DO AL ÜRET LEN KÜFLÜ PEYN RDEN ZOLE ED LEN BAZI LAKT K AS T BAKTER LER N N AFLATOKS N B 1 VE AFLATOKS N M 1 ÜZER NE ETK S N N ARA TIRILMASI

Transkript

1 I EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ DOKTORA TEZ DO AL ÜRET LEN KÜFLÜ PEYN RDEN ZOLE ED LEN BAZI LAKT K AS T BAKTER LER N N AFLATOKS N B 1 VE AFLATOKS N M 1 ÜZER NE ETK S N N ARA TIRILMASI Ziba GÜLEY Süt Teknolojisi Anabilim Dal Bilim Dal Kodu : Sunu Tarihi : Tez Dan man : Prof.Dr. Harun UYSAL BORNOVA- ZM R 2008

2 III Zir.Yük.Müh. Ziba GÜLEY taraf ndan DOKTORA TEZ olarak sunulan Do al Üretilen Küflü Peynirden zole Edilen Baz Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin B 1 ve Aflatoksin M 1 Üzerine Etkisinin Ara t r lmas ba l kl bu çal ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyar nca taraf m zdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve tarihinde yap lan tez savunma s nav nda aday oybirli i/oyçoklu u ile ba ar l bulunmu tur. Jüri Üyeleri: Jüri Ba kan ;. mza Raportör Üye ;.. Üye;. Üye;. Üye;.

3 V ÖZET DO AL ÜRET LEN KÜFLÜ PEYN RDEN ZOLE ED LEN BAZI LAKT K AS T BAKTER LER N N AFLATOKS N B 1 VE AFLATOKS N M 1 ÜZER NE ETK S N N ARA TIRILMASI GÜLEY, Ziba Doktora Tezi, Süt Teknolojisi Anabilim Dal Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Harun UYSAL Temmuz 2008, 259 Sayfa Aflatoksinler, baz Aspergillus türlerinin üretti i, toksisitesi yüksek ikincil metabolitlerdir. Süt ürünlerinde de en çok rastlanan mikotoksinler aras nda yer almaktad rlar. G dalar n ve yemlerin aflatoksinlerle kontamine olmas büyük ekonomik kay plara neden olmaktad r. Bu g dalar ayr ca insan sa l n da tehdit etmektedir. Aflatoksinlerle kontaminasyon kaç n lmaz oldu undan kontamine olmu g dalar n detoksifikasyonu büyük önem ta maktad r. Birçok ara t rmac mikroorganizmalarla detoksifikasyonun en uygun yöntem oldu u görü ünü savunmaktad r y l ndan bu yana mikotoksinlerin, özellikle de aflatoksinlerin mikroorganizmalarla detoksifikasyonu ile ilgili birçok çal ma yap lm ve bu çal malarda birçok mikroorganizma denenmi tir. Laktik asit bakterileri ile yap lan çal malar n sonuçlar da umut vericidir. Bu çal mada, aflatoksin M 1 in parçalanmas nda, aflatoksin B 1 in ise parçalanmas ve/veya olu umunun önlenmesinde etkili laktik asit bakteri tür ve su lar n n belirlenmesi amaçlanm t r. Konya ilinden toplanan küflü peynir örneklerinden izole edilen 179 adet laktik asit bakterisi, fenotipik ve genotipik yöntemler kullan larak tan mlanm lard r. Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lb.

4 VI paracasei / Lb. casei, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Pediococcus parvulus olduklar belirlenen bu izolatlar aras ndan baz lar seçilerek, aflatoksin M 1 e, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye ayr ca A. falvus ve A.parasiticus NRRL 2999 un geli imine ve aflatoksin üretimine etkileri besiyeri ortam nda incelenmi tir. Bakterilerin aflatoksin M 1 e etkilerinin olmad, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye ise önemsiz düzeyde oldu u belirlenmi tir. Ortamda canl bulunduklar zaman A. flavus ve A. parasiticus un geli im ve toksin üretimini belli bir süre engelledikleri tespit edilmi tir. Bu durumun bakterilerin üretti i herhangi bir metabolitten de il tamamen mikroorganizmalar aras ndaki rekabetten kaynakland belirlenmi tir. Bu bakterilerden olu turulan kültürle üretilen peynirde ayn etki görülmemi tir. Anahtar Kelimeler: Mikotoksin, Aflatoksin, Laktik Asit Bakterileri, Küflü Peynir

5 VII ABSTRACT INVESTIGATION OF EFFECTS OF SOME LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM NATURALLY PRODUCED MOULDY CHEESE ON AFLATOXIN M 1 AND AFLATOXIN B 1 GÜLEY, Ziba PhD Thesis in Dairy Technology Supervisor: Prof.Dr. Harun UYSAL July 2008, 259 Pages Aflatoxins are highly toxic seconder metabolites produced by some Aspergillus spp. Among the mycotoxins aflatoxins are the most prevalent. Foods and feeds contaminated with aflatoxins cause big economical losses and they may also pose a health risk to humans. As the contamination with aflatoxins is unavoidable, detoxification of contaminated foods and feeds is very important. Different physical and chemical methods have been recommended for detoxification of aflatoxin-contaminated food and feed. Nevertheless, only a few of them have been accepted for practical use. Many workers in the field are of opinion that the best solution for detoxification should be degradation by selected microorganisms. Since 1966 many researches have been done in this field and many microorganisms have been tested. Results of the studies held with lactic acid bacteria are very promising. In this study, determination of lactic acid bacteria species and strains that have ability to degrade aflatoxin M 1 and aflatoxin B 1 and/or to inhibit production of aflatoxin B 1 is aimed. 179 lactic acid bacteria, isolated from mouldy cheese samples, collected from Konya region have been identified by using phenotypic and genotypic methods. Isolates were identified as Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lb. paracasei / Lb. casei Enterococcus faecium,

6 VIII Enterococcus faecalis, Enterococcus durans and Pediococcus parvulus. Effects of some strains among these lactic acid bacteria, on growth and aflatoxin production of A. flavus and A. parasiticus NRRL 2999, as well as aflatoxin B 1, B 2, G 1, G 2 and aflatoxin M 1 have been investigated in appropriate growth mediums. It was determined that these lactic acid bacteria were not effective against aflatoxin M 1 and not so effective against aflatoxin B 1, B 2, G 1, G 2. In growth mediums, it has been noticed that they have reduced growth and aflatoksin production of A.flavus and A.parasiticus for a short period only when they were viable. It has been concluded that this situation is only the result of microbial competition and there is no any other factor such as inhibitor metabolites. The same effect has not been observed in the cheese which has been produced by using these bacteria as starter culture. Keywords : Mycotoxin, Aflatoxin, Lactic Acid Bacteria, Mouldy Cheese

7 IX TE EKKÜR Bu ara t rma süresince beni yönlendiren, k ymetli görü lerinden yararland m de erli dan man m Prof. Dr. Harun Uysal a, her zaman beni yüreklendirerek y lmadan devam etmemi sa layan, yak n ilgisini ve yard m n esirgemeyen k ymetli hocam Say n Prof. Dr. Sevda K l ç a, öneri ve ele tirileriyle çal malar ma katk da bulunan tez izleme komitesi üyelerinden Say n Doç Dr. Mustafa Ate e en içten duygularla te ekkür ederim. Ara t rmam süresince, çal mam n temelini olu turan aflatoksin analizlerini gerçekle tirebilmem için, E.Ü. Mühendislik Fakültesi Biyomühendislik Bölümü ndeki HPLC cihaz ndan ve bölüm laboratuvar ndan yararlanma imkan tan yan Say n Prof. Dr. Rengin Eltem e ve yard mlar ndan dolay arkada m Ara. Gör. Yüksel Gezgin e, laktik asit bakterilerinin genotipik identifikasyonu a amas nda zmir Yüksek Teknolojisi Enstitüsü G da Mühendisli i Bölümü laboratuvarlar n n her türlü olana ndan yararlanma imkan sa layan Say n Prof. Dr. ebnem Harsa ya, 4 ay süresince laboratuvarlar n ve genotipik identifikasyon konusundaki bilgilerini benimle payla an Moleküler G da Mikrobiyolojisi Laboratuvar ndaki Ara t rma Görevlisi arkada lar ma, özellikle Oylum Erku, Burcu Okuklu ve Mert Suda dan a te ekkürü bir borç bilirim. Küflü peynir örneklerinin toplanmas s ras ndaki yard mlar ndan dolay arkada lar m Selma ve Ömer Uysal a ayr ca Çiftçio lu G da n n sahibi Ya ar Hepçiftci ye te ekkür ederim. Çal may maddi yönden destekleyen Ahmet Cemal Adademir ve E i Asiye Adademir E itim Vakf na, vak ftan destek almamda büyük katk lar olan Say n Hakan Altuner e, ayr ca Türkiye Bilimsel ve

8 X Teknolojik Ara t rma Kurumu ile E.Ü. Bilimsel Ara t rma Projeleri Komisyonu na te ekkürlerimi sunar m. Dostluklar ndan ve çal mam süresince manevi desteklerinden dolay arkada lar m Ülkü An k a, Emine ve O uz Akpolat a, Derya Y lmaz a ve Bülent Koska ya en içten duygularla te ekkür ederim. Hayat m n her devresinde ve tez çal mam süresince maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen, kar la t m güçlükleri benimle payla an, bulundu um yere gelmemde büyük emekleri olan annem Fatma Güley e, babam Halil Güley e ayr ca karde lerim Asl ve Aytaç a tüm kalbimle te ekkür ederim.

9 XI Ç NDEK LER ÖZET... V ABSTRACT... VII TE EKKÜR... IX Ç ZELGELER D Z N... XVII EK LLER D Z N... XX RES MLER D Z N... XXIII KISALTMALAR ve S MGELER... XXV 1.G R L TERATÜR ÖZET Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M1 Bulunmas Süt Ürünlerinde Aflatoksin Üreten Küflerin Bulunmas ve Aflatoksin Üretimi Aflatoksinlerin Fiziksel ve Kimyasal Yötemlerle Detoksifikasyonu Biyolojik Yöntemlerle Detoksifikasyon Laktik Asit Bakterileri Laktik Asit Bakterilerinin Küf ve Aflatoksin Üzerine Etkileri Laktik Asit Bakterilerinin Küf Geli imi ve Aflatoksin Üretimi Üzerine Etkileri... 30

10 XII Ç NDEK LER (DEVAM) Laktik Asit Bakterilerinin Olu mu Aflatoksinler Üzerine Etkileri MATERYAL VE YÖNTEM MATERYAL YÖNTEM Küflü Peynirlerde Yap lan Kimyasal ve Mikrobiyolojik Analizler Küflü Peynirlerde Aflatoksin M 1 ve Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Belirlenmesi HPLC (Yüksek Bas nç S v Kromatogtafisi) Analizleri Aflatoksin M 1 Analizleri çin HPLC Ko ullar Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Analizleri çin HPLC Ko ullar Laktik Asit Bakterilerinin zolasyonu Laktik Asit Bakterilerinin dentifikasyonu Fizyolojik ve Biyokimyasal (Fenotipik) dentifikasyon Geleneksel Yöntemle dentifikasyon API Test Kitleri le dentifikasyon... 50

11 XIII Ç NDEK LER (DEVAM) Genotipik dentifikasyon DNA Ekstraksiyonu PCR Miksinin Haz rlanmas ve PCR Ko ullar PCR Ürünlerinin Temizlenmesi PCR Ürünlerinin Elektroforezi PCR Ürünlerinin Restriksiyon Endonükleazlar le Kesimi (RFLP -Restriction Fragment Length Polymorphism) Kesim Ürünlerinin Temizlenmesi Kesim Ürünlerinin Elektroforezi S rdna Dizi Analizi Peynir Örneklerinden Küflerin zolasyonu ve Genus Düzeyinde Tan mlanmas Laktik asit bakterilerinin Antifungal Aktivitelerinin Belirlenmesi Agar Disk Diffüzyon Yöntemi... 63

12 XIV Ç NDEK LER (DEVAM) Overlay Yöntemi Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin B 1 e Etkilerinin Belirlenmesi Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M 1 e Etkilerinin Belirlenmesi Laktik Asit Bakterilerinin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un Aflatoksin Üretimine Etkileri statistik Analizler Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Pilot Tesisinde Küflü Peynir Üretimi Kültürün Haz rlanmas Peynir Üretimi Peynirin Küflendirilmesi Peynir Örneklerinde Yap lan Analizler... 75

13 XV Ç NDEK LER (DEVAM) 4. ARA TIRMA BULGULARI VE TARTI MA Konya Küflü Peyniri ve Özellikleri Peynir Örneklerinde Aflatoksin M1 Belirlenmesi Peynir Örneklerinde Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Belirlenmesi Laktik Asit Bakterilerinin zolasyonu Laktik Asit Bakterilerinin dentifikasyonu Fizyolojik ve Biyokimyasal (Fenotipik) dentifikasyon Geleneksel Yöntemle dentifikasyon API Test Kitleri ile dentifikasyon Genotipik dentifikasyon S rdna Dizi Analizi Küflerin zolasyonu ve Genus Düzeyinde dentifikasyonu Laktik asit bakterilerinin Antifungal Aktivitelerinin Belirlenmesi

14 XVI Ç NDEK LER (DEVAM) 4.9 Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M 1 e ve Aflatoksin B 1 e Etkisi Laktik Asit Bakterilerinin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un Aflatoksin Üretimine Etkileri SONUÇ VE ÖNER LER KAYNAKLAR D Z N EK EK EK EK EK EK EK EK EK ÖZGEÇM

15 XVII Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa No 1.1 Baz Önemli Toksijenik Küf Türleri ve Ürettikleri Toksinler Türkiye ve AB Ülkelerin de Aflatoksinler çin Belirlenen Kabul Edilebilir En Yüksek De erler Çözelti çindeki Aflatoksin B 1 in Flavobacterium aurantiacium dan elde edilmi, i lem görmemi, s l i lem görmü, proteinaz K ile muamele edilmi ve DNase I ile muamele edilmi protein ekstratlar taraf ndan 30 O C de 24 saat inkübasyon boyunca azalt lmas Aflotoksin B1 i Aflatoksikole Dönü türme Yetene indeki Baz Mikroorganizmalar Laktik Asit Bakterileri Taraf ndan Üretilen Bakteriyosinlerin S n fland r lmas Farkl Laktik Asit Bakterisi Su lar n n Aspergillus un Geli imine ve Aflatoksin Üretimine Etkisi Çal mada Kullan lan Probiyotik Bakteriler Phosphate-buffered Saline (PBS) çindeki Aflatoksin M 1 (AFM 1 ) in, Canl ve Ölü Bakteri Hücreleri Taraf ndan Azalt lmas Ya s z ve Tam Ya l Sütteki Aflatoksin M 1 (AFM 1 ) in canl ve ölü L. rhamnosus GG su u ve L. rhamnosus LC-705 Su u Taraf ndan Azalt lmas Konya Küflü Peyniri Örneklerinin Baz Kimyasal Özellikleri Konya Küflü Peynirlerinin Mikrobiyolojik Say m Sonuçlar... 81

16 XVIII Çizelge Ç ZELGELER D Z N (DEVAM) Sayfa No 4.3 API Test Kitleri le Tan mlanan zolatlar n Kodlar ve Tan mlama Sonuçlar Üç Farkl Besiyerinde, A. flavus ve A. parasiticus un Laktik Asit Bakterileri Taraf ndan nhibisyonu Laktik Asit Bakterilerinin, 24 saat nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye Etkileri Laktik Asit Bakterilerinin, 3 günlük nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye Etkileri Laktik Asit Bakterilerinin, 24 Saat nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin M 1 e Etkileri ile nkübasyon Ba lang c ve Sonundaki Canl Bakteri Say lar A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba nageli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi A. flavus un, Canl Bakter, Ölü Bakteri Supernatant Ortamlar nda ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi A. flavus un, Is l lem Uygulanm Bakteri Pelleti çeren Ortamlarda Ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi

17 XIX Ç ZELGELER D Z N (DEVAM) Çizelge Sayfa No 4.12 Canl örneklerin bakteri say lar n n 14 gün boyunca de i imi A.flavus un, Is l lem Uygulanm Bakteri Pelleti, Pellet ile doldurulmu Diyaliz Torbas çeren Ortamlarda ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ile Ortamlardaki ph De i imi Üretilen Peynirin Küflendirilmeden Önce ve Küflendirildikten Sonra Baz Kimyasal Özellikleri ve Aflatoksin Miktar Üretilen Peynirin Küflendirilmeden Önce ve Küflendirildikten Sonra Mikrobiyolojik Özellikleri

18 XX EK LLER D Z N ekil Sayfa No 2.1 Aflatoksinlerin Kimyasal Yap s Lablemco Tryptone Broth (LTB) daki A. flavus subsp. parasiticus un Aflatoksin B 1 ve G 1 Üretiminin, Farkl Moleküler A rl k Geçirgenli ine (MWCO) (1.000, ve ) Sahip Diyaliz Torbalar çindeki MRS Besiyerinde Geli en Lactobacillus Türleri Taraf ndan nhibe Edilmesi Aflatoksin B 1 in Probiyotik Bakteriler Taraf ndan Ba lanmas Overlay Yönteminin Uygulanmas Peynir Üretim emas AFM 1 Standard na Ait Kromatogram Peynir Örneklerine Ait Kromatogramlar (A)5KL Örne i, (B) 8KL Örne i Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Standard na Ait Kromatogram Peynir Örneklerine Ait Kromatogramlar (A) 2KL Örne i, (B) 5KL örne i Geleneksel Yöntemle Biyokimyasal dentifikason Sonucunda 179 zolat n Genus Düzeyinde Da l m Oranlar API Test Kitleri le Tan mlanan 55 Adet zolat n Genuslara Göre Da l m Oranlar Laktobasil zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri

19 XXI EK LLER D Z N (DEVAM) ekil Sayfa No 4.8 Laktobasil zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri Referans Su lar n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Hae III ve Taq 1 Restriksiyon Profilleri Laktobasil zolatlar n n ve Referans Su lar n Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram Kok zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri Kok zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri Kok zolatlar n n ve Referans Su lar n Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram Kok zolatlar n n ve Referans Su lar n Taq1 Kesim Ürünlerinin Dendrogram Adet zolat n 16S rrna Gen Bölgelerinin Hae III ve Taq1 Restriksiyon Profilleri Referans Su lar n 16S rrna Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri Referans Su lar n 16S rrna Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri Laktobasil izolatlar,v1kl12 ve Referans Su lar n 16s rrna gen bölgelerinin Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram Laktik Asit Bakterilerinin Ortamdan Uzakla t rd klar AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 Oranlar (%)

20 XXII EK LLER D Z N (DEVAM) ekil Sayfa No 4.20 Laktik Asit Bakterilerinin Ortamdan Uzakla t rd klar AFM 1 Oranlar (%) A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 1 Miktar nda Saptanan De i imler A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 2 Miktar nda Saptanan De i imler A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl nda Saptanan De i imler A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki ph De i imleri A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 1 Miktar nda Saptanan De i imler A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 2 Miktar nda Saptanan De i imler

21 XXIII RES MLER D Z N Resim Sayfa No 3.1. Immunoaffinite Kolon Çal ma Prensibi API 50 CHL le nokule Edilmi API 50 CH Stribleri API 20 Strep Test Kiti Stribleri S-ITS Amplifikasyon Ürünlerinin ( bp lik) Jel Görüntüsü Konya Küflü Peyniri. (A). So uk Hava Deposunda Bekletilen, Henüz Küflendirilmemi Peynir.(B), (C) :Peynirin Küflendirilmesi, (D) Küflü Peynirin Pazar Yerinde Sat a Sunulmas Küflü Peynirlerden zole Edilen Küflerden Baz lar n n Malt Extract Agar Üzerinde Geli imi Laktobasil zolatlar ndan Baz lar n n A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) Lactobacillus brevis Olarak Tan mlanm R1KLx3 zolat, (B),(C) Lactobacillusplantarum Olarak Tan mlanm V8KL10 ve V8KL8 zolatlar Enterokok zolatlar n n Baz lar n n A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) Enterococcus faecium Olarak Tan mlanm SF1KL4 zolat, (B) Enterococcus durans Olarak Tan mlanm MKS5 ile SF1KL4 zolatlar Laktobasil zolatlar ndan Baz lar n n Sodyum Asetats z MRS Agar da A. flavus un Geli imine Etkileri (A) Lactobacillus brevis Olarak tan mlanm V4KL9 zolat, (B) V8KL8 (Lactobacillus plantarum)

22 XXIV RES MLER D Z N (Devam) Resim Sayfa No 4.6. R1KLx3 izolat n n Sodyum Asetats z MRS Agarda Yay lm Kolonilerinin A. flavus ve A. parasiticus un Geli imini Engellemesi Baz Laktobasil zolatlar n n Milk Agar da, A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) R1KLx3, (B) R2KL10 (Lactobacillus brevis) nkübasyonun 3. Gününde S ras yla Kar k Kültür(Canl ), R1KLx3(Canl ) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi nkübasyonun 3. Gününde S ras yla R1KLx3(Canl ) ve R1KLx3(supernatant) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi nkübasyonun 7. Gününde S ras yla R1KLx3(supernatant), R1KLx3(Canl ), Kar k Kültür(Canl ) Kar k Kültür (Supernatant) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi nkübasyonun 14. Gününde S ras yla R1KLx3(supernatant), R1KLx3(Canl ), Kar k Kültür(Canl ), Kar k Kültür (Supernatant) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi (A) Küf nokülasyonundan Hemen Önce Peynir Örneklerinin Görünü ü (B) nkübasyonun 6. Gününde Peynir Örneklerinin Görünü ü

23 XXV KISALTMALAR VE S MGELER AFB 1 Aflatoksin B 1 AFB 2 Aflatoksin B 2 AFG 1 Aflatoksin G 1 AFG 2 Aflatoksin G 2 AFM 1 Aflatoksin M 1 CECT Colección Española de Cultivos Tipo CO 2 Karbondioksit CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoksiribonükleik asit dak. Dakika dntp Deoxynucleotide triphosphate DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik Asit Ent. Enterococcus FeCl 3 Demir (III) klorür HCl Hidroklorik asit HgI 2 Civa (II) yodür ITS Internal Transcribed Spacer KEA Kanamycin Esculin Azide Agar K 2 HPO 4 Dipotasyum hidrojen fosfat KH 2 PO 4 Potasyum dihidrojen fosfat KI Potasyum iyodür KOH Potasyum hidroksit LAB Laktik asit bakterileri Lb. Lactobacillus L. Lactobacillus

24 XXVI KISALTMALAR VE S MGELER (DEVAM) Lc. Lactococcus Leu. Leuconostoc MgSO 4 Magnezyum Sülfat ml mililitre mm milimolar µg mikrogram µl mikrolitre MnSO 4 Mangan Sülfat MRS Man-Rogosa-Sharpe Agar/Broth N Normalite Na 2 HPO 4 Disodyum hidrojen fosfat NaCl Sodyum klorür NaN 3 Sodyum azid NaOH Sodyum hidroksit NCBI National Centre for Biotechnology Information ng nanogram NH 3 Amonyak NRRL ARS Culture Collection PCR Polymerase Chain Reaction ppb parts per billion milyarda 1 birim RNA Ribonükleik asit s. Saniye SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris-EDTA

25 1 1. G R Mikotoksinler, g dalarda ve yemlerde geli en küfler taraf ndan üretilen ikincil metabolitlerdir. Genel olarak, s ca a dayan kl, dü ük molekül a rl kl, antijenik özellik göstermeyen, farkl metabolik yollarla meydana gelen, kimyasal olarak çok çe itli madde gruplar na giren bile iklerdir. (Smith, 2001; Özçelik ve Sa d ç, 2003) Ortam ko ullar uygun oldu unda yakla k 200 küf türü mikotoksin olarak bilinen çe itli toksinleri üretebilmektedir. Özellikle Alternaria, Aspergillus, Penicillium ve Fusarium genuslar na ait türler mikotoksinleri üretmektedirler (Ar c, 1999). Sentezlenen mikotoksinin çe idi ve miktar, küf türüne ve su una ba l oldu u gibi substrat n nem ve besin içeri i, s cakl k, ph, oksijen ve di er mikroorganizmalar n varl gibi faktörlere de ba l d r (Hesseltine, 1976; Bullerman et al., 1984). Çizelge 1.1. Baz Önemli Toksijenik Funguslar ve Ürettikleri Toksinler (Smith, 2001) Türler Toksin Aspergillus flavus Aflatoksin B 1, B 2 ; cyclopiazonic acid A. parasiticus Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 A.ochraceus Okratoksin A; penicillic acid A.versicolor Sterigmatosistin, Siklopiazonik asit Penicillium verrucosum Okratoksin A, sitrinin P.purpurogenum Rubratoksin P.expansum Patulin, Sitrinin Fusarium sporotrichioides T-2 toksin F. moniliforme Fumonisin B 1 F. graminearum Deoksinivalenol, nivalenol, zearalenon Alternaria alternata Tenuazonik asit Stachybotrys atra Satratoksin Baz mikotoksinler belli ba l küfler taraf ndan üretilirken, baz lar farkl genuslara dahil birçok küf türü taraf ndan üretilmektedir. Günümüzde

26 2 300 civar nda mikotoksin izole edilip tan mlanm olmas na ra men, g da ve yemlerde bunlar n yakla k 20 tanesine s kça ve önemli miktarlarda rastlanmaktad r (Smith, 2001). G dalarda en s k rastlanan, yüksek toksisiteye sahip olduklar bilinen, üzerinde en çok ara t rma yap lm, insan ve hayvanlardaki toksik etkileri ortaya konmu olanlar: Aflatoksinler (B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ), Okratoksinler (A, B), Zearalenon, Patulin, Trikotesenler, Fumonisinler (B 1, B 2 ), Ergot alkaloidleri, Sterigmatosistin, ve Sitrinin dir (Hussein and Brasel, 2001; Richard, 2007). Mikotoksinler insan ve hayvanlar n besin zincirine direkt veya indirekt kontaminasyon yoluyla girmektedirler. Direkt kontaminasyon g da ve yemlerin toksijenik küflerle enfekte olmas sonucunda meydana gelirken, indirekt kontaminasyon üretimin herhangi bir a amas nda toksinli materyalin prosese girmesi sonucunda meydana gelmektedir (Smith, 2001). Çe itli bitkisel ve hayvansal orijinli g dalarda yayg n olarak bulunmaktad rlar. Aflatoksinler ya l tohumlar, f nd k, ceviz gibi sert kabuklu yemi ler, hububat, baklagiller, baharatlar ve süt ürünlerinde; Okratoksin A, hububat, m s r ve baklagillerde; Patulin, meyve sular nda; Zearalenone, hububat, m s r ve hayvan yemlerinde; Citrinin ve trikotesenler, hububatta bulunmaktad r. Bitkisel ürünlerde kontaminasyon hasat öncesi veya sonras olabilirken, süt ve süt ürünleri, et, yumurta gibi hayvansal ürünlerde ço unlukla kontamine hayvan yemlerinin kullan lmas sonucu gerçekle mektedir (Coker, 1984). Süt ürünlerinde ayr ca küflü peynir üretiminin kontrolsüz ko ullarda do al olarak yap lmas ve üretim s ras nda mikotoksijenik küflerle kontaminasyon sonucunda da çe itli mikotoksinler olu maktad r. Bunlar aflatoksinler ba ta olmak üzere okratoksin, sterigmatosistin, penisillik asit, patulin, mikofenolik asit, rokfortin, siklopiazonik asittir (Karagözlü ve Karagözlü, 2000).

27 3 Kontamine g dalar n ve yemlerin kullan lmas sonucu insan ve hayvanlarda de i ik hastal k ve zehirlenmeler ortaya ç kmaktad r. Bu durum bir taraftan büyük i gücü kayb na di er taraftan ekonomik kay plara neden olmaktad r. Mikotoksinlerin sebep oldu u zehirlenmelere ve hastal klara mikotoksikoz denilmektedir. Orta ça da Kuzey Avrupa da Claviceps purpurea n n olu turdu u ergot alkaloidleri ile enfekte olmu tah llar n tüketilmesi sonucu görülen ve binlerce insan n ölümüne neden olan ergotizm bilinen en eski mikotoksikozdur. Ergotizm dokularda gangrene sebep olmaktad r y llar aras nda Rusya n n Orenburg bölgesinde binlerce insan n ölümü ile sonuçlanan Alimentary Toxic Aleukia (beslenmeye ba l toksik etki ile kanda lökosit say s n n dü mesi sonucu olu an lösemi), 1930 y l nda yine Rusya da binlerce at n ölümüne neden olan Stachybotryotoxicosis, Uzak Do u da görülen Sar Pirinç Hastal ve 1960 y l nda hindi palaz n n ölümüne neden olan aflatoksikozis en büyük mikotoksin zehirlenmeleridir. Yugoslavya, Bulgaristan, Romanya gibi ülkelerde görülen ve Okratoksin A n n neden oldu u Balkan Endemik Nefropatisi ile aflatoksinlerin, ortaya ç kmas nda rol oynad bilinen Hepatosellular Karsinoma ve Reye s Sendromu da önemli mikotoksin kaynakl hastal klard r (Coker, 1984; Smith, 2001; Uyla er vd., 2005; Richard, 2007). Mikotoksinler özellikle karaci er, böbrek gibi organlarda hastal klar, dejenerasyonlar, ba kl k sisteminde bozukluklar, kusurlu ve eksik organ olu umlar, deri nekrozlar, üremede azalma ve kilo kayb gibi sorunlara neden olmaktad r. Yüksek dozda al nd klar nda ise akut toksik etki meydana gelmekte, g da ve yemin tüketilmesinden k sa bir süre sonra ölüm görülebilmektedir (Tunail, 2000). Mikotoksin çe idine ba l olarak vücutta etkilenen organ ve sistemler farkl d r. Aflatoksinler özellikle karaci eri, okratoksin A böbrekleri, fumonisin böbrek ve esofegal sistemi, trikotesenler mukoz membranlar, zearalenon ise uro-genital sistemi etkilemektedir.

28 4 Bunlar içinde aflatoksinler; mutajenik, teratojenik ve karsinojenik bile ikler olduklar ndan di erlerine göre daha tehlikeli olarak kabul edilmektedir (Heperkan, 2003). Mikotoksinlerin bir k sm küflerin hasattan önceki kontaminasyonu ile ilgili oldu u için kaç n lmaz olarak de erlendirilmekte ve g dalardaki miktar ; y ldan y la ve çevresel faktörlere ba l olarak de i mektedir. Birle mi Milletler G da ve Tar m Te kilat dünya genelinde tar msal ürünlerin %25 inin ciddi boyutta mikotoksinlerle kontaminasyona u rad n bildirmektedir. Mikotoksin içeren g dalar n üretimden kald r lmas veya ihraç ediliyorsa sat c ülkeye iadesi ekonomik aç dan büyük kay plara neden olmaktad r (Heperkan, 2003). Dünya genelinde, ihracat yap lan g da maddelerinin mikotoksin nedeniyle etkilenen k sm n n parasal kar l n n 2002 verilerine göre 100 milyar dolar civar nda oldu u ifade edilmektedir. (Boutrif and Pineiro, 2002). ABD ve Kanada da, mikotoksin bula mas nedeniyle, sadece yem ve hayvanc l k sektöründe meydana gelen y ll k kayb n 5 miyar ABD dolar oldu u tahmin edilmektedir (Charmley et al., 1995). Ülkemizde mikotoksin problemi ilk defa 1967 y l nda Kanada ya ihraç edilen 10 ton iç f nd n ve ikinci defa da 1971 y l nda Amerika Birle ik Devletleri ne ihraç edilen 45 parti Antep f st n n 36 partisinin aflatoksin ihtiva etti i gerekçesiyle kabul edilmemeleri ile ortaya ç km t r. Bu y llardan itibaren Antep f st ve di er ihraç edilen ürünlerde aflatoksin analizleri yap lmaya ba lanm t r y l sonunda Danimarka ya ihraç edilen kuru incirlerde de 938µg/kg gibi yüksek miktarda aflatoksin bulundu u bildirilmi tir (Özçelik ve Sa d ç, 2003) y l nda Türkiye den Almanya ya ihraç edilen k rm z pul biberin limitlerin üzerinde aflatoksin içerdi i gerekçesiyle iade edilmesi, 1994 de 2522 ton olan k rm z pul biber ihracat m z n 1996 y l nda 527 tona

29 5 dü mesine yol açm t r. Bu kayb n parasal kar l ise dolar olmu tur (Heperkan, 2003). Ba ta ABD ve Avrupa ülkeleri olmak üzere birçok ülkede, g dalarda bulunabilecek mikotoksin özellikle de aflatoksin miktarlar için k s tlamalar vard r. Türkiye de Tar m ve Köy leri Bakanl n n Resmi Gazete de yay nlanan Türk G da Kodeksi Yönetmeli i nin 16 Kas m 1997 tarihli numaral tebli i ile baharatlar, hububatlar, hububat unlar, tüm g da maddeleri, peynir, süt ve süt ürünleri, bebek mamalar ve devam formülleri ile bebek g dalar ve haz r kar mlar n kapsayabilecekleri en yüksek kabul edilebilir aflatoksin miktarlar ile elma sular nda patulin için en yüksek kabul edilebilir miktar verilmi tir. Çizelge 1.2. Türkiye ve AB Ülkelerinde Aflatoksinler çin Belirlenen Kabul Edilebilir En Yüksek De erler (Anonim, 1997; Sabanc, 2003) Türkiye de Kabul AB Ülkeleri nde Edilebilir En Kabul Edilebilir En Mikotoksin G da Maddesi Yüksek De er Yüksek De er (µg/kg, ppb) (µg/kg, ppb) Aflatoksin B 1 Baharatlar 5 5 Aflatoksin B 1 Hububatlar 2 2 Aflatoksinler Hububat ve hububat 4 (B 1 +B 2 +,G 1 +G 2 ) ürünleri Aflatoksin B 1 Hububat unlar 2 Tüm g da maddeleri Aflatoksin B (di er) Aflatoksin M 1 Peynir Aflatoksin M 1 Süt ve süt ürünleri (Süt için) Aflatoksin M 1 Süt tozu 0.5 Bebek mamalar ve Aflatoksin M devam formülleri Bebek mamalar ve Aflatoksin B 1 1 bebek g dalar Aflatoksinler Tüm g da maddeleri (B 1 +B 2 +,G 1 +G 2 ) Patulin Meyve sular 50 Aflatoksinler Bebek g dalar ve haz r (B 1 +B 2 +,G 1 +G 2 ) kar mlar

30 6 G dalar n toksijenik küflerle bula mas n önlemek, mikotoksinlerin olu umunu, dolay s yla neden olacaklar problemleri önlemek aç s ndan en rasyonel ve ekonomik yakla m olmas na kar n bu yöntem mevcut tar msal ko ullarda ve depolama ko ullar nda her zaman mümkün olmamaktad r. Bu nedenle toksinlerle kontamine olmu g dalar n kullan labilir hale gelmesinde detoksifikasyon büyük önem kazanmaktad r (Samarajeewa et al., 1990). Kullan lan detoksifikasyon yöntemi, u temel özellikleri ta mal d r: Mikotoksini, toksik olmayan bile iklere dönü türerek inaktive etmeli. Küf sporlar n ve misellerini tahrip ederek yeni toksinlerin olu umunu önlemeli. G dalar n ve yemlerin besin de erinde, tat ve aromas nda de i ikli e yol açmamal. Hammaddenin fiziksel özelliklerini önemli derecede de i tirmemeli. Maliyeti dü ük olmal (Bata and Lasztity, 1999). Mikotoksinler ile kontamine olmu g dalar n ve yemlerin detoksifikasyonu için imdiye kadar birçok fiziksel ve kimyasal yöntem önerilmi tir. Fakat bunlardan sadece bir kaç n n (örne in aflatoksinin amonyakla parçalanmas ) pratikte kullan m kabul görmü tür. Kullan lan yöntemler bir dereceye kadar ba ar l olmalar na ra men büyük dezavantajlara ve yüksek maliyete sahiptirler. Ayr ca Avrupa Birli i ve ülkemizde ç kan son yasa ve tüzükler g dalar n detoksifikasyonunda kimyasal madde kullan m n yasaklam t r (Anonim, 1997; Sabanc, 2003). Bu konuda çal an birçok ara t rmac, mikotoksinlerin, g dalar n besin de erinde ve lezzetinde kay plar olu turmadan, zararl kimyasallar kullan lmaks z n, uygun ko ullar alt nda detoksifikasyonunun, ancak seçilmi mikroorganizmalar n kullan lmas yla mümkün olaca fikrini savunmaktad rlar (Bata and Lasztity, 1999).

31 y l ndan bu yana mikotoksinlerin özellikle de aflatoksinlerin mikroorganizmalarla detoksifikasyonu ile ilgili birçok çal ma yap lm ve bu çal malarda birçok mikroorganizma denenmi tir. Konuyla ilgili literatürde rastlanan ilk bilgi Ciegler ve arkada lar n n yay nlam olduklar çal man n sonuçlar d r. Ara t rmac lar mayalar, küfler ve bakterileri içeren 1000 den fazla mikroorganizman n aflatoksinleri azaltma yetene i üzerinde çal m lar ve bunlardan sadece tek bir bakterinin, Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 ün hem s v hem de kat ortamlardaki aflatoksin B 1 i geriye dönü süz olarak uzakla t rd n tespit etmi lerdir (Ciegler et al., 1966). Daha sonra yap lan çal malarda, ortamdaki aflatoksin B 1 in bakterinin metabolik aktivitesi sonucu suda çözünen bile ikler ile CO 2 e parçaland (Line et al., 1994), azaltma mekanizmas n n enzim özelli i ta yan bir proteine ba l oldu u belirlenmi tir (Smiley and Draughon, 2000). Laktik asit bakterileri birçok g dan n özellikle de süt ürünlerinin üretiminde yayg n olarak kullan lmaktad rlar. Asitlik olu turma, aroma maddeleri meydana getirme ve proteolitik aktivite gösterme gibi yetenekleriyle ürünlerin yap, k vam ve tekstürünü etkilerken olu turduklar antimikrobiyal maddelerle de koruyucu ve terapötik etki göstermektedirler. Olu turduklar laktik asit, asetik asit, diasetil, hidrojen peroksit ve bakteriyosinler sayesinde önemli antimikrobiyal etkilere sahiptirler. Gastrointestinal sistemde birçok hastal k olu turan patojenler ve baz küf türleri üzerinde de etkileri belirlenmi tir. Laktik asit bakterileri küf geli imi ve mikotoksin üretiminin inhibisyonu ayr ca mevcut toksinin detoksifikasyonu amac yla yakla k 30 y ldan bu yana ara t rma materyali olarak kullan lmaktad r. Yap lan çal malar baz laktik asit bakterilerinin küf geli imini ve mikotoksin üretimini engelledi ini ortaya koymu tur. imdiye kadar yap lan çal malarda laktik asit bakterilerinin aflatoksinleri detoksifiye edebilme yetenekleri iki yakla mla incelenmi tir.

32 8 1. Küf geli imi inhibe edilerek ortamda aflatoksin olu umunun engellenmesi: Bunu temel alan çal malarda laktik asit bakterilerinin küf geli imi ve aflatoksin üretimi üzerine etkileri ara t r lm t r. 2. Ortamda var olan toksinin bakteri hücrelerine ba lanmas yoluyla ortamdan uzakla t r lmas : Bu amaçla canl ve cans z laktik asit bakterilerinin toksini ba lama yetenekleri ara t r lm ve bu mekanizma aç klanmaya çal lm t r (Güley vd., 2004). Laktik asit bakterileri geleneksel yöntemle üretilen ürünlerde do al olarak bulunmakta veya endüstriyel üretimde saf kültür olarak ilave edilmektedirler. Geleneksel yöntemle üretilen ürünlerin özellikle de fermente süt ürünlerinin ve peynirin starter olmayan laktik bakteri floras son y llarda birçok ara t rman n konusu olmu tur (Cogan et al., 1997; López-Díaz et al., 2000; Bulut vd., 2004; Østlie et al, 2004; González, et al., 2007). Çünkü do al mikroflora yeni ve farkl özelliklere (inhibitör madde üretimi, faja direnç vb.) sahip bakteri tür veya su lar n n elde edilmesinde büyük potansiyele sahiptir (Limsowtin et al., 1996). Bu çal mada, Konya ilinde, geleneksel yöntemlerle, kültür kullan lmaks z n üretilen küflü peynirlerdeki laktik asit bakterilerinin, küf ve varl muhtemel toksinle bir arada bulunmalar ndan kaynaklanan herhangi yeni bir özelli e (küf veya toksinle rekabet mekanizmas geli tirmek gibi) sahip olabilecekleri ihtimalinden yola ç k larak; 1. Toplanan küflü peynirlerde aflatoksin tayini yap lm 2. Laktik asit bakteri floras ve genus düzeyinde küf floras belirlenmi 3. zole edilen laktik asit bakterilerinin aflatoksin olu turan küfler, aflatoksin B 1 olu umu ile mevcut aflatoksin B 1 ve M 1 üzerine etkileri kültür ortam nda incelenmi

33 9 4. Son olarak da, etkili bakteri türlerinin yer ald bir kültür haz rlanarak peynir üretimi gerçekle tirilmi ve bakterilerin ayn etkiyi peynirlerde de gösterip göstermedikleri incelenmi tir. Çal mada, özellikle süt ve süt ürünlerindeki aflatoksinlerin olu umunun önlenebilmesinde ve/veya mevcut toksinin detoksifiye edilmesinde kullan labilecek etkili laktik asit bakterisi tür veya su lar belirlenmeye çal lm, bulgular n pratikte uygulanabilirli i ara t r lm t r.

34 10 2. L TERATÜR ÖZET Uzay p giden mikotoksinler listesi içinde aflatoksinler yaln zca bir grubu olu turmaktad rlar. Aflatoksinler, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus (Line et al., 1994), Aspergillus nomius (Kurtzman et al., 1987; Gourama and Bullerman, 1995; Gourama and Bullerman, 1995a) ve Aspergillus flavus un iki alt su u A. flavus var. columnaris ile A. parasiticus var. globosus (Uyla er vd., 2005) taraf ndan üretilmektedirler. Bunlar furan ve piranon halkalar ndan meydana gelmi dihidrofuran türevi büyük moleküllü kimyasal bile iklerdir. Ba lang çta aflatoksinin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M 2 olarak 6 tipi tespit edilmi tir. Kültür filtratlar nda en çok B 1 ve G 1 görülür. M tipleri B 1 ve B 2 nin sütteki hidroksil formlar d r. Sonraki ara t rmalarda B 2 ve G 2 nin hidroksi derivatlar olan B 2a ve G 2a da belirlenmi tir (Evren, 1999). ekil 2.1. Aflatoksinlerin Kimyasal Yap s (Tabata, 2002)

35 11 Aflatoksinler, toksisitesi yüksek olan mikotoksinler aras nda yer almaktad rlar. Bunlar n karsinojenik, teratojenik ve mutajenik özellikleri ortaya konmu tur (Barnes, 1970; Eaton and Gallagher, 1994; Henry et al., 1999). Aflatoksin B 1 (AFB 1 ) birçok hayvan türünde en etkili hepatokarsinojendir. Asya ve Afrika daki birçok ülkede aflatoksinle kontamine olmu yiyeceklerin tüketimi ile karaci er kanserinin görülme s kl ndaki art aras ndaki pozitif korelasyon nedeniyle, aflatoksinler Uluslararas Kanser Ara t rma Örgütü (IARC) taraf ndan grup 1A karsinojenler s n f na dahil edilmi tir (IARC, 1993). Aflatoksin en çok bitkisel ürünlerde görülür. Yer f st, f nd k, Antep f st, badem, çam f st, çe itli cevizler aras nda, yer f st ve mamulleri en riskli g dalard r. Tah llardan bu day, çavdar, arpa, yulaf, pirinç ve dolay s yla bunlar n de irmencilik-f r nc l k ürünleri de aflatoksin yönünden risk ta maktad r. Baklagiller içerisinde ise soya fasulyesi öne ç kmakta, ancak fasulye, bezelye, börülce, mercimekte de görülebilmektedir. Ya l tohumlardan pamuk, ayçiçe i, susam ve kolza tohumlar nda s kl kla aflatoksine rastlan r. Baharatlardan özellikle k rm z toz biber, pul biber, karabiber ve kuru meyvelerden incir, aflatoksin aç s ndan önde gelen riskli ürünlerdir (Uyla er vd., 2005). Aflatoksinler süt ürünlerine direkt ve indirekt olmak üzere iki yolla bula maktad r. Aflatoksinle bula m olan yemler hayvanlara yedirildi inde, özellikle süt ineklerinde yemle al nan B tipi aflatoksinler de i ime u rayarak süte aflatoksin M 1 olarak geçmektedir. Bunun yan nda depolama veya olgunla t rma s ras nda ürünlerde aflatoksin üreten küfler geli ebilmektedir. Ayr ca, Türkiye nin çe itli yörelerinde küflü tulum peyniri, küflü çökelek gibi do al olarak küflenmi süt ürünleri de tüketilmektedir. Bu ürünlerin

36 12 yap m nda herhangi bir saf kültür kullan lmad ndan, üreyen küfler aras nda aflatoksin üretenler de bulunabilmektedir (Evren, 1999) Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Bulunmas : Aflatoksin M 1 (AFM 1 ), laktasyon dönemindeki süt hayvanlar n n, aflatoksin B 1 ile kontamine olmu yemleri tüketmeleri sonucu sütte bulunmaktad r (Bak rc, 2001; Martins and Martins, 2004). Aflatoksin B 1 in karaci erde biyotransformasyonu neticesinde olu makta ve meme bezlerinden süte salg lanmaktad r. Süt hayvanlar n n aflatoksin B 1 ile kontamine yemleri tüketmelerini takiben, ald klar toksinin bir k sm rumende parçalanmakta ve aflatoksikole dönü mektedir. Geriye kalan ise pasif difüzyon yolu ile sindirim sisteminde emilmekte ve karaci erde aflatoksin M 1 e dönü mektedir. Olu an aflatoksin M 1 ya glukuronik asit ile birle mekte ve daha sonra safra yolu ile at lmakta ya da sistemik döngüye girmektedir. Döngüye giren aflatoksin M 1 de idrar yoluyla at lmakta veya süte geçmektedir (Fink- Gremmels, 2008). Birçok ara t rmac yemlerdeki aflatoksin B 1 miktar ile sütteki aflatoksin M 1 miktar aras nda do rusal bir ili ki oldu unu bildirmektedirler (Bak rc, 2001; Tekin en ve Uçar, 2008). Toksinin yemden süte geçi düzeyinde, hayvan n beslenme ekli, tüketilen toksinli yem miktar, sindirim derecesi, hayvan n sa l, karaci er biyotransformasyon kapasitesi ve süt miktar gibi besinsel ve fizyolojik faktörler etkili olmaktad r. Buna göre aflatoksinin absorbsiyon oran ve süte salg lanmas hayvandan hayvana, laktasyon peryoduna ve bir sa mdan di erine de i iklik göstermektedir (Fink-Gremmels, 2008). Aflatoksin M 1, aflatoksin B 1 yemle al nd ktan sonra, 6-24 saat içinde sütte tespit edilmekte, saat içinde en yüksek düzeyine ula makta ve aflatoksin B 1 al m kesildikten saat sonra sütte azalmaktad r (Oruç, 2003).

37 13 Aflatoksin B 1 in, sütte M 1 e dönü ümünün % oran nda oldu u belirtilmektedir. Süte geçme oran n n %6 ya kadar ula abildi ini ileri süren çal malar da vard r (Özkaya vd., 2003). Veldman et al. (1992), süt verimi yüksek olan ineklerin fazla miktarda konsantre yem tüketmeleri durumunda bu oran n %6.2 ye ç kt n rapor etmi lerdir. Concon (1988), McKinney et al. (1973) ve Polan et al. (1974) e atfen, kilogram nda 250µg aflatoxin B 1 içeren kuru yem tüketildi i zaman sütün litresinde 1µg aflatoksin M 1 meydana geldi ini bildirmektedir. Sütteki aflatoksin M 1 kontaminasyonuna mevsimin etkisi birçok ara t rmac taraf ndan belirlenmi tir. Buna göre k mevsiminde yaz mevsimine k yasla sütlerde daha yüksek aflatoksin M 1 miktarlar tespit edilmektedir y l nda IARC taraf ndan yap lan s n flamada aflatoksin M 1 Muhtemel insan karsinojenleri (2B) s n f nda yer alm t r. Süt ve ürünlerinde aflatoksin M 1 bulunmas, bu ürünleri daha çok tüketen bebek ve çocuklar aç s ndan oldukça önemlidir. Çünkü bebek ve çocuklar mikotoksinlerin olumsuz etkilerine kar oldukça hassast r (Oruç, 2003). Dünyan n birçok yerinde çe itli ara t rmac lar taraf ndan yap lan çal malar süt ve süt ürünlerinin aflatoksin M 1 ile önemli düzeyde kontamine olduklar n ortaya koymu tur (Concon, 1988; Barrios et al., 1996; Martins and Martins, 2004). Türkiye de de süt ve süt ürünlerinde bulunan aflatoksin M 1 ile ilgili çe itli çal malar yap lm t r. Türkiye de süt ve peynirlerde, insan sa l için risk olu turabilecek düzeylerde aflatoksin M 1 belirlenebilmi tir (Oruç, 2003). Bak rc (2001), ince tabaka kromatografisi yöntemi ile Van da üretilen süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 düzeylerini incelemi, 90 adet çi süt örne inin %87.77 sinin aflatoksin M 1 içerdi ini ve bunlar n %44.3 ünün 0.05 ppb nin üzerinde oldu unu bulmu tur. Akdemir ve Alt nta (2003), immunoaffinite kolon ile temizlemeyi takiben floresan dedektörlü HPLC metodu ile Ankara bölgesinde inceledikleri toplam 48 adet çi inek sütü örne inin %72.91 inin aflatoksin M 1 içerdi ini, bunlar n %33,3 ünün Türkiye için bildirilen limit de erin üzerinde oldu unu belirlemi lerdir. Yine ayn yöntemi kullanarak, 30 ilden temin ettikleri toplam 543 çi süt örne ini

38 14 analiz eden Özkaya vd. (2003), 18 ilden al nan örneklerde %16.7 ile % 100 oran nda aflatoksin M 1 kontaminasyonu oldu unu, bu örneklerin % inin limit de eri a t n tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar, bölgeler aras nda aflatoksin M 1 düzeyleri aç s ndan belirgin farkl l klar oldu unu, ülkemizde üretilen sütlerde bölgesel olarak sorun oldu unu; sorunun oldu u bölgelerde aflatoksin kaynaklar n n ara t r lmas ve önlemlerin al nmas gerekti ini ifade etmi lerdir. Aflatoksin M 1 oldukça stabildir ve pastörizasyon gibi s l i lem uygulamalar ndan etkilenmemektedir (Tekin en ve Uçar, 2008). Bu nedenle toksinli sütten üretilen süt ürünlerinde, ürünün yap s na ba l olarak çe itli oranlarda bulunmaktad r. Bostan vd. (2003), stanbul daki perakende sat noktalar ndan toplad klar 21 i pastörize, 46 s UHT olmak üzere toplam 67 içme sütü örne inin 16 s nda limit de erin üzerinde aflatoksin tespit etmi lerdir. Peynir üretimi s ras nda enzimatik koagulasyonla sütün p ht la mas n n toksine etkisi olmamaktad r. Ancak, p ht la madan sonraki safhada toksinin peynirde kalma ve peyniralt suyuna geçme oranlar yla ilgili çok farkl bulgular mevcuttur. Ara t rmac lar n bir k sm aflatoksin M 1 in yar s n n hatta yar s ndan fazlas n n peynir suyuna geçti ini bildirirken di er bir k sm toksinin ço unun p ht da kald n bildirmektedirler (Govaris et al., 2001; Galvano et al., 1996). Peynirin, üretildi i sütteki aflatoksin M 1 konsantrasyonundan daha yüksek konsantrasyonda aflatoksin M 1 içermesi, kimyasal yap s itibariyle suda çözünebilen bir bile ik olan aflatoksin M 1 in kazeine ba lanmas ile aç klanmaktad r. Kazeinin hidrofobik bölgeleri vard r ve aflatoksin M 1 bu bölgelere ba lanmaktad r (Dosako, 1980). Yumu ak peynirlerde, peynirin üretildi i süttekinden kat, sert peynirlerde ise kat daha yüksektir (Dragacci et al.,1995). Govaris et al. (2001), suni olarak aflatoksin M 1 ile kontamine ettikleri sütten ürettikleri teleme peynirlerinde toksin konsantrasyonunun süttekinin 3.9 ile 4.4 kat oldu unu tespit etmi lerdir.

39 15 Olgunla ma ve depolama süresince toksinin peynirdeki stabilitesi ile ilgili elde edilen veriler de de i iklik göstermektedir. Cheddar (Brackett and Marth 1982a), Brick and Limburger (Brackett et al., 1982) peynirlerinde olgunla man n ba lang c nda aflatoksin konsantrasyonunun artt daha sonra azald, Parmesan peynirinde ise tam tersi ekilde olgunla man n ilk aylar nda toksin miktar n n azald sonras nda yava yava artt gözlenmi tir (Brackett and Marth 1982b). Yine ayn çal mada Mozzarella peynirinde 4.5 ayl k olgunla t rma süresi boyunca önemli say lacak düzeyde bir de i im belirlenememi tir. Ara t rmac lara göre, olgunla ma sürecinde kazeinin proteolizi, sütten aflatoksin M 1 in geri kazan m n %31 artt rmaktad r (Brackett and Marth 1982c). Cheddar peynirinin olgunla ma sürecinde meydana gelen aflatoksin M 1 konsantrasyonundaki art da muhtemelen kazeinin k smi proteolizinden kaynaklanmaktad r. (Brackett and Marth 1982a) Bak rc (2001), i lenmek üzere i letme tank nda toplanan çi süt ile bu sütten üretilmi pastörize süt, ya s z süt, yo urt, yay kalt ve peyniralt suyundaki aflatoksin M 1 miktarlar aras nda istatistiki aç dan önemli bir fark olmad n, ancak Beyaz peynir ve Ka ar peyniri örneklerindeki toksin miktar n n çi sütün toksin miktar ndan yüksek oldu unu belirlemi tir. Krema ve tereya örneklerinde ise çi süttekinden daha dü ük düzeyde toksin bulmu tur. Ayçiçek vd. (2005), Ankara daki sat yerlerinden toplad klar 49 adet krem peynir örne inin 44 ünde, 27 adet tereya örne inin 25 inde, 94 adet Beyaz peynir örne inin 86 s nda ve 53 adet Ka ar peyniri örne inin 47 sinde aflatoksin M 1 tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar, 12 adet Beyaz peynir, 1 adet tereya ve 7 adet Ka ar peynirindeki toksin miktar n n Türk G da Kodeksi taraf ndan bildirilen kabul edilebilir de erin üzerinde oldu unu belirlemi lerdir.

40 16 Tekin en ve Uçar (2008), Türkiye nin 5 büyük ehrindeki perakende sat yerlerinden toplad klar 92 adet tereya örne inin tamam nda, 100 adet krem peynir örne inin de 99 unda aflatoksin M 1 tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar tereya örneklerinin %28 inin, krem peynir örneklerinin de %18 inin limit de erin üzerinde aflatoksin M 1 içerdi ini bildirmi lerdir Süt Ürünlerinde Aflatoksin Üreten Küflerin Bulunmas ve Aflatoksin Üretimi Süt ürünlerinde özellikle de peynirde olgunla t rma ve depolama sürecinde küf geli imi büyük problem olu turmaktad r. Peynirlerde en çok geli en küfler Penicillium ve Aspergillus genuslar na ait türlerdir. Yak n zamana kadar, peynirde küf geli mesi sadece görünüm ile arzu edilmeyen tat ve aroma olu umu aç s ndan istenmeyen bir durumdu. Ancak, bu iki genusa ait türlerin mikotoksin üretme potansiyeline sahip olmalar nedeniyle, bunlar n geli imi, sa l k aç s ndan da istenmeyen bir durum haline gelmi tir (Bullerman and Olivigni, 1974). Yap lan birçok çal mada çe itli peynirlerden, hatta yo urttan bile Aspergillus flavus un aflatoksin üreten su lar izole edilmi tir. Ayr ca peynirlerde aflatoksin olu umu tespit edilmi tir. (Bullerman and Olivigni, 1974; Bullerman, 1976; Jordano et al., 1989; Barrios et al., 1997). Calvo et al. (1979), spanya da analiz ettikleri peynir örneklerinin %52 sinde A.flavus belirlemi lerdir (Barrios et al. 1997). Barrios et al. (1997), Güney spanya da sat a sunulan, 52 peynir örne ini incelemi ler ve örneklerin 4 ünde A. flavus un aflatoksin üreten su una rastlam lard r. Cheddar peynirinden izole edilen küflerin % 82.2 sinin Penicillium genusuna, %6.6 s n n Aspergillus genusuna ve 1.1 inin Fusarium genusuna ait oldu unu belirleyen Bullerman and Olivigni (1974), bu izolatlar n kültür ortam nda patulin, penisilik asit, okratoksin A ve aflatoksin ürettiklerini

41 17 tespit emi lerdir. Bullerman and Olivigni (1974), 1967 y l nda Lie and Marth n yapt klar çal maya at fta bulunarak, ara t rmac lar n, Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un, oda s cakl nda, Cheddar peynirinde geli ebildiklerini ve önemli düzeyde aflatoksin olu turduklar n tespit ettiklerini bildirmi lerdir. Bullerman (1976), 11 adet farkl marka sviçre peynirinden izole etti i toplam 183 küf izolat n n %87 sinin Penicillium genusuna, geriye kalan %13 ünün de farkl genuslara ait küf türleri oldu unu belirlemi tir. Ara t rmac izolatlar aras nda sadece 1 adet A. flavus tespit etti ini ve bunun da aflatoksin B 1 ve B 2 üretti ini bildirmi tir. Jordano et al. (1989), 20 adet yo urt örne inin 7 tanesinde toksin üretme yetene indeki Aspergillus flavus su lar n tespit etmi lerdir. A. flavus (CMI ) un Kefalotyri peynirinde geli me ve aflatoksin olu turabilme yetene ini belirlemek amac yla yapt çal mada Karaioannoglou (1990), yüzeyine söz konusu küf sporlar n inokule ettikten sonra 5, 10, 13 ve 26ºC de %80 nisbi nemde depolad peynir örneklerinden 26ºC de depolananlarda yo un geli me gözledi ini, peynirlerde sadece yüzeyden 8mm derinli e kadar aflatoksin B 1 ve G 1 tespit etti ini bildirmi tir. Ara t rmac, peynir örneklerindeki AFB 1 miktar n n ng/g aras nda AFG 1 miktar n n ise 33-64ng/g aras nda de i ti ini belirlemi tir. Corbion and Fremy (1978), Brick peynirinde, 7.2ºC de, A. flavus CMI ve A. parasiticus CMI un her ikisinin de geli ebildiklerini fakat sadece A. parasiticus CMI un 12.8ºC de aflatoksin üretebildi ini tespit etmi lerdir. 2.3.Aflatoksinlerin Fiziksel ve Kimyasal Yötemlerle Detoksifikasyonu Fiziksel yöntemler aras nda, elle veya elektronik yollarla ay klamadan, iri taneli ürünlerin aflatoksin düzeylerini azaltmak için yayg n olarak yararlan lmaktad r. Rengi de i mi, bozulmu, ekli bozuk taneleri

42 18 ay klayarak aflatoksini azaltma yönünde en iyi sonuçlar yerf st sektöründe al nm t r. M s r veya pamuk tohumu gibi küçük taneli ürünlerde ise bu yöntemi uygulamada güçlüklerle kar la ld ndan s kl kla kullan lmamaktad r. Ürünler bir küf bozulmas göstermedi i halde mikotoksinleri önemli düzeylerde içerebilmektedir. Bu nedenle, ay klama ile son üründe ba lang çtakinden dü ük aflatoksin düzeylerine ula lsa bile ço u kez kontaminasyonun tamam giderilememektedir. Küflerin geli ti i tanelerin yo unlu unun sa lam tanelere göre daha az olmas ndan yararlan larak aflatoksinin azalt lmas yla ilgili çal malar da yap lm t r (Evren, 1999; Özkaya ve Temiz, 2003). Bunlardan ba ka, çözgenlerle ekstraksiyon, s l i lem uygulamas, nlama ve adsorbsiyon gibi yöntemlerin aflatoksinin azalt lmas na etkileri ara t r lmaktad r (Ellis et al. 1991; Creppy, 2002). Aflatoksinler termostabil yani s cakl k uygulamas na dayan kl d r. Bu nedenle besinlerin üretimi ve haz rlanmas s ras nda s cakl k uygulamas yla etkisizle tirilmeleri oldukça zordur (Evren, 1999). Yüksek s cakl k uygulamas, özellikle evlerde uygulanan pi irme i lemlerindeki (kavurma, ha lama) s cakl k dereceleri sitrinin gibi baz mikotoksinlerin parçalanmas na yol açarken aflatoksinler üzerine fazla etkili olmamaktad r. Aflatoksinin k smi parçalanmas için gerekli s cakl k derecesinin 150ºC nin üzerinde olmas ( ºC) gerekti i bildirilmi tir. Is l i lemle mikotoksinlerin parçalanmas nda ürünün nemi ve uygulama süresinin de etkili oldu u bildirilmi tir. Su, aflatoksin B 1 in lakton halkas n n aç larak karboksilik asit olu umuna yol açmaktad r. Ancak ortamda baz maddelerin varl örne in iyonik tuzlar aflatoksinlerin parçalanma süresinin uzamas na yol açmaktad r (Heperkan vd., 2003). Aflatoksinler UV nlar na hassas olup, i lem süresine ba l olarak toksin miktar nda azalma meydana gelmektedir. lem sonras nda meydana gelen ürünlerin ise daha az toksik oldu u bildirilmektedir (Heperkan vd., 2003). Sütteki aflatoksin M 1 in, UV enerjisiyle muamele edilme süresine (2-

43 19 60 dak.), kullan lan sütün miktar na ve H 2 O 2 (%1) gibi oksitleyicilerin kullan lmas na ba l olarak % oran nda parçaland saptanm t r (Bak rc ve Akyüz, 2003). Aflatosin B 1 ve aflatoksin M 1 in UV nlama sonras nda 12 yeni parçalanma ürünü meydana geldi i ve bunlar n baz lar n n tavuk embriyolar na toksik etki gösterdikleri bildirilmi tir (Samarajeewa et al., 1990). Ayr ca 8 saat UV ile muamele edilmi aflatoksinli yerf st unlar ördeklere yedirildi inde, ördeklerde karaci er lezyonlar görüldü ü bildirilmi tir (Ellis et al., 1991). Baz adsorbant maddeler aflatoksinleri ba lama kabiliyetine sahiptir ve sulu çözeltilerden uzakla t r lmalar na olanak sa lamaktad r. Bu maddeler içerisinde en yayg n olarak kullan lanlar bentonit ve aktif kömürdür. Bu yolla toksin % aras nda solusyondan uzakla t r labilmekte ve di er metotlara göre daha avantajl oldu u kabul edilmektedir. Çünkü bu metot toksini parçalama yerine ba lamaktad r (Bak rc ve Akyüz, 2003). Adsorbe etme özelli i olan di er maddeler üzerinde yap lan ara t rmalar sodyum kalsiyum alumino silikat n aflatoksini yüksek oranda ba lad n ve toksik etkisini önemli düzeyde azaltt n ortaya koymu tur. Yap lan bir çal mada, in vitro ko ullarda, sodyum kalsiyum aluminosilikat n, sulu çözeltilerdeki aflatoksin B 1 in %80 inden fazlas n adsorbe etti i belirlenmi tir (Meerdink, 2002; Ellis et al., 1991). Aflatoksinlerin detoksifikasyonunda kullan labilecek birçok kimyasal madde üzerinde çal lm t r. Bunlar, asitler, alkaliler, oksitleyici ajanlar, aldehitler, gazlar ve bisülfitlerdir (Ellis et al., 1991). Kuvvetli asitler aflatoksinleri etkili biçimde parçalamalar na kar n çok kuvvetli olduklar ndan ürünün özelliklerini de i tirmektedirler. Ayr ca asitler aflatoksin B 2 ve G 2 üzerinde pek etkili de illerdir. Birçok ara t rma inorganik veya organik bazlar n kullan m n n aflatoksinlerin detoksifikasyonu için nispeten daha ucuz ve daha etkili yöntemler oldu unu ortaya koymu tur. Bu nedenle Sodyum hidroksit (NaOH) rafine ya larda, kalsiyum hidroksit de

44 20 yerf st ve pamuk tohumu unlar ndaki aflatoksin düzeyini azaltmak için kullan lmaktad rlar. Formaldehit de yerf st unundaki aflatoksini azaltmaktad r. Amonyak kullan m hayvan yemlerindeki aflatoksinin uzakla t r lmas nda en etkili ve ekonomik yöntem olarak görülmektedir. Kuru gaz olarak, yüksek s cakl klarda ve bas nçta kullan ld nda yerf st unundaki toplam aflatoksin konsantrasyonunda %95-98 oran nda azalma sa lad bildirilmi tir (Ellis et al., 1991). Bu yemlerle beslenen ineklerin sütlerinin nispeten daha dü ük düzeyde aflatoksin M 1 içerdi i, etlerinin ise ya az miktarda veya hiç aflatoksin B 1 içermedi i belirlenmi tir. Amonyaklama i lemi ABD nin baz eyaletlerinde, Fransa, Senegal ve Sudan da yasalar n öngördü ü ekilde endüstriyel ve ticari boyutta kullan lmaktad r (Samarajeewa et al., 1990). Bu uygulama AFB 1 in lakton halkas n hidrolize ederek AFB 1 in daha az toksik bile iklere dönü mesini sa lamaktad r (Meerdink, 2002). Ancak, amonyakla muamele edilmi hayvan yemlerinin protein kalitesinde azalma, lisin ve methionin içeri inde önemli dü ü olmas, dolay s yla besin de erinde kay plar meydana gelmesi, ayr ca hidrolizasyon sonucu toksik kal nt lar n ortaya ç kmas amonyaklama i leminin kabul edilebilirli ini azaltmaktad r (Samarajeewa et al., 1990) Biyolojik Yöntemlerle Detoksifikasyon 1960 l y llarda Ciegler et al. (1966), mayalar, küfler ve bakterileri içeren 1000 den fazla mikroorganizman n aflatoksinleri azaltma yetene i üzerinde çal m lar ve bunlardan sadece tek bir bakterinin, Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 ün hem s v hem de kat ortamlardaki aflatoksin B 1 i geriye dönü süz olarak uzakla t rd n tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar logaritmik ço alma safhas ndaki Flavobacterium aurantiacum hücrelerinin 19 saat ve 44 saat inkübasyon sonunda aflatoksin B 1 i s ras yla %30 ile %74 oran nda, durgun fazdaki hücrelerin ise 41 saat ve 88 saatlik inkübasyon sonunda s ras yla %41 ve %100 oran nda azaltt klar n tespit etmi lerdir. Is

45 21 ile inaktive edilmi hücrelerin ise test ortam ndaki aflatoksin B 1 in azalt lmas nda etkili olmad n bildirmi lerdir. Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 su u ile yap lan sonraki çal malar, bakterinin ayn zamanda çe itli g dalardaki (m s r, yer f st, m s r ya, süt ve yer f st ezmesi) aflatoksinleri azaltma yetene inde oldu unu da ortaya koymu tur. Özkaya vd. (2003a), F aurantiacum NRRL B-184 su unun, 48 saat içinde, Potasyum fosfat tamponu çözeltisinde, yer f st nda ve kuru k rm z biberdeki aflatoksin B 1 miktar n s ras yla % , % ve % oranlar nda azaltt n bildirmi lerdir. Line and Brackett (1995), 72 saatlik Flavobacterium aurantiacum kültürlerinin, aflatoksin B 1 in ortamdan uzakla t r lmas nda 24 saatlik kültürlere k yasla daha etkili oldu unu belirlemi lerdir. Line et al. (1994), 14 C ile i aretlenmi aflatoksin B 1 kullanarak yapt klar çal mada, canl Flavobacterium aurantiacum hücrelerinin varl nda, 6 saat inkübasyon sonunda, radyoaktivitenin sadece %24 ünün organik fazda kald n, aflatoksin B 1 in bakterinin metabolik aktivitesi sonucu suda çözünen bile ikler ile CO 2 e parçaland n saptam lard r. Flavobacterium aurantiacum un aflatoksini parçalama mekanizmas n n bir enzime ba l olup olmad n belirlemek amac yla, aflatoksin B 1 in, Flavobacterium aurantiacum dan elde edilen protein ekstraktlar taraf ndan parçalanmas üzerine proteinase K, DNase I ve ph n etkisini inceleyen Smiley ve Draughon (2000), proteinase K ile muamele edilmi protein ekstraktlar n n aflatoksin B 1 in sadece %34,5 ini azaltabildi ini (Çizelge 2.1), ekstraktlar n en yüksek degradasyon düzeyinin ise nötral ph da gerçekle ti ini tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar, elde ettikleri bu sonuçlar n, aflatoksin B 1 in parçalanmas n n tipik enzim özelli i ta yan bir proteine ba l oldu unun göstergesi oldu unu ifade etmi lerdir.

46 22 Çizelge 2.1. Çözelti çindeki Aflatoksin B 1 in Flavobacterium aurantiacum dan Elde Edilmi, lem Görmemi, Is l lem Görmü, Proteinaz K ile Muamele Edilmi ve DNase I ile Muamele Edilmi Protein Ekstraktlar Taraf ndan 30 C de 24 Saat nkübasyon Boyunca Azalt lmas (Smiley ve Draughon, 2000). Aflatoksin B 1 konsantrasyonu (µg) Ekstrakt Ba lang ç Final a Azalt lan % SE b Kontrol A lem görmemi protein ekstrakt C Is l i lem uygulanm A Proteinaz K ile muamele edilmi B DNase I ile muamele edilmi C a Ayn harfi içermeyen ortalamalar birbirinden farkl d r. (p<0.05) b Üç tekerrürün sonuçlar ndan elde edilen ortalaman n standart hatas Kontrol reaksiyonu 20 µg aflatoksin B 1 in 50mM Tris-HCl içinde, protein ekstrakt ilave edilmeksizin ph7.2 de inkübasyonu ile gerçekle tirildi Baz mikroorganizmalar n aflatoksin B 1 i aflatoksikole dönü türme yetene inde olduklar bildirilmektedir (Çizelge 2.2). Ancak bu dönü ümün çok yava ve tam olmayan bir süreç oldu u, aflatoksin B 1 in % 60 n n transformasyonu için 3-4 gün gerekti i belirtilmektedir (Ellis et al., 1991). Çizelge 2.2. Aflatoksin B 1 i Aflatoksikole Dönü türme Yetene indeki Baz Mikroorganizmalar (Ellis et al., 1991) Carnobacterium rubrum Trichoderma viride Dactylium denroides Absidia repens Rhizopus arrhizus Rhizopus stolonifer Aspergillus niger Mucor ambigus Mucor griseo-cyanus Mucor alternans Rhizopus oryzae Tetrahymena pyriformis 2.5. Laktik Asit Bakterileri Laktik asit bakterileri genel olarak süt, et, sebzeler gibi besin maddelerince zengin ortamlarda bulunmaktad rlar fakat baz lar ayn zamanda memelilerin normal a z, ba rsak, ve vajina floras n n bir

47 23 üyesidirler (Axelsson, 1998). Bunun d nda laktik asit bakterileri do al fermantasyona u ram bitkisel ve hayvansal birçok üründe di er mikroorganizmalarla birlikte de bulunurlar: fermente süt ürünleri (peynir, tereya, yo urt), fermente et (sosis, jambon, füme et), meyveye dayal alkollü içkiler, meyve-sebze tur ular, silo yemleri, fermente tah llar örnek olarak verilebilir (K l ç, 2001). Genel olarak yo urt, tereya, peynir gibi süt mamullerinin kendilerine özgü yap lar ile be enilen tat ve aromalar n n olu mas n sa lamak amac yla kullan lan, istenen özelliklere sahip saf mikroorganizma kültürlerine saf kültür veya starter kültür denilmektedir (Yayg n ve K l ç, 1993). Laktik asit bakterileri süt ürünleri için haz rlanan kültürlerde de en fazla kullan lan bakterilerdir. Laktik asit bakterilerinin belli ba l özellikleri, birkaç n n d nda k saca öyle s ralanabilir; Gram-pozitif, hareketsiz, spor olu turmazlar, anaerobik fakat oksijene toleransl d rlar. Katalaz enzimi içermezler, ancak baz lar yalanc katalaz içerebilir. Nitrat redükte etmezler. Sitokromoksidaz enzimleri bulunmaz. Mü külpesenttirler, karma k besinsel gereksinimleri vard r. Aside toleransl d rlar. Hidrokarbonlar fermente ederek önemli miktarda laktik asit üretirler. Bu özelliklere uyan bakteriler aras nda 4 bakteri s n f ay rt edilir; Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus ve Leuconostoclar. Ancak baz Laktobasil su lar n n hareketli oldu u ve endospor olu turdu u, baz streptokoklar n aerop ortamda ya ad ve yine baz laktobasil ve pediokoklar n katalaz pozitif reaksiyon verdikleri de bilinmektedir (Axelsson, 1998; K l ç, 2001). Cogan (1996), laktik asit bakterilerinin Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Tetragenococcus ve Vagococcus olmak üzere 11 genus alt nda topland klar n fakat süt ürünlerindeki starter laktik asit bakterilerinin

48 24 Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus ve Lactobacillus olmak üzere sadece bu be genusda yer alan bakteriler oldu unu bildirmi tir. Laktik asit bakterileri, taksonomik olarak, morfolojik yap lar na, eker fermantasyonlar na, geli me s cakl klar na, laktik asit konfigürasyonlar na, tuz, asit ve alkali tolerans na, ya asitleri bile imine ve DNA baz dizisi gibi genetik kriterlere ba l olarak s n fland r lmaktad rlar (Ray, 1996; Axelsson, 1998). Karbonhidrat metabolizmalar na göre homofermentatif ve heterofermentatif laktik asit bakterileri olmak üzere iki gruba ayr l rlar. Homofermentatif laktik asit bakterileri bir molekül glukozu Embden- Mayerhof veya glikoliz yolu ile 2 molekül laktik asite çevirirken, Heterofermentatif laktik bakteriler 1 molekül glukozdan pentoz fosfat (6Pglukonat/fosfoketolaz) yolu ile 1 molekül laktik asit, 1 molekül CO 2 ve 1 molekül etil alkol veya asetat olu tururlar (Garvie, 1984; Axelsson, 1998; K l ç, 2001) Laktik asit bakterilerinin karbonhidratlar parçalamalar sonucunda ortamda bir dizi dü ük molekül a rl kl, antimikrobiyal etkiye sahip organik moleküller meydana gelmektedir. Bunlar laktik, asetik ve propiyonik asitlerdir. ph n n dü mesi ve organik asitlerin meydana gelmesi bu bakterilerin ba l ca inhibitör aktivitesidir. Laktik asit bakterilerinin aktivitesi sonucu meydana gelen ph da çok az bakteri geli ebilmektedir. Bu inhibitör birincil metabolitlerden ba ka, laktik asit bakterileri ayn zamanda hidrojen peroksit, diasetil, bakteriyosinler gibi di er birçok antimikrobiyal maddeleri de üretebilmektedirler (Ouwehand, 1998; Mäyrä-Mäkinen and Bigret, 1998). Organik Asitler: Laktik asit bakterilerinin ana metaboliti olan laktik asit, ortam ph s n dü ürerek birçok mikrorganizman n geli imini inhibe etmektedir. Asidin dissosiye olmam hidrofobik formu hücrenin membran ndan geçerek hücre içinde, dissosiye olmakta ve sitoplazmay asitlendirmektedir. Buna ek olarak, dissosiye olmam asit elektrokimyasal

49 25 proton de i imini bozarak, bakteriostasise, sonuç olarak da hassas bakterilerin ölümüne neden olmaktad r (Schnürer and Magnusson, 2005). Heterofermentatif laktik asit bakterileri laktik asitin yan s ra asetik asit ve iz miktarda propiyonik asit de üretirler. Bu iki asitin pk a de erleri laktik asitin pk a de erinden daha yüksek oldu undan belirli ph larda laktik asitten daha yüksek oranda dissosiye olmam halde bulunurlar. Bu nedenle laktik asite k yasla antimikrobiyal etkileri daha fazlad r. Asetik asit ve propiyonik asitin etki ekilleri de laktik asitinki gibidir. Fakat asetik asit ve propiyonik asitin etkisi laktik asitin neden oldu u ph dü ü üne ba l d r. Propiyonik asit, özellikle dü ük ph larda küf geli imini azaltmakta, 4.5 in alt ndaki ph de erlerinde ise küf membranlar n etkilemektedir. Sodyum propiyonat ve amonyum propiyonat gibi propiyonik asit tuzlar da dü ük ph larda maya ve küfler üzerinde benzer etki göstermektedir (Earnshaw, 1992; Schnürer and Magnusson, 2005). Asetik asitin de mayalar, küfler ve bakteriler üzerinde inhibitör etkiye sahip oldu u bildirilmi tir (Ouwehand, 1998). Hidrojen Peroksit: Antimikrobiyal etkileri, yap lan çal malarla ortaya konmu tur. Katalaz üretmeyen fakat dioksijen ile reaksiyona giren flavoprotein oksidaza sahip birçok laktik asit bakteri türleri taraf ndan üretilmektedir (Earnshaw, 1992). Oksijen varl nda laktik asit bakterileri farkl bakteriler üzerinde toksik etkisi olan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üretebilir ve biriktirebilir. Bakteri membranlar n bozmada rol oynayan bu bile i e en duyarl olan G(-) bakterilerdir. H 2 O 2 özellikle E. coli de DNA n n üzerinde bozulmalara sebep olabilir. Gerçekte kromozomik replikasyonu engelleyen nükleotidik bazlar aç a ç kararak DNA zincirinde k r lmalara meydan verir (K l ç, 2001). Ya asitleri: lipolitik aktivite gösteren baz laktobasiller ve laktokoklar uygun ko ullar alt nda, önemli miktarda antimikrobiyal etkiye sahip ya asitleri üretmektedirler. Karbon atomu say lar 12 ile 16 aras nda de i en ya asitleri en etkili olanlard r ve deterjan benzeri özellikler gösterirler

50 26 (Earnshaw, 1992). K sa zincirli ya asitleri, özellikle ek i hamurdan izole edilen Lactobacillus sanfrancisco nun üretti i kaproik asitin de antifungal etkiye sahip oldu u bildirilmi tir (Ström et al., 2002). Diasetil: Diasetil (2,3-butanedione, biacetyl) daha çok tereya n n kendine özgü aromas n n meydana gelmesinde rol oynayan bile ik olarak bilinmektedir. Di er baz mikrorganizmalar n yan s ra Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus ve Pediococcus genuslar na dahil baz türler ve su lar taraf ndan üretilmektedir. Birçok ara t rmac in vitro ko ullarada diasetilin Mycobacterium tuberculosis e etkisini ortaya koymu lard r. Ayr ca Corynebacterium diphtheriae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, laktik asit bakterileri, Mycobacterium phlei, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus ve Streptococcus spp. gibi di er mikroorganizmalar üzerinde öldürücü veya inhibe edici etkisi oldu u da belirlenmi tir (Jay, 1982). Jay (1982), diasetilin gram pozitif bakterilerden çok gram negatif bakteriler, mayalar ve küfler üzerinde daha etkili oldu unu bildirmi tir. Ara t rmac söz konusu maddenin inhibitör etki gösterdi i miktarlar n (200µg/ml, 300µg/ml) çok yüksek oldu unu, g dalarda bu amaçla kullan m n n tat ve aroma aç s ndan problem yaratabilece ini ifade etmi tir. Reuterin: Esasen Lb. reuteri, taraf ndan üretilen dü ük molekül a rl kl, geni spektrumlu antimikrobiyal bir maddedir. Baz ara t rmac lar Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. collinoides ve Lb. coryniformis in de reuterin ürettiklerini bildirmi lerdir. Ortamdaki besin maddeleri azald zaman bakterinin anaerobik ko ullarda gliserolü parçalamas sonucu ortaya ç kmaktad r. Gram pozitif ve gram negatif bakterilerin yan s ra mayalar ve küfler üzerinde de etkilidir. Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Aspergillus ve Fusarium türlerine kar antifungal aktivite gösterdi i bildirilmi tir (Schnürer and Magnusson, 2005).

51 27 Ortama glycerol ilavesinin Lb. coryniformis in antifungal aktivitesini önemli düzeyde artt rd tespit edilen bir ara t rman n ileri a amalar nda ortamdan reuterin izole edilmi tir (Schnürer and Magnusson, 2005). Dü ük Molekül A rl kl Protein Parçalanma Ürünleri ve Bakteriyosinler: Bakteriyosinler genellikle onu üreten mikroorganizmalar ile yak ndan ili kili olan türlere kar bakterisidal etkisi olan protein veya peptid yap s ndaki antimikrobiyal maddelerdir (Earnshaw, 1992; Cleveland et al., 2001). Üreten bakteriye, antibakteriyel spektrumuna, etki ekline ve kimyasal özelliklerine göre de i kenlik gösteren, heterojen bile iklerdir (Mäyrä- Mäkinen and Bigret, 1998). Genel olarak, dar etki spektrumlu, peptid içerdi i için proteazlara hassas, termostabil diye tan mlan rlar. Laktik asit bakterilerinden Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc ve Pediococcus genusuna dahil baz bakteri tür ve su lar da bakteriyosinleri üretmektedirler (K l ç, 2001). Bunlardan çok say da bakteriyosin izole edilmi ve tan mlanm t r. Bu bakteriyosinlerden baz lar muhtemel g da koruyucusu olabilme özelliklerinden ve önemli patojenlere kar antagonistik etkilerinden dolay potansiyel antimikrobiyel madde statüsü kazanm lard r. En önemlileri nisin diplococcin, acidophilin, bulgarican, helveticinler, lactacinler ve plantaricinlerdir (Nettles and Barefoot, 1993; Savadogo et al., 2006) Bunlar aras nda, Lactococcus lactis taraf ndan üretilen nisin, bugüne kadar üzerinde en çok çal lm ve g da katk s olarak kullan m dünya çap nda kabul görmü tek bakteriyosindir (Savadogo et al., 2006). Nisin in, Bacillus, Bifidobacterium, Brochotrix, Clostridium, Enterobacter, Corynebacterium, Listeria, Micrococcus, Pediococcus, Staphylococcus, Lactobacillus ve Actinomyceae genuslar na ait birçok bakteri türü üzerinde inhibitör etkiye sahip oldu u ortaya konmu tur (Millette et al., 2004) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DDS14 taraf ndan üretilen bir bakteriyosin olan bulgarican n Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

52 28 Pseudomonas fluorecens ve Serratia marcescens i içine alan gram pozitif ve gram negatif bakterilere kar inhibitör etkisi oldu u belirlenmi tir (Reddy et al., 1983). Laktik asit bakterilerinin üretti i bakteriyosinler 4 s n f alt nda toplanmaktad r (Çizelge 2.3). Çizelge 2.3. Laktik Asit Bakterileri Taraf ndan Üretilen Bakteriyosinlerin S n fland r lmas (Ouwehand, 1998) SINIF ALT SINIF TANIMLAMA SINIF I Lantibiyotikler SINIF II SINIF III SINIF IV II A II B II C Küçük (<10kDa) moleküllü, hidrofobik, orta(100ºc) ve yüksek s ya(121ºc) stabil, lanthionin içermeyen membran aktif peptidler Amino uçlar yak n nda -Y-G-N-G-V-X-C içeren Listeria aktif peptidler ki peptidli bakteriyosinler Thiol ile aktive edilmi peptidler Büyük (>30kDa) moleküllü, s yla de i en proteinler Kompleks bakteriyosinler: Lipid ve/veya karbonhidrat içeren proteinler S n f I Lantibiyotikler olarak isimlendirilen bakteriyosinleri içermektedir. Lactococcus lactis subsp. lactis in üretti i Nisin A, Streptococcus salivarius 20P3 ün üretti i Salivaricin A gibi bakteriyosinler bu s n f içinde yer almaktad r. S n f II, bakteriyosinlerin geni bir türünü içermektedir. Bu sebeple üç alt s n fa ayr lmaktad r. Lactococcus lactis DPC3147 nin üretti i Lactacin 3147, Lb. brevis in üretti i Brevicin 37 ve Lb. plantarum un üretti i Plantaricin S ve Plantaricin T bu s n fta yer almaktad r. S n f III bakteriyosinler, büyük, s yla de i en proteinler olarak tan mlanmaktad rlar. Dolay s yla bu s n f, bakteriyosinlerin fizyolojik aktivitelerine benzer ekilde aktivite gösterebilen bakteriyolitik ekstrasellüler enzimleri (hemolysinler ve muramidazlar) içine almaktad r. S n f III

53 29 bakteriyosinler imdiye kadar sadece Lactobacillus genusunun üyelerinden izole edilmi tir. Lactobacillus delbrueckii nin üretti i Lacticin A ve Lacticin B ile Lb. casei B80 nin üretti i Caseicin 80 bu s n fta yer almaktad r. S n f IV, kompleks bakteriyosinleri içermektedir. Lipid veya karbonhidrat k s mlar n n aktivite için gerekli oldu u görülmektedir. Bugüne kadar tam olarak safla t r lamam düzenli peptid bakteriyosinleri içerdi i için S n f IV ün varl genellikle kabul edilmemektedir (Ouwehand, 1998). Bakteriyosinlerin, küf geli imi üzerine herhangi bir etkilerinin olabilece i ile ilgili çok az kan t bulunmaktad r. Bakteriyosinlerle ilgili yay nlanm yüzlerce eserin tersine laktik asit bakterilerinin antifungal peptidleri ile ilgili çok az yay n mevcuttur. Birçok ara t rmac laktik asit bakterilerinin antifungal aktivitelerinin proteolitik enzimlerle muameleden sonra ortadan kalkt n bildirmektedir (Schnürer and Magnusson, 2005). Batish et al. (1989), 19 laktik asit bakteri türünün, Aspergillus parasiticus, Aspergillus fumigatus, Rhizopus stolonifer ile di er Rhizopus ssp e kar antifungal aktivitesini incelemi ler ve bunlar aras nda Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetilactis DRC1 ile Streptococcus thermophilus 489 un küflere kar en çok inhibitör etki gösteren bakteriler oldu unu tespit etmi lerdir. Ayr ca küfler aras nda A. fumigatus un ise bu bakterilere kar en hassas küf oldu unu belirlemi lerdir. Yine yapt klar di er bir çal man n sonucunda Batish et al. (1991), Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetilactis DRC1 in 30 C de 48 ile 72 saat inkübasyonu sonunda A. fumigatus a kar üretti i inhibitör maddenin üretiminin maksimum seviyede oldu unu saptam lard r. Ara t rmac lar proteinase E ve trypsin ile muamele sonucunda inhibitör bile i in inaktif duruma geçti ini dolay s yla bu maddenin muhtemelen polipeptid yap s nda bir madde oldu unu bildirmi lerdir.

54 30 Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis Si3 su undan da birçok küf ve maya üzerinde antifungal etkiye sahip, yakla k 3 kda molekül a rl nda, s ya dayan kl, ph 3 ile 6 aras nda aktif olan ve proteinase K ile tamamen inaktif hale geçen bir peptid izole edilmi ve tan mlanm t r (Magnuson and Schnürer, 2001). Gourama (1997), Penicillium citrinum ve Penicillium expansum a kar kuvvetli inhibitör etkiye sahip Lactobacillus casei su lar n n bu etkilerinin laktik asit ve hidrojen peroksitten kaynaklanmad n, etken maddenin proteolitik enzimlere ve yüksek s cakl a hassas oldu unu belirlemi tir Laktik Asit Bakterilerinin Küf ve Aflatoksin Üzerine Etkileri Laktik Asit Bakterilerinin Küf Geli imi ve Aflatoksin Üretimi Üzerine Etkileri Laktik asit bakterilerinin aflatoksin üretimini inhibe edebildiklerini ilk ortaya koyan Maing ve arkada lar (1973) olmu tur. Ara t rmac lar, Lactobacillus delbrueckii (NRRL B445) ile fermente edilen soya sosu örneklerinde fermantasyon s ras nda Aspergillus parasiticus un olu turdu u aflatoksin miktar n n Lactobacillus delbrueckii yi içermeyen örneklerdekine k yasla daha az oldu unu tespit etmi lerdir. Daha sonra yap lan çal malarda da benzer etkiler gözlenmi tir. Çizelge 2.4 de bu çal malardan baz lar n n sonuçlar özetlenmi tir. Ara t rmac lar laktik asit bakterilerinin bu etkisini geli me s ras nda bakteri ile küf aras ndaki rekabet, bakteriyel metabolitler, ph daki de i im gibi farkl faktörlere ba lam lard r.

55 31 Çizelge 2.4. Farkl Laktik Asit Bakterisi Su lar n n Aspergillus un Geli imine ve Aflatoksin Üretimine Etkisi (El-Nezami and Ahokas, 1998) Misel kuru a rl (g) Aflatoksin düzeyi (mg/l) Su küf tek ba na bakteri ile küf tek ba na bakteri ile L. delbrueckii NRRL B L. casei ATCC S. lactis ATCC L. casei ATCC L. casei ATCC S. lactis ATCC >1.5 <0.05 L. acidophilus ND L. bulgricus ND L. plantarum ND L. sake CH17 4 ND L. alimmentarius CH33 4 ND ND : ortamda toksin tespit edilemedi. Coallier-Ascah and Idziak (1985), Lactococcus lactis subsp. lactis ile Aspergillus flavus aras ndaki interaksiyonun aflatoksin üretimine etkisini incelemi ler ve iki mikroorganizman n lablemco tryptone broth (LTB) daki kar k kültüründe aflatoksin üretiminin çok az oldu unu veya hiç gerçekle medi ini bulmu lard r. Ara t rmac lar ayr ca, aflatoksin üretiminin inhibisyonunda ph daki dü menin etkisinin olmad n bildirmi ler ve Lactococcus lactis subsp. lactis in, logaritmik ço alma safhas boyunca üretmi oldu u inhibitör madde veya maddelerin inhibisyondan sorumlu oldu unu ileri sürmü lerdir. K smen safla t r lm olan bu inhibitörün s ya dayan kl ve dü ük molekül a rl kl bir bile ik oldu u ortaya konmu tur. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus ve Lactobacillus plantarum un her üçünün de, tek ba na ilave edildikleri ortamlarda küf geli imini durdurdu unu belirleyen Karunaratne et al. (1990), bu bakterilerin hücrelerinden ar nd r lm supernatant n küf geli imini etkilemeksizin aflatoksin üretimini inhibe etti ini bildirmi lerdir. Benzer ekilde Luchese et al. (1992) da Pediococcus ve Lactobacillus türlerine ait su lar n Aspergillus

56 32 parasiticus un geli imini etkilemeksizin aflatoksin üretimini durdurdu unu tespit etmi lerdir. Gourama and Bullerman (1995a), Aspergillus flavus subsp. parasiticus üzerinde Lactobacillus türlerinin etkinli ini incelemi ler, kulland klar Lactobacillus tür kar m n n söz konusu küf su unun geli mesini durdurmadan aflatoksin üretmesini engellediklerini belirlemi lerdir. Etkicil maddelerin molekül a rl klar n n dalton aras nda oldu u ara t rmac lar taraf ndan saptanm t r ( ekil 2.2) ekil 2.2. Lablemco Tryptone Broth (LTB) daki A. flavus subsp. parasiticus un Aflatoksin B 1 ve G 1 Üretiminin, Farkl Moleküler A rl k Geçirgenli ine (MWCO) (1.000, ve ) Sahip Diyaliz Torbalar çindeki MRS Besiyerinde Geli en Lactobacillus Türleri Taraf ndan nhibe Edilmesi (Gourama and Bullerman, 1995a).

57 33 Bu Lactobacillus tür kar m ndan safla t r lan Lactobacillus casei pseudoplantarum 371 in yüksek düzeyde inhibitör etki gösterdi i de tespit edilmi tir. Takip eden çal malarda bu bakterinin supernatant nda, çözünür durumda bulunan bu maddenin tripsin ve -chymotrypsin e duyarl, pepsine kar ise dayan kl oldu u ortaya konmu tur. Ayr ca 100ºC de 10 dak. s tma ile inhibe olmu tur (Gourama and Bullerman, 1997). Dört ayl k Cheddar peyniri ve çi sütten izole edilen Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3 su una ait supernatant n A.flavus IARI, A.flavus NCIM555 ve A.parasiticus un geli imini inhibe etti ini tespit eden Roy et al. (1996), bu etkinin, supernatant chymotrypsin, trypsin ve pronase E ile muamele edildi i zaman ortadan kalkt n bildirmi lerdir. Lavermicocca et al. (2000), ek i hamurdan izole ettikleri L. plantarum 21B su unun birçok küfün yan s ra aflatoksin üreticisi olan A.flavus un geli imini de inhibe etti ini gözlemlemi lerdir. Ara t rmac lar inhibisyonda rol oynayan antifungal bile ikleri phenyllaktik asit ve 4-hidroksi-phenyllaktik asit olarak tan mlam lar ve bunlar n etkisinin fungusidal oldu unu da belirlemi lerdir Laktik Asit Bakterilerinin Olu mu Aflatoksinler Üzerine Etkileri Probiyotikler, bulunduklar canl n n sa l üzerinde yararl etkileri olan canl mikrobiyal g da katk lar d rlar. Probiyotik bakteriler ba rsak mikrofloras n dengelemek ve çe itli gastrointestinal rahats zl klar önlemek için kullan lmaktad rlar. Probiyotik bakterilerin ve bunlar içeren fermente süt ürünlerinin insan sa l üzerindeki di er birçok yararl etkilerinin yan s ra antimutajenik ve antikarsinojenik etkiye de sahip olduklar bildirilmi tir. Gerçek mekanizma tam olarak aç klanamasa da, promutajen ve prokarsinojenlerin karsinojenlere dönü ümünü önleyerek veya besinlerdeki mutajenleri ve karsinojenleri ba layarak bunu gerçekle tirdikleri tahmin edilmektedir (Peltonen et al., 2000).

58 34 Buradan yola ç karak baz ara t rmac lar laktik asit bakterilerinin aflatoksinleri de ba layarak ortamdan uzakla t rabilece ini ileri sürmektedirler. Nitekim bununla ilgili yap lan baz çal malar n (El-Nezami et al., 1998a; Haskard et al., 2000; Haskard et al., 2001; Oatley et al., 2000, Pierides et al., 2000) sonuçlar da bunu do rular niteliktedir. Peltonen et al. (2000), 6 probiyotik bakteri su unun aflatoksin B 1 i ba layabilme özelliklerini incelemek amac yla yapt klar çal mada, kulland klar 6 su un aflatoksini ba lama kapasitelerinin % 5.8 ile % 31.3 aras nda de i ti ini ayr ca Lb.johnsonii Lj-1 ve Lb. paracasei F19 un ise en iyi ba lay c lar olduklar n bildirmi lerdir (Çizelge 2.5) ( ekil, 2.3). Çizelge 2.5. Çal mada Kullan lan Probiyotik Bakteriler (Peltonen et al., 2000). Su Kodu Kaynak Lactobacillus paracasei F19 Bifidobacterium lactis Bb-12 Lactobacillus crispatus M247 Lactobacillus crispatus MU5 Lactobacillus salivarius LM2-118 Lactobacillus johnsonii LJ-1 F19 Bb-12 M247 MU5 LM2-11 LJ-1 Arla, sveç Chr Hansen Ltd., Danimarka Prof Morelli, UCSC, talya Prof Morelli, UCSC, talya University College Cork, rlanda Nestec, isviçre % Ba lanan aflatoksin ekil 2.3. Aflatoksin B 1 in Probiyotik Bakteriler Taraf ndan Ba lanmas. [Kültüre al nm bakteriler ((1-1.5) ) ve AFB 1 (1.5ml PBS de 7.5µg) 30 C de 24 saat inkübe edildi. Bakteriler taraf ndan ba lanmayan AFB 1 miktar HPLC ile ölçüldü.] (Peltonen et al., 2000)

59 35 Di er bir çal mada, probiyotik özelli e sahip, süt ürünleri orijinli 6 laktik asit bakterisi su unun, PBS (phosphate-buffered saline) içerisindeki aflatoksin M 1 i azaltma yeteneklerini inceleyen Pierides et al. (2000), kulland klar tüm su lar n hem canl hem de ölü ( s yla öldürülmü ) hücrelerinin ortamdaki aflatoksin M 1 i azaltabildi ini ortaya koymu lard r (Çizelge 2.6). Çal mada canl su lardan Lactobacillus rhamnosus GG su u ile Lactobacillus rhamnosus LC-705 su unun en iyi sonucu verdi i belirlenmi tir. Ara t rmac lar daha sonra bu iki mikroorganizmay kullanarak ya s z ve tam ya l sütte denemeler yapm lard r. Lactobacillus rhamnosus GG su unun PBS dekine k yasla daha dü ük miktarda da olsa aflatoksin M 1 i ba lad n tespit ederlerken, Lactobacillus rhamnosus LC-705 su unun daha yüksek miktarda aflatoksin M 1 ba lad n tespit etmi lerdir (Çizelge 2.7). Sonuçta, aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 yi ba layabilme yetene ine sahip Lactobacillus rhamnosus GG ve aflatoksin B 1 i ba layabilme yetene ine sahip Lactobacillus rhamnosus LC-705 in ayn zamanda, ortamdaki aflatoksin M 1 i de önemli miktarda azaltabildikleri görülmü tür. Ayn çal mada, s l i lem uygulamas n n, Lactococcus lactis ssp. cremoris ARH74 hariç denenen tüm su lar n aflatoksin M 1 i ba lama yetene ini artt rd, ölü Lactobacillus gasseri ve Lactobacillus rhamnosus 1/3 ün aflatoksin M 1 i ba lama kapasitesinin canl ya göre iki kat artt belirlenmi tir. Lactobacillus rhamnosus GG ve Lactobacillus rhamnosus LC-705 su lar n n in vivo ko ullarda da ayn etkiyi gösterdikleri hatta in vitro ko ullardakine k yasla daha yüksek miktarda aflatoksin B 1 ba layabildikleri yap lan bir di er çal mada da ortaya konmu tur (El-Nezami et al., 2000).

60 36 Çizelge 2.6. Phosphate-Buffered Saline (PBS) çindeki Aflatoksin M 1 (AFM 1 ) in, Canl ve Ölü Bakteri Hücreleri Taraf ndan Azalt lmas a (Pierides et al., 2000). Su Azalt lan %AFM saatte b Azalt lan %AFB 1 4 saatte 24 saatte L. rhamnosus GG (kültüre canl 50.7 ± 2.1 al nm ) ölü 57.8 ± ± ± 1.3 L. rhamnosus GG(liyofilize) canl 53.8 ± ± 2.0 ölü 56.2 ± 2.6 L. rhamnosus LC-705 (kültüre canl 46.3 ± ± ± 4.3 al nm ) ölü 51.6 ± 3.0 L. rhamnosus LC-705 canl 45.7 ± ± 1.0 (liyofilize) ölü 57.4 ± 2.2 L. lactis ssp. cremoris(arh74 canl 40.4 ± 2.7 su u) ölü 38.9 ± 2.8 L. gasseri (ATCC 33323) canl 30.8 ± ± ± 0.1 ölü 61.5 ± 0.7 L. acidophilus LA1 su u canl 18.3 ± 4.0 ölü 25.5 ± 4.8 L.rhamnosus 1/3 su u canl 18.1 ± 1.2 ölü 39.9 ± 0.7 a Her de er üç örne in ortalamas ve ± Standart sapma dan (SD) olu maktad r. b Sonuçlar n kar la t r lmas aç s ndan El-Nezami et al., (1998a) n n AFB 1 in azalt lmas ile ilgili yapt klar çal man n sonuçlar da dahil edilmi tir. Çizelge 2.7. Ya s z ve Tam Ya l Sütteki Aflatoksin M 1 (AFM 1 ) in Canl ve Ölü L. rhamnosus GG Su u ve L. rhamnosus LC-705 Su u Taraf ndan Azalt lmas a (Pierides et al., 2000). Su Ya s z sütte azalt lan % AFM 1 Tam ya l sütte azalt lan % AFM 1 L. rhamnosus GG su u canl 18.8.± ± 1.5 ölü 26.6 ± ± 1.1 L. rhamnosus LC-705 canl 69.6 ± ± 0.9 su u ölü 27.4 ± ±1.6 a Her de er üç örne in ortalamas ± Standart sapma (SD) dan olu maktad r. Farkl bifidobakteri su lar n n in vitro ko ullarda aflatoksin B 1 i ba lama derecelerini inceleyen Oatley et al. (2000), ölü bifidobakteri su lar n n ortama ilave edilen aflatoksin B 1 i %46 ±4 ile %25±4 aras nda de i en oranlarda ba lad klar n tespit etmi lerdir. Aflatoksin B 1 i en çok ba layan Bifidobacterium bifidum BGN4 su u olmu tur (%46 ±4).

61 37 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2 ve Streptococcus thermophilus ST-36 bakterilerinin, PBS (phosphate buffered saline) de, kontamine edilmi sütte ve kontamine edilmi sütten yap lan yo urtta aflatoksin M 1 i ba lama yeteneklerini ara t ran Sar mehmeto lu ve Küplülü (2004), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2 nin aflatoksin M 1 i PBS de % 18.70, sütte % 27.56; Streptococcus thermophilus ST-36 n n ise PBS de % ve sütte % düzeylerinde ba lad klar n belirlemi lerdir. Yo urtta ise ba lanmay en dü ük düzeyde saptad klar n (% 14.82) ifade etmi lerdir. Ba lanman n mekanizmas tam olarak aç klanamamakla birlikte, yap lan çal malarda canl hücreler kadar cans z hücrelerin de etkili olmas, hatta baz su lar n ölü hücrelerinin canl s na k yasla aflatoksini daha iyi ba lamalar, ba lanmada hücrenin canl l n n ön ko ul olmad n ortaya koymu tur. Bu, mekanizman n büyük olas l kla hücre duvar yla alakal bir olay olabilece i fikrini akla getirmektedir. Bununla iligili ise çe itli yorumlar yap lmaktad r. Morotomi and Mutai (1986), mutajenlerin laktik asit bakterilerinin hücre duvar na ba lanmas n n katyonik ba lanma yoluyla olabilece ini, Tanabe et al. (1991) ise böyle bir ba lanman n büyük olas l kla hücre duvar ndaki peptidoglikan yap ya ba lanma yoluyla gerçekle ti ini ileri sürmü lerdir. El-Nezami et al. (1998), hidroklorik asitle muamele edilmi Lactobacillus rhamnosus GG ve Lactobacillus rhamnosus LC-705 su lar n n ba lad klar aflatoksin miktar n n artmas nda, her iki yakla m n da do ru oldu unu ifade etmi lerdir. Haskard et al.(2000; 2001) ph 2 ile 10 aras nda de i en s v ortamlarda, bakteriye ba l aflatoksin B 1 in sadece %10 kadar n n serbest hale geçti ini, di er taraftan, aras nda de i en ph aral klar nda aflatoksin B 1 in Lactobacillus rhamnosus GG su una ba lanma düzeyinin etkilenmedi ini belirlediklerini bildirmi lerdir. Bu durumun Morotomi and Mutai (1986) n n ileri sürdü ü katyon de i imi mekanizmas yla aç klanamayaca n, ba lanmada hidrofobik interaksiyonlar n büyük rol oynad n ileri sürmü lerdir.

62 38 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Çal man n ana materyalini olu turan laktik asit bakterileri, Konya ilinden toplanan küflü peynirlerden izole edilmi tir. Bu amaçla; 9 tanesi, Konya da geleneksel yöntemlerle, kontrolsüz ko ullarda küflendirilmek suretiyle üretilen ve yayg n olarak tüketilen Konya Küflü peyniri, 1 tanesi Küflü Kars Eski Ka ar, 1 tanesi de d yüzeyi küflü, Deri Tulum peyniri olmak üzere toplam 11 adet peynir kullan lm t r. Laktik asit bakterilerinin biyokimyasal identifikasyonunda ikinci bir yöntem olarak kullan lan API test kitleri BioMérieux Diagnostik den (BioMérieux, stanbul, Türkiye) temin edilmi tir. Laktobasiller ve leukonostoklar için API 50CHL (Ref ) medium ile birlikte API 50 CH stribleri (Ref ), koklar için API 20 Strep (Ref ) kitleri kullan lm t r. Genetik tan mlamada yararlan lan referans su lar NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection, Peoria, Illinois, USA) CECT (Spanish Type Culture Collection), DSM gibi kültür koleksiyonlar ndan ve zmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü G da Mühendisli i Bölümü nden sa lanm t r. Bunlar: Lactobacillus casei subsp. casei (NRRL B-1922), Lactobacillus casei subsp. casei (NRRL B-441), Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (NRRL B-442) Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), Lactobacillus brevis (NRRL B-4527), Lactobacillus buchneri (NRRL B- 1837), Lactobacillus acidophilus (NRRL B- 4495), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus(nrrl B-548), Lactobacillus plantarum (NRRL B-4496), Lactobacillus plantarum (DSM 1954) Lactobacillus curvatus subsp. curvatus (NRRL B-4562), Enterococcus faecium (NRRL B-2354), Enterococcus faecalis (CECT 184), Enterococcus gallinarum (CECT 970), Enterococcus

63 39 casseliflavus (NRRL B-3502), Lactococcus lactis subsp. lactis (NRRL B- 1821), Lactococcus lactis subsp. cremoris (NRRL B-634), Leuconostoc lactis (NRRL B-3468), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (NRRL B-3252), Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (NRRL B-1146), Weissella paramesenteroides (NRRL B-3471), Pediococcus acidilactici (NRRL B-1117), Pediococcus acidilactici (NRRL B-14958), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (NRRL B-512F), Pediococcus damnosus (CECT 4671), Pediococcus pentosaceus (CECT 4695), Pediococcus parvulus (CECT 813 ), Lb. casei (CHI). Aflatoksin üretme yetene indeki Aspergillus flavus TÜB TAK Marmara Ara t rma Merkezi Kültür Koleksiyonu ndan, Aspergillus parasiticus (NRRL 2999) ise Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü nden temin edilmi tir. Peynir örneklerinden ve s v kültür ortamlar ndan aflatoksin ekstraksiyonunda kullan lan immunoaffinite kolonlar ile aflatoksin analizlerinde kullan lan Aflatoksin M 1 ve Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) standartlar R-Biopharm Rhône Ltd. Türkiye distribütörü Sincer Ltd. den temin edilmi tir. Ara t rman n son a amas n n materyalini olu turan peynir örnekleri E.Ü. Ziraat Fakültesi Süt Teknolojisi Bölümü Pilot Tesisi nde, kültür kat larak ve kat lmadan (geleneksel yöntemle) üretilmi tir. Kültür, çal man n ilk a amas nda izole edilip tan mlanm, aralar nda antifungal etkiye sahip türlerin de yer ald laktik asit bakterilerinin (SFKSx1, R1KLx3, R2KL10, V8KL10 ve R1KL6 kodlu) belli oranlarda kar t r lmas ile elde edilmi tir. Peynir mayas olarak, Mayasan G da San. ve Tic. A.. taraf ndan üretilen 1:16000 kuvvetindeki s v peynir mayas kullan lm t r. CECT deki yeni numaras 7350T

64 Yöntem Küflü Peynirlerde Yap lan Kimyasal ve Mikrobiyolojik Analizler Kurumadde tayini: Gravimetrik yöntemle yap lm t r (Oysun, 2001). Ya tayini: TS 3046 da belirtilen Van-Gulik metodu ile tespit edilmi tir (Anonim, 1978). Kurumaddede ya miktar ise orant ile hesaplanm t r. Tuz: Peynir örneklerinin tuz içeri i Mohr titrasyon yöntemiyle yap lm, kurumaddede tuz orant ile hesaplanm t r (Yayg n vd., 1985). Asitlik: Titrasyon asitli i % laktik asit olarak (Yayg n vd.,1985). ph: PyeUnicam Pye Model 292 (PyeUnicam Ltd., Cambridge, England) marka ph metre ile kombine elektrot kullan larak ölçülmü tür. Laktobasiller ve leukonostoklar n say m için MRS agar (Merck ), laktokoklar n ve enterokoklar n say m için M17 agar (Merck ) kullan lm t r. Leukonostoklar ayr ca 30 g/ml vancomycin (Sigma V-2002) içeren MRS agarda (Mathot et.al., 1994) say lmaya çal lm t r. D Grubu enterokoklar Kanamycin Esculine Azide agarda (Merck, ) (Anonymous, 1987) say lm ve izole edilmi tir. Küflerin say m için PDA (Merck ) ve Rose Bengal Chloramphenicol agar (Merck ) kullan lm t r.

65 Küflü Peynirlerde Aflatoksin M 1 ve Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Belirlenmesi Dragacci et al. (1995) n, peynirden aflatoksin M 1 ekstraksiyonu için geli tirdikleri metot, ara t rmam zda, peynir örneklerinden hem aflatoksin M 1 hem de toplam aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) ekstraksiyonu amac yla kullan lm t r. Ancak ilk yap lan geri kazan m çal malar nda % gibi dü ük geri kazan m elde edilmesi nedeniyle ekstraksiyon yönteminin baz k s mlar nda modifikasyonlar yap larak geri kazan m çal malar tekrarlanm t r. Yap lan modifikasyon neticesinde daha iyi geri kazan m elde edilmesi nedeniyle yöntem a a da anlat ld ekliyle kullan lm t r. Yöntemin geri kazan m oran aflatoksin M 1 için ortalama %60, aflatoksin B 1 için ortalama %70, B 2 ve G 1 için ortalama %78 ve G 2 için ortalama %65.7 olarak belirlenmi tir. Yöntemin dedeksiyon limiti ise aflatoksin M 1 için 0.025ng/g peynir (0.25 ng/10 g peynir) ve aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 için (her biri için ayr ayr ) ng/10 g peynir olarak tespit edilmi tir. Buna göre (A). 10 gr peynir üzerine 5-10 g Celite 545 (Merck 02693) ve 80 ml diklorometan eklenerek Waring (Waring Products Division, USA) marka blend rda 2 dak. süre ile kar t r lm t r. 40 ml daha diklorometan ilave edilip birkaç saniye daha kar t r ld ktan sonra Whatman No: 4 filtre ka d ndan süzülmü tür. Elde edilen süzüntünün hacmi ölçülüp sonuçlar n hesaplanmas nda kullanmak amac yla kaydedilmi tir. Daha sonra, süzüntü ilifli balona al nm ve Heidolph (Heidolph, Germany) marka döner buharla t r c da, C de, buharla t r lm t r. Kal nt 1ml metanol ve 30ml saf su eklenerek çözülmü tür. Ya uzakla t rmak amac yla üzerine 50 ml n- hegzan eklenmi ve çözelti ay rma hunisine aktar lm t r. yice çalkaland ktan sonra faz ayr lmas için bir süre beklenmi tir. Alttaki sulu faz bir mezüre al nm t r. Ay rma hunisi iki kez daha 10 ar ml su ile y kanarak sulu fazlar toplanm t r. Toplanan sulu fazlar birle tirilmi ve immunoaffinite kolondan, üretici firman n (R-Biopharm Rhône Ltd., 2003) önerdi i kullanma talimatlar do rultusunda geçirilerek ekstraksiyon

66 42 gerçekle tirilmi tir. Bu a amada izlenen yol, ekstraksiyonu yap lan toksine, dolay s yla kullan lan kolona göre farkl l k göstermi tir. (B). Aflatoksin M 1 eksraksiyonunda; Aflatoksin M 1 e özel monoklonal antikorlar içeren Aflaprep M immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. P04) kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam (yakla k 48 ml) 2-3 ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksin M 1, kolondan, önce 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) kar m, ard ndan 1.25 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 2.5 ml lik ekstrakttan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür. (C). Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) ekstraksiyonu için aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye özel monoklonal antikorlar içeren Aflaprep immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. P07) kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam (yakla k 48ml) 2-3 ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksinler, kolondan, önce 1ml metanol, ard ndan 1 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 2 ml lik ekstrakttan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür.

67 43 I II III IV I: mmunoaffinite kolon ekstrakte edilecek mikotoksine özel bir monoklonal antikor içerir. II: Mikotoksin ( ) içeren örnek veya örnek ekstrakt ( )kolondan geçirilir. III: Antikor izole halde kal r, mikotoksin bu antikorlar sayesinde kolonda tutulur. IV: Geçirilen çözgen (metanol, asetonitril gibi) kolondaki antikoru denature eder, toksinler serbest kalarak çözgenle birlikte örnek i esine geçer. HPLC de analize al n r. Resim 3.1. mmunoaffinite Kolon Çal ma Prensibi HPLC (Yüksek Bas nç S v Kromatogtafisi) Analizleri Aflatoksin analizleri G1322A model Degaser (seri no: JP ), G1311A model Pompa (seri no: DE ), G1316A model Colcom Kolon f r n (seri no: DE ), G1321A model Fluoresan dedektör (seri no: DE ) ve G1328A model Manuel enjeksiyon (seri no: DE ) ünitelerinden olu an Hewlett Packard Agilent 1100 series marka HPLC cihaz kullan larak gerçekle tirilmi tir.

68 Aflatoksin M 1 Analizleri çin HPLC Ko ullar Kolon: C18 Hypersil ODS 5µm, 250 x 4.6 mm Kolon S cakl : 25ºC Mobil Faz: Su:Asetonitril:MeOH(Metanol) (50:30:20 v/v/v) Ak H z : 1 ml/dak. Fluoresan Dedektör: Excitation 360 nm, Emission 430 nm Enjeksiyon ve Enjeksiyon Hacmi: Manuel enjeksiyon, 100 µl Standart Çözeltilerin Haz rlanmas ve Kalibrasyon: R-Biopharm Rhône Ltd. den temin edilen aflatoksin M 1 standard (Ana Stok, AS) asetonitril içinde 1000 ng/ml (ppb) konsantrasyonda aflatoksin M 1 içeren 6 ml lik ambalajdan olu maktad r. Yüksek konsantrasyonlu standart çözeltilerin haz rlanmas nda do rudan bu standart kullan l rken, dü ük konsantrasyonlu standart çözeltilerin haz rlanmas nda, buradan 100 µl al p asetonitril ile 10 ml ye tamamlamak suretiyle elde edilen 10 ng/ml konsantrasyondaki ara stok (ARS) standart çözeltisi kullan lm t r. Bunlar µl ARS mobil faz (Su:Asetonitril:MeOH 50:30:20) ile 10 ml ye tamamlanarak ng/ml=ppb lik µl ARS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 0.25 ng/ml lik µl ARS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 0.5 ng/ml lik µl ARS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 1 ng/ml lik µl AS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 5 ng/ml lik µl AS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 10 ng/ml lik

69 µl AS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 20 ng/ml lik µl AS mobil faz ile 10 ml ye tamamlanarak 40 ng/ml lik çal ma standartlar d r. Çal mam z n her a amas nda, aflatoksin M 1 ile ilgili yap lan tüm HPLC analizlerinde, yukar daki standart çözeltilerden en az üç tanesi seçilerek (o gün okunan örneklerdeki aflatoksin M 1 miktarlar n kapsayacak konsantrasyon aral ndaki) örnekler okunmadan önce veya okunduktan sonra enjekte edilmi, kalibrasyon e rileri çizilmi ve kalibrasyon yap lm t r Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Analizleri çin HPLC Ko ullar Kolon: C18 Hypersil ODS 5µm 250 x 4.6 mm Kolon S cakl : 40 ºC Mobil Faz: Su: Metanol: Asetonitril (62/22/16 v/v/v). Kolon sonras türevlendirme için mobil faz n 1000 ml sine 350 µl 4M HNO 3 (Nitrik Asit) ve g Potasyum bromür (KBr) (Riedel-de Haën 02110) ilave edilmi tir. Ak H z : 1 ml/dak. Fluoresan Dedektör: Excitation 362 nm, Emission 455 nm (G 1, G 2, için), 425 nm (B 1, B 2 için) Enjeksiyon ve Enjeksiyon Hacmi: Manuel enjeksiyon, 100 µl 425 nm dalga boyu sadece ara t rman n ilk a amas nda, peynir örneklerinde Toplam Aflatoksin belirlenmesinde kullan lm t r. Yap lan denemelerde, 425 nm yerine 455 nm dalga boyunda çal man n, belirlenen (ölçülen) aflatoksin B 1 ve B 2 miktar nda önemli bir farkl l k yaratmad tespit edildi inden, daha sonraki a amalarda B 1 ve B 2 için de 455 nm dalga boyu kullan lm t r.

70 46 Aflatoksin B 1 ve G 1 in UV k alt ndaki do al floresans n artt rmak ve daha kolay, daha hassas bir ekilde tespit edilmelerini sa lamak için HPLC analizlerinde türevlendirme yap lmas gerekmektedir. Ara t rmam zda kolon sonras türevlendirme uygulanm, bu amaçla Kobra Cell (R-Biopharm Rhône Ltd., product no: K01) kullan lm t r. Standart Çözeltilerin Haz rlanmas ve Kalibrasyon: R-Biopharm Rhône Ltd. den temin edilen Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Standard (R-Biopharm Rhône Ltd., P22)(Ana Stok) (AS) metanol içinde toplam 1000 ng/ml (250 ng B 1, 250 ng B 2, 250 ng G 1, 250 ng G 2 ) konsantrasyonda aflatoksin kar m içeren 6 ml lik ambalajdan olu maktad r. Buradan 400 µl al narak, metanol ile 10 ml ye tamamlamak suretiyle 40ng/ml konsantrasyondaki ara stok (ARS) standart çözeltisi elde edilmi ve dü ük konsantrasyonlu standart çözeltilerin haz rlanmas nda kullan lm t r. 5 farkl konsantrasyonda çal ma standart çözeltisi haz rlanm t r. Bunlar: µl ARS, metanol ile 10 ml ye tamamlanm, bu daha sonra su ile 1:1 seyreltilerek 0.5 ng/ml=ppb lik (0.125 ng/mlx4) toplam aflatoksin µl ARS, metanol ile 10 ml ye tamamlanm, bu daha sonra su ile 1:1 seyreltilerek 1 ng/ml=ppb lik (0.25 ng/mlx4) toplam aflatoksin µl ARS, metanol ile 10 ml ye tamamlanm, daha sonra su ile 1:1 seyreltilerek 2 ng/ml=ppb lik (0.5 ng/mlx4) toplam aflatoksin µl ARS, metanol ile 10 ml ye tamamlanm, daha sonra su ile 1:1 seyreltilerek 5 ng/ml=ppb lik (1.25 ng/mlx4) toplam aflatoksin µl ARS, metanol ile 10 ml ye tamamlanm, daha sonra su ile 1:1 seyreltilerek 10 ng/ml=ppb lik (2.5 ng/mlx4) toplam aflatoksin

71 47 Yüksek konsantrasyonlu çal ma standart çözeltilerinin haz rlanmas için, önce 1000 µl AS çözeltisi al narak metanol ile 5 ml ye tamamlanm ve 200 ng/ml lik ara stok (ARS ) elde edilmi tir. Daha sonra bu ara stok (ARS ) çözeltisi kullan larak a a da görüldü ü ekilde standart çözeltiler haz rlanm t r µl ARS µl su = 100 ng/ml (25 ng/ml x4) toplam aflatoksin µl ARS µl metanol µl su = 50 ng/ml (12,5 ng/ml x4) toplam aflatoksin µl ARS µl metanol µl su = 25 ng/ml (6,5 ng/ml x4) toplam aflatoksin Toplam aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) analizlerinde bunlardan en az üç tanesi seçilerek (o gün okunan örneklerdeki toplam aflatoksin miktarlar n kapsayacak konsantrasyon aral ndaki) örnekler okunmadan önce veya okunduktan sonra enjekte edilmi, kalibrasyon e rileri çizilmi ve kalibrasyon yap lm t r Laktik Asit Bakterilerinin zolasyonu Peynir örneklerinin her birinden steril po etlere 10 ar gram tart larak üzerlerine 90 ar ml ringer (Merck 15525) solüsyonu ilave edilmi tir. Colworth Stomacher 400 (BA6021 model, Seward Laboratory, U.K.) marka kar t r c da homojen hale gelinceye kadar peynirlerin parçalanmalar sa lanm t r. Böylece 10-1 lik dilüsyonlar elde edilmi tir. Daha sonra 9 ar ml ringer solüsyonu içeren tüpler kullan lmak suretiyle 10-6 ya kadar seri dilüsyonlar haz rlanm t r. Dökme plaka yöntemi kullan larak 10-5 ve 10-6 l k dilüsyonlardan uygun besiyerlerine ekim yap lm t r. Mikroaerofilik ortam

72 48 yaratmak amac yla besiyeri çift kat dökülmü tür. Laktokoklar için M17 agar (ph:7.2) (Terzaghi and Sandine, 1975), laktobasiller için MRS agar (ph: ) (De Man et al., 1960), muhtemel leukonostoklar için 30 g/ml vancomycin (Sigma V-2002) içeren MRS agar (ph:5.8) (Benkerroum et al., 1993; Mathot et.al., 1994) ve enterokoklar için Kanamycin Esculin Azide agar (Merck ) kullan lm t r. M17 agar ve vancomycinli MRS agara ekim yap lan petriler 30 C de, MRS agar ve Kanamycin Esculin Azide agara ekim yap lan petriler 37 C de 48 saat inkübe edilmi lerdir. Bu petrilerden tesadüfi olarak seçilen koloniler önce yat k agara inoküle edilerek izole edildikleri s cakl kta 24 saat geli tirilmi lerdir. Buzdolab nda bir süre bu ekilde sakland ktan sonra uygun s v besiyerlerine aktar lm lard r. Buna göre MRS agar ile vancomycin li MRS agardan izole edilenler için MRS Broth (Merck ) M17 agardan izole edilenler için M17 Broth (Merck ) ve Kanamycin Esculin Azide agardan izole edilenler için SF Broth (Atlas, 1995) s v besiyerleri kullan lm t r. ( zolasyonda kullan lan besiyerlerinin bile imi Ek 1 de verilmi tir) dentifikasyona al nmadan önce tüm izolatlarda basit boyama, gram boyama ve katalaz testi yap lm t r (Atlas et al., 1995; Norrell and Messley, 1997). Gram pozitif katalaz negatif oldu u belirlenen ve morfolojilerine göre s n fland r lan izolatlar n her birinden 3 paralel %20 gliserol içeren s v besiyerine aktar lm ve -20ºC de saklanm t r. Bunlar daha sonra stok kültür olarak kullan lm t r. Bunun için, 500 µl, %40 gliserol (AppliChem A2926) içeren MRS veya M17 broth (bakteri türüne göre) µl 24 saat inkübe edilmi bakteri kültürü eppendorf tüpüne al nm t r. Besiyeri ve gliserol ayr i elerde otoklavlanm (121ºC de 15 dak.), kullan lmadan önce steril bir ekilde kar t r lm t r.

73 Laktik Asit Bakterilerinin dentifikasyonu Laktik asit bakterilerinin identifikasyonu fenotipik ve genotipik yöntemler kullan larak gerçekle tirilmi tir Fizyolojik ve Biyokimyasal (Fenotipik) dentifikasyon Geleneksel Yöntemle dentifikasyon Gram pozitif katalaz negatif koklar n tür düzeyinde identifikasyonu için farkl s cakl klarda geli me (10, 40 ve 45 C de), farkl tuz konsantrasyonlar nda geli me (%2, %4, %6.5), ph 9.6 da geli me, argininden amonyak olu turma, esculini parçalama gibi testlerin yan s ra çe itli karbonhidratlar fermente etme testleri uygulanm t r. Bunun için 10 farkl karbonhidrat kullan lm t r (Laktoz, D(-)-Fruktoz, D(+)- Galaktoz, Maltoz, Melibioz, Salicin, Sakkaroz, D(-)-Sorbitol, Raffinoz, L-Arabinoz). Gram pozitif katalaz negatif lakobasillerin ve muhtemel leuconostoklar n identifikasyonu için ise farkl s cakl klarda geli me (10, 15, 37 ve 45 C de), litmuslu sütte geli me, glukoz dan gaz olu turma, argininden amonyak olu turma, esculini parçalama ve 14 adet karbonhidrat (Yukar dakilere ek olarak Mannitol, Sellobioz, Trehaloz, Amigdalin) fermente etme testleri uygulanm t r (Rogosa and Sharpe, 1959; Sharpe, 1961; Sharpe et al., 1970; Harrigan and MacCance, 1974; Hlandy, 1971) Uygun s v besiyerlerinde saat inkübe edilen her bir bakteri kültüründen, Ek 2.1 ve Ek 2.2 de belirtildi i ekilde haz rlanan test ortamlar na yakla k 20 µl inoküle edilmek suretiyle identifikasyon testleri gerçekle tirilmi tir. S cakl k testleri için olanlar hariç, tüpler, inoküle edilen bakterinin izole edildi i s cakl kta (30 veya 37ºC de) inkübe edilmi, 24. saatte, 48. saatte, 5. ve 7. günlerde incelenmi, reaksiyonlar pozitif veya negatif olarak kaydedilmi tir.

74 50 Reaksiyonlar n de erlendirilmesi u ekilde yap lm t r: Farkl S cakl kta Geli me Testi: Bulan kl k ve geli me (+), tersi ( ) olarak degerlendirilmi tir. Farkl Tuz Konsantrasyonlar nda Geli me Testi: Bulan kl k ve indikatör renginin sar ya dönü mesi (+), mavi renk ve bulan kl k olmamas (-) olarak de erlendirilmi tir. ph 9.6 da Geli me: ndikatördeki renk de i imi (sar -kahve) (+), tersi ( ) olarak de erlendirilmi tir. Glukozdan Gaz Olu turma: Renk de i imi (sar renk) ve bulan kl k ile birlikte durham tüpü içinde gaz birikimi (+), tersi reaksiyon ( ) Arginin den Amonyak Olu umu: 48 saat sonunda test tüpüne 1 damla Nessler çözeltisi (Bkz. Ek 2.1) damlat larak renk de i imi gözlenmi tir. Portakal sar s renk (+), renk de i imi olmamas ( ) de erlendirilmi tir. Esculin Parçalanmas : 48 saat sonunda test tüpüne 1 damla %7 FeCl 3 çözeltisi (Bkz. Ek 2.1) damlat larak renk de i imi gözlenmi tir. Siyah renk olu umu (+), renk de i imi olmamas ( ) olarak de erlendirilmi tir. Litmus Sütte Geli me: Asitlik geli imi (A) ve dolay s yla Litmus renk maddesinin redüksiyonu (R) (+). Sütün p ht la mas (C) (+), aksi reaksiyonlar ( ) olarak de erlendirilmi tir Karbonhidrat Testleri: Sar renk (+), indikatörün renginin de i memesi (mavi ve k rm z renk) ( ) olarak de erlendirilmi tir. Sonuçlar (Bkz. Ek 6), farkl kaynaklardan yararlan larak olu turulmu tablolarla kar la t r l p, bakteriler tan mlanm lard r (Bkz. Ek 5).

75 API Test Kitleri le dentifikasyon API- Automation pour identification ( dentifikasyon için otomasyon) bakteri ve maya identifikasyonunda kullan lmaktad r. Ara t rmam zda, laktobasiller ve leukonostoclar için API 50CHL (Ref ) medium ile birlikte, API 50 CH (Ref ) stribleri, koklar için API 20 Strep (Ref ) kitleri kullan lm t r. API 50CHL (BioMérieux Ref ) API 50 CHL Medium haz r besiyeri, API 50 CH stribi ile birlikte Lactobacillus ve ilgili cinslerin 49 karbonhidrat fermente etme özelliklerinin belirlenmesi prensibine dayal olarak identifikasyonunu sa layan bir yöntemdir. Besiyeri içinde, test edilecek mikroorganizma ile bir süspansiyon haz rlan r ve stripteki her tüp inoküle edilir. nkübasyon s ras nda karbonhidratlar n fermantasyonu ile asidik ortam olu ur ve buna ba l olarak ph dü er. Bu de i im indikatörler sayesinde tespit edilir (Resim 3.2). Sonuçlar su un biyokimyasal profilini ortaya koyar ve tan mlamada kullan l r. (A) (B) Resim 3.2. API 50 CHL le nokule Edilmi API 50 CH Stribleri (A) Negatif Reaksiyon. (B) Pozitif Reaksiyon

76 52 API 50 CHL testi u ekilde uygulanm t r: Haz rlanan MRS agar (Merck ) (Bkz. Ek 1) petrilere dökülmü ve dondurulmu tur. Her bir izolat ayr bir petri kutusundaki besiyeri yüzeyine çizgi ekim yap lm ve uygun s cakl kta (30 veya 37ºC de), içine Anaerocult C kiti (Merck ) b rak lm anaerobik jar (Merck Vol 2.5 lt) içinde, 24 saat inkübe edilmi tir. Geli en koloniler, API 50 CHL (Ref ) ve API 50 CH (Ref ) nin kullan m k lavuzunda anlat lan i lem basamaklar uygulanarak test striblerine inoküle edilmi lerdir. 30 veya 37ºC de (izolata göre) 48 saat inkübasyona b rak lan stribler, yine kullan m k lavuzunda belirtildi i ekilde 24. ve 48. saatlerde kontrol edilerek meydana gelen de i iklikler kaydedilmi tir. Bu i lemler her bir izolat n tan mlanmas için ayr ayr yap lm t r. Elde edilen sonuçlar bilgisayar ortam nda tan mlama program (apiweb stand alone V 1.1.0, BioMérieux) kullan larak de erlendirilmi tir. API 20 Strep (BioMérieux Ref ) API 20 Strep, geni bir kapasiteye sahip 20 kimyasal testi kombine eden standartla t r lm bir metottur. Birçok streptokok ve enterokok un gurup veya tür düzeyinde tan mlanmas n sa lar. API 20 Strep stribi, enzimatik aktivitenin ya da ekerlerin fermentasyonunun belirlenmesi için dehidrate substratlar içeren 20 mikrotüpten olu maktad r. Enzimatik testlerde, enzimatik substratlar yeniden hidrate etmek için saf bir kültürden yap lm yo un bir organizma süspansiyonu ile inoküle edilir. nkübasyon periyodu s ras nda ortaya ç kan son metabolik ürünler spontan olarak ya da reaktiflerin eklenmesiyle renk de i iklikleri meydana getirir. Fermantasyon testlerinde ise, ekerleri hidrate eden, s v besiyeri (4 McFarland dan daha yo un mikroorganizma süspansiyonundan 500 µl ilave edilmi ) ile inoküle edilir. Karbonhidratlar n fermantasyonu sonucu ph indikatörünün renginde de i iklikler medyana gelir. Olu an reaksiyonlar,

77 53 okuma tablosuna göre okunur ve tan mlama, analitik profil indeksi ya da bilgisayar ortam nda tan mlama program kullan larak gerçekle tirilir. (A) (B) Resim 3.3. API 20 Strep Test Kiti Stribleri (A) Negatif Reaksiyon. (B) Pozitif Reaksiyon API 20 Strep testi u ekilde uygulanm t r: Haz rlanan M17 agar (Merck 15108) (Bkz. Ek 1) petrilere dökülmü ve dondurulmu tur. Her bir izolat ayr bir petri kutusundaki besiyeri yüzeyine çizgi ekim yap lm t r. 37ºC de, anaerobik jar (Merck Vol 2.5 lt) (Anaerocult C (Merck ) ile birlikte) içinde, 24 saat inkübe edilen petrilerde geli en koloniler, API 20 Strep (Ref ) in kullan m k lavuzunda anlat lan i lem basamaklar uygulanarak test striblerine inoküle edilmi lerdir. Her bir izolat için ayr strib kullan lm t r. Stribler 37 ºC de inkübasyona b rak lm lard r. nkübasyonun 4. ve 24. saatlerinde, yine kullan m k lavuzunda belirtildi i ekilde kontrol edilmi lerdir. Meydana gelen de i iklikler kaydedilmi ve sonuçlar bilgisayar ortam nda tan mlama program (apiweb stand alone V 1.1.0, BioMérieux) kullan larak de erlendirilmi tir.

78 Genotipik dentifikasyon Laktik asit bakterilerinin genotipik tan mlamas nda: PCR-RFLP (16S rrna gene-its region) yöntemi kullan lm t r (Bulut vd., 2004). Bu yöntemle sonuç vermeyen izolatlar PCR-RFLP (16S rrna) yöntemi uygulanarak tan mlanmaya çal lm t r DNA Ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonu için Cardinal et al. (1997) n, Bulut vd. (2004) taraf ndan modifiye edilen yöntemi kullan lm t r: 10 ml MRS veya M17 broth da bir gece geli tirilen kültürler 5000 rpm de 5 dak. santrifüj edilerek bakteri hücreleri elde edilmi tir. Hücre pelleti 500 l 1xTE buffer(ph 8) ile y kand ktan sonra tekrar 5000 rpm de 5 dak. santrifüj edilmi tir. Hücre pelletine 200 l eritici (lysis) buffer (%25 sakkaroz ve 30 mg/ml lisozim içeren 1xTE buffer ph 8) ilave edilmi ve 37 C de 1 saat inkübasyona b rak lm t r. Örnekler lysis (eritme) den sonra 370 l proteinase K buffer (1 mg/ml proteinaz K içeren 1xTE buffer ph 8) ve 30 l %10 luk SDS eklenerek 37 C de 1 saat daha inkübe edilmi tir. Deproteinizasyonu takiben, 100 l 5M NaCl ve 80 l CTAB/NaCl çözeltileri ilave edilmi ve örnekler yeniden 65 C de 10 dak. inkübasyona tabi tutulmu tur. Daha sonra, bir örnek hacmi kadar (750 l) kloroform/isoamil alkol : (24/1, v/v) kar m ilave edilerek iki defa kloroform ekstraksiyonu ( * ) gerçekle tirilmi tir. Kloroform ekstraksiyonu sonunda elde edilen üst faz yeni bir eppendorf tüpüne al nm, bir örnek hacmi kadar (750 l) isopropanol ilave edilerek DNA çöktürülmü tür. Elde edilen DNA yuma, bir pipet ucu yard m ile 500 l %70 lik etanol içeren eppendorf tüpüne aktar lm ve y kanm t r (DNA yumak halinde çökmedi i durumlarda 6000 rpm de 10 dak. santrifüj edilmek suretiyle pellet olarak elde edilmi tir. sopropanolün tamamen uzakla t r lmas n takiben üzerine 500 l %70 lik

79 55 etanol eklenerek y kanm t r). Y kama i leminden sonra 6000 rpm de 10 dak. santrifüj edilerek DNA pellet haline getirilmi tir. Etanol uzakla t r ld ktan sonra 37ºC de 10 dak. kurutulmu ve 100 l Rnase çözeltisi (100 g/ml Rnase içeren 1xTE) içinde çözündürülmü tür. 37 C de 1 saat inkübasyondan sonra örneklerin hacmi 1xTE ile 400 l ye tamamlanm t r. Daha sonra birbiri ard na s oku (80 C de 10 dak. ve 20 C de 20 dak.) iki kez uygulanarak DNA çözülmü tür. 1 kez fenol ve ard ndan 1 kez kloroform ile ekstraksiyondan ( * ) sonra, örnek hacminin 1/10 u kadar (40 l) 5M-NaCl ve 2 hacim(800 l) %99 luk etanol ilave edilerek DNA tekrar çöktürülmü tür. Daha sonra 6000 rpm de 5 dak. santrifüj edilerek %99 luk etanol uzakla t r lm ve pellet 500 l %70 lik etanolle y kanm t r. Tekrar 6000 rpm de 5 dak. santrifüj i leminden sonra %70 lik etanol de tamamen uzakla t r lm ve DNA pelleti 37ºC de 10 dak. kurutulmu tur. Pellet miktar na göre DNA 25 l, 50 l, 100 l veya 150 l 1xTE içinde çözündürülmü tür. Son olarak, DNA n n çözünmesi için örnekler (80ºC de 10 dak ve 20ºC de 20 dak. süreyle) 1 kez s okuna tabi tutulmu ve 20ºC de saklanm t r. ( * ) Kloroform ekstraksiyonu u ekilde gerçekle tirilmi tir: 1 örnek hacmi kadar kloroform/isoamil alkol kar m : (24/1 v/v) ilave edilmi ve iyice çalkaland ktan sonra 6000 rpm de 5 dak. süreyle santrifüj edimi tir. Üst faz yeni bir eppendorf tüpüne aktar lm t r. kinci kez kloroform ekstraksiyonu için tüpe kloroform/isoamil alkol kar m ilave edilerek ayn i lem tekrarlanm t r. Fenol ekstraksiyonu da ayn ekilde gerçekle tirilmi tir. Not: (DNA ekstraksiyonunda ve genotipik tan mlaman n bundan sonraki a amalar nda kullan lan kimyasallar n listesi Ek 3 te, bufferler ve stok çözeltilerin haz rlan ise Ek 4 de verilmi tir.)

80 PCR Miksinin Haz rlanmas ve PCR Ko ullar PCR miksi (her bir örnek için), s ras yla, Taq DNA polymerase buffer (Mg içermeyen) 5 l 25 m MgCl 2 3 l Steril dh 2 O 32,7 l Forward primer (10 pmol/ l) 1 l Reverse primer (10 pmol/ l) 1 l Her biri 2m dntps den 5 l Taq DNA polymerase 1.5 ünite (5 ünite/ l lik enzimden 0.3 l) kar t r larak elde edilmi tir. PCR i lemleri 2 l genomik DNA ve 48 l PCR miksinden olu an toplam 50 l hacimde gerçekle tirilmi tir. Takara marka (PCR Thermal Cycler, Model TP600, Takara Bio Inc., Japan) PCR cihaz kullan lm t r. 16S rrna gene-its (Internal Transcribed Spacer) bölgesinin ço alt lmas nda forward, EGE1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (Mora et al., 1998) ve reverse, L1: 5'-CAAGGCATCCACCGT-3' (Jensen et al., 1993) primerleri kullan lm t r. Burada forward primer 16S rrna n n 5' ucuna tamamlay c, revers primer ise ITS bölgesinin 3' ucuna tamamlay c d r. 16S rrna bölgesinin ço alt lmas nda ise forward EGE1 ve reverse EGE2: 5'-CTACGGCTACCTTGTTACCA-3' primerleri kullan lm t r. Burada forward primer 16S rrna n n 5' ucuna tamamlay c, revers primer ise 16S rrna n n 3' ucuna tamamlay c d r.

81 57 Amplifikasyon ko ullar : 16S rrna gene-its bölgesi için, 94 C de 5 dak. denaturasyon. 94 C de 1 dak denaturasyon 42 C de 1 dak. annealing 72 C de 1 dak. elongasyon 72 C de 10 dak. ekstension 40 tur (cycle) 16S rrna bölgesi için: 94 C de 5 dak. denatürasyon 94 C de 1 dak denatürasyon 56 C de 1 dak. annealing 72 C de 1dak. elongasyon 72 C de 10 dak. ekstension 40 tur (cycle) PCR Ürünlerinin Temizlenmesi PCR i leminden sonra PCR tüpündeki hacim eppendorf tüpüne al narak 1xTE ile 100 l ye tamamlanm t r. Üzerine hacminin iki kat kadar (200 l) kloroform/isoamil alkol ilave edilerek iyice çalkalanm t r rpm de 10dak. santrifüj edildikten sonra üst faz pipetle al nm ve yeni bir eppendorf tüpüne aktar lm t r. Üzerine 200 l kloroform/isoamil alkol ilave edilerek ayn i lem bir kez daha tekrarlanm t r. Üst faz üzerine hacminin 1/10 i kadar 3M Na-asetat (ph: 5.2) ilave edilip kar t r ld ktan sonra, 2 hacim (220 l) %99 luk etanol eklenerek tekrar fakat h zl bir ekilde kar t r lm t r rpm de 10 dak. santrifüjden sonra etanol tamamen uzakla t r lm ve pelleti y kamak için 500 l %70 etanol ilave edilmi tir. Ard ndan 6000 rpm de 5

82 58 dak. süreyle santrifüj edilerek %70 lik etanol de tamamen uzakla t r lm t r. 37ºC de kurutulan pellet 50 l 1xTE de çözülmü ve -20ºC de saklanm t r PCR Ürünlerinin Elektroforezi PCR ürünleri, ilki PCR i leminden hemen sonra ikincisi temizleme i leminden sonra olmak üzere iki kez elektroforeze tabi tutulmu lard r. Bu amaçla, 0.8 g agaroz, 100 ml 1xTAE buffer da kaynat larak eritilmi tir ºC ye so utulduktan sonra içine 10 mg/ml lik ethidium bromid çözeltisinden 15 l ilave edilerek jel tepsisine dökülmü ve üzerine taraklar yerle tirilmi tir. Jel donduktan sonra taraklar dikkatli bir ekilde ç kar larak, jel tepsisi, 1xTAE buffer dolu elektroforez tank na (Thermo EC330 Midicell Primo Electrophoretic Gel System) konulmu tur. 5 l PCR ürünü 2 l jel loading dye ile kar t r larak tüm PCR ürünleri jeldeki ikinci kuyucuktan itibaren jele yüklenmi tir. lk kuyucu a 1 kb lik DNA size-marker (Fermentas, SM0313) yüklenmi tir. Yükleme tamamland ktan sonra PCR ürünleri 80V da 30 dak. elektroforeze tabi tutulmu lard r. Sonuç, jel dökümantasyon sisteminde (Vilber-Lormat) görüntülenmi tir bp büyüklü ündeki DNA bölümlerinin varl PCR i leminin beklenen ekilde gerçekle ti ini göstermi tir (Resim 3.4).

83 bp 1500 bp Resim S-ITS Amplifikasyon Ürünlerinin ( bp lik) Jel Görüntüsü PCR Ürünlerinin Restriksiyon Endonükleazlar le Kesimi (RFLP -Restriction Fragment Length Polymorphism) Amplifikasyon ürünleri iki restriksiyon endonükleaz, Hae III ve Taq 1 (MBI Fermentas) ile ayr ayr muamele edildi. Kesim, 10 l DNA, 5 l restriksiyon enzimi buffer, 0.5 l restriksiyon enzimi (10U/ l) (Hae III veya Taq 1) ve 35 l steril deiyonize sudan olu an 50 l hacim içerisinde gerçekle tirilmi tir. Hae III ile muamele edilenler 37 C de, Taq 1 ile muamele edilenler 65 C de 1 gece bekletilmi lerdir. Taq 1 ile muamele edilenlerin üstü buharla may önlemek için minerel ya ile örtülmü tür Kesim Ürünlerinin Temizlenmesi Kesim ürünlerinin hacimi 1xTE ilave edilerek 100 l ye tamamlanm t r. Üzerine hacminin iki kat kadar (200 l) kloroform/isoamil alkol kar m ilave edilerek iyice çalkalanm t r rpm de 5 dak. santrifüj edildikten sonra üst faz pipetle al nm ve yeni bir eppendorf tüpüne aktar lm t r. Üzerine hacminin 1/10 i kadar (10 l) 3M Na-asetat (ph: 5.2)

84 60 ilave edilip kar t r ld ktan sonra, 250 l %99 luk etanol eklenmi ve bu kez kar t rma daha h zl gerçekle tirilmi tir rpm de 15 dak. santrifüj i leminden sonra etanol tamamen uzakla t r lm ve 300 l %70 etanol ilave edilerek pellet y kanm t r. Ard ndan 8000 rpm de 5 dak. süre ile santrifüj edilerek %70 lik etanol de tamamen uzakla t r lm t r. 37ºC de kurutulan pellet 15 l 1xTE de çözülerek 20ºC de saklanm t r Kesim Ürünlerinin Elektroforezi Elektroforez i lemi %1.6 l k agaroz jel de gerçekle tirilmi tir. Bu amaçla, 2.4 g agaroz, 150 ml 1xTAE buffer da kaynat larak eritilmi tir ºC ye so utulduktan sonra içine 10 mg/ml lik ethidium bromid çözeltisinden 22.5 l ilave edilerek jel tepsisine dökülmü ve üzerine taraklar yerle tirilmi tir. Jel donduktan sonra taraklar dikkatli bir ekilde ç kar larak, jel tepsisi, 1xTAE buffer (litresine 200 l ethidium bromid ilave edilmi ) dolu elektroforez tank na (Thermo EC330 Midicell Primo Electrophoretic Gel System) konulmu tur. 12 l kesim ürünü 2 l jel loading dye ile kar t r lmak suretiyle tüm örnekler jeldeki ikinci kuyucuktan itibaren jele yüklenmi tir. lk ve son kuyucu a s ras yla 2 l 100 bp marker (Fermentas, SM0328) ve 2 l 1 kb lik DNA size-marker (Fermentas, SM0313) yüklenmi tir. Elektroforez i lemi önce 30 dak. süreyle 60 ma de, sonra 4 saat 80 ma de gerçekle tirilmi tir. Elde edilen sonuçlar jel dökümantasyon sisteminde (Vilber-Lourmat) görüntülenmi tir. Foto raflar çekilen (BioCapt X Press Version 11.3 for Windows Copyright ) görüntüler Adobe Photoshop 7.0 ile düzenlendikten sonra BIO-ID ++ program (Windows Application V11.9, Copyright 2004, Vilber-Lourmat) ile analiz edilmi tir. Türler aras ndaki benzerlik Jaccard formülü seçilerek otomatik olarak belirlenmi tir. Gruplama UPGMA, BIO-ID++ ile gerçekle tirilmi tir.

85 S rdna Dizi Analizi Çal mam zda, genotipik identifikasyon a amas nda, aralar nda antifungal aktiviteye sahip izolatlar n da bulundu u 16 adet laktobasil ve 1 adet streptokok izolat n n 16S rrna-its bölgesinin amplifikasyonu sonuç vermemi ve bunun yerine farkl reverse primer kullan larak 16S rrna bölgeleri amplifiye edilmi tir (Bkz. Bölüm ) 16S rrna bölgesinin RFLP sonuçlar ile tam bir ay r m elde edilememi tir. zolatlar sadece Lactobacillus türleri olarak tan mlanabilmi lerdir. Streptokok izolat ise çok farkl bir jel görüntüsü vermi tir. Son y llarda, konu ile ilgili yap lan çal malarda hem genotipik ve biyokimyasal identifikasyonu desteklemek ve do rulamak, hem de, e er varsa, farkl özellik gösteren örnekleri tam olarak tan mlamak amac yla 16S rdna n n bir k sm n n veya tamam n n dizi analizine ba vurulmaktad r. Ara t rmam zda 15 adet laktik asit bakterisi temsilci olarak seçilmi ve RefGen Gen Ara t rmalar ve Biyoteknoloji Ltd. ti. nde 16S rdna bölgelerinin tamam n n çift yönlü dizi analizi yapt r lm t r. zolatlar n DNA ekstraksiyonu, bölüm de anlat ld gibi yap lm t r. PCR miski; 2mM dntp, 2mM MgCl, 10X buffer (AmpliTaq), 20 M primer, 1,25U Taq polimeraz (AmpliTaq) içeren 50 l hacimde haz rlanm t r. Primer olarak, forward EGE1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ve reverse EGE2: 5'-CTACGGCTACCTTGTTACCA-3' primerleri kullan lm t r. PCR Ko ullar : 94ºC de 5 dak. 94ºC de 1 dak. 56ºC de 1 dak. 72ºC de 1 dak. 72ºC de 10dak. 35 tur (cycle)

86 62 DNA dizi analizi: Bigdye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ile Cycle Sequencing yap lm t r. Ko ullar u ekildedir: 8 µl Big Dye, 3.2 pmol/µl Primer 3 ng DNA Su ile 20µl tamamlanm t r. Thermal Cycler ko ullar : 96 derecede 10 s. 50 derecede 5 s. 60 derecede 4 dak. toplam 25 siklus yap lm t r. Cycle sequencing reaksiyondan sonra ürünler NaOAc-EtOH-EDTA ile temizlenerek 3100 Avant Genetic Analyzer a (Applied Biosystems, Foster City, CA) yüklenmi tir. Cihazdan ç kan data Sequencing Analysis 5.1 ile analiz edilmi tir. 16S rdna dizileri, BioEdit bilgisayar program yard m ile düzenlenmi ve internet ortam nda, NCBI (National Centre for Biotechnology Information) web sayfas nda ( BLAST analizine tabi tutularak oradaki di er rdna dizileri ile kar la t r lm t r Peynir Örneklerinden Küflerin zolasyonu ve Genus Düzeyinde Tan mlanmas Küflü peynir örneklerinin her birinden steril po etlere 10 ar gram tart larak üzerlerine 90 ar ml ringer (Merck 15525) solüsyonu ilave edilmi tir. Colworth Stomacher 400 (BA6021 model, Seward Laboratory, U.K.) kar t r c da homojen hale gelinceye kadar parçalanmalar sa lanm t r. Böylece 10-1 lik dilüsyonlar elde edilmi tir. Daha sonra 9 ar ml ringer solüsyonu içeren tüpler kullan lmak suretiyle 10-6 ya kadar dilüsyonlar

87 63 haz rlanm t r. Dökme Plaka Yöntemi kullan larak ve 10-6 lik dilüsyonlardan Rose Bengal Chloramphenicol agara (Merck ) ekim yap lm t r ºC de 5-7 gün inkübasyondan sonra, petrilerdeki farkl görünü e sahip küf kolonileri tesadüfi olarak seçilerek Malt Extract yat k agara (Merck ) a lanm t r. Böylece izolasyon tamamlanm t r. Yine ayn s cakl k ve sürede inkübasyona tabi tutularak geli tirilen saf izolatlar identifikasyona kadar buzdolab nda saklanm t r. Aflatoksin üreten Aspergillus türlerinin olup olmad n do rudan belirlemek amac yla ayr ca Chloramphenicol Selective Supplement (Fluka 29231) ilave edilmi (Ek 1 de anlat ld gibi) Aspergillus Differentiation Agar a (Fluka BioChemika 17121) da ekim yap lm t r. Genus düzeyinde tan mlama için, küf izolatlar ndan Malt Extract Agar a (Merck 05398), i ne öze kullan larak üç nokta ekim yap lm t r ºC de 5 gün inkübasyondan sonra, geli en küf kolonileri 10x10 büyütme düzeyinde, Prior marka mikroskop alt nda incelenmi tir. dentifikasyon, Raper and Fennel (1965) ve Raper and Thom (1968), Pitt (2000) ve Klich (2002) e göre yap lm t r Laktik asit bakterilerinin Antifungal Aktivitelerinin Belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin antifungal aktivitelerini görüntülemek için iki farkl yöntem kullan lm t r Agar Disk Diffüzyon Yöntemi 1. Küf sporu süspansiyonunun haz rlanmas : Malt Extract Agar dan (Merck ) haz rlanan yat k agarlara inoküle edilen Aspergillus

88 64 parasiticus (NRRL 2999) ve Aspergillus flavus (TÜB TAK-MAM) 26 ºC de 7-10 gün inkübe edilmi lerdir. Olu turduklar sporlar %0.05 Tween 80 içeren steril deiyonize su ile y kanarak toplanm t r (Pardo et al., 2004; Lin et al., 2006). Süspansiyonun spor say s Thoma Lam kullan larak belirlenmi tir (Gürgün ve Halkman, 1990). Spor say s, istenilen düzeye, yine %0.05 Tween 80 içeren steril deiyonize su yard m yla ayarlanm t r. Ara t rman n bundan sonraki a amalar nda da, kullan lan tüm küf sporu süspansiyonlar bu ekilde haz rlanm t r. 2. Laktik asit bakterilerinin geli tirilmesi ve supernatant n haz rlanmas : Laktik asit bakterileri 5 ml s v besiyeri (bakteri türüne göre MRS veya M17) içeren tüplere inoküle edilerek 37ºC de 24 saat geli tirilmi tir. Daha sonra tüpler 5000 dev/dak. da dak. santrifüj edilerek supernatant elde edilmi tir. Supernatantlar 0.45 µm (Minisart, Sartorius) por çap na sahip filtrelerden geçirilerek sterilize edilmi tir (Gourama, 1997). 3. Antifungal aktivite testi: Gourama (1997) ye göre yap lm t r. Ancak besiyeri olarak PDA (Potato Dextrose Agar) yerine Malt Extract Agar (MEA) kullan lm t r. Yötem u ekilde uygulanm t r: Petrilere yakla k 15 er ml Malt Extract Agar dökülmü ve kat la maya b rak lm t r. Kat la an besiyeri yüzeyine 0.1 ml spor süspansiyonu (10 6 spor/ml) yay larak inoküle edilmi tir. Daha sonra üzerine, bakteri supernatant na dald r lm steril ka t diskler (6mm çap nda) yerle tirilmi tir. 26ºC de 3-4 gün inkübasyondan sonra diskler etraf ndaki inhibisyon zonlar ölçülmü tür (mm olarak). Yöntem tüm izolatlar için 1 kez uygulanm t r. Ancak inhibisyon etkisi gözlenen izolatlar için ikinci bir tekerrür yap lm t r. Hatta bu izolatlardan baz lar n n sadece supernatant de il santrifüj sonras elde edilen pelletleri de ayr ayr kullan larak yöntem tekrarlanm t r.

89 Overlay Yöntemi Magnusson and Schnürer (2001) ve Magnusson et al. (2003) e göre u ekilde gerçekle tirilmi tir: Laktik asit bakterileri, önceden petrilere dökülüp dondurulmu besiyerleri (laktobasiller için MRS agar, enterokoklar için M17 agar) yüzeyine 2 er cm lik iki çizgi eklinde çizilerek inoküle edilmi lerdir ( ekil 3.1a). Petriler 37ºC de 48 saat süre ile, içine Anaerocult C kiti (Merck ) b rak lm anaerobik jar (Merck Vol 2.5 lt) içinde inkübasyona b rak lm t r. nkübasyondan ç kar lan ve laktik bakterilerin geli ti i petrilere ikinci bir tabaka olarak 10 ar ml, /ml küf sporu içeren malt extract soft agar (Bkz. Ek 1) dökülmü ( ekil 3.1b de görüldü ü gibi) ve petriler 26-27ºC de (aerobik ko ullarda) 48 saat daha inkübe edilmi lerdir. 48 saat sonunda bakteri çizgileri etraf nda olu an zonlar u ekilde de erlendirilmi tir: zon olu mamas ( ), her bakteri çizgisinin, petri alan n n %0.1-3 ünde inhibisyon zonu olu turmas (+), her bir bakteri çizgisinin, petri alan n n %3-8 inde inhibisyon zonu olu turmas (+ +), her bir bakteri çizgisinin, petri alan n n %8 inden büyük bir inhibisyon zonu olu turmas (+ + +). Malt extract soft agar MRS veya M17 agar (b) (a) ekil 3.1. Overlay Yönteminin Uygulanmas. (a) Bakteri nolülasyonu, (b) Küf nokülasyonu

90 66 Konu ile ilgili yap lan çal malarda, laktik bakterilerin antifungal etkilerinin, MRS agar n bile imindeki sodyum asetattan kaynakland bildirilmektedir. Bu nedenle ara t rmam zda, MRS agar kullan ld nda antifungal etki gösteren izolatlar için, bir de Sodyum asetat içermeyen MRS agar kullan larak yöntem tekrarlanm t r. Di er taraftan, do al g da bile imine yak n bir ortamda da ayn etkiyi gösterip göstermeyeceklerini incelemek için bu yöntem bir de taraf mca modifiye edilen Milk Agar (Bkz. Ek 1) (Atlas, 1995 de belirtilen esas al nm t r) kullan larak gerçekle tirilmi tir. Yöntem, her farkl besiyeri kullan ld nda, her bir izolat için iki kez tekrarlanm t r Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin B 1 e Etkilerinin Belirlenmesi Konuyla ilgili, literatürde geçen tüm yöntemler sadece bakterilerin aflatoksinleri ba lay p ba lamad n do rulamak yönünde yap lm ara t rmalarda kullan lan yöntemlerdi. Ara t rmam zda kulland m z laktik bakteri türleri önceki çal malardakilerden farkl yd ve bunlar n, toksinleri ba laman n yan s ra metabolize etmek yoluyla ortamdan uzakla t rabilecekleri ihtimali de göz önünde bulundurularak öyle bir yöntem kullan lm t r: 10 ml s v MRS veya M17 besiyerine (kullan lan bakteri türüne göre) 4ng/ml (40 ng/10ml) olacak ekilde toplam aflatoksin (1 ng/ml B 1, 1 ng/ml B 2, 1 ng/ml G 1, 1 ng/ml G 2 ) standard ilave edilmi ve aktifle tirilmi bakteri kültürü ile cfu/ml düzeyinde (Breed yöntemi ve Petri kutusu say m yöntemi kullan larak belirlenmi tir.) inokülasyon yap lm t r. 24 saat 37 C de inkübasyondan sonra 5000 dev/dak da dak. santrifüj edilmi

91 67 ve supernatant 50 ml lik mezüre al nm t r. Hacim, phosphate buffer saline (PBS) ile 50 ml ye tamamlanm t r. Immunoaffinite kolon ile ekstraksiyonu olumsuz yönde etkilememesi için ph çok dü ük olan örneklere 2-3 damla 5N NaOH ilave edilerek ph lar 6-7 ye ayarlanm t r. Immunoaffinite kolon kullan larak toksin ekstrakte edilmi tir. Ekstraksiyon için, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye özel monoklonal antikorlar içeren Aflaprep immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. P07), kullan m k lavuzundaki talimatlar do rultusunda kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam (50 ml) 2-3 ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksinler, kolondan önce 1.5ml metanol, ard ndan 1.5 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 3 ml lik ekstrakttan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür. Bölüm ve deki HPLC analiz ko ullar uygulanm t r. Her denemede bakteri a lanmam, 4 ng/ml toksin içeren s v besiyeri kontrol olarak kullan lm t r. 5 farkl türe ait toplam 12 adet laktik asit bakterisinin aflatoksin B 1 e etkileri incelenmi tir. Ayr ca aflatoksin B 2, G 1, G 2 ye etkileri de belirlenebilmi tir. nkübasyon süresi uzad zaman bakterilerin aflatoksine etkisinde herhangi bir de i iklik olup olmayaca n belirlemek amac yla, baz izolatlar için, yöntem bir de 3 günlük inkübasyon süresi uygulanarak tekrarlanm t r. Bu denemede besiyeri olarak LTB (Lablemco Tryptone Broth) kullan lm t r Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M 1 e Etkilerinin Belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin aflatoksin B 1 e etkilerini belirlemede kullan lan yöntem kullan lm t r (Bkz. Bölüm 3.2.8). Fakat burada 10 ml s v

92 68 MRS veya M17 besiyerine 4 ng/ml (40 ng/10 ml) olacak ekilde aflatoksin M 1 standard ilave edilmi tir. 4 farkl türe ait toplam 10 adet izolat n etkisi incelenmi tir. Her denemede bakteri a lanmam, 4 ng/ml toksin içeren s v besiyeri kontrol olarak kullan lm t r. Eksraksiyonda, aflatoksin M 1 e özel monoklonal antikorlar içeren Aflaprep M immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. P04) (kullan m k lavuzunda önerildi i ekilde) kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam 2-3 ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksin M 1, kolondan önce 1.25 ml metanol:asetonitril (20:30) kar m, ard ndan 1.25 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 2.5 ml lik ekstrakttan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür. Bölüm ve deki HPLC analiz ko ullar uygulanm t r. Bakterilerin gereksinim duyduklar besin maddelerinin olmad bir ortamda toksine etkilerini veya böyle bir ortamda toksini ba lay p ba lamad klar n görmek amac yla, El-Nezami et al. (1998) n önerdi i metot modifiye edilerek bir deneme daha yap lm t r. Buna göre, laktik asit bakterisi, kendisi için uygun s v besiyerine (MRS veya M17) /ml düzeyinde a lanm ve 37ºC de 24 saat inkübe edilmi tir. Daha sonra ortam santrifüj edilerek (5000dev/dak da dak) hücre pelleti al nm ve. 4ng/ml aflatoksin M 1 içeren 10 ml PBS (phosphate buffer saline) içinde 24 saat daha (ayn s cakl kta) inkübasyona b rak lm t r. 24 saat sonunda 5000 dev/dak da dak. santrifüj edilen PBS 50 ml lik mezüre al narak hacim PBS (phosphate buffer saline) ile 20 ml ye tamamlanm t r. Bakteri pelleti ilave edilmemi, 4 ng/ml toksin içeren 10 ml PBS kontrol olarak kullan lm t r. Bu yötemle, 3 türe ait toplam 4 adet izolat n etkisi incelenmi tir.

93 69 Immunoaffinite kolon kullan larak yukar da anlat ld ekilde ekstraksiyon yap lm ve HPLC de okunmu tur Laktik Asit Bakterilerinin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un Aflatoksin Üretimine Etkileri: Laktik asit bakterilerinin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un aflatoksin üretimine etkileri üç farkl deneme modeli ile incelenmi tir. 1. Deneme Modeli: 3 adet laktik asit bakterisi izolat n n (R1KLx3, R2KL10, V8KL10) ayr ayr ve 5 adet laktik asit bakterisi izolat n n (R1KLx3, R2KL10, V8KL10, R1KL6, SFKSx1) kar m ndan olu an kar k kültürün, Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un toksin üretimine etkileri incelenmi tir. Bu denemede ayr ca R1KLx3 ün 37 C de 24 saat inkübasyonu sonunda elde edilen supernatant n n da A. flavus a etkisi incelenmi tir. Besiyeri olarak Gourama ve Bullerman (1995) taraf ndan önerilen LTB (Lablemco Trypton Broth) (ph 6.5) (Ek 1) kullan lm t r. Kar k kültür, ayr ayr aktifle tirilen izolatlar n u oranlarda kar t r lmas ile elde edilmi tir: %50 SFKSx1, %10 R1KLx3, %10 R2KL10, %20 V8KL10 ve %10 R1KL6. Bu kar m kullan larak 100 ml LTB ye inokülasyon yap lm t r (10 6 cfu/ml düzeyinde). Tek bakteri izolat n n kullan ld örneklerde, aktifle tirilmi laktik asit bakterisi 100 ml LTB içeren erlenlere 10 6 cfu/ml düzeyinde a lanm t r. Erlenler 37 C de 24 saat inkübe edilmi lerdir. Supernatant, 24 saatlik inkübasyondan sonra ortam n santrifuj edilip daha sonra 0.45µm (Minisart, Sartorius) por çap na sahip filtrelerden geçirilmesiyle elde edilmi tir. Tüm ortamlar /ml düzeyinde küf sporu içerecek ekilde inoküle edilmi ve 28ºC de 14 gün inkübasyona b rak lm t r. Küf sporlar inoküle edilmeden önce, glukoz eksikli inden kaynaklanacak aflatoksin üretimi inhibisyonunu önlemek amac yla ortamlara %1 oran nda glukoz ilave edilmi tir. 3., 7. ve 14. günlerde besiyerlerinde aflatoksin tayini ve ph ölçümü yap lm t r. Ayr ca

94 70 geli en küflerin misel kuru a rl belirlenmi tir. Laktik asit bakterisi a lanmaks z n küf ilave edilmi besiyerlerinde de (kontrol örnekleri) ayn analizler yap lm t r. 2. Deneme Modeli: 1. denemede toksin olu umunu en çok engelledi i gözlenen R1KLx3 ve Kar k Kültür örneklerinin, küfün toksin üretimini azaltmalar n n sebebini belirlemek amac yla gerçekle tirilmi tir. Burada küf olarak sadece Aspergillus flavus kullan lm, A. flavus. sporlar R1KLx3 ve Kar k Kültürün geli tirilmesi sonucu elde edilen 5 farkl ortama düzeyinde a lanm t r. Bunlar: I. 1. denemedeki gibi, 10 6 cfu/ml düzeyinde, bakteri ile a lanm ve 37 C de 24 saat inkübasyondan sonra canl bakteri içeren 100 ml LTB s v besiyeri. II. I. deki gibi haz rlanm fakat 63 C de 30 dak. s l i lem uygulanm ölü bakteri ortam. III. Üç günlük inkübasyon sonunda elde edilmi bakteri supernatant. u ekilde haz rlanm t r: I. de anlat ld gibi bakteri ile inoküle edilen LTB besiyerleri önce 24 saat 37 C de daha sonra 2 gün 28 C de inkübe edilmi lerdir. Üçüncü günün sonunda ortam 5000 dev/dak. da dak. santrifüj edilmi ve elde edilen supernatant 0.45µm (Minisart, Sartorius) por çap na sahip filtrelerden geçirilmi tir. 100 er ml olarak steril erlenlere bölü türülmü tür. Bu a amada, her 100 ml besiyerinin santrifüjü sonucu elde edilen bakteri pelletleri ise 100 ml LTB içeren erlenlere al narak IV. ve V. ortamlar n haz rlanmas nda kullan lm t r. I., II. ve III deki ortamlara küf sporu inoküle edilmeden önce %1 glukoz ilavesi yap lm t r. IV. Bakteri pelleti ilave edilmi ve 63 C de 30 dak. s l i lem uygulanm LTB besiyeri. (Pellet 1 olarak isimlendirilmi tir)

95 71 V. Bakteri pelleti ilave edilmi ve 95 C de dak. s l i lem uygulanm LTB besiyeri. (Pellet 2 olarak isimlendirilmi tir) Haz rlanan bütün örnekler küf inokülasyonundan sonra 28ºC de 14 gün inkübasyona b rak lm lard r. 3., 7. ve 14. günlerde besiyerlerinde aflatoksin tayini ve ph ölçümü yap lm, geli en küflerin misel kuru a rl belirlenmi tir. Laktik asit bakterisi a lanmaks z n küf ilave edilmi besiyerlerinde de (kontrol örnekleri) ayn analizler yap lm t r. Canl laktik asit bakterilerinin oldu u örneklerde (I) ayr ca, MRS ve Kanamycin Esculin Azide agara ekim yap larak bakteri say s nda meydana gelen de i imler de tespit edilmi tir. 3. Deneme Modeli: 2. denemede etkili oldu u gözlenen, Kar k Kültür den haz rlanm Pellet 2 ortam, haz rlama ekli biraz de i tirilerek bir daha deneme yap lm t r. 2. deneme modelinde pelletler 100 ml LTB içine al nd ktan sonra s l i leme tabi tutulurken, bu denemede, ayr deney tüpü içinde s l i lem uyguland ktan sonra s v besiyeri içine bo alt lm t r. Burada amaç, bir önceki denemede gözlenen inhibisyonun, istenen s cakl a gelinceye kadar geçen sürede, bakterilerin geli imi sonucu besiyerinin bile iminde meydana gelen herhangi bir de i imden kaynaklan p kaynaklanmad n belirlemekti. Bu deneme modelinde ayr ca, yine ayn ekilde haz rlanm pellet do rudan besiyerine de il, moleküler a rl k gençirgenli i (MWCO-Molecular Weight Cut-Off) dalton olan diyaliz torbas na (Spectra/Por No: , Spectrum Laboratories Inc.) al narak s v besiyeri içine b rak lm t r. Di er iki denemede oldu u gibi küf sporlar ile inokule edilen bu ortamlar 28ºC de 14 gün inkübe edilmi lerdir. 3., 7. ve 14. günlerde besiyerlerinde aflatoksin tayini ve ph ölçümü yap lm, geli en küflerin misel kuru a rl belirlenmi tir. Laktik asit bakterisi a lanmaks z n küf ilave edilmi besiyerlerinde de (kontrol örnekleri) ayn analizler yap lm t r. Denemeler 2 tekerrürlü olarak gerçekle tirilmi tir.

96 72 Küf sporu süspansiyonunun haz rlanmas Bölüm deki gibi haz rlanm t r. ph Ölçümü PyeUnicam Pye Model 292 (PyeUnicam Ltd., Cambridge, England) marka ph metre kullan larak ölçülmü tür. Misel Kuru A rl n n Belirlenmesi Besiyerleri Whatman No 4 filtre ka d ndan süzülerek küf miselleri elde edilmi tir. Bunlar saf su ile y kanarak, önceden filtre ka d ile birlikte daras al nm nikel kurumadde kaplar na yine filtre ka d ile birlikte konulmu tur. 100ºC de sabit a rl a gelinceye kadar, yakla k 5-6 saat, kurutulmu tur. Aflatoksin Ekstraksiyonu ve Aflatoksin Analizleri Filtre ka d ndan süzülen besiyeri 5000 dev/dak da dak. santrifüj edilmi tir. Elde edilen berrak k s mdan 50 ml lik mezüre 1ml al narak PBS ile 25 ml ye tamamlanm t r. Bu hacim immunoaffinite kolondan geçirilerek toksinin ekstraksiyonu gerçekle tirilmi tir. Ekstraksiyon için, toksin tutma kapasitesi yüksek EASI- EXTRACT immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. RP71/RP70N), kullan m k lavuzundaki talimatlar do rultusunda kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam (25 ml) 2-3ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksinler, kolondan önce 1.5 ml metanol, ard ndan 1.5 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 3 ml lik ekstrakttan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür. Çok yüksek toksin içeren baz örnekler, metanol:su (1:1) kar m ile uygun oranlarda seyreltildikten sonra cihaza

97 73 enjeksiyon yap lm t r. Bölüm ve deki HPLC analiz ko ullar uygulanm t r statistik Analizler Bölüm da elde edilen sonuçlar varyans analizi (ANOVA) kullan larak de erlendirilmi tir. Bu analiz sonucunda önemli ç kan faktörlerin alt grup ortalamalar, çoklu kar la t rma yöntemi olan Duncan testine göre p<0.05 düzeyinde test edilmi ve kar la t r lm t r. Bu amaçla SPSS version 9.05 (SPSS Inc. Chicago, Illinois) istatistik analiz paket program kullan lm t r Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Pilot Tesisinde Küflü Peynir Üretimi Kültürün Haz rlanmas Kültürün haz rlanmas nda, izole edip tan mlad m z, aralar nda antifungal etkiye sahip olanlar n da yer ald 4 farkl türe ait 5 izolat; SFKSx1, R1KLx3, R2KL10,V8KL10 ve R1KL6 kullan lm t r. Bunlar önce ayr ayr uygun s v besiyerlerinde (M17 ve MRS) 24 saat geli tirildikten sonra %12 ya s z kurumadde içeren, ya s z süt tozundan haz rlanm steril (115 C de 10 dk.) süte u oranlarda a lanm lard r: SFKSx1 %5, R1KLx3 %1, R2KL10 %1, V8KL10 %2 ve R1KL6 %1. Bu oranlar, peynirden izole edilen toplam 179 tane izolat içinde bu türlerin kapsad oranlar dikkate al narak belirlenmi tir. 37ºC de 8 saat inkübasyondan sonra 1 gün buzdolab nda bekletilmi tir (ph: 4.75). Daha sonra buradan önce %10 oran nda ya s z UHT süte, ard ndan iki gün üst üste ya l UHT süte (yine %10 oran nda) a lama yap larak peynir üretiminde kullan lacak kültür

98 74 haz rlanm t r (ph: 4.9). ekil 3.2 de görüldü ü gibi bu kültürden peynir sütüne %3 (v/v) oran nda ilave edilmi tir Peynir Üretimi Kültürsüz Peynir Üretimi (Kontrol) Çi Süt (inek sütü) Pastörizasyon (72 C, 5 dak.) 37 C ye So utma CaCl 2 ilavesi (20g/100lt) Maya lavesi (13ml/ 20lt) P ht Olu umu Olu an P ht n n Parçalanmas (mayaland ktan~45-50 dak. sonra) 10 dak. bekletme P ht n n Cendere Bezine Al nmas 1. Bask (45 dak.) P ht n n parçalanmas ve tuzlama (%3.5) 2. Bask (45 dak.) P ht n n parçalanmas ve naylon po etlere bas lmas (250gr l k) Vakum Ambalaj Kültür Kat larak Üretim Çi Süt (inek sütü) Pastörizasyon (72 C, 5 dak.) 37 C ye So utma CaCl 2 ilavesi (20g/100lt) Kültür Kat lmas (%3 oran nda) 30 dak. Bekletme Mayalama (36-37 C) Maya lavesi (13ml/ 20lt) P ht Olu umu Olu an P ht n n Parçalanmas (mayaland ktan~45-50 dak. sonra) 10 dak. bekletme P ht n n Cendere Bezine Al nmas 1. Bask (45 dak.) P ht n n parçalanmas ve tuzlama (%3.5) 2. Bask (45 dak.) P ht n n parçalanmas ve naylon po etlere bas lmas (250gr l k) Vakum Ambalaj ekil 3.2. Peynir Üretim emas

99 Peynirin Küflendirilmesi ekil 3.2 deki gibi üretilen peynirler, 8 gün süreyle so uk hava deposunda bekletilmi lerdir. 8 gün sonunda vakum ambalajlar aç lan peynirler, üzerlerine 3x10 6 /ml düzeyinde A. flavus sporu içeren spor süspansiyonundan 1 er ml da t larak a lama yap lm t r. Peynirler 23-24ºC de inkübasyona b rak lm lard r. nkübasyonun 5. gününde peynirlerde görünür düzeyde küf geli imi meydana gelmeye ba lam t r Peynir Örneklerinde Yap lan Analizler Peynir örneklerinde, üretimden 5 gün sonra (küflendirilmeye ba lanmadan önce) ve küf geli iminin gözle görülür hale geldi i inkübasyonun 5. gününden 1 gün sonra kimyasal ve mikrobiyolojik analizler yap lm t r. Küflü peynir örneklerinde ayr ca aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 analizi yap lm t r. Peynir üretimi 2 tekerrürlü olarak gerçekle tirilmi tir. Kimyasal ve mikrobiyolojik analizler 3 paralel, di erleri 2 paralel olarak yap lm t r. Kimyasal Analizler: Bölüm deki analizlere ek olarak peynir örneklerinde organik asit analizi de yap lm t r. Organik Asit Analizi: TÜB TAK Marmara Ara t rma Merkezi nde yapt r lm t r. Gönderilen sonuçlarada yöntem olarak AOAC 1995 in kullan ld bildirilmi tir. Mikrobiyolojik Analizler: Laktobasillerin say m için MRS agar, Enterokoklar n say m için Kanamycin Esculin Azide agar ve Küflerin Say m için PDA (Potato Dextrose Agar) kullan lm t r. Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 Analizi: Bölüm de kulland m z ekstrastraksiyon yöntemi kullan lm t r. Fakat bu peynir örnekleri ile

100 76 yapt m z geri kazan m çal mas sonucunda, yöntemin deki haliyle dü ük geri kazan m elde edilmi tir. Bu nedenle yöntemin (A) ve (C) bölümlerinde (Bkz. Bölüm 3.2.2) biraz de i iklikler yap lm t r. Buna göre; (A) bölümünde, ml toplam 120 ml diklorometan yerine burada ml yani toplam 130 ml diklorometan kullan lm t r. Bu bölümün son a amas nda toplanan sulu fazlar (yakla k 48 ml) 0.45 µm (Minisart, Sartorius) por çapl filtreden geçirilmi tir. (C). Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) ekstraksiyonu için, toksin tutma kapasitesi yüksek EASI- EXTRACT immunoaffinite kolonlar (R-Biopharm Rhône Ltd. RP71/RP70N), kullan m k lavuzundaki talimatlar do rultusunda kullan lm t r. Buna göre; mezür içeri inin tamam (47-48ml) 2-3ml/dak. olacak ekilde kolondan geçirilmi tir. Daha sonra, kirliliklerin giderilmesi amac yla kolon 10 ml saf su ile y kanm t r. Kolonda tutunan aflatoksinler, kolondan, önce 1.5 ml metanol, ard ndan 1.5 ml saf su geçirilmek suretiyle örnek i esine toplanm t r. Elde edilen toplam 3 ml lik ekstrakt 0.45 µm (Minisart, Sartorius) por çap na sahip filtreden geçirilmi tir. Buradan HPLC cihaz na 100 l enjekte edilerek toksin miktar ölçülmü tür. Bölüm ve deki HPLC analiz ko ullar uygulanm t r. Bu haliyle yöntemin geri kazan m B 1 için ortalama %76, B 2 için ortalama %78, G 1 için ortalama %80 ve G 2 için ortalama %59 olarak belirlenmi tir.

101 77 4. ARA TIRMA BULGULARI VE TARTI MA 4.1. Konya Küflü Peyniri ve Özellikleri Konya Küflü peyniri, Konya ilinde kontrolsüz ko ullarda küflendirilmek suretiyle üretilen ve bu bölge halk taraf ndan bilinip tüketilen bir peynir çe ididir. Peynirin sadece küflendirme a amas Konya da gerçekle tirilmekte, esas peynir, A r, I d r ve A r ya ba l Ta l çay bölgelerinde üretilmektedir. Peynirin üretiminde genel olarak koyun sütü kullan lmaktad r. Üreticilerin anlatt klar na göre süt yakla k 50-55ºC ye s t larak, üzerindeki ya al nd ktan sonra mayalanmaktad r. P ht olu tuktan sonra teleme parçalanarak, suyu süzülmekte, %3-5 oran nda tuzlanarak bask ya al nmaktad r. Daha sonra naylon torbalara bas larak kiloluk torbalar halinde Konya ya gelmektedir. Bu ekilde so uk hava deposunda gün bekletildikten sonra (Resim 4.1 A.), Eylül sonu Ekim ay n n 15 i gibi peynirler küflendirilmeye ba lanmaktad r. Küflendirme u ekilde gerçekle tirilmektedir: Resim 4.1 B. de görüldü ü gibi naylon torba aç larak, peynir silindiri dilimlenmekte, üzerine gazete ka d örtülerek (Resim 4.1 C.) 18-23ºC aras nda ideal ºC de (kimi üreticilere göre ºC de) küflenmeye b rak lmaktad r. Yakla k gün süren küflenme a amas ndan sonra sat a sunulmaktad r (Resim 4.1 D).

102 78 (A) (B) (C) (D) Resim 4.1. Konya Küflü Peyniri. (A). So uk Hava Deposunda Bekletilen, Henüz Küflendirilmemi Peynir. (B), (C) :Peynirin Küflendirilmesi, (D) Küflü Peynirin Pazar Yerinde Sat a Sunulmas Literatürde Konya Küflü peyniri ile ilgili yap lm herhangi bir çal maya rastlanmam t r. Hem ara t rmam z n ileri a amalar ndaki sonuçlar n de erlendirilmesinde fikir vermesi amac yla hem de daha önce hiç incelenmemi olan bu geleneksel peynir çe idimiz hakk nda bilgi edinmek amac yla, kulland m z peynir materyalinin büyük k sm n olu turan Konya Küflü peynirinin baz kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri belirlenmi tir. Çizelge 4.1 de farkl üreticilerden al nm Konya Küflü Peynirlerinin baz kimyasal özelliklerine ait de erler Çizelge 4.2 de ise bu peynirlerin baz mikrobiyolojik özellikleri görülmektedir.

103 79 Çizelge 4.1. Konya Küflü Peyniri Örneklerinin Baz Kimyasal Özellikleri Kurumadde (KM) (%) %Ya KM de Ya (%) % Tuz KM de Tuz (%) ph Asitlik (% Laktik Asit) KS* KL KL KL KL KL KL KL KL *Henüz küflenmemi peynirden al nan örnek. Çizelge 4.1 de de görüldü ü gibi 2KL örne i hariç peynir örneklerinin kurumadde oranlar % ile % aras nda belirlenmi tir. 2KL örne i bölge halk aras nda böreklik küflü peynir diye bilinen ve bir önceki üretim sezonundan kalm, daha sert yap da ve parçalanm halde sat lan bir peynir örne iydi. Peynirlerin ya oranlar ile kurumaddede ya oranlar ise yine 2KL örne inde hariç, s ras yla %3.5 - %4.5 ile % %11.19 aras nda bulunmu tur. Peynirlerin oldukça dü ük ve çok farkl ya oranlar na sahip olduklar görülmektedir. Üretim s ras nda süt ya n n büyük k sm n n geli igüzel olarak üreticiler taraf ndan al nmas bunun nedenini aç klamaktad r. Genel olarak dünyada peynirlerin s n fland r lmas nda, ya s z peynir kitlesindeki %su oran dolay s yla ya s z kurumadde oran, % kurumaddede ya oran ve olgunla ma özellikleri en çok göz önüne al nan parametrelerdir. Ya s z peynir kitlesindeki su oran %54 ile %63 dolay s yla ya s z kurumadde oran %37 - %46 aras nda de i en peynirler yar sert peynir

104 80 olarak tan mlanmaktad r. Kurumaddede ya oran % 10 dan az olan peynirler ise yavan peynir s n f na girmektedir (Üçüncü, 2004a). Çizelge 4.1 deki sonuçlar n genelini dikkate ald m zda, Konya Küflü peyniri yar sert ve yavan peynir s n f na girmektedir. Dünyada üretilen mavi-küflü peynir çe itleri aras nda en çok bilinenleri Roquefor, Gorgonzola, Stilton, Danablue peynirleridir. Bu peynirler de yar sert peynirler s n f nda yer almaktad rlar (Fox, 1999). Ancak, Konya Küflü peyniri mavi küflü olmas haricinde gerek üretim ekli gerekse yap sal ve kimyasal özellikleri aç s ndan bu peynirlerden oldukça farkl d r. Roquefor peynirinin kurumadde oran %55-62, kurumaddede ya oran %50-60, Stilton peynirinin kurumadde oran en az % 58, kurumaddede ya oran en az %48 ve Danablu peynirinin kurumadde oran %53 kurumaddede ya oran %50-60 olarak bildirilmektedir (Üçüncü, 2004b). ncelenen peynir örneklerinin tuz ile kurumaddede tuz oranlar n n birbirinden oldukça farkl ve yüksek oldu u görülmektedir. Peynirlerle ilgili tüm TSE standartlar nda kabul edilebilir en yüksek kurumaddede tuz oran (her peynir için geçerli de il) % 10 dur (Üçüncü, 2004a). 2KL örne i hariç tüm örneklerin kurumaddede tuz oranlar ya s n rda veya bu de erden yüksek bulunmu tur. Tuz oranlar % 3.97 ile % 6.66 aras nda, kurumaddede tuz oranlar ise %5.66 ile %15.21 aras nda belirlenmi tir. Roquefor, Stilton ve Danablu peynirlerinin tuz oranlar ise s ras yla % , %1.5 ve %3.5 olarak bildirilmektedir (Üçüncü, 2004b).

105 81 Çizelge 4.2. Konya Küflü Peynirlerinin Mikrobiyolojik Say m Sonuçlar (cfu/g) Laktobasiller ve Leuconostoklar (MRS agar) Leuconostoklar (vancomycin+mrs) Laktokoklar (M17 agar) Enterokoklar (D Grubu ) (KEA agar) Küfler (PDA ve RBC agar) KS* 4.45x x x x10 6-1KL 6.00x x x x x10 6 2KL 8.50x x x x x10 6 3KL 1.045x x x x x10 6 4KL 2.70x x x x x10 6 5KL 1.75x x x x x10 7 6KL 9.25x x x x x10 7 7KL 7.65x x x x x10 6 8KL 6.40x x x x x10 6 * Küflendirilmemi peynirden al nan örnek. Çizelge 4.2 de görüldü ü gibi peynir örneklerindeki laktik asit bakterilerinin say lar oldukça yüksek düzeylerde bulunmu tur. Laktobasillerin say s 4.45x10 6 ile 2.70x10 7 cfu/g ars nda belirlenirken leukonostoklar n say s 4.00x10 6 ile 2.55x10 7 cfu/g aras nda, laktokoklar n say s 4.20x10 6 ile 6.45x10 7 cfu/g aras nda, enterokoklar n say s ise 1.50x10 5 ile 3.50x10 6 cfu/g aras nda belirlenmi tir. Burada elde edilen sonuçlar, laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve identifikasyonu bölümlerinde ayr nt l olarak ele al n p tart lacakt r. Örneklerde 1x10 6 ile 1.1x10 7 koloni/g aras nda de i en düzeylerde küf oldu u tespit edilmi tir. KS örne i henüz küflendirilmemi peynirden al nm örnek oldu u için bu örnekte küf varl saptanmam t r. Aran vd.(1986), Türkiye nin çe itli bölgelerinden toplad klar küflü görünümdeki Tulum, Küp, Civil ve Küflü peynir örneklerinde küf say lar n s ras yla koloni/g, 0-3x10 4 koloni/g, 0-6x10 6 koloni/g, koloni/g olarak belirlemi lerdir. Bizim buldu umuz de erler, ara t rmac lar n Tulum peyniri

106 82 örneklerinde tespit ettkleri küf say lar ndan dü ük, Civil peynirlerinde tespit ettikleri say larla benzer, Küp ve Küflü peynir örneklerinde tespit ettikleri küf say lar ndan çok yüksektir Peynir Örneklerinde Aflatoksin M 1 Belirlenmesi Ara t rmam zda, 11 adet peynir örne inin 10 unda aflatoksin M 1 tayini yap lm ve 10 örne in hiçbirinde tespit edilebilir düzeyde aflatoksin M 1 e rastlanmam t r. ekil 4.1 de AFM 1 standard na ait kromatogram, ekil 4.2 de ise örneklerden baz lar na ait kromatogramlar görülmektedir. ekil 4.1. AFM 1 Standard na Ait Kromatogram (0.5 ng/ml)

107 83 (A) (B) ekil 4.2. Peynir Örneklerine Ait Kromatogramlar (A)5KL Örne i, (B) 8KL Örne i

108 84 Peynirde aflatoksin M 1 varl ile ilgili çok farkl literatür bulgular na rastlanmaktad r; Sar mehmeto lu vd. (2004) inceledikleri 400 adet peynir örne inin 327 sinde AFM 1 tespit ettiklerini, bunlar n 110 tanesinde miktar n yasal limitin üzerinde oldu unu bildirmi lerdir. Tekin en ve Uçar (2008), 100 adet krem peynir örne inin 99 unda AFM 1 belirlemi ler ve bunlardan %18 inin limit de eri a n gözlemi lerdir. Ayçiçek vd. (2005), Ankara daki sat yerlerinden toplad klar 49 adet krem peynir örne inin 44 ünde, 94 adet Beyaz peynir örne inin 86 s nda ve 53 adet Ka ar peyniri örne inin 47 sinde aflatoksin M 1 saptam lard r. 12 adet Beyaz peynir ve 7 adet Ka ar peynirindeki toksin miktar n n ise Türk G da Kodeksi taraf ndan bildirilen kabul edilebilir de erin üzerinde oldu unu bildirmi lerdir. Di er taraftan Gürbüz vd. (1999), Konya da, 240 peynir numunesinde AFM 1 tespit edememi lerdir. Karaioannoglou et al. (1989), Yunanistan daki Feta ve Teleme peynirlerinde, Tabata et al (1993) ile Taguchi et al. (1995) de Japonya daki ithal peynirlerde yapt klar incelemelerde AFM 1 e rastlamam lard r. Elde etti imiz sonuçlar Gürbüz vd. (1999), Karaioannoglou et al. (1989), Tabata et al (1993) ve Taguchi et al. (1995) n bulgular ile benzerlik göstermektedir. Bilindi i gibi, AFM 1 laktasyondaki hayvanlar n aflatoksin B 1 ile kontamine yemleri tüketmeleri sonucu sütte bulunmaktad r. So ukta saklama, dondurma, s ya tabi tutma, fermantasyon, konsantre etme, kurutma ve pastörizasyon gibi i lemler genellikle miktar nda de i iklik olu turmamakta, dolay s yla süt ürünlerinde ve peynirde de bulunmaktad r (Oruç, 2003). Toksinin yemden süte geçi düzeyinde, hayvan n beslenme ekli, toksinli yem tüketme miktar, sindirim derecesi, hayvan n sa l, karaci er biyotransformasyon kapasitesi ve süt miktar gibi besinsel ve fizyolojik faktörler etkili olmaktad r. Dolay s yla, aflatoksinin absorbsiyon oran ve süte salg lanmas hayvandan hayvana, laktasyon dönemine ve bir sa mdan di erine de i iklik göstermektedir (Fink-Gremmels, 2008). Birçok

109 85 ara t rmac ya göre, AFM 1 varl nda mevsimsel bir etki de söz konusudur. Baz ara t rmac lar, so uk mevsimlerde s cak mevsimlere nazaran daha s k AFM 1 e rastland n bildirmektedirler. Buna neden olarak da, k aylar nda ineklerin fazlaca silaj yemi ve depolanm yemlerle, yaz ve bahar aylar nda ise merada otlamak suretiyle besleniyor olmalar n göstermektedirler (Blanc and Karleskind, 1981; Blanco et al., 1988; Galvano et al., 1996). Bachner et al. (1988), Almanya n n çe itli bölgelerinde yap lan bir çal mada, farkl zirai uygulamalar ve yemleme ekillerinin AFM 1 varl n etkiledi ini tespit etmi lerdir (Galvano et al., 1996). Özkaya vd., (2003), Türkiye nin çe itli bölgelerinden temin ettikleri toplam 543 çi süt örne inde aflatoksin M 1 mevcudiyeti aç s ndan bölgelere göre farkl l k oldu unu, Bursa, Erzurum, Kars, Kastamonu, Samsun ve Trabzon dan al nan örneklerin hiçbirinde AFM 1 e rastlanmad n bildirmi lerdir. Çoksöyler vd. (2003), Van n 10 ilçesine ait köylerden 52 si yaz ve 52 si k döneminde olmak üzere toplad klar toplam 104 adet çi inek sütü örne inin 96 s nda aflatoksin M 1 tespit etmezken bunlar n 8 inde maksimum izin verilebilir limitin alt nda aflatoksin M 1 belirlemi lerdir. Ara t rmac lar, her iki dönemde de sütlerde aflatoksin e rastlama s kl n n ve bulunan düzeylerin oldukça dü ük oldu unu, ayr ca, elde edilen bulgular n yörede hayvan besleme yöntemi ile paralellik gösterdi ini ifade etmi lerdir. Örneklerin al nd bölgelerdeki hayvanlar n yaz döneminde merada otlad n ah rda hiç beslenmediklerini, k döneminde ise kurutulmu ot ve kepek ile beslendiklerini belirtmi lerdir. nceledi imiz örneklerden 9 u Konya Küflü peyniri 1 tanesi de Kars Eski Ka ar Peyniri idi. Daha önce de de indi imiz gibi, Konya Küflü peyniri, A r, I d r ve A r ya ba l Ta l çay bölgelerinde üretilip 55-60kg l k torbalara bas lm halde Konya ya gönderilen peynirlerin küflendirilmesi sonucunda elde edilen bir peynir çe ididir. Örnekler Aral k ay ba nda toplanm t r. Üreticiler bu gelen peyniri gün so uk hava deposunda beklettikten sonra Eylül sonu Ekim 15 i gibi küflendirmeye ba lad klar n bildirmekteydiler. Buna göre esas peynirin üretimi yaz aylar na denk gelmektedir. Bu da analiz etti imiz peynir örneklerinde aflatoksin M 1

110 86 belirlenememesinin nedenini k smen izah etmektedir. Çoksöyler vd. (2003) nin bulgular da bu sonucu destekler niteliktedir. Ayr ca peynirlerin üretildi i bölge aç s ndan da ele alacak olursak Özkaya vd. (2003) nin elde ettikleri sonuçlar da bulgular m zla uyum göstermektedir. Literatürde daha çok inek sütüyle ilgili veriler mevcuttur. Oysa, AFM 1 in koyun, keçi, bufalo ve deve sütlerinde de bulunabildi i çok iyi bilinmektedir (Galvano et al., 1996). spanya n n güneyinde, marketlerde sat a sunulan, 9 u taze, 9 tanesi yar olgunla t r lm, 17 tanesi de olgunla t r lm, inek, koyun, keçi ve bunlar n kar m ndan üretilmi toplam 35 adet peynir örne inin 16 tanesinde 20 ile 200 ng/g aras nda de i en miktarlarda AFM 1 tespit edilmi tir (Barrios et al., 1996). Buna göre, inceledi imiz örneklerde AFM1 tespit edilememesinde peynirin koyun sütünden üretilmi olmas n n etkisi yoktur. 4.3 Peynir Örneklerinde Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Belirlenmesi ekil 4.3 de Toplam aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) standard na ait kromatogram, ekil 4.4 de ise toplam aflatoksin analizi sonucunda elde edilen, örneklere ait kromatogramlardan baz lar görülmektedir. nceledi imiz 10 örne in hiçbirinde tespit edilebilir düzeyde aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye rastlanmam t r.

111 87 ekil 4.3. Toplam Aflatoksin (B 1, B 2, G 1, G 2 ) Standard na Ait Kromatogram (0.5ng/ml x 4) (A)

112 88 (B) ekil 4.4. Peynir Örneklerine Ait Kromatogramlar (A) 2KL Örne i, (B) 5KL örne i Süt ürünlerinde aflatoksin M 1, bu toksinle kontamine olmu sütlerin üretimde kullan lmas sonucu bulunurken, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ancak bu toksini olu turan küflerin üründe geli mesi ile görülebilmektedir. Aflatoksin olu umunda substrat çe idi ile birlikte depolama s cakl n n çok büyük etkisi vard r. Yumu ak ve sert peynirlerde, küf geli imi ve/veya aflatoksin üretimi için gerekli en dü ük s cakl k derecesi su a ve peynir çe idine göre farkl l k göstermektedir (Karaioannoglou, 1990). Karaioannoglou (1990), yüzeyine A. flavus (CMI ) sporlar inokule etti i Kefalotyri peynirinde, 13ºC nin alt nda küf geli imi olmad n, 13ºC de çok zay f, 26ºC de ise yo un geli me oldu unu gözlemlemi tir. Ara t rmac, 26ºC de depolanan peynirlerde sadece yüzeyden 8mm derinli e kadar aflatoksin B 1 ve G 1 tespit etti ini, örneklerdeki AFB 1 miktar n n ng/g aras nda AFG 1 miktar n n ise ng/g aras nda de i ti ini

113 89 bildirmi tir. Corbion and Fremy (1978), Brick peynirinde, 7.2ºC de, A. flavus CMI ve A. parasiticus CMI un her ikisinin de geli ebildiklerini fakat sadece A. parasiticus CMI un 12.8ºC de aflatoksin üretebildi ini tespit etmi lerdir. Oldham et al. (1971), A. flavus ATCC nin, Cheddar peynirinde, 4.4ºC ve 7.2ºC de geli me göstermezken 25ºC de geli ti ini ve aflatoksin üretti ini bildirmi lerdir. Bu çal malarda küf sporlar peynirlere ara t rmac lar taraf ndan inoküle edilerek toksin olu turma yetenekleri incelenmi tir. Peynirlerin küf mikrofloas n belirleyen Bullerman (1976), Aran vd. (1986), Barrios et al (1997), peynirlerden toksijenik A. flavus izole ettiklerini bidirmi lerdir ancak bu peynirlerde aflatoksin olup olmad n belirlememi lerdir. Konya Küflü peynirinin üretimine bakt m zda peynirin küflendirilmesi 18-23ºC aras nda ideal ºC de (kimi üreticilere göre ºC de) gerçekle tirilmektedir. Karaioannoglou (1990), Corbion and Fremy (1978), Oldham et al. (1971) n bulgular na bakt m zda bu s cakl k dereceleri Aspergilluslar n da geli imi ve toksin üretimine imkan sa layacak derecelerdir. Ancak çal mam zda, peynir örneklerinden izole edilen küflerin genus düzeyinde tan mlamas nda (Bkz. Bölüm 4.7), Aspergillus genusuna ait türlere rastlanmam t r. Bu sonuç peynir örneklerinde aflatoksin tespit edilmemesinin sebebini aç klamaktad r. Peynirde küf geli iminde s cakl n yan s ra ortamdaki di er birçok faktör de rol oynamaktad r. Metin (1996), de küf geli imine s cakl n ve birçok fizyolojik faktörün etkisi oldu unu, hatta Aspergilluslar n geli iminin di er küfler taraf ndan engellendi i için peynirde aflatoksin üretemediklerini bildirmi tir. Ara t r c, bunun bir rekabetten ileri geldi ini de belirtmi tir. Bulgular m za benzer ekilde K vanç (1990) da, perakente sat yerlerinden temin etti i 25 adet taze peynir örne i ile salamura Beyaz peynirinde A. flavus tespit edemedi ini, ayr ca örneklerin hiçbirinde aflatoksine de rastlamad n bildirmi tir. Ancak Konya Küflü peyniri kontrolsüz ko ullarda küflendirilmektedir ve bilindi i gibi baz Penicillium türleri de mikotoksin

114 90 olu turabilmektedirler. Halk aras nda yayg n olan bir anlay a göre maviye il küfler peynire aroma katmakta ayr ca baz hastal klara kar direnç sa lamaktad r. Oysa bugün starter kültür olarak kullan lan küflerin bile toksin olu turabilece i bildirilmektedir. Nitekim Penicillium roqueforti nin baz su lar n n PR toksin, roquefortin, izofomigaklavin, penisillik asit ve patulin gibi mikotoksinleri olu turduklar bildirilmi tir (Erdo an vd., 2000). Wei Yun et al. (1988), çe itli peynirlerden izole ettikleri 176 Penicillium roqueforti su unun %12 sinin patulin ve penisillik asit ürettiklerini tespit etmi lerdir. Erdo an vd. (2002), Küflü tulum peynirlerinden izole ettikleri Penicillium roqueforti su lar n n tamam n n toksin üretme potansiyeli olan su lar olduklar n ve patulin, penisillik asit, PR toksin ve roquefortin toksinlerini ürettiklerini belirlemi lerdir. Bu toksinlerden patulin ve penisillik asit kanserojen olup di erleri ise doku ve organlarda önemli lezyonlar olu turmaktad r (Erdo an vd., 2000). Yap lan bu çal malarda küf izolatlar n n toksin olu umu yetenekleri besiyeri ortam nda tespit edilmi tir. Ve baz kaynaklarda (Üçüncü, 2004a), bu toksinlerin peynirlerde asl nda çok dü ük miktarlarda olu tu u, k sa süre sonra da parçalan p ortadan kalkt bildirilmektedir. Ancak, halk sa l aç s ndan Konya Küflü peynirinin bu toksinlerin varl yönünden de incelenmesi ileriki çal malar n konusunu olu turmal d r Laktik Asit Bakterilerinin zolasyonu 24 tanesi Küflü Kars Eski Ka ar ve küflü Deri Tulum Peynirinden, geriye kalanlar da Konya Küflü Peynirlerinden olmak üzere toplam 200 adet bakteri izole edilmi tir. Bu 200 izolat n 43 tanesi MRS agardan, 45 tanesi vancomycinli MRS (VMRS) agardan, 57 tanesi Kanamycin Esculin Azide agardan ve 55 tanesi de M17 agardan tesadüfi olarak seçilmi ve izole edilmi lerdir. Yap lan morfolojik incelemeler sonunda; MRS agar ve VMRS agardan izole edilen izolatlar n, 1 tanesi hariç, ikili, tekli, k sa zincir eklinde

115 91 k sa çubuklar veya kokobasil formunda olduklar görülmü tür. 1 tane izolat n dörtlü kok (tetrakok) formunda oldu u gözlenmi tir. Baz izolatlar n preparatlar nda hem tekli, ikili veya zincir eklinde k sa çubuk hem de oval kok- kokobasil eklinde görüntü elde edilmesi, kültürün kar k oldu u dü üncesini uyand rm t r. Ancak yap lan tekrarl preparatlarda bunlar n asl nda saf oldu u, kültürün ya na göre kokobasil veya çubuk formunu ald klar anla lm t r. Cogan (1996), leukonostoklar n durgun-faz safhas ndaki kültürlerinde bazen hem kok eklinde hem de çubuk eklinde hücreler bulundu unu, bu durumun kültürün saf olmad izlenimini verdi ini bildirmi tir. Dellaglio et al. (1995), glukoz besiyerlerinde ve kat besiyerlerinde geli en leukonostok hücrelerinin uzay p laktobasil gibi görünebildiklerini dolay s yla laktobasillerle kar t r labildiklerini ifade etmi lerdir. Di er taraftan baz ara t rmac lar, leukonostoklar n ve baz heterofermantatif laktobasillerin her ikisinin de kokobasil görüntüsü verdikleri için morfolojik olarak ay rt edilemediklerini bildirmi lerdir (Sharp et al., 1970; Axelsson, 1998). Morfolojik incelemelerde elde edilen bulgular, tüm bu bilgiler dikkate al n p de erlendirildi inde, MRS agar ve VMRS agardan izole edilen izolatlar n laktobasil mi yoksa leukonostok mu olduklar belirlenememi tir. Bunlar ancak identifikasyon a amas nda ay rt edilebilmi lerdir. dentifikasyon sonuçlar, Cogan (1996) n n leukonostoklar için belirtti i durumun, benzer ekilde, mezofil (ço unlukla heterofermantatif) laktobasiller için de geçerli oldu unu ortaya koymu tur. M17 agardan izole edilen toplam 55 adet izolat n 53 tanesinin ikili-tekli veya k sa zincir eklinde kok morfolojisine sahip olduklar gözlenirken 2 tanesinin k sa çubuk formunda oldu u belirlenmi ve di er basil izolatlar n n aras na al nm lard r. Yap lan katalaz testi sonucunda M17 agardan izole edilen koklar n 11 tanesi katalaz (+) reaksiyon verdikleri için uzakla t r lm lard r. Geriye kalan 42 adet izolat n tamam enterokok olarak tan mlanm lard r.

116 92 VMRS agardan izole edilen 10 adet izolat bekleme s ras nda aktivitelerini kaybettikleri için kullan lmaz hale gelmi lerdir. Yap lan identifikasyonlar sonucunda, M17 den izole edilen 2 adet basil izolat ile MRS agardan izole edilen 43 adet izolat n mezofil laktobasil olduklar saptanm t r. Ayn ekilde leukonostoklar n izolasyonu amac yla kullan lan VMRS den izole edilen 35 izolat n tamam n n da mezofil laktobasil olduklar tespit edilmi tir. Liu and Holland (2002); Simpson and Taguchi (1995), baz laktobasillerin ve pediokoklar n vancomycin e dirençli olduklar için böyle ortamlarda geli ebildiklerini bildirmi lerdir. Østlie et. al. (2004), vancomycin ilave edilmi MRS agardan izole ettikleri 39 adet laktik bakterinin 20 tanesinin laktobasil oldu unu belirlemi lerdir. Bütün bu bilgiler elde etti imiz sonucu desteklemektedir. Elde etti imiz bu bulgular, küflü peynir örneklerinde yap lan laktik asit bakterilerinin say m sonuçlar yla k yaslayacak olursak; Çizelge 4.2 de VMRS agarda yap lan say mlar ile MRS agarda yap lan say mlar n sonuçlar n n birbirine oldukça yak n oldu u, MRS agarda 4.45x10 6 ile 2.70x10 6 cfu/gr aras nda de i irken, VMRS de 4.00x10 6 ile 2.55x10 6 cfu/gr aras nda de i ti i görülmektedir. Her iki besiyerinden de izole edilen bakterilerin laktobasil olmas bunun sebebini aç klamaktad r. Di er taraftan M17 agarda yap lan say mlar n, KEA (Kanamycin Esculin Azide) agardaki say m sonuçlar ndan yüksek oldu u, M17 de 4.20x10 6 ile 6.45x10 7 cfu/gr aras nda de i irken KEA agarda 1.50x10 5 ile 3.50x10 6 cfu/gr aras nda de i ti i göze çarpmaktad r. M17 de elde edilen sonuçlar n laktokok oldu u varsay ld nda say m sonuçlar mant kl d r. Ancak, M17 agardan izole edilenlerin tamam n n enterokok olmas iki besiyeri aras ndaki fark ile ilgili soru i areti olu turmaktad r. zolasyon ve identifikasyon sonuçlar bu durumun sebebini aç klamaktad r. KEA agar, içerdi i sodyum azid ve kanamisin sülfat sayesinde sadece enterokoklar n geli imine izin verirken, M17 de laktobasiller ve di er baz katalaz pozitif bakteriler de geli ebilmektedirler. Bu da aradaki fark izah etmektedir. Benzer durum di er baz ara t rmac lar taraf ndan da bildirilmi tir. González et al. (2007), M17

117 93 agardan izole ettikleri bakterilerin %5.67 sinin Lactobacillus genusuna, %27.66 s n n Enterococcus genusuna, %7.80 inin Leuconostoc genusuna ve %55.32 sinin Lactococcus genusuna dahil türler oldu unu belirlemi lerdir. López- Díaz et al. (2000) M17 agardan Lactobacillus ve Leuconostoc genusuna ait türler izole ettiklerini bildirmi lerdir. Bizim bulgular m zdan farkl olarak, M17 agardan oldukça dü ük oranda enterokok izole ettiklerini, ancak laktik asit bakterisi olmayan izolatlara rastlamad klar n ifade etmi lerdir Laktik Asit Bakterilerinin dentifikasyonu Fizyolojik ve Biyokimyasal (Fenotipik) dentifikasyon Geleneksel Yöntemle dentifikasyon Yap lan Gram boyama, katalaz testi ve morfolojik incelemeler sonucunda, 99 tanesi streptokok, 80 tanesi laktobasil ve/veya muhtemel leukonostoc olmak üzere toplam 179 tane izolat geleneksel yöntemle çe itli fizyolojik ve biyokimyasal testlere tabi tutulmu lard r (Bkz. Bölüm ). Bu testler sonucunda elde edilen reaksiyon sonuçlar (Ek 6), Ek 5 deki identifikasyon tablolar ile kar la t r larak bekteriler tan mlanm lard r. 42 tanesi M17 agardan 57 tanesi Kanamycin Esculin Azide agardan izole edilmi toplam 99 kok izolat n n tamam n n 10ºC de, 45ºC de ve ph 9.6 da geli ebildikleri, esculin i parçalayabildikleri belirlenmi tir. Ayr ca karbonhidrat fermantasyon sonuçlar na bak ld nda yine hepsinin hemen hemen ayn sonucu verdikleri sadece sorbitol, arabinoz, raffinoz ve sakkarozu fermente etme yeteneklerinde farkl l klar oldu u görülmü tür. Bu bulgular n alt nda izolatlar n tamam n n Enterococcus genusuna ait türler oldu u, hatta Enterococcus faecalis veya Enterococcus faecium

118 94 olduklar belirlenmi tir. Ancak, her izolat ayr ayr tür olarak isimlendirilememi tir. Ayr ca, izolatlar n tamam n n, %2 ve %4 NaCl içeren ortamda geli me göstermelerine ra men %6.5 tuzda geli ememeleri bunlar n farkl bir enterokok türü olabilece i ihtimalini de dü ündürmü tür. Daha sonra yap lan API testleri ve genotipik tan mlama ile bunlar n Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium olduklar do rulanm t r. Enterokok türlerinin fenotipik identifikasyon yöntemleri ile tam olarak tan mlanamad klar baz ara t r c lar taraf ndan da bildirilmi tir (Devriese and Pot, 1995; Bulut vd., 2004). Biyokimyasal testler tamamen bakterilerin fizyolojik özelliklerine ve besin gereksinimlerine dayal tan mlama yöntemleridir. Bakteriler farkl çevre ko ullar nda kendilerini ortam artlar na uydurmaya çal maktad rlar. zole edildikleri farkl ortam artlar na uyum sa lam bakteriler bazen bu testlerde bilinenin d nda reaksiyonlar vermektedirler. Bu durum bunlar n farkl bir tür olarak tan mlanmas na veya tam olarak tan mlanamamas na neden olmaktad r. Arslan (2002), kültür kullan lmadan üretilmi peynir örneklerinden izole etti i baz Streptococcus thermophilus izolatlar n n %4 NaCl içeren identifikasyon besi ortam nda pozitif sonuç verdi ini belirlemi tir. Oysa Streptococcus thermophilus, di er laktik koklardan 10 C de ve %2 NaCl de geli ememe özelli i ile ay rt edilebilmektedir. Ara t rmac bu sonucu, do al florada yer alan Streptococcus thermophilus un, canl l n sürdürmek için peynirdeki tuz konsantrasyonuna adapte olmas na ba lam t r. Bulut (2003), peynirlerden izole etti i baz Lactococcus lactis subsp. lactis izolatlar n n %6.5 NaCl içeren ortamda geli me gösterdiklerini bildirmi tir. Çizelge 4.1 de Konya Küflü Peynirlerinin %tuz oranlar incelendi inde genel olarak %3.97 ile %5.38 aras nda de i ti i, sadece iki örnekte %6.20 ve %6.66 oldu u görülmektedir. Bu da izole etti imiz

119 95 enterokoklar n %6.5 tuzda geli ememelerini izah etmektedir. Muhtemelen bakteriler %6.5 den dü ük tuz oranlar na adapte olmu lard r. dentifikasyona al nan toplam 80 adet laktobasil ve muhtemel leukonostok izolatlar n n birkaç tanesi hariç tamam n n hem 10 C de hem de 45 C de geli ebildikleri, büyük ço unlu unun argininden amonyak olu turmad buna kar n ço unun esculini parçalad klar belirlenmi tir. Baz izolatlar n laktozu fermente edemedikleri veya çok az fermente edebildikleri tespit edilmi tir. zolatlar n oldukça farkl konbinasyonlarda karbonhidrat fermentasyon sonuçlar na sahip olduklar gözlenmi tir. Elde edilen sonuçlar Ek 5 deki tablolarla kar la t r ld nda, izolatlar tan mlamada güçlük çekilmi ve tür düzeyinde isimlendirmede tereddütler ya anm t r. Örne in, di er özellikleri Lb. plantarum ve Lb. brevis oldu unu gösteren izolatlar n 45 C de geli ebildikleri belirlenmi tir. Argininden amonyak olu turma, glukoz dan CO 2 olu turma test ortamlar nda pozitif sonuç veren ve laktoz fermentasyonu negatif olan bir izolat, morfolojisi de dikkate al nd nda Lb. brevis olarak tan mlan rken 45 C de geli ebilmesi soru i areti yaratm t r. Di er taraftan, literatürde bir karbonhidrata kar pozitif reaksiyon verdi i bildirilen bir bakterinin negatif reaksiyon göstermesi veya tam tersi olmas bakteriyi tan mlamada tereddüte neden olmu tur. Di er özellikleri Lb. brevis e benzemesine ra men, incelenen baz izolatlar n laktoz (+), esculin (-) reaksiyon verdikleri görülmü tür. Bu durum, izolatlar n, Lb. brevis ile ayn fenotipik özellikler gösteren fakat esculin (-), ço unlukla laktoz (+) reaksiyon veren Lb. kefir olabilece i ihtimalini dü ündürmü tür. (Lactobacillus brevis, laktoz negatif, esculin (±) olarak bilinmektedir) Bulut (2003), peynirden, 45 C de geli ebilen Lactococcus lactis subsp. lactis izole etti ini bildirmi tir. Bulut (2003), Fortina et al., (2003) n

120 96 yapt klar çal maya da at fta bulunarak, benzer ekilde, ara t rmac lar n da 10 C de geli ebilen laktokok izolatlar tespit ettiklerini ifade etmi tir. Fitzsimons et al (1999), çal malar nda kulland klar baz referans su lar n bile, literatürde bildirilenden farkl fenotipik özellik gösterdiklerini, örne in Lactobacillus paracasei nin (LMG 12586/ATCC 334) raffinoz u, Lactobacillus plantarum un (LMG 6907/ATCC 14917) rhamnoz u fermente edebildiklerini bildirmi lerdir. Ayr ca peynirden izole ettikleri bakteriler aras nda da riboz negatif Lb. paracasei ile raffinoz negatif Lb. plantarum a rastlad klar n belirtmi lerdir. Baz izolatlar, laktobasillerin bilinen fenotipik özelliklerine tam uymayan fakat k smen leukonostoklara benzeyen çok farkl özellikler göstermi lerdir. Bu nedenle bunlar n genus düzeyinde tan mlanabilmelerinde bile güçlük ya anm t r. Ancak, Ek 5 deki tablo incelendi inde leukonostoklar n herhangi bir özelli i ile ilgili çe itli literatürlerde çok farkl bilgilerin oldu u görülmü tür. Ayr ca, leukonostoklar n, biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerindeki heterojenlikten dolay fenotipik yöntemlerle identifikasyonlar n n güç oldu u hatta heterofermantatif laktobasiller, pediokoklar ve Weissella türleri ile kar t r labildikleri birçok ara t rmac taraf ndan da bildirilmi tir (Björkroth et al., 1998; Santos et al., 2005). Buradan yola ç k larak, bu izolatlar n tan mlamas leukonostok olabilecekleri göz önünde bulundurularak gerçekle tirilmi tir. Tüm bu bilgiler do rultusunda, izolatlar n baz atipik özellikler gösterebilecekleri dikkate al n p de erlendirme yap ld nda 11 tanesinin Lb. plantarum, 15 tanesinin Lb. casei, 18 tanesinin Lb. brevis ve/veya Lb. kefir olduklar tespit edilmi tir. Geriye kalan 36 tane izolat n 12 tanesi Lactobacillus türleri, 1 tanesi de Pediococcus türü olarak tan mlanm t r. Fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri laktobasillere uymayan fakat k smen leukonostoklara benzeyen 23 adet izolat Leuconostoc türleri olarak tan mlanabilmi lerdir.

121 97 Genel olarak sonuçlar ele ald m zda, geleneksel yöntemle yap lan fenotipik identifiyasyon sonucunda, 179 adet laktik asit bakterisi izolat n n %55,31 inin Enterococcus genusuna, %31.28 inin Lactobacillus genusuna (mezofil laktobasil) geriye kalan %12.85 inin ise Leuconostoc genusuna ait türler oldu u belirlenmi tir. Ayr ca 1 adet (%0.56) de Pediococcus genusuna ait izolata rastlanm t r. ( ekil 4.5) Leuconostoc %12.85 Pediococcus %0.56 Lactobacillus %31.28 Enterococcus %55.31 ekil 4.5. Geleneksel Yöntemle Biyokimyasal dentifikason Sonucunda 179 zolat n Genus Düzeyinde Da l m Oranlar API Test Kitleri ile dentifikasyon 179 adet laktik asit bakterisinin antifungal aktiviteleri belirlendikten sonra (Bkz. Bölüm 4.8), aralar nda antifungal etkiye sahip izolatlar n da yer ald, toplam 55 adet laktik bakteri izolat API 50CHL ve API 20 STREP identifikasyon kitleri kullan larak tan mlanm lard r. API 50CHL ile tan mlanan 30 adet laktobasil ve leukonostok izolat n n 13 adedinin Lactobacillus brevis, 9 adedinin Lactobacillus plantarum, 6 adedinin Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, 1 adedinin Pediococcus spp. ve 1 adedinin de Lactococcus lactis subsp. lactis oldu u tespit edilmi tir. API 20STREP kitleri ile tan mlanan 25 adet streptokok izolat n n 14 adedinin Enterococcus faecium, 9 adedinin Enterococcus durans ve 2 adedinin de

122 98 Lactococcus lactis subsp lactis oldu u belirlenmi tir. Çizelge 4.3 de izolatlar n kodlar ve tan mlama sonuçlar görülmektedir. ekil 4.6 da ise genuslara göre da l m oranlar verilmi tir. Lactococcus %5.45 Pediococcus %1.82 Enterococcus %41,82 Lactobacillus %50,91 ekil 4.6. API Test Kitleri le Tan mlanan 55 Adet zolat n Genuslara Göre Da l m Oranlar Çizelge 4.3. API Test Kitleri le Tan mlanan zolatlar n Kodlar ve Tan mlama Sonuçlar Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Enterococcus faecium Enterococcus durans ZOLAT KODU VKS10, R2KL10, R2KL12, RKSx2, R3KL6, R1KL8, V8KL3, V7KL6, V4KL9, R2KL9, R1KLx3, RKSx1, RKS12 RKS11, R6KL5, V8KL10, V8KL8, V7KL5, V5KL2, V5KL6, R6KL2, R8KL13, V7KL3, V8KL9, V3KL10, R2KL7, R3KL3, R1KL6, M6KL1, M6KL3, M5KL5, M1KL3, M2KL7, MKS6, M7KL9, M2KL2, SFKSx1, SF4KL2, SF7KL1, SF5KL3, SF5KL8, SF1KL4 M7KL10, M3KL1, MKS3, SFKS2, SFKSx3, SF3KL8, SF3KL3, SF1KL5, SF3KL4 OLASILIK (%ID)* % %99.4 % %99.9 % %99.9 % %99.6 %54 - %97.8 Pediococcus spp. V1KL12 %66.8 Lactococcus lactis V7KL4, MKS5, M8KL2 % %86.2 subsp. lactis *Herbir izolata ait tan mlama sonucu, %ID ve T de erleri ile birlikte Ek 8 de ayr nt l olarak verilmi tir

123 99 API test kitleri ile yap lan identifikasyon sonucunda, 55 adet izolat 4 farkl genusa ait 7 farkl tür alt nda toplanm t r. Çizelge 4.3 ve ekil 4.6 da görüldü ü gibi bu 55 adet izolat aras nda Leuconostoc türlerine rastlanmam t r. Oysa, bu 55 izolat aras nda, geleneksel yöntemle leukonostok olarak tan mlanm izolatlar da vard. Burada bu izolatlar n da laktobasil olduklar belirlenmi tir. Geleneksel yöntemle tan mlamadan farkl olarak API test kitleri ile 3 tane de Lactococcus lactis subsp. lactis tan mlanm t r. Fakat daha sonra yap lan genotipik tan mlama ve dizi analizleri sonucunda bunlar n böyle olmad klar tespit edilmi tir. V1KL12 izolat API test kitleri ile de sadece Pediococcus olarak tan mlanabilmi, hangi tür oldu u belirlenememi tir. API test kitlerinde elde edilen sonuçlar bilgisayar ortam nda, apiweb program kullan larak de erlendirilmektedir. Program, tan mlanacak bakteriye ait biyokimyasal profili, API veri taban nda kay tl olan bakteri profilleriyle kar la t rmakta ve buradaki bilgiler do rultusunda bakteriyi tan mlamaktad r. Daha önce de belirtildi i gibi biyokimyasal testler tamamen bakterilerin fizyolojik özelliklerine ve besin gereksinimlerine dayal tan mlama yöntemleridir. Farkl ortam artlar na uyum sa lam bakteriler bu testlerde bilinenin d nda reaksiyonlar verdikleri zaman farkl bir tür veya genus olarak tan mlanabilmektedirler. Bakterinin gösterebilece i farkl reaksiyonlar burada da farkl bir tür veya genus olarak tan mlanmas na neden olabilmektedir. BioMérieux apiweb e göre Ent. faecium su lar n n %90, Ent. durans su lar n n ise %76 s -galaktozidaz pozitiftir. - galaktozidaz (-) reaksiyon veren M8KL2 izolat %40.9 olas l kla Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tan mlanm t r. dentifikasyon sonucunda izolat n %30.2 olas l kla Enterococcus durans %27.4 olas l kla Enterococcus faecium olabilece i de belirtilmi tir. Di er üç identifikasyon yöntemi ile M8KL2 izolat n n Enterococcus faecium oldu u belirlenmi tir.

124 100 V7KL4 izolat amigdalin ve gentiobioz negatif reaksiyon vermi tir. BioMérieux apiweb e göre Lactobacillus paracasei subsp. paracasei su lar n n %99 u amigdalin pozitif ve %100 ü gentiobioz pozitiftir. Bu nedenle V7KL4 izolat, su lar n n %75 i amigdalin pozitif ve %81 i gentiobioz pozitif sonuç veren Lactococcus lactis subsp lactis (%86.2 olas l kla) olarak tan mlanm t r. Lactobacillus paracasei subsp. paracasei olma olas l ise %9.7 olarak verilmi tir. V7KL4 geleneksel yöntemle Leuconostoc türü olarak tan mlanm t r. PCR/RFLP 16S rrna-its yöntemi ile identifikasyonda. jel görüntüsü Lb. casei subsp. casei (NRRL B-1922), Lb. paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), ve Lb. casei subsp. rhamnosus (NRRL B-442) Lb. curvatus subsp curvatus (NRRL B-4562) referans su lar n n hepsi ile benzerlik göstermi 16S rdna dizi analizi sonucunda %98 Lactobacillus paracasei oldu u belirlenmi tir. MKS5 izolat % 60 olas l kla Lactococcus lactis subsp. lactis, %25.2 olas l kla Enterococcus durans ve %12.9 olas l kla Enterococcus faecium olarak tan mlanm t r. BioMérieux apiweb bu izolat voges proskauer (VP) testindeki reaksiyonuna ve mannitolü fermente edebilme özelli ine göre de erlendirmi tir. Bu programa göre Enterococcus durans su lar n n %100 ü, Enterococcus faecium su lar n n %94 ü, Lactococcus lactis subsp lactis su lar n n %90 VP pozitiftir. MKS5 izolat VP negatif reaksiyon verdi i için, su lar n n daha az VP pozitif sonuç veren Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tan mlanm t r. Mannitol negatif sonuç verdi i için Enterococcus durans olma olas l Enterococcus faecium a k yasla daha yüksek belirtilmi tir. Çünkü apiweb e göre Enterococcus durans lar n %2 si Enterococcus faecium lar n ise %78 i mannitol pozitiftir. Bu izolat, geleneksel yöntemle Enterococcus türü, 16S rdna dizi analizi ile %93 Enterococcus durans olarak tan mlanm t r. Farkl bir jel görüntüsü verdi i için PCR/RFLP 16S rrna yöntemi ile tan mlanamam t r. BioMérieux apiweb e göre Lb. plantarum su lar n n %92 si melezitoz pozitiftir. API 50CH de melezitoz negatif sonuç veren RKS12 izolat %70.4

125 101 olas l kla Lb. brevis olarak tan mlanm t r. Hem geleneksel yöntemle hem de 16S rdna dizi analizi ile bu izolat n Lactobacillus plantarum oldu u belirlenmi tir. Kao et al. (2007), 16S rrna dizi analizi sonucunda Lb. paracasei olarak tan mlad klar izolat API test kitleri ile Lactobacillus rhamnosus olarak tan mlad klar n bildirmi lerdir. Ara t rmac lar, bu durumu öyle izah etmi lerdir: API identifikasyon sistemine göre Lb. rhamnosus un tüm su lar rhamnoz pozitiftir. Lb. paracasei su lar n n ise sadece %1 i rhamnozu fermente edebilmektedir. zolat rhamnoz pozitif sonuç verdi i için Lactobacillus rhamnosus olarak tan mlanm t r. Baz kaynaklar Enterococcus durans ile Enterococcus faecium un ayn tür oldu nu bildirilmektedirler (Yayg n ve K l ç, 1993; K l ç, 2001). Devriese and Pot (1995), Enterrococcus durans Ent. faecium, Ent. durans, Ent. hirae ve Ent. mundtii den olu an Enterococcus faecium türleri grubu içinde vermi lerdir. Son y llarda yap lan identifikasyon çal malar nda ise Enterococcus durans ve Enterococcus faecium dan ayr iki tür olarak bahsedilmektedir (López-Díaz et al., 2000; Bulut vd., 2004; Cheriguene et al., 2007). BioMérieux apiweb izolatlar n 9 tanesini Enterococcus durans, 14 tanesini ise Enterococcus faecium olarak tan mlam t r. API bu ayr m lösin amino peptidaz (LAP) aktivitesi ile mannitol ve arbinoz fermantasyon sonucuna göre yapm t r. Her üçünde de negatif sonuç veren izolatlar Ent. durans olarak kabul etmi tir. Bunlardan baz lar PCR/RFLP yöntemi ile tan mlamada Enterococcus faecium ile benzer jel görüntüsü vermi lerdir. Baz lar ise restriksiyon enzimine ba l olarak Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis ile benzerlik göstermi tir.

126 Genotipik dentifikasyon Aralar nda antifungal etkiye sahip olanlar n da bulundu u, 46 tanesi laktobasil ve leukonostok, 37 tanesi kok toplam 83 adet laktik asit bakteri izolat genotipik tan mlamaya al nm lard r. Bunlardan 66 tanesi PCR/RFLP (16S rrna gene-its region) yöntemi ile tan mlan rken, 16 tane laktobasil ve 1 adet kok izolat bu yöntemle sonuç vermemi lerdir. Bu izolatlar n 16S rrna-its bölgeleri ço alt lamam, bunlardan PCR ürünü elde edilememi tir. Söz konusu 17 izolat ve V1KL12 izolat (16S rrna-its de uygulanm ) PCR/RFLP 16S rrna yöntemi kullan larak tan mlanmaya çal lm t r. Çal mada Lb. plantarum referans su lar ile Leuconostoc türü ve Pediococcus türü referans su lar nda da ayn durum gözlenmi tir. Bu nedenle bu referans su lara da ayn yöntem uygulanm t r. Bunlar n da 16S rrna bölgeleri ço alt lm t r. V1KL12 izolat di er idenifikasyon yöntemleri ile Pediococcus türü olarak tan mlanm t. Pediococcus referanslar yla kar la t rabilmek amac yla bu izolata bir de PCR/RFLP 16S rrna uygulanm t r. 16S rrna-its bölgesine RFLP uyguland nda, Laktobasillerde en iyi ay r m, Hae III restriksiyon endonükleaz ile elde edilmi tir. ekil 4.7 de laktobasil izolatlar n n 16S rrna-its gen bölgelerinin Hae III kesim ürünlerine ait jel görüntüsü, ekil 4.8 de Laktobasil izolatlar n n 16S rrna- ITS gen bölgelerinin Taq 1 kesim ürünlerine ait jel görüntüsü, ekil 4.9 da ise referans su lar n 16S rrna-its gen bölgelerinin hem Hae III hem de Taq 1 kesim ürünlerine ait jel görüntüsü verilmi tir.

127 bp ekil 4.7. Laktobasil zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. R1KL6; 3. R1KL8; 4. R1KLx3; 5. V4KL9; 6. RKSx1, 7. RKSx2, 8. R2KL9; 9. R2KL10; 10. R2KL11; 11. R2KL12; 12. R3KL2; 13. R3KL3; 14. R3KL6; 15. R3KL4(M); 16. RK R5; 17. RK R6; 18. RKS14, 19. VKS10; 20. V2KL5; 21.V3KL10; 22. V1KL12, 23.V7KL2; 24. V7KL3; 25. V7KL4; 26. V7KL6; 27. V7KL10; 28. R7KL11; 29. V8KL3; 30. V8KL9; 31. R2KL1(M) bp DNA ladder Gene Ruler bp ekil 4.8. Laktobasil zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. R1KL6; 3. R1KL8; 4. R1KLx3; 5. V4KL9; 6. RKSx1, 7. RKSx2, 8.R2KL9; 9. R2KL10; 10. R2KL11; 11. R2KL12; 12. R3KL2; 13. R3KL3; 14. R3KL6; 15. R3KL4(M); 16. RK R5; 17. RK R6; 18. RKS14, 19. VKS10; 20.V2KL5; 21.V3KL10; 22. V1KL12, 23.V7KL2; 24. V7KL3; 25. V7KL4; 26. V7KL6; 27. V7KL10; 28. R7KL11; 29. R7KL11; 30. V8KL3; 31. V8KL9; 32. R2KL1(M) bp DNA ladder Gene Ruler

128 104 bp Hae III Taq ekil 4.9. Referans Su lar n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin HaeIII ve Taq 1 Restriksiyon Profilleri. Hae III: bp DNA 2. NRRL B-4527 Lb. brevis; 3. CHI Lb. casei; 4. NRRL B-1922 Lb. casei subsp. casei 5. NRRL B-4560 Lb. paracasei subsp. paracasei; 6. NRRL B-548 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus; 7. NRRL B-1837 Lb. buchneri 8. NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei, 9. NRRL B-442 Lb. casei subsp. rhamnosus 10. NRRL B-4562 Lb. curvatus subsp curvatus 11. NRRL B-634 Lc. lactis subsp. cremoris; 12. NRRL B-1821 Lc. lactis subsp. lactis; 13. CECT 184 Enterococcus faecalis; 14. CECT 970 Enterococcus gallinarum; 15. NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus; 16. NRRL B-2354 Enterococcus faecium; 17. CECT 813 Pediococcus parvulus 18. CECT 813 pediococcus parvulus bp DNA ladder Gene Ruler ; Taq 1: 20. NRRL B-4527 Lb. brevis; 21. CHI Lb. casei; 22. NRRL B Lb. casei subsp. casei; 23. NRRL B-4560 Lb. paracasei subsp. paracasei; 24. NRRL B-548 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus; 25. NRRL B-1837 Lb. buchneri; 26. NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei; 27. NRRL B-442 Lb. casei subsp. rhamnosus; 28. NRRL B-4562 Lb. curvatus subsp curvatus; 29. NRRL B-634 Lc. lactis subsp. cremoris; 30. NRRL B-1821 Lc. lactis subsp. lactis; 31. CECT 184 Enterococcus faecalis; 32. CECT 970 Enterococcus gallinarum; 33. NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus; 34. NRRL B-2354 Enterococcus faecium; 35. CECT 813 Pediococcus parvulus 36. CECT 813 Pediococcus parvulus 37. 1kb DNA ladder Gene Ruler zolatlar n Hae III kesim ürünlerinin 3 farkl tip jel görüntüsü verdikleri göze çarpm t r ( ekil 4.7). Referans su lar n jel görüntüleri ile kar la t r ld nda, bunlar n Lb. brevis (NRRL B-4527); Lb. casei subsp. casei (NRRL B-1922), Lb. paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), Lb. casei subsp. casei (NRRL B-441), Lb. casei subsp. rhamnosus (NRRL B- 442) ve Lb. curvatus subsp curvatus (NRRL B-4562) ile benzer jel görüntülerine sahip olduklar görülmü tür. Referans su larla birlikte

129 105 olu turulan dendrogramda izolatlar 5 farkl grup alt nda toplanm lard r ( ekil 4.10). zolatlar n Taq 1 kesim ürünleri tek tip jel görüntüsü vermi tir ( ekil 4.8). Referans su lar n Taq 1 kesim ürünlerinin jel görüntüleri incelendi inde, NRRL B-4527 Lb. brevis; NRRL B-1922 Lb. casei subsp. casei, NRRL B-4560 Lb. paracasei subsp. paracasei ve NRRL B-442 Lb. casei subsp. rhamnosus un da birbirlerine benzer jel görüntüsü verdikleri görülmü tür. Olu turulan dendrograma göre ( ekil 4.10), laktobasil izolatlar n n 10 tanesi Lb. brevis (NRRL B-4527) ile, 7 tanesi Lb. casei subsp. casei (NRRL B-441) ile, 6 tanesi Lb. curvatus subsp curvatus (NRRL B-4562) ile, 6 tanesi de hem Lactobacillus casei subsp. casei (NRRL B-1922), hem Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), hem de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (NRRL B-442) ile. %100 homoloji göstermi lerdir. R2KL1 izolat ayr bir tür olarak grupland r lm ve dolay s yla tan mlanamam t r. Ancak bu izolat n Taq 1 restriksiyon profili di er izolatlarla benzerlik göstermektedir. Görüldü ü gibi Hae III Lactobacillus casei subsp. casei (NRRL B- 1922), Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (NRRL B-442) aras nda ay r m sa layamam t r. Ancak R3KL3, V3KL10 ve R1KL6 izolatlar API test kitleriyle Lactobacillus paracasei subsp paracasei olarak tan mlanm lard r. 16S rdna dizi analizi sonucunda da R1KL6 n n Lactobacillus paracasei oldu u belirlenmi tir.

130 106 ekil Laktobasil zolatlar n n ve Referans Su lar n Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram Dendrogramada Lb. curvatus subsp. curvatus (NRRL B-4562) ile %100 homoloji gösteren izolatlardan V7KL3 ve V8KL9 API test kitleri ile

131 107 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei olarak tan mlanm lard r. V7KL4, yap lan 16S rdna dizi analizi sonucunda %98 Lactobacillus paracasei olarak tan mlanm t r. ekil 4.9 da referans su lar n Hae III jel görüntüleri incelendi inde Lb. curvatus subsp. curvatus (NRRL B-4562) un jel görüntüsünün de asl nda Lactobacillus casei subsp. casei (NRRL B-1922), Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (NRRL B-4560), Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (NRRL B-442) ile ayn oldu u görülmektedir. Taq 1 jel görüntüsü ise bu üçünden farkl d r. zolatlar n hiçbirinin Taq 1 jel görüntüsü Lb. curvatus subsp. curvatus (NRRL B-4562) a benzememektedir. NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei ile ayn grupta yer alan 7 tane izolattan V8KL3, V7KL6 ve R3KL6 n n geleneksel yöntemle Lb. brevis/lb. kefir, API test kitleriyle Lb. brevis olduklar belirlenmi tir. VKS10 geleneksel yöntemle leukonostok, API ile Lb. brevis olarak tan mlanm t r. Bu 4 izolat ve dendrogramda onlarla ayn grupta yer alan di er 3 izolat n Hae III kesim ürünlerinin jel görüntüleri NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei i ile benzerlik göstermi tir. Ancak ekil 4.9 incelendi inde NRRL B-4527 Lb. brevis in ve NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei nin Hae III jel görüntülerinin hemen hemen birbirine benzedi i de göze çarpmaktad r. Di er taraftan, söz konusu izolatlar n Taq 1 jel görüntülerinin NRRL B-441 Lb. casei subsp. casei nin Taq 1 jel görüntüsüne benzemedi i görülmektedir. dentifikasyona al nan 36 adet kok izolat n n ne Hae III ne de Taq1 restriksiyon profilleri NRRL B-634 Lc. lactis subsp. cremoris ve NRRL B Lc. lactis subsp. lactis referans su lar n n restriksiyon profilleriyle benzerlik göstermemi tir. Çal mada, CECT 184 Enterococcus faecalis, CECT 970 Enterococcus gallinarum, NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus ve NRRL B-2354 Enterococcus faecium olmak üzere 4 farkl enterokok referans su u kullan lm t r. Hem HaeIII hem de Taq1 restriksiyon endonükleaz CECT 184 Enterococcus faecalis ile NRRL B-2354 Enterococcus faecium aras nda iyi ay r m sa larken, HaeIII, CECT 184 Enterococcus faecalis ile CECT 970 Enterococcus gallinarum aras nda tam

132 108 olarak ay r m sa layamam t r. NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus ise hemen hemen bunlara yak n bir jel görüntüsü vermi tir. Taq1, CECT 970 Enterococcus gallinarum, NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus aras nda ay r m sa lamazken CECT 184 Enterococcus faecalis ile NRRL B Enterococcus faecium u bu iki türden ay rt etmi tir. ( ekil 4.9) Kok izolatlar n n 16S rrna-its gen bölgelerinin Hae III kesim ürünlerine ait jel görüntüsü ekil 4.11 de, Taq 1 kesim ürünlerine ait jel görüntüsü ise ekil 4.12 de verilmi tir bp ekil Kok zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler 2. MKS6; 3. MKS11; 4. MKS12; 5. M1KL1; 6. M1KL3; 7. 2KL2; 8. M2KL3; 9. M5KL5; 10. M6KL1; 11. M6KL3; 12. M7KL6; 13. M7KL7; 14. M7KL9; 15. M7KL10; 16. M8KL2; 17. SFKSx3; 18. SFKS2; 19. SF1KL4; 20. SF3KL4; 21. SF3KL3; 22. SF3KL6; 23. SF3KL7; 24. SF3KL8; 25. SF4KL2; 26. SF5KL2; 27. SF5KL3; 28. SF5KL5; 29. SF5KL8; 30. SF7KL1; 31. SFDTI5; 32. MKS3; 33. M2KL7; 34. M3KL1; 35. MDTI8; 36. SFKSx1; 37. SF1KL5

133 bp ekil Kok zolatlar n n 16S rrna-its Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. MKS6; 3. MKS11; 4. MKS12; 5. M1KL1; 6. M1KL3; 7. M2KL2; 8. M2KL3; 9. M5KL5; 10. M6KL1; 11. M6KL3; 12. M7KL6; 13. M7KL7; 14. M7KL9; 15. M7KL10; 16. M8KL2; 17. SFKSx3; 18. SFKS2; 19. SF1KL4; 20. SF3KL4; 21. SF3KL3; 22. SF3KL6; 23. SF3KL7; 24. SF3KL8; 25. SF4KL2; 26. SF5KL2; 27. SF5KL3; 28. SF5KL5; 29. SF5KL8; 30. SF7KL1; 31. SFDTI5; 32. MKS3; 33. M2KL7; 34. M3KL1; 35. MDTI8; 36. SFKSx1; 37. SF1KL5 Hae III restriksiyon profillerinden olu turulan dendrogramda ( ekil 4.13) kok izolatlar n n 3 farkl grup alt nda topland klar görülmü tür. 24 tanesi NRRL B-2354 Enterococcus faecium ile, 4 tanesi CECT 184 Enterococcus faecalis ile, 5 tanesi ise hem CECT 970 Enterococcus gallinarum hem de NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus ile %100 homoloji göstermi lerdir. Ancak burada Enterococcus gallinarum ve Enterococcus casseliflavus olarak tan mlanan M2KL7 ile SFKSx3, API test kitleri ile Enterococcus durans olarak tan mlanm lard r. Di er taraftan, burada Enterococcus faecalis olarak tan mlanan SFKSx1 izolat hem API test kitleri ile hem de 16S rdna dizi analizi sonucunda Enterococcus faecium olarak tan mlanm t r.

134 110 ekil Kok zolatlar n n ve Referans Su lar n Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram Taq 1 restriksiyon profillerinden olu turulan dendrogramda ( ekil 4.14) kok izolatlar 2 farkl grup alt nda toplanm lard r. 9 tanesi CECT 184 Enterococcus faecalis ile, geriye kalanlar ise NRRL B-2354 Enterococcus faecium ile %100 homoloji göstermi lerdir.

135 ekil Kok zolatlar n n ve Referans Su lar n Taq1 Kesim Ürünlerinin Dendrogram 111

136 112 16S rrna-its bölgesi amplifiye edilemeyen 17 adet izolat PCR/RFLP (16S rrna) yöntemi kullan larak tan mlanmaya çal lm t r. 17 izolattan 16 s n n ve V1KL12 izolat n n jel görüntüleri hem Lb. brevis hem Lb. casei subsp. casei, Lb. casei subsp. rhamnosus, Lb. paracasei subsp. paracasei hem de Lactobacillus plantarum ile benzerlik göstermi tir ( ekil 4.15, 4.16 ve 4.18). Bu izolatlar sadece Lactobacillus türleri olarak tan mlanabilmi lerdir. Geriye kalan 1 adet kok izolat, MKS5 in Hae III kesim ürünü di er izolatlarla benzer görüntü verirken, Taq1 kesim ürünü hem di er izolatlardan hem de referans kültürlerden (laktokok ve enterokok) tamamen farkl bir görüntü vermi ve tan mlanamam t r. Hae III Taq bp ekil Adet zolat n 16S rrna Gen Bölgelerinin Hae III ve Taq1 Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. VKS8; 3. RKS11; 4. RKS12; 5. R1KLx2; 6. R4KL5; 7.V1KL12; 8. V5KL2; 9. V5KL6; 10. R5KL8; 11. R6KL2; 12. R6KL5; 13. V7KL5; 14. V8KL4; 15. V8KL8; 16. V8KL10; 17. R8KL12; 18. R8KL13; 19. MKS5; bp DNA ladder Gene Ruler 21. VKS8; 22. RKS11; 23. RKS12; 24. R1KLx2; 25. R4KL5; 26. V1KL12; 27. V5KL2; 28. V5KL6; 29. R5KL8; 30. R6KL2; 31. R6KL5; 32. V7KL5; 33. V8KL4; 34. V8KL8; 35. V8KL10; 36. R8KL12; 37. R8KL13; 38. MKS5; 39. 1kb DNA ladder Gene Ruler

137 bp ekil Referans Su lar n 16S rrna Gen Bölgelerinin Hae III Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. DSM 1954 Lactobacillus plantarum; 3. NRRL B Lactobacillus plantarum; 4. NRRL B-4527 Lactobacillus brevis; 5. NRRL B-548 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 6. NRRL B Lactobacillus acidophilus; 7. NRRL B-4560 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 8. NRRL B-1922 Lactobacillus casei subsp. casei; 9. CHI Lactobacillus casei; 10. NRRL B-442 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus; 11. NRRL B-1821 Lactococcus lactis subsp. lactis; 12. NRRL B-1837 Lactobacillus buchneri; 13. NRRL B-634 Lactococcus lactis subsp. cremoris; 14. NRRL B-2354 Enterococcus faecium; 15. CECT 184 Enterococcus faecalis; 16. CECT 970 Enterococcus gallinarum; 17. NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus; 18. NRRL B-3471 Weissella paramesenteroides; 19. NRRL B-3468 Leuconostoc lactis; 20. NRRL B-3252 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides; 21. NRRL B-512F Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides; 22. CECT 4777 Pediococcus inopinatus; 23. CECT 813 Pediococcus parvulus; 24. NRRL B-1117 Pediococcus acidilactici; 25. NRRL B Pediococcus acidilactici; 26. NRRL B-1146 Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum; 27. CECT 4695 Pediococcus pentosaceus 28. 1kb DNA ladder Gene Ruler

138 bp ekil Referans Su lar n 16S rrna Gen Bölgelerinin Taq 1 Restriksiyon Profilleri bp DNA ladder Gene Ruler ; 2. DSM 1954 Lactobacillus plantarum; 3. NRRL B Lactobacillus plantarum; 4. NRRL B-4527 Lactobacillus brevis; 5. NRRL B-548 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 6. NRRL B Lactobacillus acidophilus; 7. NRRL B-4560 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 8. NRRL B-1922 Lactobacillus casei subsp. casei; 9. CHI Lactobacillus casei; 10. NRRL B-442 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus; 11. NRRL B-1821 Lactococcus lactis subsp. lactis; 12. NRRL B-1837 Lactobacillus buchneri; 13. NRRL B-634 Lactococcus lactis subsp. cremoris; 14. NRRL B-2354 Enterococcus faecium; 15. CECT 184 Enterococcus faecalis; 16. CECT 970 Enterococcus gallinarum; 17. NRRL B-3502 Enterococcus casseliflavus; 18. NRRL B-3471 Weissella paramesenteroides; 19. NRRL B-3468 Leuconostoc lactis; 20. NRRL B-3252 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides; 21. NRRL B-512F Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides; 22. CECT 813 Pediococcus parvulus; 23. NRRL B-1117 Pediococcus acidilactici; 24. NRRL B Pediococcus acidilactici; 25. NRRL B-1146 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum; 26. CECT 4695 Pediococcus pentosaceus 27. 1kb DNA ladder Gene Ruler

139 ekil Laktobasil izolatlar,v1kl12 ve Referans Su lar n 16S rrna gen bölgelerinin Hae III Kesim Ürünlerinin Dendrogram 115

140 S rdna Dizi Analizi Üç identifikasyon yöntemiyle de tam olarak tan mlanamayan veya üç yöntemde farkl sonuçlar veren izolatlardan 15 tanesi seçilerek bunlar n 16S rdna bölgelerinin tamam n n çift yönlü dizi analizi yap lm t r. Bakterilere ait diziler ve BLAST analizi sonuçlar Ek 7 de görülmektedir. Buna göre PCR/RFLP 16S rrna-its yöntemi ile tan mlanamayan R6KL5, RKS12, V8KL10 izolatlar %97 Lactobacillus plantarum olarak tan mlanm lard r. API test kitleri ile Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tan mlanan V7KL4 ve M8KL2 izolatlar n n s ras yla Lactobacillus paracasei (%98) ve Enterococcus faecium (%95) olduklar belirlenmi tir. Biyokimyasal testlerde sadece Pediococcus türü oldu u belirlenebilen, genotipik identifikasyonda ise laktobasillere benzer jel görüntüsü veren V1KL12, %95 Pediococcus parvulus olarak tan mlanm t r. Benzer ekilde Randazzo et al. (2004), fenotipik yötemle Enterococcus türü olarak tan mlad klar izolatlar n genotipik tan mlamada Lactobacillus spp. ne benzeyen jel görüntüleri verdiklerini ancak 16S rdna dizi analizi uyguland zaman bunlar n enterokok olarak tan mland klar n bildirmi lerdir. R2KL10, R1KLx3, V4KL9 ve VKS10 izolatlar n n %96-%98 Lb. brevis, V8KL9 ile R1KL6 izolatlar n n ise %96 Lb. paracasei olduklar tespit edilmi tir. Klasik yöntemde enterokok, API de % 60 olas l kla Lactococcus lactis subsp lactis oldu u belirlenen ve genotipik identifikasyonda, farkl bir jel görüntüsü verdi i için tan mlanamayan MKS5 izolat %93 Enterococcus durans olarak tan mlanm t r. Genotipik identifikasyonda, iki restriksiyon enzimi ile farkl sonuç veren SF3KL4 ve SFKSx1 izolatlar n n ise %93-%96 Enterococcus faecium olduklar belirlenmi tir.

141 117 Tüm identifikasyon sonuçlar incelendi inde, peynir örneklerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin genel olarak Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei / Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis olduklar görülmektedir. Oran olarak bakt m zda izolatlar n büyük bölümünü enterokoklar olu turmaktad r. Laktokoklar, peynir üretiminde asitlik art ve p ht olu umunda rol oynad klar için genel olarak olgunla man n ilk dönemlerinde say lar yüksektir. Olgunla man n ileri dönemlerinde say lar giderek azalmakta, enterokoklar ve laktobasiller dominant flora haline gelmektedirler (López- Díaz et al., 2000). Mavi küflü peynir olan Valdeon peynirinin, olgunla ma döneminin ba lang c ndan sonuna kadar laktik asit bakteri floras n inceleyen López- Díaz et al. (2000), olgunla man n ba lang c nda laktokok ve enterokoklar n dominant oldu unu, az say da laktobasil ve leukonostoklar n da bulundu unu, fakat ilerleyen dönemlerde enterokoklar ile laktobasiller ve leukonostoklar n (enterokoklara göre daha az) dominant hale geldi ini, laktokoklar n ise belirgin ekilde azalarak ortadan kalkt klar n bildirmi lerdir. Çal mam zda bakterilerin büyük ço unlu u Konya Küflü peynirinden izole edilmi lerdi. Daha önce de belirtildi i gibi küflü peynir için üretilen peynirler so uk hava deposunda gün bekletildikten sonra küflendirilmeye ba lamaktad r. Küflendirme süresini ve sat a kadar geçen süreyi hesaba katt m zda toplad m z peynir örnekleri, üretiminin üzerinden en az iki-üç ay geçmi peynirlerdi. Bu da izolatlar n ço unun enterokok, geriye kalanlar n n da mezofil laktobasil olu unun ve laktokoklara rastlanmamas n n sebebini izah etmektedir Küflerin zolasyonu ve Genus Düzeyinde dentifikasyonu Genus düzeyinde tan mlama sonucunda, peynir örneklerinden izole edilen toplam 27 adet küf izolat n n tamam n n Penicillium genusuna ait küf

142 118 türleri oldu u belirlenmi tir. Resim 4.2 de bu küflerden baz lar n n Malt Extract Agar üzerindeki geli imi görülmektedir. Resim 4.2. Küflü Peynirlerden zole Edilen Küflerden Baz lar n n Malt Extract Agar Üzerinde Geli imi Yap lan ara t rmalarda, peynirlerde en fazla bulunan küflerin Penicillium türleri oldu u bildirilmektedir. Nitekim Bullerman and Olivigni (1974), Cheddar peynirinden izole ettikleri 349 adet küf izolat n n %82.2 sinin, Bullerman (1976), sviçre peynirlerinden izole etti i toplam 183 küf izolat n n %87 sinin, Lund et al. (1995) ise de i ik peynirlerden izole ettikleri 371 küf izolat n n %91 inin Penicillium türleri oldu unu bildirmi lerdir. Erdo an vd. (2002) ise Erzurum bölgesindeki marketlerden toplad klar mavi küflü tulum peynirlerinden izole ettikleri 16 adet küfün 12 sinin Penicillium roqueforti oldu unu tespit etmi lerdir. Aran vd. (1986), inceledikleri 11 adet küflü peynir örne inde hakim floray Penicillium

143 119 türlerinin olu turdu unu, bu türler içinde de Penicillium roqueforti nin predominant oldu unu belirlemi lerdir. Görüldü ü gibi elde etti imiz bulgular bu ara t rmac lar n bulgular yla k smen benzerlik göstermektedir. Çünkü bu ara t rmac lar Penicillium türlerinin yan s ra di er genuslara ait türlere, hatta toksijenik Aspergillus türlerine rastlad klar n da bildirmi lerdir. Bullerman and Olivigni (1974), elde ettileri izolatlar n %6.6 s n n Aspergillus, %1.1 inin de Fusarium genusuna ait türler oldu unu belirlerken, Bullerman (1976), 183 küf izolat n n %13 ünün farkl genuslara ait küf türleri oldu unu, bunlar aras nda 1 tane de toksin üretebilen A. flavus bulundu unu bildirmi tir. Aran vd. (1986), küflü peynirlerden izole ettikleri 24 tane izolat n 3 tanesinin Aspergillus oldu unu, bunlar n 2 tanesinin de A. flavus oldu unu belirlemi lerdir. Erdo an vd. (2002) ise 16 izolat n 4 ünü Geotricum candidum olarak tan mlam lard r. Oysa ki çal mam zda ne Aspergillus genusuna ne de ba ka bir genusa ait herhangi bir küf türüne rastlanmam t r. Ayr ca Aspergillus Differentiation Agar a (Fluka 17121) yap lan ekimlerin sonucunda da toksin üreten Aspergillus türleri tespit edilmemi tir. Benzer ekilde, Erdo an vd.(2000), Çoksöyler ve Kö ker (1980) e atfen, Isparta, Konya ve Mersin den toplanan 4 adet küflü Tulum peynirinden izole edilen 12 küf izolat n n hepsinin P. roqueforti oldu unu, A. flavus ve A. parasiticus izole edilemedi ini bildirmi lerdir. Aran (1993), da Tulum ve Civil peynirlerinden A. flavus ve A. parasiticus izole edemedi ini ifade etmi tir Laktik asit bakterilerinin Antifungal Aktivitelerinin Belirlenmesi 179 adet laktik asit bakterisinin, aflatoksin üretme potansiyeline sahip Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un geli imi üzerine etkisi, ilk olarak, agar disk difüzyon metodu kullan larak incelenmi tir. Uygulanan bu

144 120 yönteme göre 179 tane izolat n tümü negatif sonuç vermi tir. nkübasyonun 24. saatinde baz izolatlar n diskleri etraf nda çok ince bir zon gözlenmesine ra men ikinci ve üçüncü günde bu zonun tamamen kayboldu u ve hatta izolatlar n ço una ait disklerin üzerinin bile tamamen küf sporlar yla kapland gözlenmi tir. Buna benzer bir durumu, çe itli g dalardan izole etti i laktik asit bakterilerinin Aspergillus türleri üzerine etkisini inceleyen Baylas (2002) da bildirmi itir. Sonuç böyle olmakla birlikte baz izolatlar n disklerinin üzerinin 7 günlük inkübasyon sonunda bile küf sporu ile kaplanmad dikkati çekmi tir. Böyle özellik gösteren izolatlar seçilerek bunlarda, konuyla ilgili son literatürlerde s kça rastlanan di er bir metot, overlay metodu uygulanm t r. Overlay metodunda ilk önce MRS agar kullan lm t r. Resim 4.3 de baz izolatlar n MRS agarda geli tirildikleri zaman A. flavus ve A. parasiticus un geli imine etkileri görülmektedir. Laktobasillerin ço unun küf geli imini farkl düzeylerde engelledi i gözlenmi tir. ncelenen enterokoklar n ise küf geli imini önlemedikleri ancak baz lar n n atipik küf geli imine neden olduklar ve spor olu umunu engelledikleri belirlenmi tir. (Resim 4.4) A B C Resim 4.3. Laktobasil zolatlar ndan Baz lar n n A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) Lactobacillus brevis Olarak Tan mlanm R1KLx3 zolat, (B),(C) Lactobacillus plantarum Olarak Tan mlanm V8KL10 ve V8KL8 zolatlar

145 121 A B Resim 4.4. Enterokok zolatlar n n Baz lar n n A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) Enterococcus faecium Olarak Tan mlanm SF1KL4 zolat, (B) Enterococcus durans Olarak Tan mlanm MKS5 ile SF1KL4 zolatlar Konu ile ilgili yap lan çal malarda, laktik bakterilerin antifungal etkilerinin, MRS agar n bile imindeki sodyum asetattan kaynakland bildirilmektedir (Stiles et al., 2002). MRS agarda gözlenen etkinin sodyum asetat n etkisiyle olup olmad n belirlemek amac yla ayn deneme bile iminden sodyum asetat ç kart lm MRS agar kullan larak da gerçekle tirilmi tir. Normal MRS agarda antifungal etkisi gözlenen baz izolatlar n, sodyum asetats z MRS de etkisinin ortadan kalkt belirlenmi tir. Baz lar n n etkisinin burada da devam etti i ancak biraz azald görülmü tür (Resim 4.5). A B Resim 4.5. Laktobasil zolatlar ndan Baz lar n n Sodyum Asetats z MRS Agar da A. flavus un Geli imine Etkileri (A) Lactobacillus brevis Olarak Tan mlanm V4KL9 izolat, (B) V8KL8 (Lactobacillus plantarum)

146 122 Resim 4.6. R1KLx3 zolat n n Sodyum Asetats z MRS Agar da Yay lm Kolonilerinin, A. flavus ve A. parasiticus un Geli imini Engellemesi. Genel olarak, sodyum asetats z MRS de, Lactobacillus plantarum lar n antifungal etkinliklerinin ortadan kalkt belirlenmi tir. Baz Lactobacillus brevis izolatlar n n ise, normal bile imli MRS deki kadar olmasa da antifungal etkinliklerinin devam etti i görülmü tür. Di er taraftan, do al g da bile imine yak n bir ortamda da ayn etkiyi gösterip göstermeyeceklerini incelemek amac yla kullan lan Milk agarda da, hemen hemen normal bile imli MRS agarda elde edilmi sonuçlara benzer sonuçlar al nm t r (Resim 4.7). Baz izolatlar n etkinli inin Milk agarda daha yüksek oldu u göze çarpm t r. Her üç besiyerinde meydana gelen küf inhibisyonlar n n derecelendirilmi ekli Çizelge 4.4 de verilmi tir. A B Resim 4.7. Baz Laktobasil zolatlar n n Milk Agar da, A. flavus ve A. parasiticus un Geli imine Etkileri (A) R1KLx3, (B) R2KL10 (Lactobacillus brevis)

147 123 Çizelge 4.4. Üç Farkl Besiyerinde, A. flavus ve A. parasiticus un Laktik Asit Bakterileri Taraf ndan nhibisyonu MRS Agar Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus NRRL 2999 Sodyum Sodyum Milk Milk Asetats z MRS Agar Asetats z Agar Agar MRS Agar MRS Agar R1KLx V8KL V8KL R2KL R2KL R2KL R2KL RKSx RKSx ND ND RKS V4KL R6KL R1KL6 + - ND + - ND R3KL3 + - ND + - ND MKS5 - ND ND - ND ND SF1KL4 - ND ND - ND ND ND: Belirlenmedi zon olu mamas + her bir bakteri çizgisinin, petri alan n n %0.1-3 ünde inhibisyon zonu olu turmas + + her bir bakteri çizgisinin, petri alan n n %3-8 inde inhibisyon zonu olu turmas her bir bakteri çizgisinin, petri alan n n %8 inden büyük bir inhibisyon zonu olu turmas. 4.9 Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M 1 e ve Aflatoksin B 1 e Etkisi 11 tanesi izole edip tan mlad m z, 1 tanesi de NRRL kültür koleksiyonundan temin edilen B-4495 Lactobacillus acidophilus olmak üzere, 5 farkl türe ait toplam 12 adet laktik asit bakterisinin aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye etkileri incelenmi tir. Çizelge 4.5 de, besiyerinde 24 saatlik inkübasyon sonucunda söz konusu bakterilerin, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye

148 124 etkileri ve dolay s yla toksinlerin geri kazan m oranlar (kontrol örne i ile kar la t rmal olarak) ile inkübasyon ba lang c ve sonunda ortamdaki canl bakteri say lar verilmi tir. ekil 4.19 da ise bakterilerin besiyerinden uzakla t rd klar AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 oranlar (% olarak) görülmektedir. Çizelge 4.5. Laktik Asit Bakterilerinin, 24 Saat nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye Etkileri Laktobasiller 24 saat inkübasyon sonunda ortamdaki toksinin (1ng/ml) geri kazan m oran (%) AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 Laktik asit bakterilerinin say s (cfu/ml) nokülasyon 24. saat düzeyi MRS Kontrol R1KLx x x10 8 R2KL x10 6 s RKSx x x10 8 R1KL x x10 8 R3KL x10 5 s R6KL x10 5 s RKS x10 6 s V8KL x x10 9 NRRL B- 4495* x10 6 s Enterokoklar M17 Kontrol SF4KL x x10 9 SFKSx x x10 9 M3KL x10 6 s s: say m yap lmad. *NRRL kültür koleksiyonundan temin edilen Lactobacillus acidophilus

149 125 Besiyerindeki AFB1, AFB2, AFG1, AFG2'yi Azaltma Oran (%) AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 0 R1KLx3 R2KL10 RKSx1 R1KL6 R3KL3 R6KL5 RKS11 V8KL10 B-4495 SFKSx1 ekil Laktik Asit Bakterilerinin Ortamdan Uzakla t rd klar AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 Oranlar (%) MRS Kontrol örne inde AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 nin geri kazan mlar s ras yla %88.6, %90.1, %86.3, %84.9 olarak belirlenirken M17 Kontrol örne inde %86.7, %85.8, %72.8, %73.4 olarak belirlenmi tir. AFB 1 geri kazan mlar, laktobasillerin etkisinin incelendi i örneklerde %77.4 ile %93.9, enterokoklar n etkisinin incelendi i örneklerde ise %86.4 ile %94.1 aras nda de i iklik göstermi tir. Bu sonuçlar kontrol örnekleri ile k yasland nda, laktobasillerin ortamdaki AFB 1 i %0.5 ile %11.2 aras nda de i en oranlarda azaltt klar, en etkili izolat n %11.2 lik azaltma oran ile V8KL10 oldu u görülmü tür. Bu izolat Lactobacillus plantarum olarak tan mlanm t. Lactobacillus brevis olarak tan mlanan R1KLx3 ve RKSx1 izolatlar n n s ras yla %7 ve %8, Lactobacillus paracasei olarak tan mlanan R1KL6 izolat n n %7, Lb. plantarum olarak tan mlanan R6KL5 izolat n n %0.5 ve NRRL B-4495 Lb. acidophilus un ise %1.2 oran nda AFB 1 i azaltt klar belirlenmi tir. Ancak sonuçlardan da görüldü ü gibi denenen laktobasil türlerinin aflatoksin B 1 e etkileri yok denecek kadar dü ük

150 126 düzeydedir. Di er taraftan, s ras yla Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei ve Lb. plantarum olarak tan mlanan R2KL10, R3KL3, RKS11 izolatlar ile Enterococcus faecium olarak tan mlanan SF4KL2 ve M3KL1 izolatlar n n etkisinin incelendi i örneklerde, AFB 1 geri kazan mlar n n, kontrol örneklerine göre yüksek oldu u tespit edilmi tir. R2KL10 ve R3KL3 hariç, söz konusu izolatlar için benzer durum, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 ye olan etkilerinde de gözlenmi tir. Laktobasillerin AFB 2 yi %1 ile %7.2, AFG 1 i %6 ile %12.7 ve AFG 2 yi %2.5 ile %10.8 aras nda de i en oranlarda azaltt klar tespit edilmi tir. Ve burada da yine en yüksek azaltma oranlar na V8KL10 un sahip oldu u görülmü tür. Bununla birlikte, genel olarak elde edilen azaltma oranlar na bak ld nda, V8KL10 da dahil denenen tüm bakterilerin AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 ye etkileri de önemsiz düzeydedir. Laktik asit bakterilerinin küf geli imi ve toksin olu umuna etkisinin incelendi i Bölüm 4.10 da, küflerin canl bakterilerle birlikte geli tirildi i ortamlarda, inkübasyonun üçüncü gününde ortamdaki aflatoksin B 1 miktarlar oldukça dü ük düzeylerde tespit edilmi tir. Böyle bir sonuç, olu an toksin üzerinde bakterilerin etkinli inin olup olmad n n belirlenmesi gerekti i dü üncesini akla getirmi tir. Buradan yola ç k larak, R1KLx3, R2KL10, R1KL6, V8KL10, SFKSx1 ve bunlar n kar m ndan olu an Kar k Kültür ün 3 günlük inkübasyon süresince LTB besiyerindeki aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 ye etkileri de incelenmi tir. Çizelge 4.6 da görüldü ü gibi LTB kontrol örne inde AFB 1 in geri kazan m oran %84.8 olarak belirlenirken, R1KL6 ile Kar k kültür hariç bütün örneklerdeki AFB 1 geri kazan m bu de erden yüksek belirlenmi tir. Ayn durum AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 geri kazan mlar nda da gözlenmi tir. Sadece R1KL6 örne inde AFB 2 geri kazan m kontrole göre dü ük ç km t r.

151 127 Çizelge 4.6. Laktik Asit Bakterilerinin, 3 günlük nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 ye Etkileri Laktobasille r 3 günlük inkübasyon sonunda ortamdaki toksinin (1 ng/ml) geri kazan m oran (%) AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 Laktik asit bakterilerinin say s (cfu/ml) nokülasyon düzeyi 3.gün LTB Kontrol R1KLx x x10 6 R2KL x x10 6 R1KL x x10 7 V8KL x x10 6 SFKSx x x10 8 Kar k Kültür Laktobasil 6.80x x10 8 Enterokok 4.40x x10 8 RKSx1 ve NRRL B-4495 Lactobacillus acidophilus hariç, AFB 1, AFB 2, AFG 1 ve AFG 2 ye etkisi incelenen tüm bakterilerin, AFM 1 e etkileri de incelenmi tir. Burada, s v besiyerinin yan s ra baz bakteriler için PBS ortam kullan larak da deneme gerçekle tirilmi tir. Çizelge 4.7 de, 24 saat sonunda örneklerdeki AFM 1 in geri kazan m ile deneme süresince ortamdaki canl bakteri say lar, ekil 4.20 de de bakterilerin AFM 1 i azaltma oranlar verilmi tir.

152 128 Çizelge 4.7. Laktik Asit Bakterilerinin, 24 Saat nkübasyon Sonunda Ortamdaki Aflatoksin M 1 e Etkileri ile nkübasyon Ba lang c ve Sonundaki Canl Bakteri Say lar 24 saat inkübasyon sonunda ortamdaki toksinin (4 ng/ml) geri kazan m oran (%) Laktik asit bakterilerinin say s (cfu/ml) Laktobasiller AFM 1 nokülasyon düzeyi 24.saat MRS Kontrol R1KLx x x10 8 R2KL x x10 8 R1KL x x10 8 R3KL x x10 8 R6KL x x10 8 RKS x x10 9 V8KL x x10 9 Enterokoklar M17 Kontrol SF4KL x x10 9 SFKSx x x10 9 M3KL x x10 8 PBS Denemesi Pelletteki canl bakteri say s (cfu/ml) PBS Kontrol R1KLx x10 8 V8KL x10 9 R1KL x10 8 R3KL x AFM1 Besiyerindeki AFM1'i Azaltma Oran (%) R1KLx3 R2KL10 R1KL6 R3KL3 R6KL5 RKS11 V8KL10 SF4KL2 SFKSx1 M3KL1 ekil Laktik Asit Bakterilerinin Ortamdan Uzakla t rd klar AFM 1 Oranlar (%)

153 129 MRS kontrol örne inde AFM 1 geri kazan m %97.4, M17 kontrol örne inde %97 olarak tespit edilmi tir. Laktobasil örneklerinde AFM 1 geri kazan m %88,1 ile %97.4 aras nda, enterokoklarda ise %96.9 ile %100 aras nda belirlenmi tir. Bu sonuçlara göre laktobasillerin besiyerindeki AFM 1 i azaltma oranlar %0 ile %9.3 aras nda hesaplanm t r. Di er taraftan, enterokoklarda, SF4KL2 hariç, geri kazan m n kontrol örne inden yüksek oldu u görülmü tür. SF4KL2 izolat n n ise %0.1 oran nda bir azaltma etkisi gösterdi i tespit edilmi tir. Bakterilerin gereksinim duyduklar besin maddelerinin olmad bir ortamda toksine etkilerini veya böyle bir ortamda toksini ba lay p ba lamad klar n görmek amac yla, R1KLx3, V8KL10, R1KL6 ve R3KL3 izolatlar n n bir de PBS ortam nda 24 saat inkübasyon sonunda AFM 1 i azaltma yetenekleri incelenmi tir. Bu deneme sonucunda PBS den toksinin geri kazan m %96.3 olarak tespit edilirken, R1KL6 hariç di er üç örnekte geri kazan m bu de erden yüksek bulunmu tur (Çizelge 4.7). Genel olarak sonuçlara bak ld nda denemeye al nan bakterilerin hiçbirinin AFM 1 e etkilerinin olmad sonucuna var lmaktad r. Gerek aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 ye gerekse aflatoksin M 1 e etkinin incelendi i bütün denemelerde, inkübasyon ba lang c nda ve sonundaki canl bakteri say lar da belirlenmi tir. nokülasyon s ras nda, inokulasyon düzeyi her ne kadar cfu/ml ye ayarlanmaya çal ld ysa da baz bakterilerin inkübasyon ba lang c ndaki say s n n 10 5 cfu/ml oldu u belirlenmi tir (Çizelge 4.5). Aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 ye etkileri incelenen bakterilerin inkübasyon ba lang c ndaki say lar 2x10 5 ile 1.66x10 7 cfu/ml düzeyinde belirlenmi tir. 24. saatte say m al nan örneklerde bakteri say lar n n cfu/ml düzeylerine ç kt gözlenmi tir. Benzer durum AFM 1 e etkinin incelendi i denemede de belirlenmi tir. nkübasyon ba lang c nda cfu/ml düzeyinde olan bakteri say lar 24. saatte cfu/ml düzeyine ç km t r. PBS de gerçekle tirilen denemede ise elde edilen pelletteki canl bakteri say lar 10 8 cfu/ml düzeyinde tespit edilmi tir. 3 günlük inkübasyon

154 130 süresinin toksine etkisinin ara t r ld denemede inkübasyon ba lang c nda 10 6 cfu/ml düzeyinde belirlenmi, 3. günde 10 6 ile 10 8 cfu/ml aras nda de i mi tir. Laktobasillerin aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 ye etkilerinin incelendi i denemede, bakterilerin ortamdaki toksini azaltma oranlar ile inkübasyon ba lang c ndaki say lar kar la t r ld nda aralar nda bir do ru orant oldu u göze çarpm t r. Ancak ne enterokoklar n kullan ld ayn denemede ne de daha sonraki denemelerin hiçbirinde böyle bir ili ki görülmemi tir. Laktik asit bakteri türlerinin aflatoksin B 1 ve M 1 e etkilerini belirlemek amac yla yap lm birçok ara t rma mevcuttur. Bu çal malarda farkl türler kullan lm ve farkl sonuçlar elde edilmi tir. Peltonen et al. (2000), Lactobacillus paracasei F19, Bifidobacterium lactis Bb-12, Lactobacillus salivarius LM2-118, Lactobacillus johnsonii LJ- 1 ve Lactobacillus crispatus un iki su unun aflatoksin B 1 i ba layabilme özelliklerini incelemi ler ve söz konusu bakterilerin aflatoksini ba lama kapasitelerinin % 5.8 ile % 31.3 aras nda de i ti ini belirlemi lerdir. Lb.johnsonii Lj-1 ve Lb. paracasei F19 un ise en iyi ba lay c lar olduklar n bildirmi lerdir. Peltonen et al. (2001), 12 laktobasil, 5 bifidobakter ve 3 laktokok türünü kulland klar di er bir çal mada, 37ºC de 24 saat inkübasyon sonunda, bakterilerin ortamdaki AFB 1 i %5.6 ile %59.7 aras nda de i en oranlarda ba lad klar n tespit etmi lerdir. Ara t rmac lar, en etkili su lar n 2 tane Lactobacillus amylovorus ve 1 tane Lactobacillus rhamnosus su u oldu unu, bunlar n AFB 1 in %50 den fazlas n ba lad klar n ifade etmi lerdir. Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus LC-705, Lactobacillus gasseri (ATCC 33323), Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus rhamnosus 1/3 ün AFM 1 i ba lama yetene ini inceleyen Pierides et al. (2000), PBS den AFM 1 i uzakla t rmada canl Lactobacillus rhamnosus GG ve Lactobacillus rhamnosus LC-705 su lar n n en iyi sonucu

155 131 verdiklerini tespit etmi lerdir. Lactobacillus rhamnosus GG su unun ortamdaki toksinin yakla k %50 sini, Lactobacillus rhamnosus LC-705 in ise yakla k % 45 ini uzakla t rd n bildirmi lerdir. Di er taraftan Lactobacillus acidophilus LA1, Lactobacillus rhamnosus 1/3 su lar n n ise toksinin sadece %18 kadar n ortamdan uzakla t rabildiklerini belirlemi lerdir. El-Nezami et al. (1998a), Lactobacillus rhamnosus GG ve Lactobacillus rhamnosus LC-705 su lar n n 24 saatlik inkübasyon sonunda s ras yla ortamdaki AFB 1 in %75.3 ve %76.1 ini uzakla t rd klar n ortaya koymu lard r. Lactobacillus rhamnosus GG, Bifidobacterium bifidum BGN4, Bifidobacterium sp. JO3, Bifidobacterium longum JR20 ve Bifidobacterium sp. CH4 ün AFB 1 i s ras yla %37±1, %46±4, %41±3, %37±3 ve %37±1 oranlar nda ba lad klar belirlenmi tir (Oatley et al., 2000) Sar mehmeto lu ve Küplülü (2004), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2 ve Streptococcus thermophilus ST-36 n n PBS deki AFM 1 i s ras yla %18.70 ve % düzeyinde ba lama yetene inde olduklar n tespit etmi lerdir. Ara t rmam zda elde etti imiz bulgular daha önce yap lan çal malarda elde edilen bulgulardan çok farkl ç km t r. Kullan lan bakterilerin toksinlere etkisi yok denecek kadar dü ük düzeylerde belirlenmi tir. Kulland m z laktik asit bakteri türleri, Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus paracasei hariç daha önceki çal malarda denenmemi türlerdi. Görüldü ü gibi konuyla ilgili yap lan ara t rmalarda, kullan lan bakteri türüne hatta su una göre de i en sonuçlar elde edilmi tir. Nitekim Pierides et al. (2000) ayn çal mada kulland klar Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus LC-705 nin en etkili türler oldu unu belirlerken, genetik olarak Lactobacillus rhamnosus GG ye oldukça benzeyen Lactobacillus rhamnosus 1/3 su unun en dü ük AFM 1 ba lama kapasiteli su oldu unu tespit etmi lerdir. Yine ayn çal mada, Lactobacillus acidophilus un AFM 1 i

156 132 ba lama yetene inin di er bakterilere göre oldukça dü ük oldu u, toksinin ancak %18 ini ba layabildi i belirlenmi tir. Çal mam zda inceledi imiz NRRL B-4495 Lb. acidophilus un ise ortamdaki AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 yi s ras yla %1.2, %4.1, %7.7 ve %7.1 oran nda azaltt görülmü tür. Di er taraftan, Peltonen et al. (2000), ortamdaki AFB 1 in %30 unu ba layan Lactobacillus paracasei F19 su unu en iyi ba lay c bakteri olarak belirlemi lerdir. Bizim kulland m z Lactobacillus paracasei izolatlar ndan R1KL6, 24 saat inkübasyon sonunda, MRS besiyerindeki AFB 1 in %7 sini, 3 günlük inkübasyon sonunda ise LTB besiyerinde %4.5 ini azaltm t r. Bakterinin AFM 1 e etkisine bakt m zda besiyeri ortam nda toksinin %0.3 ünü, PBS de %0.9 unu azaltm t r. Di er bir Lactobacillus paracasei izolat R3KL3 ün ise besiyerindeki AFM 1 i %4.7 oran nda azaltt tespit edilirken, AFB 1 e herhangi bir etkisi olmad hatta toksin geri kazan m n n o ortamlarda daha yüksek oldu u belirlenmi tir. Yap lan çal malarda bazen, kullan lan ortama ba l olarak da toksinin ba lanma miktar nda farkl l klar oldu u gözlenmi tir. Nitekim, canl Lactobacillus rhamnosus GG nin ya s z ve tam ya l sütte PBS dekine k yasla daha dü ük miktarda AFM 1 ba lad belirlenmi tir (Pierides et al., 2000). Bunun tam tersi Streptococcus thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2 nin PBS e göre sütte daha fazla miktarda AFM 1 ba lad klar saptanm t r (Sar mehmeto lu ve Küplülü, 2004). Sar mehmeto lu ve Küplülü, (2004) bu durumu AFM 1 in kazeine ba lanmas ile aç klam lard r. Çal mam zda baz ortamlarda kontrol örneklerine göre daha yüksek toksin geri kazan mlar elde edilmi tir. Bunu u ekilde aç klayabiliriz: ortamda toksin, muhtemelen ortam bile enlerinden birine ba lan p, immunoaffinite kolondan ekstraksiyon i lemi s ras nda kolonda tutunamamaktad r. Ancak bakterinin oldu u ortamda, besiyerinin bu bile eni bakteri taraf ndan kullan ld için toksin bununla herhangi bir ekilde ba olu turamamakta ve kolonda tutunarak ekstrakte edilebilmektedir.

157 Laktik Asit Bakterilerinin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus un Aflatoksin Üretimine Etkileri Ara t rmam z n bu a amas nda ilk olarak, canl laktik asit bakterilerinin küf ile bir arada geli tikleri zaman aflatoksin üretme yetene indeki küflerin yani A. flavus un ve A. parasiticus un geli imini ve toksin üretimini nas l etkiledi i incelenmi tir. Çal ma süresince kullan lan A. flavus ve A. parasiticus NRRL 2999 un daha çok AFB 1 ve dü ük miktarlarda da AFB 2 ürettikleri gözlenmi tir. Ne tek ba lar na geli tirildikleri ortamlarda (Kontrol örnekleri) ne de di er ortamlarda; laktik asit bakterileri ile birlikte, AFG 1 ve AFG 2 ye rastlanmam t r. 1. Deneme modelinde, A. flavus ve A. parasiticus NRRL 2999, 37ºC de 24 saat inkübe edilmi canl laktik asit bakterilerinin bulundu u LTB s v besiyerine inokule edilmi lerdir. Bu denemede ayr ca, sadece A. flavus, 24 saatlik R1KLx3 kültüründen elde edilmi supernatanta da inokule edilmi tir. Çizelge 4.8 de A. flavus un 14 gün boyunca söz konusu ortamlarda geli imi (misel a rl ) ve aflatoksin üretimi, ayr ca inkübasyon süresince ortamlardaki ph de i imleri görülmektedir. ekil 4.21 ve 4.22 de ise 14 gün boyunca ortamlarda AFB 1 ve AFB 2 miktar ndaki de i imler verilmi tir.

158 134 Çizelge 4.8. A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi Gün R1KLx3 R1KLx3 Supernat. R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol Ortalama a AFB b (ng/ml) c Ort b f a e c d a AFB b (ng/ml) c Ort e b c f a d a ph b c Ort c 6.33 d 5.42 c 5.27 b 5.07 a 6.78 e a Misel b kuru a (g) c Ort a e c f b d a,b,c,d,e,f: Ayn sat r ve sütundaki farkl harflerle gösterilen de erler p<0.05 düzeyinde birbirinden farkl d r Gün 7. Gün 14. Gün AFB1 ng/ml R1KLx3 R1KLx3 sup R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 1 Miktar nda Saptanan De i imler Çizelge 4.8 de ve ekil 4.21 de görüldü ü gibi, 14 gün inkübasyon süresince kontrol örne i hariç bütün örneklerde AFB 1 üretiminde düzenli bir

159 135 art olmu tur. Kontrol örne inde ise 7. güne kadar artm, 14. günde dü mü tür. A. flavus un laktik asit bakterileriyle birlikte geli tirildi i tüm örneklerde ve supernatantta, inkübasyonun 3. gününde kontrole k yasla oldukça dü ük AFB 1 miktarlar ölçülmü tür. 7. güne gelindi inde R1KLx3 supernatant ve V8KL10 örneklerinde ani bir art oldu u, bu örneklerde kontrol örne indekinden daha yüksek miktarda AFB 1 üretimi gerçekle ti i tespit edilmi tir. 7. günde de dü ük AFB 1 belirlenen R 1KLx3, R 2KL10 ve Kar k kültür örneklerinde 14. günde ani bir art oldu u, hatta kar k kültür örne inde tüm örnekler aras nda en yüksek de ere ula t gözlenmi tir. 14. günde 3. günün tersine en dü ük AFB 1 miktar kontrol örne inde tespit edilmi tir. 14 gün boyunca örneklerdeki AFB 1 miktar nda meydana gelen bu de i imler istatistiki aç dan da önemli bulunmu tur (p<0.05). 14 günlük inkübasyon sonunda örneklerin ortalama AFB 1 miktarlar n n ng/ml ile ng/ml aras nda de i ti i, en yüksek AFB 1 miktarlar n n R1KLx3 supernatant ve V8KL10 örneklerine ait oldu u belirlenmi tir. Yap lan varyans analizi sonucunda da örneklerin AFB 1 miktarlar aras ndaki fark önemli bulunmu tur (p<0.05) Gün 7. Gün 14. Gün AFB2 ng/ml R1KLx3 R1KLx3 sup R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 2 Miktar nda Saptanan De i imler

160 136 Örneklerde AFB 2 üretiminin oldukça dü ük miktarlarda oldu u fakat olu um seyrinin genel olarak AFB 1 ile benzerlik gösterdi i görülmü tür ( ekil 4.22). 14 günlük inkübasyon sonunda ortalama AFB 2 miktarlar n n ng/ml ile ng/ml aras nda de i ti i, en yüksek AFB 2 üretiminin R1KLx3 ve V8KL10 da oldu u belirlenmi tir. Yap lan varyans analizi sonucunda örneklerdeki AFB 2 miktarlar aras ndaki fark önemli bulunmu tur (p<0.05). 1,8 1,6 3. Gün 7. Gün 14. Gün 1,4 Misel Kuru A rl (g) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 R1KLx3 R1KLx3 sup R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl nda Saptanan De i imler Misel kuru a rl ile aflatoksin üretimi aras nda (özellikle AFB 1 ) paralellik oldu u, misel a rl n n art na ba l olarak aflatoksin miktar n n da artt gözlenmi tir. Kontrol örne i hariç di er tüm örneklerde 14 gün boyunca misel kuru a rl nda düzenli bir art oldu u tespit edilmi tir. Kontrol örne inde ise AFB 1 miktar ndaki duruma benzer ekilde 7. güne kadar artm 14. gün ise azalm t r. Kontrol örneklerinde 7. ve 14. günlerde spor olu umu gözlenirken canl bakterilerle birlikte ve supernatantta geli en küf misellerinin zar tabakas eklinde oldu u ve sporlanmad görülmü tür. 14 gün süresince misel kuru a rl klar ndaki art ile 14 gün inkübasyon sonunda örneklerin ortalama misel kuru a rl klar aras ndaki fark da yap lan istatistik analizler sonucunda önemli bulunmu tur (p<0.05).

161 137 Coallier-Ascah and Idziak (1985), Lactococcus lactis subsp. lactis in A. flavus un aflatoksin üretimine etkisini inceledikleri çal malar nda, A. flavus un tek ba na oldu u ortamlarda yani kontrol örneklerinde, aflatoksin üretiminin ilk 5 gün boyunca artt n, 15. günden sonra çok dü ük seviyelere indi ini belirlemi lerdir. Laktik asit bakterilerinin A. flavus un aflatoksin üretimine etkisinin ara t r ld di er bir çal mada da benzer ekilde kontrol örneklerinde aflatoksin miktar n n ilk 4 gün boyunca artt, 6. günde en yüksek seviyeye ula t ve inkübasyonun 14. gününde dü tü ü bildirilmi tir (Gourama and Bullerman, 1995a). Yousef and Marth (1981), aflatoksinlerin, küf misellerinin otolizi sonucu aç a ç kan hücre içi fungal enzimler taraf ndan parçaland n ileri sürmü lerdir (El-Gazzar et al. 1987). El-Gazzar et al. (1987) yine Doyle and Marth (1978; 1978; 1979) n yapt klar çal malara da at fta bulunarak, ara t rmac lar n, 5 ile 6.5 ph aral klar nda ve 28ºC de, 9 günlük küf misellerinin en yüksek miktarda aflatoksini parçalad n tespit ettiklerini bildirmi lerdir. Literatürde rastlanan bu bulgular, çal mam zda baz örneklerde ve kontrol örneklerinde 14. günlerde aflatoksin miktar ve misel a rl klar ndaki azal n sebebini aç klamaktad r. Denemenin ba lang c nda, A. flavus sporlar n n inokülasyonundan hemen önce R1KLx3, R1KLx3 supernatant, R2KL10, V8KL10 ve Kar k Kültür ün ph lar s ras yla 6.30, 6.30, 6.35, 4.65 ve 4.10 olarak ölçülmü tü. nkübasyonun 3. gününe gelindi inde R2KL10, V8KL10 ve Kar k Kültür ün ph lar n n s ras yla 4.60, 4.00 ve 4.00 e dü tü ü belirlenirken R1KLx3 ün 5.35 e, supernatant n ise 5.90 a dü tü ü tespit edilmi tir. 7. gün di er tüm örneklerin ph lar nda art gözlenirken Kar k kültürün ph s n n de i medi i, R1KLx3 ün ph s n n daha da dü tü ü görülmü tür. nkübasyonun ilk 3 gününde örneklerdeki küf geli imi ve aflatoksin üretiminin inhibisyonuna dü ük ph n n neden oldu u dü ünülse de R1KLx3 ün ve supernatant n ph larn n yüksek olmas bu örneklerde bunun böyle olmad n ortaya koymaktad r. Ancak Çizelge 4.8 deki aflatoksin

162 138 miktarlar, ph ve misel a rl klar dikkatli bir ekilde incelendi inde inhibisyonun tamamen rekabetten dolay olu tu u göze çarpmaktad r. Çünkü örneklerde, misel kuru a rl, ortam ph ve aflatoksin miktar ndaki art aras nda paralellik oldu u görülmektedir. lk önce bakteri ortama hakim olmakta daha sonra ise küf adaptasyon sa layarak ortama hakim duruma geçmektedir. Böylece küf geli imi ile birlikte ph artmakta ayr ca aflatoksin üretimi de artmaktad r. Bu durum R1KLx3 ve Kar k kültür örnekleri hariç di er örneklerde 7. günde olu maya ba larken bu iki örnekte 14. günde meydana gelmektedir. Buna göre, küf ile rekabeti en zay f olan, Lactobacillus plantarum olarak tan mlanm V8KL10 izolat d r. Di er taraftan, R1KLx3 supernatant ile R1KLx3 örne i kar la t r ld zaman da inhibisyonun sadece rekabetten kaynakland ortaya ç kmaktad r. Çünkü canl bakteri bulunan R1KLx3 ortam nda toksin miktar 14. günde artarken, supernatantta 7. günde ng/ml düzeyine ula m t r. Bu de er 7. günde belirlenen en yüksek AFB 1 miktar idi Gün 7. Gün 14. Gün 6 5 ph R1KLx3 R1KLx3 sup R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. flavus un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte, Tek Ba na ve Supernatantta Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki ph De i imleri

163 139 Coallier-Ascah and Idziak (1985), Lactococcus lactis subsp. lactis ile Aspergillus flavus aras ndaki interaksiyonun aflatoksin üretimine etkisini incelemi ler ve iki mikroorganizman n lablemco tryptone broth (LTB) daki kar k kültüründe aflatoksin üretiminin çok az oldu unu veya hiç gerçekle medi ini bulmu lard r. Ara t rmac lar ayr ca, aflatoksin üretiminin inhibisyonunda ph daki dü menin etkisinin olmad n bildirmi ler ve Lactococcus lactis subsp. lactis in, logaritmik ço alma safhas boyunca üretmi oldu u inhibitör madde veya maddelerin inhibisyondan sorumlu oldu unu ileri sürmü lerdir. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus ve Lactobacillus plantarum un her üçünün de, tek ba na ilave edildikleri ortamlarda küf geli imini durdurduklar n belirleyen Karunaratne et al. (1990), bu bakterilerin hücrelerinden ar nd r lm supernatant n, küf geli mini etkilemeksizin aflatoksin üretimini inhibe etti ini bildirmi lerdir. Buradan yola ç karak ara t rmac lar, küf geli iminin bakteriler taraf ndan inhibisyonunun ph ve mikroorganizmalar aras ndaki rekabetten kaynaklan yor olabilece ini fakat aflatoksin inhibisyonu için ayn eyin söylenemeyece ini belirtmi lerdir. Benzer ekilde Luchese et al. (1992) da Pediococcus ve Lactobacillus türlerine ait su lar n Aspergillus parasiticus un geli imini etkilemeksizin aflatoksin üretimini durdurdu unu tespit etmi lerdir. Gourama and Bullerman (1995a), Aspergillus flavus subsp. parasiticus üzerinde Lactobacillus türlerinin etkinli ini incelemi ler, kulland klar Lactobacillus tür kar m n n söz konusu küf su unun geli mesini durdurmadan aflatoksin üretmesini engellediklerini belirlemi lerdir. Görüldü ü gibi di er çal malardaki bulgular n tersine ara t rmam zda, sadece küfün canl bakterilerle birlikte geli tirildi i ortamlarda dü ük aflatoksin miktarlar tespit edilmi fakat supernatantlarda küf geli imi ve aflatoksin üretiminde (ilk 3 gün haricinde) herhangi bir inhibisyon

164 140 görülmemi tir. Bunun aksine supernatantlarda (2. denemede kar k kültür supernatant hariç) 14. güne kadar aflatoksin miktar n n artt belirlenmi tir. Çal mam zda canl laktik asit bakterilerinin ayr ca A. parasiticus NRRL 2999 a etkileri de incelenmi tir. Çizelge 4.9 da A. parasiticus NRRL 2999 un LTB s v besiyerinde, tek ba na ve canl laktik asit bakterileri ile birlikte 14 gün boyunca geli imi (misel a rl ) ve aflatoksin üretimi, ayr ca inkübasyon süresince ortamlardaki ph de i imleri görülmektedir. ekil 4.25 ve 4.26 da ise 14 gün boyunca ortamlarda AFB 1 ve AFB 2 miktar ndaki de i imler verilmi tir. Aspergillus parasiticus NRRL 2999 un genel olarak dü ük aflatoksin üretme yetene inde oldu u gözlenmi tir. Canl laktik asit bakterilerinin Aspergillus parasiticus NRRL 2999 un geli imi ve aflatoksin üretimine etkilerinin hemen hemen A. flavus a olan etkilerine benzer ekilde gerçekle ti i görülmü tür. Çizelge 4.9. A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi Gün R1KLx3 R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol Ortalama a AFB b (ng/ml) c Ort a b d c e a AFB b (ng/ml) c Ort a b d e c a ph b c Ort c 6.07 c 5.42 b 5.00 a 7.00 d a Misel b kuru a (g) c Ort b c e a d a,b,c,d,e: Ayn sat r ve sütundaki farkl harflerle gösterilen de erler p<0.05 düzeyinde birbirinden farkl d r.

165 141 nkübasyonun 3. ve 7. günlerinde tüm örneklerde kontrole göre oldukça dü ük düzeylerde AFB 1 tespit edilmi tir R1KLx3, R2KL10 ve Kar k Kültür örneklerinin 3. ve 7. günde belirlenen AFB 1 miktarlar aras nda çok fazla farkl l k görülmemi tir. 3. günde s ras yla ng/ml, ng/ml ve ng/ml, 7. günde ise s ras yla 1.253, ve ng/ml olarak tespit edilmi tir. V8KL10 örne inde 7. gün ani bir art oldu u, fakat bu miktar n kontrole k yasla yine oldukça dü ük seviyede oldu u belirlenmi tir. Ancak 14. günde tüm örneklerde AFB 1 miktar n n artt fakat sadece V8KL10 örne inde kontrolden fazla oldu u belirlenmi tir. Gourama and Bullerman (1995a), Lactobacillus plantarum olarak tan mlad klar LAB 251 izolat ile birlikte geli tirdikleri A. flavus un dü ük miktarda toksin üretimini, bakterinin olu turdu u dü ük ortam ph s nedeniyle küf geli iminin inhibisyonuna ba lam lard r. Ara t rmam zda V8KL10 izolat da Lb. plantarum olarak tan mlanm t r. 24. saatten itibaren V8KL10 oldukça dü ük ph olu turmu tur. 3. gün de oldukça dü ük ph tespit edilmi tir. Ayr ca bu dönemlerde gözlenen küf geli imi ve ölçülen aflatoksin miktarlar da oldukça dü ük bulunmu tur. Ancak küfün ortama hakim olmaya ba lad ve ph n n artt 7. günde, bu örnekte, küf geli imindeki art ile birlikte ani toksin miktar art görülmü tür. Buna göre Gourama and Bullerman (1995a) n n tespit etmi olduklar durum bizim örne imiz için de geçerlidir.

166 Gün 7. Gün 14. Gün 100 AFB1 ng/ml R1KLx3 R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 1 Miktar nda Saptanan De i imler Kontrol hariç, inkübasyonun 3. gününde örneklerin hiçbirinde AFB 2 tespit edilmemi tir. Kar k kültür de 7. günde de belirlenmezken 14. günde en yüksek miktar bu örnekte ölçülmü tür. V8KL10 örne inde inkübasyonun 7. gününde, AFB 1 üretimine benzer ekilde, AFB 2 üretiminde de ani bir art olmu tur. Kontrol örne i de dahil örneklerin tümünde 14 gün süresince art tespit edilmi tir. Ancak en dü ük AFB 2 miktarlar R1KLx3 örne inde görülmü tür. 14 günlük inkübasyon sonunda örneklerdeki ortalama AFB 2 miktarlar n n ng/ml ile ng/ml aras nda de i ti i belirlenmi tir.

167 Gün 7. Gün 14. Gün 4 AFB2 ng/ml R1KLx3 R2KL10 V8KL10 Kar k Kültür Kontrol ekil A. parasiticus NRRL 2999 un, Canl Laktik Asit Bakterileri ile Birlikte ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Ortamlardaki AFB 2 Miktar nda Saptanan De i imler 3. günde V8KL10 ve Kar k kültürün en dü ük ph lara sahip örnekler oldu u görülmü tür. 7. gün bu durum Kar k kültür örne inde ayn ekilde devam ederken, V8KL10 örne inin ph n n artt ve 4.85 e ula t göze çarpm t r. Bu bakteri için benzer durum A. flavus ile yap lan denemede de gözlenmi ti. Bu iki deneme için bakterilerin etkisini ayr ayr ele alacak olursak, Lactobacillus brevis olarak tan mlanm olan R1KLx3 ün bulundu u ortamlarda, inkübasyonun 7. gününe kadar dü ük AFB 1, AFB 2 miktarlar ve misel kuru a rl klar belirlenmi tir. 7. günlerde 3. güne göre daha dü ük ph lar ölçülmü tür. 14. güne gelindi inde bu örneklerde AFB 1 ve AFB 2 miktarlar nda ani art lar, ph ve misel a rl klar nda ise kontrole göre çok yüksek veya yak n de erler tespit edilmi tir. Lb. brevis olarak tan mlanm olan R2KL10 un bulundu u ortamlarda da hemen hemen ayn sonuçlar saptanm t r.

168 144 Lactobacillus plantarum olan V8KL10 un yer ald örneklerde, daha önce de belirtildi i gibi, sadece ph n n dü ük oldu u inkübasyonun 3. gününde dü ük aflatoksin miktarlar ve küf misel a rl klar belirlenmi tir. 7. günlerde ani art lar tespit edilmi tir. Kar k kültür 4 farkl türe ait 5 izolat n belli oranlarada kar t r lmas sonucu elde edilmi tir. Bu oranlar, peynirlerden izole edilen laktik asit bakterileri aras nda kapsad klar oranlara göre tespit edilmi tir. Kar k kültür kullan lmas n n amac, farkl türlere ait bakterilerin belli oranlarda birlikte bulunmalar durumunda nas l bir etki olu turacaklar n belirlemekti. Çünkü bilindi i gibi bakterilerin birbirleriyle etkile imleri, tek ba lar na olduklar durumdakine k yasla daha iyi geli melerini ve baz metabolitler olu turmalar n te vik etmektedir. Nitekim elde etti imiz sonuçlar da bunu ortaya koymu tur. Yap lan ön denemelerde, Enterococcus faecium olarak tan mlanm SFKSx1 izolat küf ile tek ba na geli tirildi i zaman, ortamlarda küf geli iminin dolay s yla misel kuru a rl n n 3. günden itibaren kontrole göre yüksek düzeylerde oldu u belirlenmi ti. Ayr ca 7. günden itibaren pelletlerde a r bir spor olu umu gözlenmi ti. nkübasyonun 3. günlerinde ortam ph n n gibi oldukça dü ük seviyelerde olmas na ra men 7. günlerde 6.7 civarlar na ula t 14. günlerde ise 7 nin üzerine ç karak kontrolden bile yüksek oldu u tespit edilmi ti. Ancak %50 si SFKSx1 izolat ndan olu an Kar k kültürün bulundu u ortamlarada, 3. ve 7. günlerde, ph lar n ve aflatoksin miktarlar n n ayr ca misel kuru a rl klar n n dü ük seviyelerde oldu u belirlenmi tir. 3. ve 7. günlerdeki ph lar n e it oldu u saptanm, 14. günlerde hem ph ve misel kuru a rl klar nda hem de aflatoksin miktarlar nda ani art ve yüksek de erler tespit edilmi tir. 1. denemede elde etti imiz tüm bulgular inhibisyonun rekabetten kaynakland n ortaya koysa da, küflerin R1KLx3 ile birlikte geli tirildi i ortamlarda, 6.30 ile 5.35 ph larda (inkübasyonun ilk günü ve 3. gün deki ph

169 145 de erleri) bile küfün geli imi ve toksin üretiminin dü ük düzeylerde olmas, inhibisyonun ba ka nedenlerden dolay gerçekle mi olabilece ini dü ündürmü tür. Ancak, bu izolattan elde edilen supernatantta ayn durumun gözlenmemesi, bakterinin ortama salg lad herhangi bir metaboliti olmad n da göstermi tir. Bu da, e er inhibisyonda rol oynayan ba ka bir faktör varsa, bunun, bakteri hücrelerinin varl nda ortamda bulunan bir metabolit veya inhibitör madde olabilece ini akla getirmi tir. Buradan yola ç k larak ikinci deneme modeli kurulmu tur. Bu denemede, R1KLx3 ün yan s ra Kar k kültür de kullan lm t r. A. flavus, canl bakterilerin bulundu u ortamlara, 63 C de 30 dak. s l i lemle öldürülmü bakterilerin bulundu u ortamlara, 3 günlük inkübasyon sonunda elde edilmi supernatanta ve iki farkl ekilde s l i lemle öldürülmü bakteri pelleti bulunan ortamlara inoküle edilmi tir. 3 günlük supernatant kullan lmas n n nedeni, 24 saat sonunda de il de inkübasyonun 2. veya 3. günlerinde supernatanta geçebilen bir metabolit olup olmad n belirlemekti. Çizelge 4.10 ve 4.11 de 14 gün inkübasyon süresince A. flavus un geli imi ve misel kuru a rl, aflatoksin üretimi ve inkübasyon süresince ortamdaki ph de i imleri görülmektedir. Canl bakterilerin kullan ld ortamlarda, daha önceki denemelerde elde edilen sonuçlara hemen hemen benzer sonuçlar elde edilmi tir. nkübasyonun 3. gününde, hem R1KLx3 supernatantta hem de Kar k kültür supernatantta, canl bakteri bulunan ortamlardakine yak n AFB 1 ve AFB 2 miktarlar tespit edilirken, bakterilerin ölü oldu u ortamlarda bu de erlerden biraz daha yüksek ölçülmü tür. Pellet 1 ve Pellet 2 ortamlar nda ise oldukça yüksek toksin miktarlar belirlenmi tir.

170 146 Çizelge A. flavus un, Canl Bakter, Ölü Bakteri Supernatant Ortamlar nda ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ve Ortamlardaki ph De i imi Gün R1KLx3 (Canl ) R1KLx3 (Supern) R1KLx3 (Ölü) Kar k Kültür (Canl ) Kar k Kültür (Supern) Kar k * Kültür (Ölü) Kontrol a AFB b (ng/ml) c Ort b f e c d a g a AFB c (ng/ml) b Ort b e g c d a f a ph b c Ort c 6.12 d 6.28 f 5.12 b 5.02 a 6.22 e 6.69 g a Misel b kuru c a (g) Ort b g a e c f d a,b,c,d,e,f,g: Ayn sat r ve sütundaki farkl harflerle gösterilen de erler p<0.05 düzeyinde birbirinden farkl d r. * tam olarak ölüm sa lanamam t r. 3 gün inkübe edilen kültürden elde edilen supernatant. nkübasyonun 7. gününde, 1KLx3 (ölü) örne inde, hem AFB 1 hem de AFB 2 miktar n n ani bir art gösterdi i, kontrol örne inden bile yüksek düzeylere ç kt tespit edilmi tir. Kar k kültür örne inde ise böyle bir durum söz konusu olmam t r. Bu örnekten yap lan ekimlerde canl laktik asit bakterisine rastlanmas bunun nedenini aç klamaktad r. 7. günde hem R1KLx3 ün hem de Kar k Kültür ün Pellet 1 örneklerinde kontrol örne inden yüksek miktarlarda AFB 1 miktarlar tespit edilmi tir. Kontrolden yüksek olmasa da Pellet 2 örnekleri ve supernatantlarda da yüksek AFB 1 miktarlar belirlenmi tir. 7. gün kontrol örne inden yüksek miktarda toksin belirlenmi olmas nedeniyle Pellet 1 örnekleri ile R1KLx3 (ölü) örne i 14. günde analize al nmam lard r. nkübasyonun 14. gününde, Kar k Kültür supernatant, R1KLx3 pellet 2 ve Kar k Kültür pellet 2 örnekleri hariç di er örneklerdeki Ort.

171 147 toksin miktar nda art görülürken, bu 3 örnekte 7. güne göre azalma oldu u belirlenmi tir. R1KLx3 canl, R1KLx3 supernatant ve Kar k Kültür pellet 2 örneklerinde 14. gün, kontrole göre daha yüksek AFB 1 miktar tespit edilmi tir. Çizelge A. flavus un, Is l lem Uygulanm Bakteri Pelleti çeren Ortamlarda Ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi Ve Ortamlardaki ph De i imi Gün R1KLx3 Pellet 1 R1KLx3 Pellet 2 Kar k Kültür Pellet 1 Kar k Kültür Pellet 2 Kontrol Ortalama a AFB c (ng/ml) b Ort c a d b e a AFB c (ng/ml) b Ort d a c b e a ph c b Ort b 6.85 c 6.46 a 6.67 b 6.69 b a Misel b kuru a (g) c Ort a c b e d a,b,c,d,e: Ayn sat r ve sütundaki farkl harflerle gösterilen de erler p<0.05 düzeyinde birbirinden farkl d r Pellet 1: Bakteri pelleti ilave edilmi ve 63 C de 30 dak. s l i lem uygulanm LTB besiyeri Pellet 2: Bakteri pelleti ilave edilmi ve 95 C de dak. s l i lem uygulanm LTB besiyeri. Coallier-Ascah and Idziak (1985), de 95ºC de 10 dak. s l i lem görmü Lactococcus lactis hücrelerini içeren LTB de A. flavus un geli imi ve aflatoksin üretiminin etkilenmedi ini, tam tersi, bakteri pelletinin A. flavus un geli imini stimule edici etki gösterdi ini bildirmi lerdir. Bakteri pelletleri ve ölü bakterilerin bulundu u ortamlarda elde etti imiz sonuçlar ara t rmac lar n bulgular yla benzerlik göstermektedir.

172 148 nkübasyonun 3. gününde, misel kuru a rl klar, canl, ölü ve supernatant örneklerinde kontrole k yasla dü ük, pellet örneklerinde ise hemen hemen kontrole yak n belirlenmi tir. Kar k kültür (ölü) ve kontrol örne i hariç tüm örneklerde 14 gün boyunca misel kuru a rl nda art olmu tur. Ancak 14. günde analize al nan tüm örneklerde kontrol örne inden yüksek misel kuru a rl klar tespit edilmi tir. Durum böyle olmakla birlikte, kontrol örneklerinde 7. ve 14. günlerde spor olu umu gözlenirken, canl bakterilerle birlikte ve supernatantta geli en küf misellerinin zar tabakas eklinde kald, sporlanmad görülmü tür. Resim 4.8, 4.9, 4.10 ve 4.11 de 14 gün boyunca söz konusu ortamlarda A. flavus un geli imi görülmektedir. Resim 4.8: nkübasyonun 3. Gününde S ras yla Kar k Kültür(Canl ), R1KLx3(Canl ) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi Resim 4.9: nkübasyonun 3. Gününde S ras yla R1KLx3(Canl ) ve R1KLx3(supernatant) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi

173 149 Resim 4.10: nkübasyonun 7. Gününde S ras yla R1KLx3(supernatant), R1KLx3(Canl ), Kar k Kültür(Canl ), Kar k Kültür(Supernatant) ve Kontrol Örneklerinde A. flavus un Geli imi Resim 4.11: nkübasyonun 14. Gününde S ras yla Kontrol, Kar k Kültür(Canl ), R1KLx3(Canl ), R1KLx3(supernatant) ve Kar k Kültür(Supernatant) Örneklerinde A. flavus un Geli imi Çizelge 4.10 ve 4.11 ile canl bakteri ortamlar nda 14 gün boyunca belirlenen laktik asit bakterilerinin say lar incelendi inde inhibisyonun rekabetten kaynakland bir kez daha ortaya ç kmaktad r. Çizelge 4.12 de görüldü ü gibi inkübasyonun 7. gününe kadar R1KLx3 örne inde bakteri say s art göstermi tir. 14. günde ise önemsiz düzeyde bir azalma meydana gelmi tir. Kar k kültür örne inde ise bakteri say s nda azalma oldu u fakat 7. günde bile 10 8 cfu/ml düzeyinin alt na dü medi i görülmü tür.

174 150 Çizelge Canl Örneklerin Bakteri Say lar n n 14 Gün Boyunca De i imi R1KLx3 (Canl ) Kar k Kültür (Canl ) Gün MRS Agar MRS Agar KEA 1* 2.00x x10 8 3x10 8 Laktik Asit Bakteri Say lar (cfu/ml) * Küf inoküle edildi i gün canl bakteri say s x x x x x x x x x10 7 Coallier-Ascah and Idziak (1985), Lactococcus lactis, besiyerine tek ba na inokule edildi i zaman say s n n 8 saat içinde 10 2 ve 10 7 cfu/ml den 10 9 cfu/ml ye ula t n, fakat A. flavus un 3 gün geli tirildi i ortamlara inokule edildi i zaman h zla azalarak, 8. ve 24. saatlerde s ras yla 10 cfu/ml ile 4x10 2 cfu/ml düzeylerine dü tü ünü bildirmi lerdir. Her ne kadar da bakteri pelletlerinin küfe etkisi olmad belirlendiyse de Çizelge 4.11 incelendi i zaman, inkübasyonun 3. gününde bu örneklerde, özellikle de Kar k Kültür de, kontrole göre daha dü ük toksin üretimi oldu u göze çarpm t r. 2. deneme modelinde pelletler, 100 ml LTB içine al nd ktan sonra s l i leme tabi tutulmu lard. Is l i lem s ras nda, istenen s cakl a gelinceye kadar geçen sürede, bakterilerin geli imi sonucu besiyerinin bile iminde meydana gelen de i im, gözlenen bu durumun sebebi olabilirdi. Bunu belirlemek için bir deneme daha yap lm t r. Haz rlama ekli biraz de i tirilerek Kar k Kültür den Pellet 2 ortam haz rlanm t r. Elde edilen pellet, deney tüpü içinde s l i lem uyguland ktan sonra, s v besiyeri içine bo alt lm t r. Bu denemede ayr ca, yine ayn ekilde haz rlanm pelletin MWCO-Molecular Weight Cutoff dalton olan diyaliz torbas içinde de etkisi incelenmi tir. Tablo 4.13 de bu denemenin sonuçlar görülmektedir.

175 151 Çizelge 4.13 A. flavus un, Is l lem Uygulanm Bakteri Pelleti, Pellet ile doldurulmu Diyaliz Torbas çeren Ortamlarda ve Tek Ba na Geli tirildi i 14 Gün Boyunca, Misel Kuru A rl, Aflatoksin Üretimi ile Ortamlardaki ph De i imi Gün Kar k Kültür Kar k Kültür Kontrol Pellet *** Diyaliz Torbas (A. flavus) Ortalama a AFB c (ng/ml) b Ort c a b a AFB c (ng/ml) b Ort c a b a ph b c Ort b 6.45 a 6.65 b a Misel b kuru a (g) c Ort c b a *** 95ºC de dak. s l i lem uygulanm t r. 95ºC de dak. s l i lem görmü pellet ile doldurulmu tur. Çizelge 4.13 de görüldü ü gibi inkübasyonun 3. gününden itibaren her iki örnekte de kontrol örne inden yüksek AFB 1, AFB 2 miktarlar ve misel kuru a rl klar belirlenmi tir. Elde edilen bu sonuçlar, bakteri pelletinin, küfün geli imini ve aflatoksin üretimini engellemek yerine daha çok te vik etti ini ortaya koymu tur. Bakterilerin besiyerinde gösterdikleri etkinin, peynir üretiminde kullan ld klar zaman da ayn ekilde gerçekle ip gerçekle meyece ini belirlemek için Kar k kültür diye adland rd m z ve 4 bakteri türünden olu an kültür kullan larak peynir üretilmi tir. Aspergillus flavus un geli imi ve toksin üretimi bu peynirlerde incelenmi tir. Aspergillus flavus sporlar ile inoküle edildikten sonra 23-24ºC de inkübasyona b rak lan peynirlerde inkübasyonun ilk 3 gününde geli me

176 152 gözlenmezken, 5. günde peynirlerin küf miselleriyle kapland ve spor olu umu meydana geldi i görülmü tür.(resim 4.12 A ve 4.12 B) (A) (B) Resim 4.12 (A) Küf nokülasyonundan Hemen Önce Peynir Örneklerinin Görünü ü (B) nkübasyonun 6.Gününde Peynir Örneklerinin Görünü ü Çizelge 4.14 ve 4.15 de, peynir örneklerinin, küflendirilmeden önce ve küflendirilmeye ba land kdan 6 gün sonra belirlenen kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri görülmektedir. Çizelge 4.14 de ayr ca küflü peynirlerin aflatoksin miktarlar da verilmi tir. Çizelge 4.14 ve 4.15 de görüldü ü gibi küflendirme sürecinde hem kontrol örne inin hem de kültürlü peynir örne inin ph de erlerinde dü me, titrasyon asitliklerinde ise art meydana gelmi tir. Kontrol örne inin laktobasil ve enterokok say lar artarken, kültürlü peynir örne inin laktobasil say lar nda önemli bir de i im olmam, enterokok say lar ise biraz azalm t r. Ancak küflendirme a amas n n 6. gününde her iki peynir örne inde de 10 8 cfu/g düzeyinde laktik asit bakterisi varl belirlenmi tir. ph daki azalmaya, asitlikteki art a ve yüksek laktik asit bakterisi varl na ra men, her iki peynir örne inde de yo un küf geli iminin yan s ra oldukça yüksek ve birbirine yak n de erlerde aflatoksin B 1 tespit edilmi tir. Yap lan 1 tekerrürde dü ük miktarda AFB 2 ve AFG 1 e de rastlanm t r.