ATF-6 yı ER membranında tutar. ER lumeninde katlanmamış proteinlerin varlığı GRP78 in GLS1 den ayrılmasına neden olur ve GLS2 aktive olarak ATF-6 nın golgi ye göçünü uyarır. Bir serin proteaz olan S1P enzimi, ATF-6 nın luminal bölgesini keser. Bir diğer enzim metalloproteaz S2P, ATF-6 nın transmembran bölgesini keser. Bu reaksiyon sonucunda ATF-6 (Activating transcription factor-6) nın sitozolik bzip bölgesi serbest kalır ve nükleusa giderek transkripsiyonu başlatır. ATF-6, DNA üzerindeki ATF/CRE bölgelerine, ERSE-I e (CCAAT-N 9 -CCACG) ve ERSE-II ye (ATTGG-N-CCACG) bağlanır. ATF-6 nın ERSE-I ve ERSE-II ye bağlanabilmesi için NF- Y/CBF ye ihtiyacı vardır. ATF-6, ER stresinin azalmasında büyük rolü olan UPR ın önemli elemanlarından XBP-1 in transkripsiyonunu uyarır. XBP-1 nin, mrna nın aktivasyonu için splice işlemine uğraması gerekmektedir. XBP-1 in splice edilmiş formu (XBP-1s) UPR nin transkripsiyonel cevaplarını tetikleyerek ER un genişlemesini ve şaperonların artmasını sağlar ve uzun süreli ER stresini azaltır (1,2,9,16).

27 15 Şekil 2.6: ER stresi algılayıcı proteinlerinin primer yapılarının şematik gösterimi (13) IRE-1, PERK ve ATF-6. Sarı ince çubuklar sinyal iletimi ve oligomerizasyon için yeterli bölgeleri göstermektedir. Mor çubuklar GRP78 le ilişkiye girilen bölgeleri göstermektedir. Siyah kutular sinyal peptidlerini, yeşil kutular ise IRE1 ve PERK arasındaki homoloji bölgelerini temsil etmektedir. bzip: basic leucine zipper, GLS1 ve GLS2: Golgi lokalizasyon dizisi 1 ve 2, TAD:Transkripsiyonel aktivasyon bölgesi, TM: transmembran bölge (13) IRE-1 Aktivasyonu IRE-1 enzimi, ER luminal dimerizasyon ve sitozolik kinaz ve endoribonükleaz bölgeleri içeren tip I ER transmembran proteindir. ER stresi durumunda GRP78 in dimerizasyon bölgesinden ayrılması ile IRE-1 dimerize olur ve transotofosforilasyona uğrayarak aktivasyon kazanır. Memelilerde IRE-1 in iki izoformu vardır. IRE-1α bütün dokularda gözlenirken IRE-1β sadece barsak epitelyum hücrelerinde görülmektedir. IRE-1α-/- fareler yaşamazken IRE-1β-/- fareler sağlıklıdırlar fakat barsak iltihaplarına (kolit) daha yatkındırlar. UPR nin IRE-1 kolu evrim süresince en iyi korunmuş ve moleküler anlamda UPR sinyal ağının bulunan ilk sinyal koludur (9,14).

28 16 IRE-1 endoribonükleaz bölgesinin keşfedilen ilk substratı bzip transkripsiyon faktörü olan XBP-1 mrna sıdır. XBP-1 in 26 nükleotidlik inhibitör intron bölgesinin IRE-1 endoribonükleaz tarafından kesip atılmasından sonra translasyonel çerçeve kayması sonucu oluşan XBP-1s plazma hücrelerinin farklılaşmasında rol oynar. XBP-1 salgı hücrelerinde yüksek seviyelerde exprese edilmektedir. XBP-1s, hücrelerin artan protein sentezi ve modifikasyonu taleplerine cevap verebilmesi için ER un genişlemesinden sorumlu genlerin transkripsiyonunu artırarak hücrelerin farklılaşmasında rol oynamaktadır. XBP-1s, ERSE-I, ERSE-II ve UPRE (TGACGTGC/A) motiflerine bağlanarak şaperon, ER ilişkili yıkım ve ER genişlemesini sağlayan fosfolipit sentezi ile ilgili genlerin transkripsiyonunu artırır (9,14,17). IRE-1 in kinaz domaininin aktivasyonu ile JNK sinyal yolunun aktivasyonunda rol oynar. IRE-1 in sitoplazmik domaini bir adaptör protein olan TRAF2 ile etkileşerek aşağı sinyal akışını aktive eder. TRAF2 ASK1 e bağlanır ve ASK1 JNK ı fosforilleyerek aktive eder. IRE-1 in bu etkisi ER stresi ile büyüme faktörleri ve mitojenler arasında köprü kurulmasını sağlar. Aktive olan JNK insülin sinyal elemanları IR, IRS1 ve IRS2 yi serin bakiyelerinden fosforilleyerek insülinin hücre içine sinyal iletmesini inhibe eder ve böylece insülin direnci oluşur. Bu yol ile IRE-1, ER üzerine binecek insülin uyarımlı protein sentezi ve modifikasyonu yükünü engellemiş olur (17-18) ER`da Protein Katlanması ER, sitoplazmadan sonra en önemli protein katlanma bölgesidir. Sitozoldeki protein katlanma kuralları ER için de geçerlidir. Fakat katlanması için ER a aktarılan proteinler N-bağlı glikozilasyon ve disülfit bağı oluşumu gibi posttranslasyonel modifikasyona uğradıklarından, ER da gerçekleşen protein katlanması sitozoldekinden daha karmaşıktır. ER, sadece doğru katlanmış ve birleşmiş proteinlerin çıkış yapmasını garanti altına almak için kalite kontrol denilen bir sisteme sahiptir. Kalite kontrol sisteminden beklenen, katlanmış ve katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinleri birbirinden ayırmaktır. Bazı proteinler, mutasyonlar veya hücrenin enerji ihtiyacı nedeniyle, şaperon döngüsünü tamamlayamazlar ve tam olarak katlanamazlar dakikalık bir lag fazından sonra yanlış katlanmış proteinler ERAD a gönderilirler. ERAD substratları olan bu katlanmamış proteinler sitozole ulaştıkları anda

29 17 ubikitin/proteozom yıkım yolu ile yıkılırlar. Proteinlerin doğru katlanmasını sağlayan bu yolun etkili bir şekilde işlemesi için ER daki katlanma talep yükünün sitozole ve çekirdeğe devamlı olarak bildirilmesi gereklidir. ER talebi karşılayamayacak durumda ise ER Stresi denilen durum oluşur ve bir sinyal ağı başlatılır. ER daki protein katlanma durumu sitozole ve çekirdeğe UPR sinyal ağı aracılığı ile bildirilir (2,9,14). ER, ait olduğu hücreye gelen protein sentezi talebine göre anlık protein modifikasyon talep artışı ile karşılaşabilir. Böyle durumlarda oluşan ER stresi ilk etapta, ER un katlama kapasitesini artırmaktan ziyade transkripsiyondan bağımsız olarak, hatalı protein katlanması ihtimalini azaltmak için translasyonu UPR aracılığı ile kontrol altına alır. UPR sinyal ağı ilk olarak tip I transmembran kinazlar PERK ve IRE-1 in aktivasyonu ve ardından tip II transmembran proteini ATF-6 aktivasyonu ile başlatılır (Şekil 2.7) (1,2,9,16,19). Şekil 2.7: ER`de protein katlanması (13)

30 18 Stres olmadığında GRP78 şaperon proteini, ATF-6, PERK ve IRE-1 ER membran proteinlerinin luminal bölgelerine bağlı konumdadır. Artan protein trafiği, mutant proteinlerin sentezi, viral enfeksiyonlar ve glukoz açlığı gibi stres durumlarında GRP78 ER stresi algılayıcı proteinlerinden ayrılır, katlanmamış proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanır ve katlanmayan proteinleri ERAD a gönderir. GRP78 in ayrılması ile aktive olan PERK eif2α yı fosforilleyerek translasyonu durdurur. Bir diğer ER stresi algılayıcısı olan ATF-6 Golgiye göç eder, orada aktive olur, nukleuse gider ve ERSE- UPRE içeren genlerin transkripsiyonunu aktive ederek ER un katlama kapasitesini artırır. IRE-1 TRAF2 yolu ile JNK ı aktive eder. JNK serin kinaz enzimi büyüme faktörlerinin uyardığı sinyal yollarını baskılayarak protein sentezi yönündeki talepleri engeller. IRE-1 endoribonükleaz bölgesi ile XBP-1 mrna sını kesip yeniden düzenler ve aktif transkripsiyon faktörü XBP-1s oluşur. XBP-1s ERSE-UPRE içeren, şaperon, ERAD bileşikleri ve ER un genişlemesi ile ilgili genleri aktive ederek ER un kapasitesini artırır ve ER stresinin azalmasını sağlar (13) ER STRES İLE HASTALIKLAR ARASINDAKİ İLİŞKİ Çok hücreli organizmalarda tek hücreli organizmalara göre özelleşmiş hücre tipleri arasında işbirliği vardır. Bu işbirliği farklı bir hücrenin reseptörüne bağlanarak gerçekleşir. Bu sebeple hücrelerin haberleşmeye ihtiyacı vardır. Bu haberleşme; hem çözünür ligandları hem de yüzey moleküllerinin sert hücre dışı ortamına dayanıklı sentezlenen proteinleri gerektirir. Çünkü hücre dışı ortam ile sitoplazma birbirinden çok farklıdır. Bu yüzden proteinlerin hedeflendiği bölgelere gidebilmesi için plazma içine salınmadan sitoplazmada disülfid bağı oluşumu ve glikolizasyon gibi bazı değişikliklere uğraması gerekir. Bu değişimin olması için sitoplazmada topolojik bir bölgeye ihtiyaç duyulur. Bu bölgeden sorumlu organel endoplazmik retikulumdur (20). ER fonksiyonu ve sentez kapasitesine yönelik talepler arasındaki dengeyi korumak için homeostatik bir mekanizma vardır. Ayrıca organizmalar daha karmaşık hale geldikçe bu mekanizmanın özellikle uzun ömürlü profesyonel salgı hücrelerinde önemi büyük ölçüde artmaktadır. Çünkü bu mekanizmadaki bozuklukların ER strese yol açtığı ve ER stres varlığında insanlarda çeşitli hastalıkların ortaya çıktığını görmekteyiz. Birçok hastalığa katlanmamış protein yanıtı (UPR) olarak adlandırılan ve ER deki katlanmamış protein birimleri neden olur. Bu birimler glukoz yokluğunda N-bağımlı glikolizasyonun

31 19 etkisiyle ER strese neden olurlar. Bu durum ER de şaperonların normal çalışmasını etkiler ve Ca +2 düzenlenmesi anormal bir hal alır. Bu durumda hücre oluşan hatalı işlevden dolayı UPR yi tetikler ve bu durum hücrenin ölümüne yol açar. Ayrıca bu olay proteinlerin katlanması, protein üretimi ve taşınması bozulacağından vücutta birçok hastalığa neden olabilir (20). Bu hastalıkları diyabet, obezite, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser olarak sayabiliriz ER Stres ve Diyabet Geçtiğimiz on beş yılda yapılan çalışmalarda metabolizma ve bağışıklık sistemi arasındaki ilişkinin kronik hastalıkların patogenezinde kritik bir rol oynadığı belirtilmektedir. Özellikle obezite ve tip II diyabette metabolizma ve bağışıklık sistemi arasındaki bu ilişki oldukça önemlidir. Diyabet hastalarında insülin reseptör sinyalindeki tümör nekroz faktör (TNF) molekülü mekanizmasının aydınlatılması ile bu durum daha net anlaşılmıştır (21). Daha yakın zamanlarda yapılan çalışmalarda obezite bağımlı ER stres ve JNK (c-jun N- terminal kinase) aktivasyonu ile enflamatuvar yanıt ve periferik insülin direnci başlangıcının altında yatan temel sebepler gösterilmiştir. ER, transmembran proteinlerin sentezinde, üç boyutlu yapılarının düzgün bir şekilde katlanmasında ve modifiye edilip gitmesi gereken yere ulaştırılmasında rol oynayan kritik bir görev üstlenmektedir. Yük trafiğinin artması veya mutant proteinlerin ER ye ulaşmasıyla ER stres oluşur ve UPR yanıt uyarılır. UPR, yardımcı protein katlayıcı şaperonların artmasını, transkiripsiyonel olayların aktif hale gelmesini, protein sentezinin selektif olarak azaltılmasını ve proteaz aracılı protein yıkımını uyarır. Sonuç olarak hücre patojenlere ve hipoksik sinyallere maruz kalınca ER yi uyarabilir. Bu nedenle hücrede besin ve patojenlerin en erken algılayıcısı olarak ER yi düşünebiliriz (21). Yukarıda belirtildiği gibi erken algılayıcı sistem olarak çalışan ER nin aşırı besin alımı sonucunda oluşan obezite ve diyabet gibi hastalıkların etkisiyle stres oluşturabileceği varsayılarak çalışmalara devam edilmektedir. Protein ve lipit sentezindeki artış, lipit birikimi, intraselüler besin ve enerji akışındaki düzensizlikler yapılan çalışmaların ve araştırmaların temelini oluşturur.

32 20 Bu varsayımlar incelendiğinde, obez hayvanlarda zayıf hayvanlara göre karaciğer ve adipoz dokusunda, ER stresin birçok biyomedikal göstergesinin yükseldiği gözlenmiştir. Bu gözlemler ile JNK aktivasyonu ve PERK fosforilasyonunun indüklendiği ve şaperon ekspresyonunun arttığı tespit edilmiştir. Daha sonraki çalışmalarda ise insülin aktivitesi ve insülin reseptör sinyalinin modifikasyonunda ER stres yanıtın manipülasyona yol açıp açmadığı araştırılmaktadır. Kültür edilmiş hücrelerde XBP-1, ER stresin indüklediği UPR yi düzenleyen kritik bir transkripsiyonel faktördür. ER stres JNK aktivasyonu ile insülin direncine aracılık eder ve kinaz aktivitesinin engellenmesini tersine çevirir (21). Yapılan çalışmalar ER stres ile insülin direnci arasındaki ilişkinin varlığını hayvanlarda kanıtlamıştır. Bu hayvanların karaciğer ve adipoz dokularında ER stres oluşturan faktörlerdeki artış, JNK aktivasyonu ve IRS-1 serin fosforilasyonundaki yükselmelerde açık bir şekilde görülmektedir (22). Bu bulgular tip II diyabetin ve terapötik patogenezinin anlaşılmasında yeni fikirlerin yeni modellerin oluşmasını sağlamıştır. Şekil 2.8. İnsülin etkisini engelleyen enflamatuvar ve metabolik yolların entegrasyon modeli (23)

33 21 Şekilde görüldüğü gibi obezitede ki enflamatuvar yanıtlar ER stres üzerinden veya sitokin ya da lipitlerin ekstraselüler mediyatörleri tarafından makrofajlarda ve yağ hücrelerinde tetiklenebilir. Bu mediyatörlerin tüm sinyalleri JNK, IKK ve protein kinaz C nin dahil olduğu enflamatuvar sinyal yolları üzerinde birleşir. JNK ve IKK öncülüğünde transkripsiyonel düzenleme yoluyla enflamatuvar mediyatörlerin üretimine yol açar ve böylece kısır bir döngü başlar. Bu durum doğrudan insülin reseptör sinyallerinin engellenmesine yol açar. Lipit sinyallerinin birleştirilmesi bu mediyatörlerin aktivasyonunu ve dağıtımını kontrol eden sitozolik yağ asidi bağlayıcı proteinler tarafından düzenlenir (23). ER, metabolik stresin özellikle JNK ve diğer enflamatuvar mediyatörlerinin aktivasyonunun oluştuğu ve enflamatuvar yanıtların görüldüğü organel olduğundan çalışmalar bu organel üzerinde yoğunlaşmıştır. ER stres nükleer faktör B yolağını uyarır ve bu durum insülin direncine götüren iki önemli sinyal iletimine yol açar. Bu sebeple ER stres bağımlı insülin direncinde IKK NF-B yolunu ve inflamasyon rolünü test etmek bu sistemin anlaşılmasında oldukça önemlidir. Çalışmalar ER stresin neden olduğu patolojik durumların, metabolik yanıtların ve ER stres aktivasyonuna yol açan bileşenlerin anlaşılmasına yöneliktir. Bu konuda ilgi çekici olan durum makrofaj kolestrol yükünün artması ile ER membran özelliklerinin değişmesi ve ER stres aracılı apoptotik yanıtın yol açtığı ateroskleroz ve dispepsi oluşmasıdır (23). ER stresin diyabet ile ilgili çalışmalarında sürekli bir gelişme söz konusudur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, inflamasyonun diyabet ve ilişkili hastalıkların ayrılmaz bir parçası olduğu açıkça ortaya konmuştur. Diyabet kaynaklı inflamasyon JNK ve IKK nın aktivitesi ve ER stresin indüksiyonu sonucu oluşmaktadır. Bu doğrultuda ER stres yolunu ya da enflematuvar modülasyonunu ve bu yanıt sistemleri arasındaki bağlantıyı daha iyi anlamak metabolik hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için birçok yeni seçenek sunmaktadır. Özellikle tip II diyabet tedavisinde. Diyabet hastalığının temelinde yatan metabolik bozuklukların anlaşılması için öncelikle insülin sinyal iletimi ve insülin direncinin iyice anlaşılması gerekmektedir İnsülin Duyarlılığın Azalması İnsülin, besinlerin sindirimi ve emilimi sonrasında yükselen kan glikoz seviyesini azaltan, pankreastan salınan anabolik ve lipojenik bir hormondur. Belirli aminoasitler,

34 22 özellikle arjinin ve lözin, FFA lar ve steroid hormonlar da insülin salınımında etkilidir. Kısaca pankreasın insülin salınımını şematize edecek olursak: Besin alımı Kanda glikoz yükselmesi β-hücrelerine glikoz alımı Glikoz oksidasyonu sitozolik ATP artışı ATP-kapılı K + kanallarının kapanması Hücre Depolarizasyonu Voltaj kapılı Ca 2+ kanallarının açılması Hücre içi Ca 2+ konsantrasyonunun artması insülin veziküllerinin ekzositozu (18). İnsülin glikozun depo edilmesini uyarır. Karaciğerde glikolizi ve glikojenezi uyarırken, glikoz yapım yolunu ile glukoneojenezi ve kana glikoz salınımını engeller. Lipogenez yolunu aktive eder ve oluşan trigliseritleri, VLDL (çok düşük yoğunluklu lipoprotein) kompleksler halinde kana salar ve adipoz dokunun glukozu yağ olarak depolamasını uyarır ve adipositlerde lipolizisi baskılar. İnsülin, kas hücrelerinde GLUT-4 glukoz transport proteininin hücre yüzeyinde artmasını uyararak kas hücrelerinin kandaki glukozu hücre içine almalarını sağlar (24,25). Şekil 2.9: İnsülinin karaciğer, adipoz ve kas dokularındaki metabolik etkileri (13) İnsülin karaciğerde glikoz üretimini baskılar, glikojen sentezini artırır ve kana glikoz salınımını azaltır. Adipoz dokuda glikoz alımını artırır, lipit kullanımını baskılayarak glikoz kullanımını tetikler. Glikozun lipitlere dönüşümünü, lipogenezi aktive eder. Kaslarda hücre içine glikoz transportunu artırır (13). Hedef hücrelerin kan dolaşımındaki normal insülin seviyelerine cevap verememeleri, yani insüline karşı duyarsızlaşmaları durumuna insülin direnci denilir. Bunun

35 23 sonucunda insülinin etkili olabilmesi için kanda normalden daha yüksek düzeylerde bulunması gerekmektedir. Bu tanımlama insüline karşı biyolojik yanıt olarak, insülinin metabolik etkileri yanında (karbonhidrat, lipid ve protein metabolizması) mitojenik etkilerini (büyüme, farklılaşma, DNA sentezi, gen transkripsiyonunun düzenlenmesi) de kapsar. İnsüline karşı in vivo biyolojik yanıtlar insülin konsantasyonuna, insülin salınım hızına ve dolaşımda kalış süresine bağlı olarak değişkenlik gösterir. Glukoz intoleransı olan hastalar ya da DM tip 2 li hastalar ve sağlıklı insanların %25 inde insülin direnci vardır. İnsülin direnci DM tip 2, kardiyovasküler hastalıklar, esansiyel hipertansiyon, alkole bağlı olmayan yağlı karaciğer hastalığı, polikistik over ve uyku apnesi gelişme olasılığını arttırır. İnsülin direnci gelişimi, insülinin normal glukoz ve lipit homeostazisini sağlayamaması ile sonuçlanır. İnsülin hassasiyetinde azalmalar; puberte, hamilelik ve yaşlılık gibi bazı evrelerde de görülmektedir. Bu evrelerde düzenli fiziksel aktivite ve karbonhidrat alımı insülin hassasiyetinin artmasını sağlar. İnsülin direncine eşlik eden obezite, dislipidemi, glukoz intolerans, hipertansiyon gibi metabolik bozukluklar; tip 2 diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, kanser, polikistik over hastalığı, nörodejeneratif hastalıklar, alkole bağlı olmayan yağlı karaciğer hastalıklarınının gelişimine neden olur (24,25,26) İnsülin Direnci ve Tip 2 Diyabet Adipoz doku FFA lar, gliseroller, leptin ve adiponektin gibi insülin hassasiyetinde ve besin alımının kontrolünde önemli olan çeşitli adipokinler ve proenflamatuvar sitokinler sentezler. Adipoz kütlesinin artması ile birçok adipoz kaynaklı bileşik sentezide artar. Bu bileşiklerin çoğu insülin direnci gelişiminde rol oynar. Örneğin; TNF-1, hedef hücrelerde stres sinyal yollarını aktive ederek, JNK yoluyla insülin direncine neden olur. Bunun dışında, obezite ve tip II diyabet hastalarında serum FFA seviyeleri yükselir. FFA, her iki hastalıkta da görülen insülin direnci ile ilişkilendirilmiştir. Kan FFA seviyesindeki ani artış sonucu akut insülin direnci oluşur (24). İnsülin direncinin tip 2 diyabet ile ilişkilendirilebilmesi için pankreatik β hücrelerinin insülin salımında hatalar olması gerekir. İnsülin dirençli bireylerin çoğunda hiperglisemi gelişmektedir. Normal koşullarda, pankreatik β hücreleri insülinin azalmış etkisinin üstesinden gelebilmek için insülin salımını artırırlar ve böylece normal glukoz