I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Oral epitel hücresi ve oral epitel hücre dizini Streptococcus pyogenes etkileşiminin immün regülasyon

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Oral epitel hücresi ve oral epitel hücre dizini Streptococcus pyogenes etkileşiminin immün regülasyon üzerindeki etkisinin araştırılması Proje Yürütücüsü Prof. Dr. Hatice Özenci Proje Numarası Başlangıç tarihi Bitiş tarihi Teslim tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2005 " 1

2 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Oral epitel hücresi ve oral epitel hücre dizini Streptococcus pyogenes etkileşiminin immün regülasyon üzerindeki etkisinin araştırılması. Mukozal immün sistemde epitel hücre, özgül olmayan immün yanıttan kazanılmış immün yanıta geçişte ve immün homeostazın regülasyon veya tolerans yönünde belirlenmesinde bir kavşak noktası oluşturmakta; antijene antijenin yapısı, miktarı ve sunum şekline göre nasıl bir yanıt oluşturulacağını belirlemektedir. Çalışmamızda insan ağız epitel hücresi (AEH) ve insan ağız epitel hücre dizininin (KB hücresi) farklı miktarlardaki Streptococcus pyogenes e verdiği yanıttaki değişimlerin incelenmesi; ağız epitel hücresi ve KB hücresinin S. pyogenes in farklı miktarları ile uyarımının bakterisidal etkide ve doğal immüniteye aracılık eden IL-8, kazanılmış immüniteye aracılık eden IL-6 ve toleransa aracılık eden IL-10 gibi sitokinlerin üretiminde değişikliğe neden olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma öncesinde AEH ve KB hücreleri ve S. pyogenes ATCC suşu hazırlanmış; 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında plaklarda karşılaştırılmıştır. 1 ve 6 saatlik inkübasyonların ardından her bir kuyucuktaki süpernatan üremenin engellenmesi deneyi için kuyucuklardan toplanmış ve kanlı agara ekilmiştir. 37 o C de bir gecelik inkübasyondan sonra plaklarda meydana gelen koloni oluşturan birimler sayılmış ve bakterisidal etki yüzdesi hesaplanmıştır. 1, 6 ve 24 saatlik inkübasyonlardan sonra kuyucuklardan süpernatan sitokin üretiminin ölçümü için toplanmış ve IL-6, IL-8 ve IL-10 seviyeleri ticari ELİSA kitleriyle değerlendirilmiştir. Çalışmaların istatistiksel değerlendirmesi Kruskal-Wallis testi ve multipl comparison testi ile yapılmıştır. Çalışmalar sonucunda S. pyogenes ile uyarılan AEH nin 1. saatte ortalama % 38.7, 6. saatte ortalama %54.5 ve doza bağlı baterisidal etki gösterdiği; KB hücresinin 1. saatte ortalama % 36.3 ve 6. saatte ortalama% 37.7 bakterisidal etki gösterdiği tespit edilmiştir. IL-6, IL-8 ve IL- 10 nun yapısal olarak AEH ve KB hücresinden salgılandığı saptanmış; farklı S. pyogenes miktarları ile uyarıma bu sitokinlerin üretiminde doz ve zamana bağlı olarak değişikler olduğu gösterilmiştir. 2

3 Evaluation of Oral epithelial cells and cell lines - Streptococcus pyogenes interaction effects on immune regulation. Epithelial cells take role of stimulating nonspecific immune response to adaptive one on mucosal immune system. Epithelial cells have critical role at designate immune homeostasis whether as immune regulation or tolerance and according to antigen structure, dose and form of the presentation way response type will be determined. In this study it is aimed to evaluate the alteration of human oral epithelial cells and oral epithelial cell lines (KB) to different doses of Streptococcus pyogenes, at the same time the effect of the different doses of S. pyogenes on oral epithelial cells and KB cell line for bactericidal effect and differences on the production of cytokines that stimulate innate and adaptive immune response or tolerance such as IL-8, IL-6, IL-10 respectively. Before experiment, oral epithelial cells and KB cells and S. pyogenes ATCC strain were prepared. The cells were stimulated with bacteria in plates with an effector / target cell ratio of 1/1, 1/100, 1/1000 and 1/ At the end of 1 and 6 hours incubation, supernatants were collected from each wells for growth inhibition assay and were inoculated onto blood agar plates. Following overnight incubation at 37 o C, colony forming units were enumareted and bactericidal effects were calculated. At the end of 1, 6 and 24 hours incubation, supernatants were collected from each wells for measurment of cytokine production, and IL-6, IL-8, IL-10 levels were measured with commercial ELİSA kits. Kruskal-Wallis test and multiple comparison test were used for statistical analysis. Oral epithelial cells stimulated with S. pyogenes showed dose dependent bactericidal effect, calculated mean value for bactericidal effects were 38.7% at the end of 1 hour incubation, 54.5% at the end of 6 hours incubation. Calculated mean value for bactericidal effects on KB cells stimulated with S. pyogenes were 36.3% at the end of 1 hour incubation, 37.7 % at the end of 6 hours incubation. It s determined that IL-6, IL-8 and IL-10 were produced by each oral epithelial cells and KB cells and induction of these cells with different doses of S. pyogenes represent a dose and time dependent manner in cytokine production. 3

4 II. Amaç ve Kapsam Mikroorganizmalar, insan ve hayvanlarda vücuda değişik yollardan girerek bozukluklara neden olmakta ve çeşitli mekanizmalarla hastalık oluşturmaktadır. Mikroorganizma, organizmada ilk önce epitel hücre (EH) fiziksel bariyeri ile karşılaşmakta, bu bariyer ile antijen immün sistemden uzak tutulabilmektedir. Patojen konağa girdiğinde, EH tarafından oluşturulmuş olan mukus gibi infeksiyondan önce var olan ve antimikrobiyal peptidler gibi infeksiyonun ilk dakikaları içinde etkinleşen doğal savunma mekanizmaları ile karşılaşmakta, bu savunmayı aşar veya bu savunmadan kaçabilirse kazanılmış immün yanıta ihtiyaç duyulmaktadır. EH; profesyonel olmayan antijen sunumu, sitokin salınımı, kemokin oluşumu, adezyon moleküllerinin ekspresyonu ile immün yanıtın yönünü immün tolerans veya immün aktivasyon şeklinde belirlemektedir. Mukozal immün sistemde (MİS) EH, özgül olmayan immün yanıttan kazanılmış immün yanıta geçişte ve immün homeostazın regülasyon veya tolerans yönünde belirlenmesinde bir kavşak noktası oluşturmakta, bu noktada antijene; antijenin yapısı, miktarı ve sunum şekline göre nasıl bir yanıt oluşturulacağını belirlemektedir. Bu noktalardan hareketle çalışmamızda, insan ağız epitel hücresinin (AEH) ve insan ağız epitel hücre dizininin (KB hücresi) S. pyogenes in farklı miktarları ile uyarımının bakterisidal etkide ve IL-6, IL-8 ve IL-10 gibi sitokinlerin üretiminde değişikliğe neden olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamız kapsamında, farklı miktarlardaki mikroorganizma ile uyarılan AEH ve KB hücresinin, bu hücrelerin bakterisidal etkileri ve kazanılmış immünite ile ilişkili IL-6, doğal immünite ile ilişkili IL-8 ve tolerans ile ilişkili IL-10 sitokinlerininin üretimlerindeki değişikliklerin incelenmesi bulunmaktadır. EH; bariyer fonksiyonu, defensinler gibi doğal antibiyotik fonksiyonuna sahip peptid oluşumu ve kompleman oluşumu, TLR ekspresyonu ile antijeni tanıma, MHC molekül ekspresyonu ile antijeni alma ve sunma işlemi, profesyonel olmayan yollar ile mikroorganizmayı fagosite etmesi, sitokin ve kemokinleri üretmesi, adezyon moleküllerini eksprese ederek diğer immün hücreleri infeksiyon alanına çağırması ve antikor oluşumuna katkısı ile patojen mikroorganizma ile baş etmeye çalışmaktadır. Bakteri ile EH mücadelesi, EH nin bakteriye göstermiş olduğu antibakteriyel etkilerin toplamının bir sonucu olarak bakteri veya konak lehine sonuçlanmaktadır. 4

5 Sitokinler inflamatuar ve immün süreçte, hücreler arası sinyal oluşumunda görev alan salgısal proteinlerdir ve uyarımları bakteri ve bakteri ürünleri ile olmaktadır. EH, immün yanıtta görevli çeşitli sitokin ve kemokinler salgılamakta ve bu özellikleri mikroorganizmaya karşı konak savunmasına yardımcı olmaktadır. EH nin sitokin profili; mikroorganizma türü, patojenitesi, dozu, EH ile karşılaşma süresi ve EH nin bulunduğu mukozal alana göre değişmektedir. Proinflamatuar ve antiinflamatuar sitokinler arasındaki dinamik denge; sitokinlerin üretilme oranları, miktarları ve reseptörlerinin eksprese olma oranları oluşacak olan uyarımın kontrolünü sağlamaktadır. Bakteri ile konağın etkileşimi bir veya daha fazla sitokinin salgılanmasına neden olmakta, oluşan sitokin bakteri ve konak hücre doğasına göre belirlenmektedir. Proinflamatuar sitokinler (IL-1, IL-6, IL-8 ve TNF gibi) inflamatuar hücrelerin aktivasyonu ve görev alanına çağrılmasında ve efektörlerin uyarılması kaskadında rol alan bileşenlerdir. Patojene karşı oluşan proinflamatuar yanıt (sitokinler, PG ve NO dan oluşan), mukozal patolojiye katkıda bulunmakta; konağın korunması için IL-10 ve TGF-β gibi antiinflamatuar sitokinlere ihtiyaç duyulmaktadır. IL-6; hem immün düzenleyici hem inflamatuar özellikleri olan çok fonksiyonlu bir sitokindir. IgA üreten B hücre olgunlaşmasını arttırmaktadır. Lokal artımı, lokal lenfoid hiperplazi ve lümende özellikle CD3 lenfositlerinin artışı ile sonuçlanmaktadır. IL-6 nın inflamatuar etkisi, akut faz reaktanlarını (CRP; C-reactive ptrotein) uyarması ve ateştir. IL-8; nötrofiller için güçlü kemoatraktan ve aktive edici etkiye sahiptir. EH den mikroorganizma girişine yanıt olarak oluşmakta, artışı o bölge lümenindeki nötrofil sayısı ile ilişkili bulunmaktadır. IL-8 nötrofil yüzeylerindeki adezyon moleküllerinin ekspresyonunu arttırmakta, nötrofillerin transepitelyal göçünü uyarmakta, oksidatif patlamayı ve lizozomal enzimlerin salınmasını başlatmaktadır. IL-10; makrofaj fonksiyonlarının güçlü baskılayıcısıdır ve T hücrelerinden Th1-tipi sitokin üretiminin inhibisyonuna yol açmaktadır. Bu immün düzenleyici etkisi; MHC sınıf II moleküllerinin ekspresyonunu engelleyerek, IL-1, IL-6 ve TNF-α gibi proinflamatuar sitokinlerin üretimini azaltarak ve makrofajlardan B7-1, CD40 ve ICAM-1 gibi kostimülatör moleküllerin ekspresyonunu düşürerek gerçekleştirmektedir. IL-10, primer mikst lenfosit reaksiyonlar sonucu aktive edilen T hücresinin anerjisinin devam ettirilmesinde esas rolü almaktadır. ASH nin oluşturduğu IL-10, yine ASH nin oluşturduğu ve MHC sınıf II molekülünün ekspresyonunu arttıran IFN-γ nın etkisini engellemekte ve bu etki ile T 5

6 hücresinin Th2 yönünde farklılaşmasına neden olmaktadır. IL-10 proinflamatuar sitokinlerin oluşumunu azalttığı gibi, makrofaj/ monosit ve nötrofillerin aktivitesini de düşürmekte ve otoregülatuar bir mekanizma sergilemektedir. Oral tolerans (OT); ağız yolundan alınmış ve daha önceden maruz kalınmış olan antijene karşı sistemik immün yanıtın aktif olarak baskılanmasıdır. Mukozal yoldan verilen antijenin toleransı indüklemesi; mikroorganizma türü ve genetik yapısı, antijenin dozu, formu (solübl veya partiküler olma) ve veriliş yolu ve süresine bağlıdır. OT, antijenin tek yüksek doz veya tekrarlayan düşük doz uygulamasını takiben indüklenmektedir. Oral antijenin yüksek doz uygulanması lenfosit anerjisi veya delesyonunu başlatmaktadır. Lenfosit anerjisi ile ilişkili yüksek doz tolerans; kostimülatör molekül yokluğunda T hücre reseptörü (CD28) ile ASH reseptörü (CD80 ve CD86) nün bağlanması veya solübl IL-2 gibi sitokinlerin oluşumu ile ortaya çıkmaktadır. Yüksek dozla indüklenen delesyon ise, proinflamatuar sitokin IL-12 ile bloke edilen FAS ilişkili apoptozis ile meydana gelmektedir. Düşük doz tolerans regülatuar T hücreleri (T reg) ile ilişkilidir. Oral antijene düşük dozda tekrarlayan karşılaşmalar T reg i aktive etmekte, T reg solübl veya hücre yüzeyi ile ilişkili IL-10 ve TGF-β gibi baskılayıcı sitokinler yoluyla immün yanıtı baskılamaktadır. 6

7 III. Materyal ve Yöntem Çalışma, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı İmmünoloji laboratuarında Helsinki Deklerasyonu prensiplerine uygun olarak Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik kurulundan onay ve katılımcılardan Bilgilendirilmiş olur formu alınarak yürütülmüştür. Örnekler; sigara içmeyen ve son bir haftadır antibiyotik kullanmayan sağlıklı gönüllülerden toplanmıştır. Ağız epitel hücresinin hazırlanması Gönüllülerin uyarılmamış tükürükleri, 10 ml % 1 Penisilin-Streptomisinli Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) içeren 50 ml lik steril polipropilen santrifüj tüpüne alınmış, 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek hücreler çökertilmiştir. Hücreler 3 kez HBSS ile yıkanmış ve santrifüj işlemi ile tekrar çökertilmiştir. Çökelti besiyerinde sulandırılmış, Tripan mavisi ile boyanıp Thoma lamında sayılmış ve ml de 1x10 5 EH olacak şekilde besiyeri ile süspanse edilmiştir. KB epitelyal hücre dizini kültürünün hazırlanması KB hücre dizini, hücre kültürü şişesinde tek kat üretilmiş, çalışmada kullanılmadan önceki pasajları antibiyotiksiz besiyeri ile yapılmış, 2-3 günde kaplayan yeni hücreler Versen Tripsin ile kaldırılmış ve HBSS ile 3 kez yıkanarak çökertilmiştir. Besiyeri içinde sulandırılan hücreler ml de 1x10 5 canlı hücre olacak şekilde ayarlanmıştır. 24 kuyucuklu plaklara her bir kuyucuğa 500 er µl hücre süspansiyonu konmuş ve 2 saat 37 o C de %5 CO 2 li etüvde hücrelerin tutunması için inkübe edilmiştir. Streptococcus pyogenes in hazırlanması S. pyogenes ATCC suşu, koyun kanlı agara ekilmiş, 37 o C de bir gecelik inkübasyona bırakılmıştır. Ertesi gün kanlı agardan koloniler steril fosfat tampon solüsyonuna (PBS) toplanmış ve 3 kez yıkanmış, santrifüj işlemi ile çöktürülen bakterilerin üzerine besiyeri ilave edilmiş, Tripan mavisi ile boyanıp Thoma lamında sayılmış ve mililitrede 1x10 5, 1x10 7, 1x10 8 ve 1x10 9 bakteri olacak şekilde 10 ar ml lik sulandırımları yapılmıştır. 7

8 Hücrelerin Streptococcus pyogenes ile uyarılması 24 kuyucuklu plaklara her bir oran ve kontroller için 3 er kuyucuk 500 er µl AEH ve KB hücrelerinin üzerlerine 500 er µl 10 5 /ml, 10 7 /ml, 10 8 /ml, 10 9 /ml mikroorganizma içeren süpernatanlardan ilave edilmiştir. Plaklar 37 o C de % 5 CO 2 li etüvde inkübe edilmiştir. 1 ve 6 saatlik inkübasyonların ardından her bir kuyucuktaki süpernatan üremenin engellenmesi deneyi için alınmış ve seri sulandırımı yapılıp uygun dilüsyondan kanlı agara çift ekim yapılmıştır. Sitokin değerlendirmesi için 1, 6 ve 24 saatlik inkübasyonlardan sonra kuyucuklardan süpernatan toplanmış ve sitokin seviyesi ölçümü yapılacağı zamana kadar -70 o C de derin dondurucuda saklanmıştır. Streptococcus pyogenes inhibisyonunun saptanması 1/1, 1/100, 1/1000, 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında 1 ve 6 saat karşılaştırılmış olan AEH ve KB hücrelerinin S.pyogenes e karşı gösterdikleri bakterisidal etkiyi değerlendirmek için her bir kuyucuktan sulandırım yapıldıktan sonra koyun kanlı agara ekilmiştir. Kontrol olarak, uyarılmamış AEH ve KB hücresi ve mikroorganizma kuyucuğunun uygun sulandırımının kanlı agar plaklarına ekimleri yapılmıştır. Plaklar bir gece 37 o C de inkübe edilmiş, ertesi gün plaklarda meydana gelen koloni oluşturan birimler (KOB) sayılmış ve bakterisidal etki yüzdesi şu formüle göre hesaplanmıştır: Bakterisidal etki(%) = KOB (kontrol kuyucuğu) KOB (deney kuyucuğu)x100 KOB (kontrol kuyucuğu) Sitokin sekresyonunun saptanması S. pyogenes ile uyarılmış AEH ve KB hücresi ve kontrol olarak mikroorganizma ile uyarılmamış AEH ve KB hücresi süpernatanları 1, 6 ve 24. saatlerde toplanmış, 3000 rpm de santrifüj edilmiş ve süpernatan -70 o C de saklanmıştır. ELISA ile ölçüm yapılacağı zaman -70 o C den çıkarılmış ve oda ısısına getirilmiştir. IL-6, IL-8 ve IL-10 seviyeleri ticari ELISA kitleriyle prospektüsünde yazdığı şekilde yapılarak ölçülmüş, absorbansları spektofotometrik mikroplak okuyucusunda 450 nm de değerlendirilmiş ve protein seviyeleri pikogram cinsinden hesaplanmıştır. 8

9 3.3. İstatistiksel değerlendirme KB hücreleri ve AEH nin farklı miktarlardaki S. pyogenes e karşı bakterisidal etkileri ve sitokin yanıtları arasındaki fark Kruskal-Wallis testi ile, gruplar arasındaki farklılıkların değerlendirilmesi çoklu karşılaştırma testi ile yapılmıştır. Değerlendirmelerin sonucunda p<0.05 anlamlı olarak kabul edilmiştir. 9

10 IV. Analiz ve Bulgular A. Ağız epitel hücre sonuçları Gönüllülerin tükürüğünden toplanıp yıkanmış olan hücreler, besiyerinde süspanse edildikten sonra 20 mikrolitre hücre süspansiyonu % 4 lük Tripan mavisi ile boyanıp Thoma lamında sayılmıştır. Sayım sonuçlarında görülen hücrelerin dağılımları ortalama % 90 epitelyal hücre, % 5 lökosit ve lenfosit ve % 5 makrofaj şeklinde olmuştur. Ağız epitel hücresinin farklı miktarlardaki Streptococcus pyogenes e karşı bakterisidal etkisi AEH nin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1. saatte ortalama % 38.7 ve 6. saatte ortalama % 54.5 bakterisidal etki gösterdiği saptanmıştır (Tablo 1). Tablo 1: AEH nin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte gösterdikleri bakterisidal etki ortalamaları. S.pyogenes 1. saat S.pyogenes 6. saat *ss; standart sapma AEH 1/1 E/H * 56.0 ± ± AEH 1/100 E/H 27.4 ± ± AEH 1/1000 E/H 29.3 ± ± AEH 1/10000 E/H 38.7 ± ± AEH nin S. pyogenes e karşı 1. saatte göstermiş olduğu bakterisidal etki yüzdeleri, farklı mikroorganizma miktarlarına verdikleri antibakteriyel etkinlik açısından değerlendirildiğinde; 1x10 5 /ml mikroorganizma ile uyarılan AEH nin, 1x10 7 ve 1x10 8 /ml bakteri ile uyarılan hücrelere göre anlamlı olarak yüksek bakterisidal etki gösterdiği saptanmıştır (p<0.05). 6. saat bakterisidal etki yüzdelerine bakıldığında ise; 1x10 5 ve 1x10 7 /ml mikroorganizma ile uyarılan AEH, diğer bakteri miktarları ile uyarılan hücrelerin meydana getirdiği bakterisidal etkiden anlamlı olarak yüksek bakterisidal etki göstermiştir (p<0.01) (Grafik 1). 10

11 Bakterisidal etki (%) /5. 5/7. 5/8. 5/9. 1.saat 6.saat Efektör/Hedef hücre oranı (log10) Grafik 1: AEH nin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte gösterdikleri bakterisidal etki ortalamaları. Ağız epitel hücresinin farklı miktarlardaki Streptococcus pyogenes e karşı sitokin yanıtı 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes ile karşılaştırılan AEH nin yapısal olarak ve S. pyogenes e karşı yanıtta 1, 6, 24. saatte ölçümler sonucu IL-6, IL-8 ve IL-10 sitokinlerini oluşturduğu saptanmıştır (Tablo2). Tablo 2: AEH nin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1, 6 ve 24. saatte oluşturdukları sitokin seviyeleri ortalamaları. S.pyogenes 1. saat S.pyogenes 6. saat S.pyogenes 24. saat AEH Yapısal ** IL-6 (pg) 10,09± IL-8 (pg) 5,82± IL10 (pg) 32,6± IL-6 (pg) 11,13± IL-8 (pg) 16,9± IL10 (pg) 28,7± IL-6 (pg) 12,82± IL-8 (pg) 20,6± IL10 (pg) 43,2± AEH 1/1 E/H hücre 13.6 ± ± ± ± ± ± ± ± ± AEH 1/100 E/H hücre 12.1 ± ± ± ± ± ± ± ± ± AEH 1/1000 E/H hücre 12.3 ± ± ± ± ± ± ± ± ± AEH 1/10000 E/H hücre 11.6 ± ± ± ± ± ± ± ± ± *pg; pikogram, **ss; standart sapma. 11

12 AEH nin 1. saatte mikroorganizma ile uyarıma karşı oluşturduğu IL-6 ve IL-8 yanıtları, yapısal olarak meydana getirdiğinden anlamlı olarak yüksek bulunmuşken (p<0.05, p<0.001), IL-10 yanıtında farklı mikroorganizma miktarları ile uyarımdan sonra değişim saptanmamıştır (p>0.05). 6. saat IL-6 oluşumunda, yapısal üretimden farklı bir yanıt saptanmazken, S. pyogenes ile uyarılan AEH nin IL-8 yanıtı 1/100, 1/1000, 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında yapısal üretiminden anlamlı olarak düşük (p<0.05, p<0.01, p<0.01) ve IL-10 yanıtı 1/100, 1/1000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında yapısal üretiminden anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p<0.05, p<0.05). 24. saatte ise IL-6 üretimi 1/100 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında anlamlı olarak yüksek (p<0.05, p<0.001); IL-8 1/100 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında, IL-10 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında yapısal üretiminden anlamlı olarak düşük bulunmuştur (p<0.05, p<0.01, p<0.01). AEH nin farklı S. pyogenes miktarları ile uyarıma vermiş oluğu IL-6, IL-8 ve IL-10 yanıtları 1,6 ve 24 saatlerde doza bağlı olarak değişmiştir. (Grafik 2). AEH sitokin yanıtları 100 IL-6 1.saat IL-8 1.saat Sitokin yanıtı (pikogram) Kontrol Mikroorganizma miktarı (log10) IL-10 1.saat IL-6 6.saat IL-8 6.saat IL-10 6.saat IL-6 24.saat IL-8 24.saat IL saat Grafik 2: AEH nin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1, 6 ve 24. saatte oluşturdukları sitokin seviyeleri ortalamaları. 12

13 B. KB hücresi sonuçları KB hücrelerinin farklı miktarlardaki S. pyogenes e karşı bakterisidal etkisi KB hücresinin S. pyogenes ile 1 ve 6. saatlik inkübasyondan sonra, mikroorganizmaya karşı 1. saatte ortalama % 36.3 ve 6. saatte ortalama % 37.7 antibakteriyel etki gösterdiği saptanmıştır. KB hücresinin S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte göstermiş olduğu bakterisidal etki yüzdeleri, farklı mikroorganizma miktarlarına verdikleri antibakteriyel etkinlik açısından değerlendirildiğinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0.05) (Tablo 3; Grafik 3). Tablo 3: KB hücrelerinin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte gösterdikleri bakterisidal etki ortalamaları. S.pyogenes 1. saat S.pyogenes 6. saat *ss; standart sapma. KB 1/1 E/H * 43.8 ± ± KB 1/100 E/H 29.3 ± ± KB 1/1000 E/H 30.0 ± ± KB 1/10000 E/H 42.0 ± ± Bakterisidal etki (%) /5. 5/7. 5/8. 5/9. Efektör/Hedef hücre oranı (log10) 1.saat 6.saat Grafik 3: KB hücrelerinin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte gösterdikleri bakterisidal etki ortalamaları. 13

14 KB hücrelerinin farklı miktarlardaki S. pyogenes e karşı sitokin yanıtı KB hücresinin yapısal olarak ve 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes ile uyarım sonucu IL-6, IL-8 ve IL-10 sitokinlerini oluşturduğu saptanmıştır (Tablo 4). Tablo 4: KB hücrelerinin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1, 6 ve 24. saatte oluşturdukları sitokin seviyeleri ortalamaları. KB yapısal ** KB 1/1 E/H hücre KB 1/100 E/H hücre KB 1/1000 E/H hücre KB 1/10000 E/H hücre S.pyogenes 1. saat S.pyogenes 6. saat S.pyogenes 24. saat IL-6 (pg) 111,2± IL-8 (pg) 5,68± IL10 (pg) 35,4± IL-6 (pg) 163± IL-8 (pg) 24,9± IL10 (pg) 31,9± IL-6 (pg) 451± IL-8 (pg) 84.6± IL10 (pg) 37,5± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± *pg; pikogram. **ss; standart sapma. KB hücresinin 1. saatte farklı mikroorganizma miktarları ile uyarıma karşı oluşturduğu IL-6 yanıtında uyarımdan sonra anlamlı değişim saptanmamış (p>0.05); IL-8 in yapısal olarak oluşumu 1/100, 1/1000, 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında uyarılan hücrelerin yanıtlarından anlamlı olarak yüksek bulunmuş (p<0.01, p<0.001, p<0.001) ve IL-10 un yapısal üretimi 1/1 Efektör hücre/hedef hücre oranından anlamlı olarak yüksek (p<0.05), 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranından anlamlı olarak düşük bulunmuştur (p<0.05). 6. saat IL-6 oluşumunda, yapısal üretimden 1/1000 Efektör hücre/hedef hücre oranında anlamlı olarak 14

15 yüksek yanıt saptanırken (p<0.05), IL-8 yanıtı 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarının hepsinde yapısal üretiminden anlamlı olarak düşük (p<0.01, p<0.001, p<0.001, p<0.001) ve IL-10 yanıtı 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında yapısal üretiminden anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (p<0.001, p<0.001, p<0.05). 24. saatte ise IL-6 ve IL-8 in yapısal üretimi mikroorganizma ile uyarılanlardan yüksek (p<0.01, p<0.01); IL-10 un yapısal üretimi ise 1/1 ve 1/100 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında uyarımdan anlamlı olarak yüksek (p<0.001, p<0.001), ancak 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranında uyarımdan sonra anlamlı olarak düşük bulunmuştur (p<0.05). KB hücresinin, farklı mikroorganizma miktarları ile uyarıma farklı zamanlarda IL-6, IL-8 ve IL-10 yanıtlarının değişken olduğu tespit edilmiştir (Grafik 4) KB hücresi sitokin yanıtları Sitokin yanıtı (pikogram) Mikroorganizma miktarı (log10) Kontrol IL-6 1.saat IL-8 1.saat IL-10 1.saat IL-6 6.saat IL-8 6.saat IL-10 6.saat IL-6 24.saat IL-8 24.saat IL saat Grafik 4: KB hücrelerinin 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes e karşı 1, 6 ve 24. saatte oluşturdukları sitokin seviyeleri ortalamaları. 15

16 V. Sonuç ve Öneriler 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes ile karşılaştırılan AEH ve KB hücresinin S. pyogenes e karşı 1 ve 6.saatte bakterisidal etki gösterdiği saptanmıştır. AEH ve KB hücresinin S. pyogenes e karşı 1 ve 6. saatte göstermiş olduğu bakterisidal etki yüzdeleri, farklı mikroorganizma miktarlarına verdikleri antibakteriyel etkinlik açısından değerlendirildiğinde; AEH nin doza bağlı bakterisidal etki gösterdiği, ancak KB hücresinin doza bağlı yanıt göstermediği saptanmıştır. Deney koşullarında AEH ve KB hücresinin mikroorganizma ile uyarım olmadan 1, 6 ve 24. saatlerde yapısal olarak IL-6, IL-8 ve IL-10 oluşturduğu gösterilmiştir. 1/1, 1/100, 1/1000 ve 1/10000 Efektör hücre/hedef hücre oranlarında S. pyogenes ile karşılaştırılan AEH ve KB hücresinin 1, 6 ve 24. saatlerde IL-6, IL-8 ve IL-10 sitokin seviyelerinde doza ve zamana bağlı olarak değişiklikler oluşturduğu tespit edilmiştir. Bulgularımız sonucunda S. pyogenes in logaritmik artış gösteren miktarlarına karşı, AEH ve KB hücresinin 1 ve 6 saatlik uyarıma bakterisidal etki ile 1, 6, 24 saatlik uyarıma IL-6, IL-8 ve IL-10 salınımlarında değişen oranlarda artış veya azalma ile yanıt verdiği saptanmıştır. Böylece AEH nin doza ve zamana bağlı antibakteriyel etkinlik ve sitokin yanıtı oluşturduğu; KB hücresinin de doza ve zamana bağlı sitokin profilinde değişiklikler olduğu tespit edilmiştir. EH bakterisidal etkisindeki değişimler, birebir değerlendirdiğimiz sitokin yanıtları ile ilişkili olmasa da, değerlendirdiğimiz ve değerlendirmeye almadığımız deney ortamında oluşmuş olan diğer sitokin ve solübl faktörlerin ortak yansıması olarak karşımıza çıktığı varsayılmaktadır. Farklı mukozal hücreler, farklı zamanlar, farklı mikroorganizmalar, farklı E/H hücre oranları, hücrelerin mikroorganizma ile birlikte olmasındaki ve süresindeki değişiklikler; hücrelerin farklı yanıt oluşturmasına, sitokin yanıtlarının nitelik ve niceliklerinin değişik olmasına neden olacak; değişik yanıt oluşturan hücrelerin flora yerleşimleri ve flora ile ilişkileri de farklı olacaktır. EH nin mikroorganizmaya karşı yanıtının daha iyi anlaşılması için, hücresel ve çözünür faktörlerin mikroorganizma üzerindeki tek başına ve diğer faktörler ile birlikte etkilerinin daha ayrıntılı olarak araştırılmasına ihtiyaç vardır. Mukozal EH nin zaman ve doza bağlı değişen proinflamatuar ve antiinflamatuar yanıtının daha iyi anlaşılması mukozal aşı çalışmalarına büyük katkılarda bulunacaktır. 16

17 VI. Kaynaklar Abbas, A.K., Lichtman, A.H. (2002). Innate Immunity. In Cellular and Molecular Immunology (ed. J. Malley), pp Saunders: Philadelphia. Acheson, D.W.K, Luccioli, S. (2004). Mucosal Immune Responses. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology. 18: Albayrak, N., Biriken, D., Özenci, H. (2005). İnsan ağız ve üriner sistem epitel hücrelerinin farklı Eschericha coli suşlarına karşı bakterisidal etkisinin araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 39: Berin, C.M., Mckay, D.M., Perdue, M.H. (1999). Immune-epithelial interactions in host defense. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60: Bodet, C., Chandad, F., Grenier, D. (2005). Modulation of cytokine production by Porphyromonas gingivalis in a macrophage and epithelial cell co-culture model. Microbes and Infection. 7: Boyaka, P.N., Marinaro, M., Fujihashi, K., McGhee, J.R. (2001). Host defenses at mucosal surfaces. In Clinical Immunology Principles and Practice (ed. R.R. Rich, T.A. Fleischer, W.T. Shearer, B.L. Kölzin,H.W. Schroeder), pp Bu, P., Kesharvarzian, A., Stone, D.D., Liu, J., Le, P.T., Fisher, S., Qiao, L. (2001). Apoptosis: one of the mechanisms that maintains unresponsiveness of the intestinal mucosal immune system. The Journal of Immunology. 166: Chehade, M., Mayer, L. (2005). Oral tolerance and its relation to food hypersensitivities. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115: Chung, W.O., Dale, B.A. (2004). Innate immune response of oral and foreskin keratinocytes: utilization of different signaling pathways by various bacterial species. Infection and Immunity. 72: Dolapci, I., Albayrak, N., Boyvat, A., Ozenci, H. (2003). Antibacterial capacity of oral (epithelial) cells from healthy donors and patients with Behçet s disease. Archives of Dermatological Research. 295: Dommett, R., Zilbauer, M., George, J.T., Bajaj-Elliott, M. (2005) Innate immune defence in the human gastrointestinal tract. Molecular Immunology. 42: Eckmann, L., Kagnoff, M.F., Fierer, J. (1993). Epithelial cells secrete the chemokine interleukin-8 in response to bacterial entry. Infection and Immunity. 61: Ellmerich, S., Djouder, N., Schöller, M., Klein, J.P. (2000). Production of cytokines by 17

18 monocytes, epithelial and endothelial cells activated by Streptococcus bovis. Cytokine. 12: Ernst, P.B., Song, F., Klimpel, G.R., Haeberle, H., Crowe, S.E., Ye, G., Reyes, V.E. (1999). Regulation of the mucosal immune response. The American Journal of Medicine and Hygiene. 60: 2-9. Fünfstück, R., Franke, S., Hellberg, M., Ott, U., Knöfel, B., Straube, E., Sommer, M., Hacker, J. (2001). Secretion of cytokines by uroepithelial cells stimulated by Eschericha coli and Citrobacter spp.. International Journal of Antimicrobial agents. 17: Ganz, T. (2002). Epithelia: Not just physical barriers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99: Gewirtz, A.T., Siber, A.M., Madara, J.L., McCormick, B.A. (1999). Orchestration of neutrophil movement by intestinal epithelial cells in response to Salmonella typhimurium can be uncoupled from bacterial internaization. Infection and Immunity. 67: Hamzaquı, N., Pringault, E. (1998). Interaction of microorganisms, epithelium, and lymphoid cells of the mucosa-associated lymphoid tissue. Annals of New York Academy of Sciences. 859: Hayday, A. Viney, J. (2000). The ins and outs of body surface immunology. Science. 290: Hedges, S.R., Agace, W., Svanborg, C. (1995). Epithelial cytokine response and mucosal cytokine networks. Trends Microbiology. 3: Hunstad, D.A., Justice, S.S., Hung, C.S., Lauer, S.R., Hultgren, S.J. (2005). Suppression of bladder epithelial cytokine responses by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 73: Hurley, B.P., McCormick, B.A. (2004). Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Current Gastroenterology Reports. 6: Huttner, K.M., Bevins, C.L. (1999). Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defence. Pediatric Research. 45: Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (2001). Innate Immunity: In Immunobiology (ed Penelope Austin), pp Garland Publishing, New York and London. Kagnoff, M.F. (1996). Mucosal immunology: new fronties. Immunology Today. 17: Kelly, D., Conway, S. (2005). Bacterial modulation of mucosal innate immunity. Molecular Immunology. 42: Kilian, M. (1998). Streptococcus and Lactobacillus. In Topley Wilson s Microbiology and 18

19 Microbial Infections (ed. A. Balows and B.I. Duerden), pp Kunzelmann, K. (2004). First encounter: how pathogens compromise epithelial transport. Physiology. 19: Lamm, M.E. (1997). Interaction of antigens and antibodies at mucosal surfaces. Annual Review of Immunology. 51: Lee, H.Y., Andalibi, A., Webster, P., Moon, S.K., Teufert, K., Kang, S.H., Li J.D., Nagura, M., Ganz, T., Lim, D.J. (2004). Antimicrobial activity of innate immune molecules against Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and nontypeable Haemophilus influenzae. BMC Infectious Disease. 4: Mahida, Y.R. (2004). Epithelial cell responses. Best Practice and Research of Clinical Gastroenterology. 18: Mavris, M., Sansonetti, P. (2004). Epithelial cell responses. Best Practice and Research of Clinical Gastroenterology. 18: Mayer, L. (2003). Mucosal Immunity. Pediatrics. 111: Mestecky, J., Moldoveanu, Z., Elson, C.O. (2005). Immune response versus mucosal tolerance to mucosally administered antigens. Vaccine. 23: Mostefaoui, Y., Bart, C., Frenette, M., Rouabhia, M. (2004). Candida albicans and Streptococcus salivarius modulate IL-6, IL-8, and TNF-alpha expression and secretion by engineered human oral mucosa cells. Cellular Microbiology. 6: Mulvey M.A., Schilling, J.D., Hultgren, S.J. (2001). Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69: Özenci, H., Çelik, H.İ., Tekeli, F.A., Aksoy A.M. (2001). Comparison of Growth Inhibition Effect of CaCo2 Human epithelial cells and polymorphonuclear neutrophils on various Candida species. Turkish Journal of Infection. 15: Pettersen, C.A., Adler, K.B. (2002). Epithelial-neutrophil interactions. Chest. 121: 142S- 150S. Philpott, D.J., Girardin, S.E., Sansonetti, P.J. (2001). Innate immune responses of epithelial cells following infection with bacterial pathogens. Current Opinion in Immunolgy. 13: Quayle, A.J. (2002). The innate and early immune response to pathogen challenge in the female genital tract and the pivotal role of epithelial cells. Journal of Reproductive Immunology. 57 : Ratner, A.J., Lysenko, E.S., Paul, M.N., Weiser, J.N. (2005). Synergistic proinflammatory 19

20 resposes induced by polimicrobial colonization of epithelial surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102: Riedemann, N.C., Guo, R.F., Sarma, V.J., Laudes, I.J., Huber-Lang, M., Warner, R.L., Albrecht, E.A., Speyer, C.L., Ward, P.A. (2002). Expression and function of tha C5a receptor in rat alveolar epithelial cells. The Journal of Immunology. 168: Ruoff K.R., Whiley, A., Beihgton, D. (2003). Steptococcus. In Manual of Clinical Microbiology (ed E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken), pp Schilling, J.D., Mulvey, M.A., Vincent, C.D., Lorenz, R.G., Hultgren, S.J. (2001). Bacterial invasion augments epithelial cytokine response to Escherichia coli through a lipopolisaccharide-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 166: Schmid, Y., Grassi, G.A., Bühler, O.T., Skurnik, M., Autenrith, I.B., Bohn, E. (2004). Yersinia enterocolitica adhesin A induces production of interleukin-8 in epithelial cells. Infection and Immunity. 72: Shao, L., Serrano, D., Mayer, L. (2001). The role of epithelial cells in immune regulation in the gut. Semin Immunology. 13: Shimizu, T., Yokota, S., Takahashi, S., Kunishima, Y., Takeyama, K., Masumori, N., Takahashi, A., Matsukawa, M., Itoh, N., Tsukamoto, T., Fujii, N. (2004). Membraneanchored CD14 is important for induction of interleukin-8 by lipopolsaccharide and peptidoglycan in uroepithelial cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11: Steele, C., Fidel P.L. (2002). Cytokine and Chemokine Production by Human Oral and Vaginal Epithelial Cells in Response to Candida albicans. Infection and Immunity. 70: Svanborg, C., Godaly, G., Hedlund, M. (1996). Cytokine responses during mucosal infections: role in disease pathogenesis and host defence. Current Opinion in Immunolgy. 2: Wilson, M., Seymour, R., Henderson B. (1998). Bacterial perturbation of cytokine Networks. Infection and Immunity. 66: Wu, Q., Lu, Z., Verghese, M.W., Randell, S.H. (2005). Airway epithelial cell tolerance to Pseudomonas aeruginosa. Respiratuar Research. 6:

21 VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları Tüketime yönelik mal ve hizmet alımı, toplam; Türk Lirası b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Proje ile teçhizat alımı yapılmamıştır. c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar Yok d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) Poster sunumu; Albayrak N, Biriken D, Özenci H. Investigation of Bactericidal effect of human oral and uroepithelial cells. 4 th Balkan Congress of Immunology, İstanbul, Turkey, Sözlü sunum; Albayrak N, Biriken D, Özenci H. Üretral hücrelerin farklı miktarlardaki E.coli ye karşı bakterisidal etkisinin araştırılması. I. Ulusal Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Sempozyumu, Kuşadası-Aydın, Türkiye, e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler Albayrak N, Biriken D, Özenci H. İnsan ağız ve Üriner sistem epitel hücrelerinin farklı E.coli suşlarına karşı bakterisidal etkisinin araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni 2005, 39: İnsan ağız epitel hücresi ve insan ağız epitel hücre dizininin (KB) farklı miktarlardaki Streptococcus pyogenes e karşı bakterisidal etkisinin ve sitokin yanıtının araştırılması AÜTF Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji ABD Dr. Nurhan Albayrak Uzmanlık Tezi. 21