POLtMERÎK PARTİKÜLLER ÎLE TRÎASETÎNÎN ENZÎMATIK HİDROLİZ HIZININ ARTIRILMASI

Transkript

1 POLtMERÎK PARTİKÜLLER ÎLE TRÎASETÎNÎN ENZÎMATIK HİDROLİZ HIZININ ARTIRILMASI Fatma KAYIRHAN, Serdâr S. ÇELEBİ ve Arif ÇAĞLAR* * Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Bey tepe, Ankara * Fırat Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Blaztğ INCREASE OF ENZYMATIC HYDROLYSIS RATE OF TRIACETIN WITH POLYMERIC PARTICLES SUMMARY The hydrolysis of triacetin (glycerol triacetate) by candidal lipase has been investigated in a recirculated column reactor contains polyethylene particles. The aim of this study is to increase the hydrolysis rate of triacetin by using polymer particles specially at the soluble triacetin concentrations at which the activity of lipase is very low. The effects of the circulation rate of the solution through the column on the reaction rate were defined in both cases with and without particles and the optimum flow rates were determined as 2 and 0.5 ml/min, respectively. In addition, the variation of the reaction rate with ph were investigated in the presence of polyethylene particles and the optimum activity was observed at ph of 6.0. On the other hand, the effects of the circulation period of the triacetin solution on the activity were examined and the required time for the completion of film formation by triacetin molecules on the surface of particles was found.15minutes before adding enzyme solution. The variation of reaction rate with triacetin concentration in both soluble and insoluble regions were investigated in the presence and also in the absence of polyethylene particles. The comparlsion of the results show that the polymer particles provide an increase of % on the hydrolysis rate of triacetin in the soluble region. Michaelis constants (Km ) for two cases with and without particles were determined as and M triacetin, respectively. On the hydrolysis of triacetin at the soluble concentrations by lipase; the increase ratios on the activity obtained in this study by using polyethylene particles are compatible with the enhancements provided by adding some non-polar organic solvents to the reaction medium and also by polymeric membrane system in the literature. ÖZET. Sirkûlasyonlu kolon tipi reaktörde, polietilen parti küllerin kullanılmasıyla Candida cylindracea Hpazı ile triasetln hidrolizi incelenmiştir. Özellikle lipaz aktivitesinin düşük olduğu çözünür konsantrasyonlarda triâsetin hidroliz hızını artırmaya yönelik bu araştırmada, referans çalışma olarak alman polietilen - partiküllerin bulunmadığı ve polimerik partiküllerin bulunduğu kolon sisteminde çözelti sirkülasyon hızının reaksiyon hızma etkisi ayri ayn incelenmiş ve optimum Teğetler saptanmıştır. Referans çalışmada eh yüksek reaksiyon hızı 0.5 ml/dak sirkülasyon hızında gözlenirken, polietilen partiküllerin bulunduğu sistemde 2 ml/dak'da gözlenmiştir. Ayrıca reaksiyon hızının ph İle değişimi partiküllü durumda incelenmiş ve optimum ph 6.0 olarak bulunmuştur., 325

2 Araştırmanın bir bölümünde enzim ilavesinden önce triasetin çözeltisinin poîietilen îi kolon sisteminde sirkülasyon süresinin reaksiyon hızına etkisi incelenmiş ve triasetin moleküllerinin hidrofobik partiküller yüzeyinde film oluşturması için gerekli süre 15 dakika olarak belirlenmiştir. Referans ve polietilen partiküller içeren çalışmalarda triasetin konsantrasyonu ile reaksiyon hızı değişimi çözünür ve çözünmez (emülsiyon) bölgelerde incelenmiş, çözünür bölgede partikül kullanımıyla reaksiyon hızında sağlanan artış oranlan % olarak bulunmuştur. Triasetinin çözünür olduğu konsantrasyonlarda, polietilen partiküllü ve partikülsüz durumlarda Michaelis sabitleri sırasıyla M ve M triasetin olarak saptanmıştır. Sonuç olarak, sulu ortamda triasetinin çözünür konsantrasyonlarda lipaz enzimiyle hidrolizinde,, polietilen partiküllerin kullanılmasıyla sağlanan reaksiyon hızı artış oranları, literatürde ortama suyla karışmayan organik çözücülerin eklenmesiyle ve poîim erik membran sistemlerinin kullanılmasıyla elde edilen artış oranlarıyla karşılaştırılabilir dü zeyd edir., GİRİŞ Lipazlar, hidrofobik arayüzeylerde adsorpsiyonla aktif yapı kazandıklarından, yağ-sü emülsiyon sistemlerinde yüksek reaksiyon hızı (aktıvite) verirler. Ancak, triasetînin lipazla hidrolizinde olduğu gibi basit yağîann suda çözünen konsantrasyonlarında düşük aktivite gözlenmektedir. Bu substratm suda Çözünür konsantrasyonlarında, lipaz enziminin aktivıtesini arttırmaya yönelik Önceki çalışmalarda, ortama suyla karışmayan organik çözücüler eklenerek emülsiyon sistemleri oluşturulmuş ve aktivite artışları sağlanmıştır [ 1]. Bu çalışmada ise triasetinin çözünür konsantrasyonlarında özellikle kritik misel konsantrasyonunun (CMC) altmda Candida cylindracea lipazı ile hidrolizinde, hidrofobik karakterli polietilen partiküller kullanılarak, partikül yüzeyinde yağ-su arayüzeyi oluşumuyla aktivite artışı amaçlanmıştır. DENELBÖLÜM Denev Sistemi: Ön çalışmalar sonucu triasetinde çözünmemesi ve yüksek aktivite sağlaması nedeniyle polietilen partiküller model polimer olarak seçilmiştir. Lipaz ve triasetin içeren sulu reaksiyon ortamı bir peristaltik pompa yardımıyla rezervuardan alınarak poîimerik partiküllerin bulunduğu paslanmaz çelik kolondan (D= 0.7 cm; L= 11.2 cm) sirküle edilir- Rezervuar ve kolon sistemi sabit sıcaklık banyosu içindedir. Reaksiyon, ph-metre, ph-kontrol ünitesi ve peristaltik pompadan oluşan ph-stat sistemi ile izlenir. Reaksiyon sırasında yağ asıti oluşumu ortam ph im düşürür. Bu nedenle ph kontrolünün yapıldığı rezervuara, oluşan asetik asite eşdeğer miktarda NaOH çözeltisi otomatik olarak eklenir. Zamana karşı alınan NaOH çözeltisi miktarları reaksiyon hızının saptanmasında kullanılır. -Substrat Çözeltisi: Reaksiyon ortamı değişik konsantrasyonlarda ( % , v/v) triasetin (Merck, % 99, Almanya) içerir. Sulu çözeltide ayrıca M NaCl, 3.75 x 10 3 M CaCİ2-4 H2O ve 2.5 x 10'^ M sodyum asetat bulunmaktadır. Enzim Çözeltisi: % 21.5 protein (w/w) içeren Candida cylindracea lipazı (Meito Sangyo, Japonya) ph ı 6 olan 0.01 M fosfat tamponunda 3 mg protein/l olacak şekilde çözülür. 326

3 SONUÇLAR VE TARTIŞMA Polietilen partiküller içeren geri döngülü kolon tipi reaktör ile hidroliz hızını artırm aya yönelik çalışm alarda; triasetinin polimerik partiküller yüzeyindeki adsorpsiyonu (film oluşumu) dikkate alınarak deneyin başlatılm asında iki farklı yöntem kullanılm ıştır. B irinci yöntemde, enzim ve triasetin reaksiyon ortam ına aynı anda ilave edilm iş ve daha sonra sirkülasyon başlatılm ıştır. İkinci yöntemde ise, önce triasetin çözeltisi 3 dakika kolondan sirküle edilmiş ve daha sonra rezervuar çözeltisine lipaz ilave edilerek reaksiyon başlatılmıştır. Bu deneylerde, birinci yöntemde polimer içerm eyen referans deneyine göre hidroliz hızm da % 99.7 lik bir artış gözlenirken ikinci yöntemde % 165'lik bir artış saptanm ıştır. Bu nedenle triasetin çözeltisinin kolondan sirkülasyon süresi ile rea k siyon h ızın d a k i d eğişim i in celen m iştir. Şekil l*de görüldüğü gibi sirkülasyon süresinin artm ası ile reaksiyon hızı artm akta, yaklaşık 15 d a k ik a lık sirkülasyon süresinden sonra sabit kalm aktadır. Ö te yandan polietilen partiküllerin yüzeyinde triasetin film tabakasının oluşumu, kolondan triasetin çözeltisi geçirilerek test edilm iş ve 15 dakikada triasetinin yüzeye adsorpsiyonunun tam am landığı an alitik olarak belirlenm iştir. Bu ik i sonuç b irb irin i d estekler n ite lik te olup lip a z' ak tivitesi için yağ-su arayü zeyi oluşumunun önemini gösterm ektedir. Triaaelin Sirkülasyon Süresi (dak) Şekil 1. Triasetin çözeltisinin kolondan sirkülasyon süresinin reaksiyon hızına etkisi (triasetin konsantrasyonu % 0,25 (v/v); enzim konsantrasyonu: 20 mg/1; karıştırm a hızı: 500 rpm; sirkülasyon. hızı: 0.5 ml/dak; ph: 6; T: 35 C; toplam çözelti hacmi: 100 mi). Ç özelti Sirkülasyon H ızın ın Reaksiyon H ızına Etkisi: Sirkülasyonlu kolon tip i reaktörde, p olietilen p a rtik ü llerin bulunm adığı referans çalışm alarda, sirk ü la s y o n h ız ın ın a rtm a s ıy la re a k s iy o n h ızın d a h a fif b ir a za lm a g ö zle n m e k te d ir. A k ış h ız ın ın a r tış ıy la kolon iç e ris in d e ve b a ğ la n tı borularındaki kaym a kuvvetleri artm akta, bu durum azda olsa enzimin aktivite kaybına yol açm aktadır. P olietilen li kolon sisteminde ise sirkülasyon hızı iig reaksiyon hızında artış görülm ekte, 2 ml/dak'dan sonra reaksiyon hızı sabit k a lm a k ta d ır (Ş e k il 2). K olon da p H kontrolü yap ılam ad ığın d an düşük sirkülasyon h ızların da alıkohm a süresi fa zla olduğundan kolon içindeki ph 4.4'e kadar düşmektedir. Bu ph değerinde lipaz aktivitesi düşük olduğundan düşük reaksiyon h ız la n g özlen m ek ted ir. Sirkülasyon h ızın ın artm asıyla kolondaki alıkonma süresi kısaldığından geçiş sırasında fazla bir ph değişim i 327

4 olmamakta, optimum ph 6.0 civarında yüksek aktivite elde edilmektedir* Ayrıca yüksek sirkülasyon hızlarında kolon içerisindeki kayma kuvvetleri etkisinin boş kolona göre çok daha fazla olmasına rağmen reaksiyon hızında azatina gözlenmemesi, iipaz enziminin partikül üzerindeki triasetin filîsine-, adsorplanması sonucu yapısını korumasıyla açıklanabilir. Sirkülutyon Hin, tml/dak). Şekil 2. Reaksiyon hızının çözelti sirkülasyon hm ile değişimi (triasetin konsantrasyonu % 0*25 (v/v); enzim konsantrasyonu: 20 m g/l; karıştırma hızı: 500 rpm; sirkülasyon; hızı; 0.5 ml/dak; ph: 6; T: 35 C; toplam çözelti hacmi: 100 mi). ahlın Reaksivon_Hızına Etkisi: Polietilen partiküller içeren kolon sisteminde düşük ve yüksek rezervuar ph'lannda düşük enzim aktivitesi, ph*=6.0*d& ise maksimum aktivite görülmektedir (Şekil 3), Bu davranış daha önceki çalışmalarda yağ-su emülsiyon sistemlerinde elde edilen İipaz aktivitesiftiö ph la değişimine çok benzerdir [1]. Bu sonuç, polietilen partiküller üzerinde film oluşumuyla çözünür triasetin konsantrasyonlarında da liparin yağ-su ara yüzeyinde çözünmez substratlara karşı aldığı aktif konfora asyonu kazandığım göstermektedir. Triasetin KflrLsantrasyoımmm Reaksiyon Hızına Etkisi: Partikül içermeyen kolon sistemindeki. referans deneylerde, hidroliz hızının triasetin konsantrasyonu İle değişimi Şekil 4*de verilmiştir. Çözünür ve çözünmez bölgelerde reaksiyon hızındaki değişim klasik Michaelis-Menten kinetiğine uymaktadır, Triasetinin çalışılan koşullarda kritik misel konsantrasyonu (CMC) % 3.5* 3.7 (v/v) dir. Bu konsantrasyon civarında reaksiyon hızında ani bir artış gözlenmemiştir. Verilerin değerlendirilmesiyle kritik misel konsantrasyonundan düşük ve yüksek (çözünmezlik sınırına kadar) triasetin konsantrasyonlarında Michaelis-Menten sabitleri sırasıyla ö. 124 ve M triasetin olarak bulunmuştur. Bu değerlerin çok yakm olması misel oluşumuyla lipazm substtatı triasetine karşı ilgisinin değişmediğini ortaya koymaktadır. Polietilen partiküller içeren kolon sistemindi, triasetin koâsantrasy&ûı* artışıyla hidroliz hızında gözlenen artış, aynı koşullarda partikülsüz durumda gözlenenden çok farklıdır (Şekil 4). Bu veriler Lineweaver-Bürk çizimiyle değerlendirilmiş ve çözünür bölgedeki Michaelis sabiti M triasetin olarak bulunmuştur. Bu değerin partikülsüz durumdaki Km değerine göre daha küçük olması lipazm yağ-su arayüzeyinde adsorpsiyonuyla aldığı konformasyemitt

5 Şekil 3. Reaksiyon hızının ph ile değişimi ( triasetin konsantrasyonu % 1 (v/v); enzim konsantrasyonu: 20 mg/1; karıştırma hızı: 500 rpm; sirkülasyon hm: 0.5 ml/dak; ph: 6; T: 35 C). Şekil 4. Triasetin hidrolizinde reaksiyon hızının triasetin konsantrasyonu ite değişimi : enzim konsantrasyonu: 20 mg/1; karıştırma hızı: 500 rpm; sirkülasyon hızı: 0.5 ml/dak; ph: 6; T: 35 C). reaksiyon vermek İçin daha uygun olduğu görüşünü desteklemektedir. Çizelge l de görüldüğü gibi reaksiyon hızında bu yolla özellikle triasetin çözünür konsantrasyonlarda % oranında artış sağlanmaktadır. Polietilen partikülîerin kullanılmasıyla sağlanan artış oranları, literatürde ortama suyla karışmayan organik çözücülerin eklenmesiyle (% ) ve polimerik membran sistemlerinin kullanılmasıyla elde edilen artış oranlarıyla karşılaştırılabilir düzeydedir îl-33.aruş oranlarım tartışabilmek için, partiküllü durumda gözlenen reaksiyon hızının, kolon içinde partikül yüzeyindeki filmde 329

6 adsorplanmış enzim tarafından verilen reaksiyon hızı,ile rezervuarda çözünür fazda yürüyen reaksiyon hızı toplamı olduğunu göz önüne almak gerekir. Düşük triasetin konsan trasyon ların da p a rtik ü ller üzerinde triasetin film in d ek i reaksiyonun toplam reaksiyon hızına katkısının çok daha fazla olması artış oranının yüksek olm asın a neden olm aktadır. T riasetin konsantrasyonu artışıyla rezervuarda çözünür fazdaki reaksiyon hızı da ağırlık kazandığından artış oram düşmektedir. A yrıca Şekil 4 de görüldüğü gibi triasetinin çözünmez konsantrasyonlarına geçildiğinde evre değişim iyle reaksiyon hızı; partikülsüz durumda 2.8 kat artarken, partiküllü durumda ise 1.4 kat artmaktadır. Bu artışın p a rtik ü llü sistem d e y a n y a rıy a daha az olm ası, çözünür tria s e tin konsantrasyonlarında p a rtik ü ller sayesinde em ülsiyondakine benzer yağ-su arayüzeylerinin oluşturulduğunu göstermektedir. Çizelge 1. Triasetin Konsantrasyonunun H idroliz Hızındaki Artışa Etkisi. Triasetin Konsantrasyonu ( %, v/v) H idroliz Hızındaki Artış (%)* LO * Artış oranlan polietilen partiküllerin bulunmadığı referans çalışmalara göre hesaplanmıştır. "Bu araştırma T Ü B İT A K -T em el Bilim ler Araştırm a Grubu tarafından TBAG-1020 no lu proje olarak desteklenmektedir" KAYNAKLAR 1. T. Uçar, H.î. Ekiz, S.S. Çelebi, A. Çağlar, The Effects o f Solvents on the Kinetics o f Free and Im m obilized Lipase, Biocatalysis in Organic Media (Ed. C. Laane, J. Tram per and M.D, Lilly), Elsevier, Science Publishers B.V., Amsterdam (1987) R.P. Guit, et.al,, Lipase Kinetics: H ydrolysis o f Triaeetin by Lipase from C a n d i d a cylindracea in a H ollow Fiber Membrane Reactor, Biotech, and Bioeng., 38(1991) T. Hageshi, Y. Ikada, Lipoprotein Lipase Immobilization onto Polyacrolein Microspheres, Biotech, and Bioeng., 36 (1990) 593.