VERATRUM ALBUM BİTKİSİNDEN SAFLAŞTIRILAN JERVİN ADLI MOLEKÜLÜN ANTİENFLAMATUVAR VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 VERATRUM ALBUM BİTKİSİNDEN SAFLAŞTIRILAN JERVİN ADLI MOLEKÜLÜN ANTİENFLAMATUVAR VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Fadime ATALAY Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Doktora Tezi

2 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ VERATRUM ALBUM BİTKİSİNDEN SAFLAŞTIRILAN JERVİN ADLI MOLEKÜLÜN ANTİENFLAMATUVAR VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Fadime ATALAY Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Doktora tezi Tez Danışmanı Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Erzurum 2013

3 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ECZACILIK FAKÜLTESİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI VERATRUM ALBUM BİTKİSİNDEN SAFLAŞTIRILAN JERVİN ADLI MOLEKÜLÜN ANTİENFLAMATUVAR VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Fadime ATALAY Tez Savunma Tarihi : Tez Danışmanı Jüri Üyesi Jüri Üyesi Jüri Üyesi Jüri Üyesi : Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Ö. İrfan KÜFREVİOĞLU (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Ahmet ÇAKIR (Kilis 7 Aralık Üniversitesi) : Yrd. Doç. Dr. Mesut HALICI (Atatürk Üniversitesi) Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitü Müdürü Doktora Tezi ERZURUM

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV ÖZET... V ABSTRACT... VII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... IX ŞEKİLLER DİZİNİ... XIII TABLOLAR DİZİNİ... XVI 1.GİRİŞ GENEL BİLGİLER Enflamasyon Akut Enflamasyon Kronik Enflamasyon Antienflamatuvar İlaçlar Zambakgiller Veratrum album (Beyaz çöpleme) Alkaloitler Antioksidanlar Serbest Radikaller Antioksidan Savunma Sistemleri MATERYAL VE METOT Deneylerde Kullanılan Kimyasallar I

5 3.2. Deneylerde Kullanılan Cihazlar Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları Deney Bitkisi Bitki Materyali Alkaloitçe zengin NH 4 OH-benzen ile ekstraksiyon ve üzerinde yapılan kromatografik çalışmalar Deney Hayvanları Karragenin kullanılarak akut enflamasyon oluşturulması Biyokimyasal Ölçümler Biyokimyasal analizler için pençe doku homojenatlarının hazırlanması İstatistiksel Analizler BULGULAR Veratrum album dan Saflaştırılan Jervin in Spektral Verilerle Yapısının Aydınlatılması Makroskopik Bulgular Karragenin (CAR) ile deneysel olarak oluşturulan pençe ödemleri üzerine Jervin in ve pozitif kontrol olarak kullanılan diklofenak (DIC) ile indometazin (İND) nin etkileri Biyokimyasal Bulgular Rat serumlarında tümör nekroz faktör-α (Tnf-α) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri II

6 Rat serumlarında İnterlökin-1β (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri Rat pençelerindeki miyeloperoksidaz (MPx) aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki lipit peroksidasyon (LPO) seviyeleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki katalaz (CAT) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki glutatyon peroksidaz (GPx) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki glutatyon (GSH) seviyeleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki glutatyon-s-transferaz (GST) aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Rat pençelerindeki glutatyon redüktaz (GR) aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EK 1. ÖZGEÇMİŞ EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU III

7 TEŞEKKÜR Doktora tezi olarak sunduğum bu çalışmayı, değerli bilgi ve katkıları ile yöneten, tezimin her aşamasında yardımlarını esirgemeyen hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU na en derin saygı ve şükranlarımı sunarım. İzolasyon ve karakterizasyon çalışmalarını yapan hocam Sayın Prof. Dr. Ahmet ÇAKIR a ve Sayın Yrd. Doç. Dr. Tuba AYDIN a, biyokimyasal çalışmalarda yardımcı olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Mesut B. HALICI ya, çalışmalarım sırasında ilgi ve desteklerini esirgemeyen çalışma arkadaşlarıma, yoğun eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen aileme teşekkür ederim. Fadime ATALAY Mart IV

8 ÖZET Veratrum Album Bitkisinden Saflaştırılan Jervin Adlı Molekülün Antienflamatuvar ve Antioksidan Özelliklerinin Belirlenmesi Amaç. Ratlarda CAR ile uyarılmış akut enflamasyon modeli kullanılarak Veratrum album un rizomlarından elde edilen Jervin molekülünün antienflamatuvar etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot. Enflamasyon deneyinde Jervin in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg dozları ile DIC ve İND 25 mg/kg dozları oral yoldan uygulandı ve hayvanların ayak hacimleri diz eklemine kadar plethismometrede ölçüldü. İlaçlar verildikten bir saat sonra bütün sıçanların ayak pençesine 0.1 ml CAR (% 1) enjekte edildi. Rat pençeleri 5. saatte plathismometriksel olarak ölçüldü. Pençe homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda MPx, CAT, GPx, SOD, GR, GST, enzim aktiviteleri ve GSH ve LPO miktarları, serumlarda ise TNF-α, IL-1β parametreleri ölçüldü. Bulgular. Jervin tüm dozlarda CAR tarafından uyarılmış olan enflamasyonu % % oranında azaltmıştır. CAR enjekte edilmiş sıçanların serumunda enflamasyon prosesinin önemli ölçütleri olan TNF-α, IL-1β düzeyleri, pençe dokularında ise MPx enzim aktivitesi sağlıklı canlılara göre yüksek oranda bulunurken, Jervin, İND ve DIC ile muamele edilmiş olan gruplarda TNF-α, IL-1β düzeyleri ve MPx enzim aktivitesi daha düşük oranda tespit edilmiştir. Tüm sıçan pençe dokularında CAR enjeksiyonu CAT ve GST enzimlerinin aktivitesini arttırırken DIC, İND ve Jervin molekülünün bu enzimlerinin aktivitesini azalttığı gözlenmiştir. Ayrıca doku hasarı göstergesi olan LPO düzeyi CAR grubunda yüksek, DIC, İND ve Jervin grubunda ise düşük oranda bulunmuştur. Jervin, DIC ve İND SOD, GPx, GR ve GSH gibi antioksidanlar üzerine olumlu etkiler yaparak CAR ın olumsuz etkilerini azaltmıştır. V

9 Sonuç. CAR ile uyarılmış akut enflamasyon modeli esas alınarak yapılan bu çalışmada enflamasyon ile oksidatif stres arasında sıkı bir ilşkinin olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Enflamasyon, jervin, karregenin, lipid peroksidasyonu, miyeloperoksidaz. VI

10 ABSTRACT The determination of anti-inflammatory and antioxidant properties of the Jervine isolated from the rhizomes of Veratrum album Aim. It is aimed to investigate the anti-imflammatory effects of Jervin isolated from the rhizomes of Veratrum album induced by CAR in rats. Material and Method. In inflammatory study, 50, 100, 200 ve 400 mg/kg doses of Jervine, 25 mg/kg doses of DIC and IND were orally administered, and the volume of the foots were measured up to their knee arthorisis by plethismometer. After one hour of the oral administration of the drugs, 0.1 ml of CAR solution (1%) was injected into the foot of the all rat groups and and the volume of the foots were measured up to their knee arthorisis by plethismometer after 5 hours of CAR injection. MPx, CAT, GPx, SOD, GR, GST enzyme activities and GSH, LPO levels of supernatants of paw homogenates, and TNF-α and IL-1β in the serums of the rats were determined. Results. Jervine reduced the inflammation reduced by CAR with % inhibition. TNF-α, IL-1β levels in serums and MPx enzyme activity in rat paw tissues used as indicator of the inflammation were found to high level in CAR groups as compared with those of the healthy rat groups, whereas TNF-α, IL-1β levels and MPx enzyme activity were found at low levels in the groups treated with Jervine, İND ve DIC. In all paw tissues, while CAT and GST enzymes activities were increased by the CAR injection, DIC, IND and Jervine decreased these enzymes activities. Furthermore, LPO level as indicator of tissue damage was found to be high level in CAR-treated group and it was found to be low levels in DIC, IND and Jervine-treated groups. Jervine, DIC and IND reduced the negative effects of CAR due to increasing effects on the antioxidants such as SOD, GPx, GR and GSH. VII

11 Conclusion. It is determined that there is a strict relationship between inflammation and oxidative stress during inflammation process induced by CAR. Key Words: Inflammation, jervine, carrageenin, lipid peroxidation, myeloperoxidase. VIII

12 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ A : Absorbans AA : Araşidonik asit ADP : Adenozin difosfat AMP : Adenozin monofosfat ASA : Asetilsalisilik asit B 1 : Bradikinin 1 B 2 : Bradikinin 2 BSA : Sığır Serum Albumin camp : Siklikadenozin monofosfat CAR : Karragenin CAT : Katalaz cgmp : Siklikguanozin monofosfat cnos : Yapısal nitrik oksit sentaz COX : Siklooksijenaz enzimi DIC : Diclofenac DNA : Deoksiribonükleik asit DSÖ : Dünya Sağlık Örgütü enos : Nitrik oksit sentaz IX

13 EÜ : Enzim ünitesi FAD : Flavin adenin dinükleotid GİS : Gastrointestinal sistem GPx : Glutatyon peroksidaz GR : Glutatyon redüktaz GSH : İndirgenmiş glutatyon GSSG : Yükseltgenmiş glutatyon GST : Glutatyon S-Transferaz H 1 : Histamin 1 H 2 : Histamin 2 IFN γ : İnterferon Ig : İmmunglobulin IL : İnterlökin İND : İndometazin inos : İndüklenebilir nitrik oksit sentaz İTK : İnce tabaka kromatografisi LO : Lipooksijenaz LPO : Lipit peroksidasyonu LPS : Lipopolisakkarit X

14 LT : Lökotrien MDA : Malondialdehit MPx : Miyeloperoksidaz NAD : Nikotinamid adenin dinükleotid NADPH : Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat NBT : Nitro blue tetrazolium NBT : Nitroblue tetrazolium nnos : Nöronal nitrik oksit sentaz NO : Nitrik oksit NO 2 : Azot dioksit NOS : Nitrik oksit sentaz NSAİİ : Steroidal olmayan antienflamatuvar ilaçlar PG : Prostaglandin PMN : Polimorfo nükleer PUFA : Polidoymamış yağ asiti RNA : Ribo nükleik asit SAİİ : Steroidal antienflamatuvar ilaçlar SKK : Silikajel kolon kromatografisi SOD : Süperoksit dismutaz XI

15 SSS : Santral sinir sistemi TAF : Trombosit aktive edici faktör TBA : Tiyobarbütirik asit TNF α ve β : Tümör nekrozis faktör TX : Tromboksan TXA2 : Trombosit agregan ajan ve vazokonstrüktör XII

16 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No SayfaNo Şekil 2.1. Araşidonik asit metabolitleri yolu Şekil 2.2. Veratrum album un toprak üstü kısımları Şekil 2.3. Veratrum album un toprak altı kısımları Şekil 2.4. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller Şekil 2.5. GSH ın molekül yapısı Şekil 3.6. TNF- miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil 3.7. IL-1 miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil 3.8. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil 3.9. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil Jervin in kimyasal yapısı Şekil Jervin in IR spektrumu Şekil Jervin in 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu Şekil Jervin in 13 C-NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu Şekil Jervin in DEPT 13 C-NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu Şekil Jervin in DEPT 13 C-NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu (0-80 ppm arası genişletilmiş spektrum Şekil Jervin in 1 H- 1 H COSY (CDCl 3, 400 MHz) Spektrumu Şekil Jervin in HMBC (CDCl 3, 400 MHz) Spektrumu Şekil Jervin in 13 C- 1 H COSY (HETCOR) (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pençe hacimleri üzerine XIII

17 Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkilerinin değişimini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe hacimleri üzerine saatlere bağlı olarak Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkilerinin değişimini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda serum örneklerinde tümör nekroz faktör (Tnf-Alpha) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda serum örneklerinde İnterlökin-1beta (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki miyeloperoksidaz (MPx) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki lipid peroksidasyonu (LPO) miktarları üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram XIV

18 Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki katalaz (CAT) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki glutatyon peroksidaz (GPx) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki glutatyon (GSH) miktarları üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki glutatyon-stransferaz (GST) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pençe dokularındaki glutatyon redüktaz (GR) enzim aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerini gösteren diyagram XV

19 TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Tablo 4.1. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak Sayfa No oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pence hacimleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkileri Tablo 4.2. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde alınan serum örneklerinde tümör nekroz faktör (Tnf-Alpha) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri Tablo 4.3. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde alınan serum örneklerinde İnterlökin-1 beta (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri Tablo 4.4. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki miyeloperoksidaz (MPx) akiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 4.5. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki lipid peroksidasyonu (LPO) seviyeleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 4.6. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki XVI

20 süperoksit dismutaz (SOD) enziminin aktiviteleri Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 4.7. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki katalaz (CAT) enziminin aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 4.8. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki glutatyon peroksidaz (GPx) enziminin aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 4.9. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki glutatyon (GSH) miktarları üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki glutatyon-s- transferaz (GST) enziminin aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pençe dokularındaki glutatyon redüktaz (GR) eziminin aktiviteleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri XVII

21 1. GİRİŞ Enflamasyon organizmada enfeksiyöz, fiziksel, kimyasal ve diğer etkenlerin neden olduğu doku hasarına karşı sellüler ve hümoral düzeyde oluşan güçlü ve abartılmış bir fizyolojik cevaptır. 1-3 Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya çıkan ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol sağladıktan sonra, hasarlanmış dokunun tamir ve yenilenmesini mümkün kılmaktır. 1-3 Enflamasyonun oluşmasında histamin, serotonin, bradikinin, nitrik oksit (NO), lipooksijenaz (LO) ürünleri, sitokinler, serbest oksijen radikalleri, lizozomal enzimler ve prostaglandinler (PG) gibi enflamasyon mediyatörlerinin rolü iyi bilinmektedir. 4-7 Enflamasyon akut ve kronik olmak üzere iki şekilde sınıflandırılır. Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün sürer. Akut enflamasyon eksudasyon (vasküler) ve lökosit akümülasyonu (hücresel) ile karakterizedir. 1,8,9 Enflamasyonun bu fazında çok sayıda faktör rol oynar ve bu faktörlerden bir grubununda antioksidan sistem olduğu düşünülmektedir. Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin birlikte görüldüğü uzun süreli bir enflamasyon olarak kabul edilir. 3,10,11 Kronik enflamasyon zor iyileşen enfeksiyonlar, potansiyel toksik ajanlara uzun süre maruz kalma ve otoimmün hastalıklar sırasında oluşabilir Akut enflamasyonu kronik enflamasyon izleyebilir. Akut enflamasyon oluşumundan çok kısa bir süre sonra proliferatif hücrelerin oluşması ile enflamasyon kronikleşerek devam eder; bu hücreler yaygın veya granüloma şeklinde olur. 15 Antiproliferatif etki, ilaçlar tarafından kollajen liflerinin oluşumunun engellenmesi, 1

22 mukopolisakaridlerin baskılanması şeklindedir. 16 Kronik enflamasyonda nötrofil infiltrasyonu ve eksudasyondan daha ziyade monosit infiltrasyonu ve fibroblast proliferasyonu rol oynar. Aktive edilmiş monositler ve makrofajlar; antitümör, antimikrobik ve patojenlere karşı fagositoz fonksiyona sahip kan hücreleridir. 17 Hem akut hemde kronik enflamasyon araştırmalarında çeşitli deneysel modeller geliştirilmiştir. Karragenin enflamasyon modeli, maddelerin enflamasyonun akut fazına etkilerini araştırmak için, cotton pellet granuloma testi ise enflamasyonun kronik fazına etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır. 15,16 Akut enflamasyonun oluşmasında eikosanoidlerin (araşidonik asit metabolitleri) rolü bilinmektedir. 13 Steroidal ve nonsteroidal antienflamatuvar ilaçların etki mekanizması enflamasyonun kimyasal mediyatörlerinin sentezini inhibe etme esasına dayanmaktadır. 17 Steroidal antienflamatuvar ilaçlar (SAİİ) olarak bilinen glukokortikoidler adrenal kortekste sentez edilirler. Bazı çalışmalar ilaçların antienflamatuvar etki mekanizmasında adrenal korteks hormonlarının rolünün olduğunu göstermiştir. 18 Liliaceae (Zambakgiller), Liliales bitki takımına ait bir bitki familyasıdır. Bu familyada özellikle rizom, yumru ve soğan gibi toprakaltı kısımlarıyla çok yıl yaşayan otsu bitkiler bulunur. 19 Dünya florasında bu familya 250 cins ve 3500 kadar türle temsil edilmektedir. Ülkemiz florasında 44 cins ve 430 türün yayılış gösterdiği bilinmektedir. 20,21 Bu familyaya ait bitkiler fitokimyasal ve farmakolojik yönden birçok bilimsel araştırmanın konusu olmuştur Bu familyaya ait bitkilerin farmakolojik özelliklerinin sentezledikleri kompleks yapılı steroidal alkaloitlerden ileri geldiği düşünülmektedir. 25 2

23 Veratrum, Zambakgiller familyasına ait önemli bir bitki cinsidir. Dünya florasında, kuzey yarım kürenin ılıman bölgelerinde 45 civarında Veratrum türü yetişmektedir. Asya, Avrupa ve Kuzey Amerika da yayılış gösteren Veratrum türlerinin 20 kadarına Çin de rastlanmaktadır. Bu bitki türü Çin de çok iyi tanınmakta ve geleneksel tıpta yaygın bir kullanıma sahiptir. Veratrum türlerinin kuru kök ve rizomlarından hazırlanan ilaçlar Çin kaynaklarında Lilu ismiyle bilinmektedir. Eski Çin tıp kaynaklarında Lilu dan yüksek tansiyon, iltihaplanma, pıhtılaşma ve spazm gibi rahatsızlıkları tedavi edici bitki olarak bahsedilmektedir Kızılderililer ve sanayileşme öncesinde Avrupalılarda; öksürük, boğaz ağrısı, bademcik iltihaplanması, ruh hastalıkları, sara hastalığı, sarılık, uyuz, bakteriyel enfeksiyonlar, yılan sokması, zührevi hastalıklar ve yaralanmalar gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde Veratrum türleri kullanılmıştır. 22,25,29 Veratrum türleri, hellebore, Amerikan çöplemesi, yalancı çöpleme ve beyaz çöpleme gibi yerel isimlerle bilinmektedir. 29 Veratrum türlerinin 300 yılı aşkın bir süredir farmakolojik aktiviteleri dikkat çekmiştir. Veratrum türlerinden elde edilen ekstreler 1950 li yıllara kadar bazı zararlı böcek türlerine karşı insektisit olarak kullanılmıştır. 30 Bu nedenle 1930 lu yıllardan itibaren Veratrum türleri üzerinde fitokimyasal çalışmalar yapılmış ve 100 ün üzerinde değişik farmakolojik özelliklere sahip alkaloit tipli metabolit tespit edilmiştir. 31 Veratrum bitkilerinde alkaloitlerin yanı sıra flavonoit ve stilbenoit sınıfına dahil maddelerin olduğu da rapor edilmiştir Bunlar arasında en fazla biyolojik aktivite gösteren metabolitlerin steroidal alkaloitler olduğu tespit edilmiştir. 23,24,33,38,39 Son yıllarda kimyasal maddelerin yapı belirlenmesinde spektroskopik yöntem ve tekniklerin gelişmesi (özellikle de 2D-NMR yöntemleri) ile Veratrum türlerinde birçok metabolitin kimyasal yapısı aydınlatılmıştır Aynı zamanda alkaloitlerin yapı karakterizasyonu ve biyolojik aktiviteleri üzerine yapılan bilimsel çalışmalar da artmıştır. 27 3

24 Bu bilimsel çalışmalar doğrultusunda mevcut çalışmanın amacı; halk hekimliğinde kullanımı ile ilgili yeterli bilgi sahibi olmadığımız fakat ülkemizde geniş yayılış gösteren Veratrum album un rizomlarından izole edilip Jervin molekülünün karrageninle (CAR) akut enflamasyon modelinde antienflamatuvar etkisinin ve etki mekanizmasının araştırılıp, mekanizmasının aydınlatılmasıdır. 4

25 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Enflamasyon Enflamasyon ilk kez M.S. I. yüzyılda yaşamış olan Celsus tarafından, kızarıklık, sıcaklık artışı, ağrı ve şişme şeklinde tanımlanmış olup; sonraları fonksiyon kaybı da bu özelliklere eklenmiştir. 40,41 Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya çıkan ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol sağladıktan sonra, hasarlanmış dokunun tamir ve yenilenmesini mümkün kılmaktır. 1-3 Enflamasyonlarla ilgili birçok sınıflandırma olsa da kabul gören sınıflandırma enflamatuvar prosesin süresi göz önüne alınarak yapılan sınıflandırmadır. Bu sınıflandırmaya göre enflamasyon akut ve kronik olmak üzere ikiye ayrılır. 40, Akut Enflamasyon Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün sürer. Akut enflamasyon eksudasyon (vasküler) ve lökosit akümülasyonu (hücresel) ile karakterizedir. 1,8,9 Vasküler Değişiklikler: Akut enflamatuvar prosesde kan damarları reaksiyonun merkezini oluşturur. Akut enflamasyonun üç temel komponenti bulunmaktadır; 1. Vasküler çap değişikliği (vazodilatasyon), kan akımında artış (konjesyon-staz) 2. Mikrovasküler sahada yapısal değişiklikler, permabilite artış Lökositlerin endoteli geçerek zedelenen dokuda toplanması. 44 Enflamasyonun en erken fazında çok kısa süreli refleks vazokonstrüksiyon olur. 45 Bunu takiben arteriol kapiller yatak ve venüllerde oluşan vazodilatasyon meydana gelir Vazodilatasyon artışı bölgesel kan akımını artırarak, intravasküler hidrostatik basıncı yükseltir. Bu basınç yükselmesi stazı ortaya çıkarır. Staz sonucu 5

26 ekstravasküler dokuya proteinden zengin sıvı geçerek ödemi oluşturur. 2,42,43 Staz sonucu doku aralığında biriken bu sıvının o bölgede birikmiş olan toksik ve irritan maddelerin dilüe edilmesinin yanı sıra, lökosit ve kompleman faktörlerinin taşınmasında da önemli rolleri vardır. 40,42 Hücresel Değişiklikler: Akut enflamasyonun ikinci ayağını oluşturan lökosit hareketleri üç aşamada oluşur. Marginasyon denen ilk aşamada lökositler damar içinde perifere doğru yer değiştirerek vasküler endotelle karşı karşıya gelirler. Adezyon denilen ikinci aşamada lökositler endotele sıkı bir şekilde yapışırlar. Migrasyon aşamasında ise lökositler kemotaktik ajanlar yardımıyla endotel dışına hasarlı bölgeye göç ederler. 40,42, 48,49 Lökositler vasküler lümenden ekstravasküler boşluğa çıkarak, hasarlı bölgede mikroorganizmaları öldürüp, nekrotik dokuları ve yabancı antijenleri parçalayıp, kimyasal mediatörleri ve oksijen radikallerini serbestleştirerek doku hasarına yol açar. 40, 50,51 Lökositlerin bu hâkimiyeti ilk 6-24 saat sürerken, takip eden saatte bu tablo monositlerin lehine dönüşür. 52 Enflamasyonun Kimyasal Mediatörleri: a-vazoaktif Aminler Histamin: Histamin biyolojik sistemlerde belirli hücrelerde sentez edilip depolanan endojen aktif maddedir. Özellikle vücudun iç kısımlarının dış ortamla temas ettiği bölgelerde, (akciğer, gastrointestinal sistem, deri gibi) histamin miktarı nisbeten yüksektir. 53 Kanda histaminin ana deposu bazofil lökositlerdir. Histaminin en zengin kaynağı bağ dokusu mast hücreleridir. Mast hücreleri histamini sentezler ve salgı granüllerinde depo eder. Antijen-antikor kompleksi, ısı, soğuk, toksinler, travma ve kimyasal ajanlar histaminin salınmasına yol açar. Salgılanan histamin akut hipersensitivite ve allerjik 6

27 cevapta önemli rol oynar. Histaminin kardiyovasküler sistemdeki en önemli etkisi (vazodilatasyon nedeniyle) arteryal kan basıncını düşürmesidir. Histaminin damarlardaki etkisi, kapiller permabiliteyi artırarak hücre dışı alana plazma, protein ve sıvı sızmasını sağlaması şeklindedir. Lenf dolaşımındaki sıvı miktarı ve protein içeriğindeki artışla ödem oluşur. 45,54 Artmış histamin endotelial hücreleri kasar. Bu durumda da plazma proteini ve plazma sıvısı buradan serbestçe geçer. Endotelde bulunan ve bir adhezyon molekülü olan P-selektin in varlığı sayesinde lökosit migrasyonu artırılır. 55 Cilt içine ufak dozda histamin injekte edilmesi Lewis in üçlü cevabı denilen bir reaksiyonun oluşmasına neden olur. 56 Bu reaksiyonda histamin tarafından damarların genişletilmesi, kapiller permeabilitesinin arttırılması ve afferent sinir uçlarının stimüle edilmesi rol oynar. 45,54 İnjeksiyon yerinde önce bir kızarıklık ve daha sonra kan sıvısının sızması sonucu ödem papülü oluşur. Bu kızarıklık ve onun yerini alan papül, üçlü cevabın iki öğesini oluşturur. Üçüncü öğe ise papül çevresinde oluşan nisbeten geniş bir alana yayılan ve dış sınırı düzensiz olan hale şeklindeki kızarıklıktır. 53 Bu kızarıklık akson refleksi sonucu cilt damarlarının genişlemesine bağlıdır. Histamin damar dışındaki diğer düz kasları nadiren gevşetir, genellikle kasar. Vazodilatatör etkiden Histamin 1 (H 1 ) ve Histamin 2 (H 2 ) reseptörleri, permeabilite artışından ise sadece H 1 reseptörleri sorumludur. Kasılma çoğunlukla H 1, gevşeme ise H 2 reseptör aktivasyonuyla olur. İnsan bronş düz kaslarında H 1 reseptörlerinin kasıcı etkileri baskındır. Barsak kaslarında histamin cevapları bölge ve türe göre değişir. Fakat klasik etki kasılmadır. 53 Mesane, üreter, safra kesesi, iris ve çoğu diğer düz kas histamin tarafından çok az etkilenir. Histamin çeşitli sinir uçlarını stimüle eder. Bu yüzden epidermisden salındığında kaşıntıya yol açar, dermiste ağrı hissi uyandırır. Periferik nöronlarda histamin reseptörleri genellikle H 1 tipindedir. 7

28 Serotonin: Serotonin ya da diğer adıyla 5-HT (5-Hidroksitriptamin) esansiyel bir aminoasit olan triptofandan sentezlenir. 57,58 Serotonin sentezinin başlangıç ve hız kısıtlayıcı enzimi triptofan hidroksilazdır. 57 Yetişkin bir insanda ortalama 5 10 mg serotonin bulunmaktadır. İntestinal mukozada bulunan enterokromaffin hücrelerde lokalize olmuştur. Serotonin burada düz kasları stimüle ederek gastrointestinal motiliteyi arttırır. 58 Kandaki tüm serotonin trombositlerde depolanır. Trombositlerde serotonin sentez edilmez, trombositler serotonini plazmadan alırlar ve depolarlar. Trombosit agregasyonu ile salınımı uyarılır. 2 Serotoninin lokal enjeksiyonu o bölgede enflamasyona yol açar. 59 b-plazma Proteazları Kompleman Sistemi: Kompleman, çoğunluğu enzim prekürsörü olan toplam 20 kadar proteini kapsayan genel bir tanımdır. Normalde bu proteinlerin tümü plazma proteinleridir ve kapiller damardan dokuya sızan plazmada da bulunurlar. C1 den C9 a kadar sıralanan komponentler normalde plazmada inaktif halde bulunurlar. Aktivasyonları klasik ve alternatif olmak üzere iki yolla olur. 3,58,60 C3 ün ayrışması en kritik aşama olup, her iki yolda bu noktadan sonra ortak aktivasyon şeklini izler. Antijen-antikor kompleksleri klasik yolu, mikrobiyal yüzeyler ve polisakkaritler ise alternatif yolu aktive ederler. 1. Opsonizasyon ve Fagositoz: Kompleman reaksiyon zincirinin bir ürünü olan C3b, nötrofil ve makrofajların fagositozunu uyarır. Bu hücrelerin antijen-antikor kompleksini bağlamış olan bakteriyi içlerine almalarını sağlar. Bu işlem opsonizasyon adını alır ve yok edilen bakteri sayısını yüzlerce kat artırabilir. 1-3,10,60 2. Lizis: Kompleman reaksiyon zincirinin en önemli ürünlerinden biri litik kompleks adını alan, kompleman faktörlerinden bir çoğunun oluşturduğu ve C5b6789 8

29 olarak gösterilen moleküler komplekstir. Bu kompleksin bakteri ya da diğer istilacı organizmaların membranlarını direkt yırtma etkisi vardır. 1-3,10,60 3. Aglütinasyon: Kompleman ürünlerinin istilacı organizmanın yüzeyini değiştirerek birbirlerine yapışmalarını ve aglütinasyonlarını kolaylaştırıcı etkidir. 1-3,10,60 4. Virusların Nötralizasyonıı: Kompleman enzimleri ve diğer kompleman ürünlerinin bazı viruslerin yapılarına saldırarak, onları avirulan hale getirmesidir. 1-3,10,60 5. Kemotaksi olay: C5a fragmanı nötrofil ve makrofajların kemotaksisini ve böylece çok sayıda fagositin antijenik ajanın bulunduğu bölgeye göçmesini sağlar. 1-3,10,60 6. Mast Hücresi ve Bazofil Aktivasyonu: C3a, C4a ve C5a mast hücresi ve bazofilleri aktifler. Aktiflenen bu hücreler lokal sıvılara histamin, heparin ve diğer maddeleri salgılarlar. Bu maddelerin salgılanması bölgesel kan akımını, dokulara sıvı ve plazma proteinlerinin sızmasını artırır ve antijenik ajanın hareketsizleştirilmesini ve inaktivasyonunu sağlar. Enflamatuvar Etkiler: Mast hücreleri ve bazofilleri uyararak oluşturdukları enflamatuvar etkilerinin yanısıra, diğer birçok kompleman ürününün de lokal enflamatuvar etkisi vardır. Bu kompleman ürünleri artmış olan kan akımını daha da artırarak kapillerlerden dokuya protein sızmasını sağlarlar. Sızan bu proteinler doku aralıklarında pıhtılaşarak saldırgan organizmaların dokular arasında yayılmasının engellenmesini sağlar. Pıhtılaşma Sistemi: Koagülasyon sıvı olan kanın, pıhtı ya da trombus denilen jel kıvamlı katı bir maddeye dönüşmesidir. Pıhtılaşma plazma proteinlerinden fibrinojenin fibrine dönüştüğü zaman gerçekleşir. Fibrinojen karaciğer tarafından yapılan ve normal insanların serumunda her zaman bulunan çubuk şeklinde bir proteindir. 3 Fibrin başlangıçta gevşek ağ gibidir. Oluştuktan hemen sonra kovalent 9

30 çapraz bağların oluşmasıyla kuvvetlenir. Bu olay faktör XIII denilen bir plazma enzimi sayesinde gerçekleşir. Fibrinojen kanda her zaman bulunur. Trombin normalde kanda bulunmaz, yalnızca pıhtılaşma olayı uyarıldığı zaman oluşur. 3 Uyarılmadan önce kanda protrombin denilen inaktif şekilde bulunur. Kan damarının yaralandığı bölgede enzimatik olarak trombine çevrilir. Trombin de faktör XIII i aktive eder. Pıhtılaşmaya bırakılan kan örneğinde pıhtılaşma sonrası ayrılan sıvıya serum denir. 11 Serum plazmadan farklı olarak fibrinojen ve bazı pıhtılaşma faktörlerini kapsamaz. Bunun dışında bileşimi plazma ile aynıdır. Pıhtılaşma olayında rol oynayan trombin lökosit adezyonunu kuvvetlendirir. Fibrinojenin fibrine dönmesi sırasında oluşan fibrinopeptidler de vasküler permabiliteyi artırırken lökositler için de kemotaktiktirler. Kinin Sistemi: Hageman faktörün aktivasyonu sonrası oluşan bir sistemdir. enflamatuvar reaksiyonlarda önemli rolleri vardır. 2,61,62 Kinin sisteminin aktivasyonu dolaşımdaki yüksek moleküler ağırlıklı kininojenin bradikinine dönüşmesini sağlar. Bradikininde histamine benzer şekilde vasküler permeabiliteyi artırır, arterioler dilatasyon yapar. Ekstravasküler düz kas kasılmasına yol açar. 63 Ayrıca deriye enjekte edildiğinde ağrı oluşturur. 64,65 Bradikininin etkisi kısa sürelidir. Çünkü plazma ve dokularda bulunan kininazlarla hızlı bir şekilde parçalanır. Bradikininler, substans P ve prostanoidler ağrı yolaklarını stimule ederler ve enflamasyonun dolor u oluşur. Kininler etkilerini Bradikinin 1 (B ı ) ve Bradikinin 2 (B 2 ) olarak adlandırılan iki tip reseptörle oluştururlar. 61,65,66 B ı reseptörleri doku hasarı ve enflamasyon gibi patolojik durumlarda indüklenirken, normal dokularda bulunmaz. 64 B 2 reseptörleri afferent sinir uçlarında ve santral sinir sistemi (SSS) de bulunur, ağrı reseptörlerinin duyarlılığını artırır. 64,67,68 10

31 Kininler vücutta bulunan enflamasyon veya doku hasarında, aktifleşen çeşitli hücrelerden serbest radikaller ve proenflamatuvar etkili maddelerinin de salınımına katkı sağlarlar. Mast hücrelerinden histamin salınımını da artırırlar. 62 P Maddesi: P maddesi SSS de yaygın olarak bulunur. 69 P maddesinin periferden gelen ve nosiseptif uyarıları SSS ye taşıyan primer duyusal nöronlarda, omuriliğin arka boynuzunda ve duyusal trigeminus çekirdeğindeki akson uçlarında glutamat ile birlikte bulunduğu gösterilmiştir. P maddesi SSS de ağrının birinci nörondan ikinci nörona taşınmasında rol oynar. Yapılan birçok deneysel çalışma P maddesinin enflamatuvar cevaba katkısı olduğunu desteklemektedir. 70,71 Lewis in üçlü cevabında vazodilatasyon yapması 72 ve ayrıca karrageninle oluşturulan enflamasyon modelinde (sıçan pençesinde yapılan ölçümlerde 15. dakika ve sonrasında) P maddesinin artması bu kanıtı desteklemektedir. 47 c-araşidonik Asit (AA) Metabolitleri AA poliansatüre bir yağ asidi olup hücre membranındaki fosfolipidlerde önemli bir miktarda bulunur. Sellüler fosfolipaz aktivasyonuyla membran fosfolipitlerinden ortaya çıkar. 73 Hücresel fosfolipazlar mekanik, kimyasal, fiziksel uyarı veya C5a gibi iltihabi mediatörlerce aktive edilirler. AA metabolizması iki major yoldan biri şeklinde ilerler. AA metabolizmasından kaynaklanan ürünler başta enflamasyon, ateş, ağrı ve hemostaz olmak üzere, birçok biyolojik olay üzerine etkilidir. 74,75 Bu ürünler kısa zamanlı hormonlar olarak değerlendirilirler. 75 Yapıldıkları yerde lokal olarak etki ederler ve daha sonra çok hızlı bir şekilde spontan veya enzimatik olarak yok edilirler yılında Von Euler prostat bezinde bulduğu bir maddenin düz kasları kastığını farketmiş ve bulduğu yerden esinlenerek bu maddeye Prostaglandin (PG) adını vermiştir

32 AA metabolitlerine Eikosanoidler de denir. Eikosanoidler prekürsör yağ asitlerinden oluşumlarında rol oynayan enzim türüne göre; COX ürünleri, LO ürünleri ve 450 monoksijenaz ürünleri şeklinde 3 ana gruba ayrılır. 77,78 Siklooksijenaz (COX) Yolu Ürünleri: Burada PGE2, PGD2, PGF2 α, PGI2 ve tromboksan (TXA2) bulunur. AA, COX ile siklik endoperoksitlere (PGG 2, PGH 2 ) dönüşür. 79,80 PGH 2 çok labil bir madde olup diğer biyolojik ürünlerin öncüsüdür. Prostaglandin E, F ve D ler doğrudan doğruya siklik endoperoksid ara ürünlerinden oluşurlar ve bunlara primer PG ler adı verilir. 81,82 Primer PG ler enflamasyonda anahtar mediatör olarak rol oynarken, bunların her biri spesifik bir enzim etkisi ile oluşur. Bu enzimlerin bazılarının dokulardaki dağılımı sınırlıdır. Örneğin trombositlerde tromboksan sentetaz enzimi vardır. Dolayısıyla güçlü bir trombosit agregan ajan ve vazokonstrüktör olan TXA2, ana PG ürün olarak bu hücrelerde bulunur. 83,84 Diğer yandan endotel tromboksan sentetaz içermez. Ancak PGI2 oluşumunu sağlayan prostasiklin sentetaz içerir. PGI2 güçlü bir trombosit agregasyon inhibitörü ve ayrıca önemli bir vazodilatatördür. 83,84 PGD2, COX yolunun mast hücrelerindeki ana metabolitidir. PGE2, PGF2 ile birlikte bulunur. PGD2 vazodilatasyona neden olur ve ödemi artırır. Aspirin ve ibuprofen gibi NSAİİ ler proksimal COX aktivitesini inhibe ederler. Bu antienflamatuvar ajanlardan LO yolu etkilenmez. Son yapılan çalışmalarda COX un iki formu olduğu gösterilmiştir. 83,85 COX-1 ile COX-2 arasındaki en önemli fark COX-1 in esas olarak konstitütif, COX-2 nin ise indüklenebilir olmasıdır. 86 Bu iki enzim % 60 oranında, homolog aminoasit dizilişine sahip olup farklı genler tarafından kodlanmaktadır. 74 İlginç olarak gastrik mukozada COX-1 mevcutken, COX-2 yoktur. Bu bölgede mukozal PG ler COX-1 etkisiyle oluşurlar ve aside bağlı hasarı engellediklerinden koruyucudurlar. NSAİİ ve aspirin, COX u inhibe ederek PG sentezini bloke edip, enflamasyonu azaltırken, gastrik ülsere 12

33 de zemin hazırlar. Antienflamatuvar etkilerini korumak ve gastrik mukoza üzerindeki zararlı etkilerinden kaçınmak için birçok sayıda ve oldukça seçici COX-2 inhibitörleri geliştirilmiştir. Bunlardan gastrik mukoza ülserasyonu oluşturmadan antienflamatuvar etkiler beklenmektedir. COX-1 ayrıca damar endotelinde, trombositlerde, böbrek glomerül ve tubulüs hücrelerinde ve vezikula seminaliste fazla miktarda bulunur. COX- 2 nin başta endotoksinler, IL-1 α, IL-6 ve TNF-α olmak üzere enflamasyona neden olan değişik faktörlerce (bazı büyüme faktörleri, trombosit aktive edici faktör, endotelin, koryonik gonadotropin, serotonin ve ayrıca mekanik bir uyarı olan sürtünme stresi) indüklenir. Bu nedenle COX-2 nin olması, enflamasyon gibi patolojik olaylardan sorumlu olan PG lerin sentezlenmesinde rol aldığını düşündürmektedir. 74,77,87 COX-2 nin sentezlenmesinden sorumlu olan gen glukokortikoidler ile baskılanabilir. Sadece dışardan verilen glukokortikoidler değil bazal glukokortikoidlerin de COX-2 yi süprese edebildikleri gösterilmiş olup, COX-1 geni için bu sözkonusu değildir. 88 PGE1: İntradermal injeksiyonu eritem ve hiperaljezi oluşturur. CAR, histamin, bradikinin ile oluşan ödematöz cevabı potansiyelize eder. Pirojen olduğu söylenmektedir. 88 PGE2: Hiperaljezi oluşturur. Çok düşük dozlarda bile olsa CAR, histamin, bradikinin ile oluşan ödematöz cevabı potansiyelize eder. Düşük dozlarda diğer enflamasyon mediatörlerinin etkilerini arttırırken yüksek dozlarda direkt enflamatuvar etki oluşturur. 88 PGG2: Etkileri PGE2 ye benzemektedir

34 Stimulus Hücre membran harabiyeti Kortikosteroidler r Fosfolipidler Fosfolipaz Araşidonik asit Lipoksijenaz Siklooksijenaz NSAİİ LTB 4 Fagosit İnflamasyon Lökotrienler LTC 4 /D DP değişiklikleri Bronkokonstriksiyon PG ler TX PGI 2 Lökosit modülasyonu İnflamasyon Şekil 2.1. Araşidonik asit metabolitleri yolu Lipooksijenaz (LO) Yolu Ürünleri: 5-lipooksijenaz nötrofillerde baskın olarak bulunan AA metabolizması enzimidir. AA, 5-hidroperoksieikotetraenoik asit (5- HPETE) AA nın 5-hidroperoksi ürünüdür. 5-HPETE oldukça kararsızdır; ya 5-HPETE 5-Hidroksieikosatetraenoik asite (5-HETE) indirgenir ya da topluca lökotrienler diye adlandırılan bileşiklere dönüşür. 89,90 5-HPETE den türeyen ilk LTA4 olup bu enzimatik hidrolizle LTB4 e dönüşür veya glutatyon eklenmesiyle LTC4 oluşur. 81,91,92 Bunların alt ürünleri olan LTD4 ve LTE4 vazokonstrüksiyon, bronkospazm ve vasküler permeabilite artışına neden olurlar. LTB4 lökosit, monosit ve doğal öldürücü hücrelerin güçlü stimülasyonuna ve kemotaksisine, nötrofil aktivasyonuna, lizozomal enzim ve süperoksit salınımına ve sitokinin üretimine yol açan proenflamatuvar bir maddedir. 81,91,93 Özet olarak; ağrı ve ateş mekanizması da dahil olmak üzere eiokosanoidler akut enflamasyonun her aşamasında yer alırlar. 14

35 d-trombosit Aktive Edici Faktör (TAF): TAF fosfolipid kökenli mediatör olup mast hücresi ve bazofil başta olmak üzere birçok hücreden salınır. Trombosit agregasyonuna ve degranülasyona sebep olması nedeniyle bu şekilde adlandırılmıştır. TAF asetil gliserol eter fosfokolin yapısındadır. Fosfolipaz A 2 etkisiyle nötrofillerin, monositlerin, bazofillerin, endotelin, trombositlerin ve diğer bazı hücrelerin membran fosfolipidlerinden elde edilir. 94 Trombositlerin uyarılmasının yanı sıra vazokonstriksiyon ve bronkokonstriksiyona sebep olur. Vazodilatasyonun stimüle edilmesinde ve damar geçirgenliğinin artırılmasında, histaminden 100 ile kez daha güçlüdür. Aynı zamanda lökosit adezyonunu, kemotaksisini, lökosit degranülasyonunu ve oksidatif reaksiyonları artırır. Hedef hücreleri spesifik reseptörleri üzerinden etkiler. Böbrek kan akımını azaltır. Kalpte negatif inotrop etkiye neden olur. 94,95 Eikosanoidler başta olmak üzere diğer bazı mediatörlerin sentezini de stimüle eder. e-sitokinler: Sitokinler aktive olmuş lenfositler ve makrofajlar başta olmak üzere birçok hücreden sentezlenen ve diğer hücrelerin fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol oynayan polipeptid yapıdaki maddelerdir. Hücresel immün cevap üzerine etkilerinin yanısıra enflamatuvar yanıtın oluşumunda da ilave önemli rolleri vardır. 1,9,10,57,60,69,96 Enflamasyonun oluşmasında rol alan en önemli sitokinler; IL-1, IL-8, TNF-α ve β, IFN-γ ve kemokinlerdir. Sistematik akut faz reaksiyonlarını stimüle eden bu sitokinlerin endotel, lökositler ve fibroblastlar üzerine lokal etkileri de bulunmaktadır. 9,69 IL-1 ve TNF-α, aktive olmuş makrofajlar tarafından sentezlenir. 1,60 Sitokinler hücre bölünmesi ve farklılaşmasının kontrolü, hematopoez ve bağışıklık sisteminin regülasyonu, yaraların iyileşmesi, kemik formasyonu ve hücresel 15

36 metabolizmanın değiştirilmesi gibi biyolojik olaylarda rol oynamaktadır. Sitokinler immün ve enflamatuvar cevabın etkin mekanizmalarının çoğuna katılırlar. 97 Lenfokin, monokin, IL ve IFN olarak da adlandırılan sitokinlerin ortak karakteristik özellikleri: 98,99 1. Sitokinler doğal ve spesifik immünitenin efektör fazında yapılırlar. 2. Bir sitokin değişik tip hücreler tarafından yapılabilir. 3. Bir sitokin değişik tip hücreler üzerine etki gösterebilir. 4. Düşük molekül ağırlıktadırlar. 5. Bir sitokinin aynı hedef hücre üzerinde farklı etkileri olabilir. Bu etkilerin bazıları aynı anda, bazıları ise dakikalar saatler hatta günler sonra oluşabilir. 6. Birden fazla sitokin aynı etkiyi gösterebilir. 7. İki sitokin birbirlerinin etkisini ortadan kaldırabilir (antagonizm), arttırabilir (sinerji) hatta değişik bir etkiye yol açabilir. 8. Sitokin sentez ve sekresyonu kısa süreli olaylardır. Sentezleri genellikle yeni gen transkripsiyonu ile başlar, hücrede önceden yapılmış halde bekletilmezler. 9. Sitokinler hedef hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanarak etkilerini başlatırlar. 10. Belli bir biyolojik etkiyi sağlamak için gereken sitokin miktarı genellikle çok düşüktür. 11. İmmünite ve enflamasyon reaksiyonlarında vücut cevabının amplitud ve süresini regüle ederler. 12. Daima geçici süre ile ve lokal olarak sentezlenirler. 13. Son derece potenttirler. Sitokinlerin sekresyonu, endotoksinler, immün kompleksler, fiziksel travma ve bazı enflamasyon mediatörleri tarafından stimüle edilir. IL-1 ve TNF-α, endotelyal 16

37 aktivasyon olarak isimlendirilen bir grup değişikliği stimüle eder. 9 Bu değişiklikler adhezyon moleküllerinin artmış dışa vurumu, bazı sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin sekresyonu, eikosanoidlerin ve NO nun sentezlenmesi ve endotel trombojenisitesinin artmasıdır. TNF-α, endotoksin ile karşılaşmış makrofajlar tarafından meydana getirilen ve salman potent bir biyolojik madde olup kaşektin olarak da bilinir. 100 TNF nin bulunması, 1800 lerde Coley in piyojenik bakteri ekstresi ile tedavi edilen hastalarda dramatik anti-tümör cevabın elde edildiğine dair tanımlamalar yapmasına kadar uzanmaktadır. 101 TNF-α ve IL-1, enflamatuvar eklem hastalığının patofizyolojisinde rol oynadığı düşünülen birçok biyolojik aktiviteyi paylaşmaktadırlar. 102 IL-l gibi TNF de in vitro olarak immün sistem üzerinde kuvvetli etkilere sahiptir. Bunlar arasında T- hücre proliferasyonunda, majör histokompatibilite kompleksi (MHC) klas 1 ve 2 ekspresyonunda artış ve diğer sitokinlerden IL-1, IL-2, IL-6 ve IL-8 sentezinin uyarılması sayılabilir. 103 TNF-α, ayrıca nötrofillerin agregasyonu ve aktivasyonunu stimüle eder. Mezenkimal hücrelerden proteolitik enzimlerin salınımını uyararak doku hasarına neden olur. 2 IL-1 ve TNF-α enfeksiyonlara ya da yaralanmalara eşlik eden sistemik akut faz reaksiyonlarını uyarır. 1,69 Bunun yanı sıra TNF-α septik şokta hipotansif etkilerin ortaya çıkmasına neden olan NO sentezini de indükler. IFN-γ makrofaj ve nötrofiller için güçlü bir aktivatördür. Onların oksidatif yıkımdan sorumlu enzimlerini arttırarak fagosite edilmiş mikroorganizmaların öldürülmesini sağlar. Aynı zamanda önemli bir NO sentaz uyarıcısıdır. 9 Kemokinler enflamatuvar hücreler için kemotaktik moleküller olmaları ve bazı sitokin etkilerini göstermeleri nedeniyle bu şekilde adlandırılmışlardır. İlk tanımlanan 17

38 kemokinlerden birisi olan IL-8, güçlü bir kemotaktik ajandır. Başlıca nötrofilleri aktive eder. 1,9,69 IL-1 ve TNF-α ya cevap olarak aktive olmuş makrofajlardan, endotelden ve fibroblastlardan salınır. g- Nitrik Oksit ve Oksijen Kaynaklı Serbest Radikaller: Nitrik Oksit (NO): Otokrin ve parakrin bir hücresel ajan olan NO, normal fizyolojik koşullar ile birçok patofizyolojik durumda homeostazın sürdürülmesinde önemli bir etkendir. Memelilerde nitrik oksidin varlığı ilk kez 1916 yılında gösterilmiş olup 1985 de aktive olmuş makrofajların NO saldığı bulunmuştur. 104 Makrofajlar tarafından mikroorganizmalar ve tümör hücrelerine karşı sitotoksik bir metabolit olarak kullanılır. Siklikguanosin monofosfatın (cgmp) düzeyini yükselterek, damar düz kaslarında gevşemeye yol açan guanil siklazı aktive eder. NO, L-argininden sitrulin oluşumu sırasında, L-argininin guanidin nitrojen grubunun hidroksilasyonu ile oluşan ara üründür. Bu reaksiyon bir dizi NO sentaz (NOS) enzimi tarafından katalize edilir Nitrik oksit sentaz enzimleri yapısal nitrik oksit sentaz (cnos) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inos) olmak üzere iki ana gruba ayrılır. 108 Yapısal NOS vasküler endotelde, nöronlarda ve trombositlerde bulunur. 109 Nöronlarda bulunan, nöronal nitrik oksit sentaz (nnos), endotel hücrelerinde bulunan endotelyal nitrik oksit sentaz (enos) adını alır. cnos kardiyomiyositler, hepatositler, nöronlar, mikroglial hücreler, nötrofiller, vasküler endotel ve düz kas hücrelerinde bulunur. Yapısal NOS tarafından yapılan nitrik oksit hücreler arası ve hücre içi haberleşmede rol oynar. Yapısal NOS enzimleri ortamdaki kalsiyum konsantrasyonlarının artışından etkilenirken, inos etkilenmez. 110,111 inos un enflamasyon olayının fizyopatolojisinde önemi rol aldığı bilinmektedir. Bu enzimler IL-1, TNF-α, IFN-γ; gram negatif bakterilerin duvarında bulunan lipopolisakkarit (LPS) 18

39 tarafından oluşturulan mediatörler ve çeşitli enflamatuvar sitokinlerle uyarılmaktadır. 112 Yapısal NOS çeşitli organ sistemleri için bazal seviyelerde gereklidir. 109 Arterlerde venlerden daha fazla NO üretilir. 113 NO enflamasyonda birçok rol üstlenir. 112,114,115 Enflamasyondaki bu rolleri: damar düz kas gevşemesi, 116,117 trombositlerin çeşitli aşamalarda aktivasyonu, 112,118,119 aktive makrofajlarda mikroorganizmaları öldüren ajan olması, 112 lökosit endotel ilişkisinin sağlanması, 120 endotel hücre adhezyon moleküllerinin salınımı, 121 Lenfosit proliferasyonu 122 şeklinde özetlenebilir. NO nun serbest oksijen radikalleriyle etkileşimi ve antioksidan özellikleri ile ilgili araştırmalardan elde edilen sonuçlar çelişkilidir. Aktif makrofajların mikrosidal aktivitelerini NO aracılığıyla gösterdikleri ileri sürülmekle birlikte asıl mediatörün NO dan üretilen nitrojen dioksit (NO 2 ) gibi ikincil bir oksidan madde olabileceği düşünülmektedir. 123 Ayrıca NO nun yara iyileşmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir. 124 h-lizozomal Unsurlar: Nötrofil ve monositler lizozomal granüller içerirler. Nötrofillerde üç tip granül izlenir. Spesifik granüller laktoferrin, lizozim, defensin, alkalen fosfataz, kollejenaz gibi enzimler içerir. Primer granüller miyeloperoksidaz (MPx), lizozim, defensin, asit hidrolazlar ve nötral proteazlar içerir. Tersiyer granüllerde ise; asid hidrolazlar ve jelatinazlar bulunur. Bu enzimlerin birçoğu matriks proteinlerini parçalayarak, destrüktif doku hasarına neden olurlar. 1,2,5,10,60, Kronik Enflamasyon Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin birlikte görüldüğü uzun süreli bir enflamasyon olarak kabul edilir. 3,10,11 Kronik enflamasyon akut enflamasyonu izleyebilir. Bu geçiş zedeleyici etkenlerin ısrarla devam etmesi veya iyileşme proseslerinde bozukluklar nedeniyle ortaya çıkar. Zedelenmenin bazı türlerinde 19

40 ise zedeleyici etkene karşı yanıt başlangıçtan itibaren kronik enflamasyondur. Kronik enflamasyonu ortaya çıkaran zedeleyici etkenler akut enflamasyon yapanlardan daha az toksik olmalarına rağmen, iyileştirme proseslerinde bir yetersizlik olması daha uzun süren bir zedelenmeye neden olabilir. Fibrozis birçok kronik enflamatuvar hastalığın ortak özelliğidir ve organ disfonksiyonunun önemli nedenlerinden biridir. Kronik Enflamasyon Hücreleri: Kronik enflamasyon proliferatif hücrelerin oluşmasıyla ortaya çıkar. Bunlar makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleridir. 40,126 Makrofajlar kemik iliği orijinli hücrelerden oluşan dolaşımdaki monositler ve doku makrofajlarından ibaret mononükleer fagositik sistemin bir komponentidir. 127 Kandaki monositlerin yarı ömrü yaklaşık 1 gün kadardır. 127 Monositler ekstravasküler dokuya ulaştıkları zaman bir değişim geçirirler ve daha büyük, makrofaj olarak adlandırılan, fagositik hücreleri oluştururlar. 128,129 Makrofajların da aktive olabilme özellikleri vardır. 130,131 Aktive olduklarında hücrenin büyüklüğü ve lizozomal enzim içeriği artar. Metabolizması daha aktif hale gelir. Fagosite ettikleri organizmaları ve bazı tümör hücrelerini öldürebilme yetenekleri ortaya çıkar. Makrofajları aktive edici sinyaller; hassaslaşmış T lenfositlerden salınan sitokinler (özellikle IFN-γ), bakteriyel endotoksinler, akut enflamasyon sırasında oluşan çeşitli mediatörler ile fibronektin gibi ekstrasellüler matriks proteinlerinden oluşur. Aktive olan makrofajlar çok sayıda biyolojik olarak aktif ürün salgılarlar Bunlar; sitokinler, eikosanoidler, reaktif oksijen ürünleri, nötral proteazlar, kompleman komponentleri ve koagulasyon faktörleridir. Bu mediatörler kronik iltihabın karakteristik özellikleri olan doku destrüksiyonunu, anjiogenezisi ve fibrozisi oluştururlar. Akut iltihapta irritan maddenin temizlendiği ve iyileştiği yerlerde makrofajlar ölürler ve lenfaktiklere girerek vücuttan atılırlar. Ancak kronik iltihap odağında makrofaj birikimi kalıcıdır. Lenfosit kökenli faktörlerin devamlı salgılanması iltihabi odakta makrofajların toplanmasını veya 20

41 immobilize olmasını sağlayan önemli bir mekanizmadır. IL-4 veya IFN-γ da makrofajları uyararak, bu hücrelerin birleşmelerine ve dev hücreler adı verilen büyük, çok nükleuslu hücreleri oluşturmalarına yol açarlar. Uygun koşullarda makrofajlar çoğalma kapasitesine de sahiptirler. Kronik iltihapta rol oynayan diğer hücre tipleri; lenfositler ve plazma hücreleridir. 133 Lenfositler non-immün enflamasyonda olduğu gibi herhangi bir immün reaksiyonda da mobilize olurlar. T lenfositler kronik enflamasyonda makrofajlarla karşılıklı bir ilişki halindedir. Plazma hücreleri B lenfosit aktivasyonu sonucunda oluşurlar. Enflamasyon bölgesindeki antijenlere karşı veya değişen doku komponentlerine karşı antikor oluştururlar. Eozinofiller karakteristik olarak parazitik enfeksiyonlar çevresinde veya allerjilerde olduğu gibi immunglobulin E (IgE) ile oluşturulan immun reaksiyonlarda rol oynarlar. Granülomatöz Enflamasyon: Granülamatöz iltihap kronik iltihabın ayrı bir paternidir. Büyümüş skuamöz epitel hücresine benzer bir görünümde aktive makrofajların kümelenmesi ile karakterizedir. Granülomlar tüberküloz başta olmak üzere nisbeten az sayıda patolojik durumlarda görülürler. 12 Bundan dolayı granülamatöz paterni tanımak sınırlı sayıda ancak bazıları yaşamı tehdit eden hastalıkları belirlemek açısından önemlidir. Granülomlar parçalanması güç olan yabancı cisimlere karşı da oluşabilir ve yabancı cisim granulomları olarak adlandırılır. 12 Granülomlar T hücreleri tarafından immünolojik yanıt verilen bazı organizmalara (listeria, salmonella) karşı veya hazmedilemeyen partiküllere karşı meydana gelebilir Bu durumlarda aktive T lenfositlerden salgılanan sitokinler makrofajların epiteloid hücreye veya dev hücreye dönüşmesini sağlarlar. 135 Granülomlar ayrıca sarkoidoz, Wegener granülamotozisi ve crohn hastalığı gibi otoimmün hastalıklarda da görülebilir. 136 İlginç olarak hodgkin ve non-hodgkin lenfoma 21

42 gibi bazı malignensilerde de granülom formasyonu görülmektedir. 137 Kısaca söylemek gerekirse granülom kronik enfeksiyona karşı organizmayı korumaktadır Antienflamatuvar İlaçlar Ağrı ve enflamasyon tedavisinde kullanılan ilaçların başında, SAİİ ler ve NSAİİ ler gelir. 74,138 NSAİİ ler antibiyotiklerden sonra en sık reçete edilen ilaçlardandır. Toplumda NSAİİ kullanım prevalansı % 5 olarak hesaplanmaktadır. 139 Ayrıca enflamatuvar olaylarda yukarıda belirttiğimiz antienflamatuvar ilaçlar haricinde penisilamin, kolşisin, kinin türevleri, altın bileşikleri ve antienflamatuvar etkisi kanıtlanmış bazı bitkiler de kullanılmaktadır Steroidal Antienflamatuvar İlaçlar (SAİİ) SAİİ ler NSAİİ lere göre daha belirgin antienflamatuvar etki oluştururlar. 144 Bu etkileri muhtemelen; lizozomal membran stabilizasyonu, kapiller geçirgenliğin azalması, lökositlerin enflamasyon alanına göçünün önlenmesi, hasarlı hücrelerin fagositozunun (özellikle T lenfosit yapımının azalması) ve lökositlerden IL-1 in salınımının inhibisyonuna bağlıdır. Kortizol inos, COX ve fosfolipaz A2 nin sentezini baskılar. 145,146 Fosfolipaz A2 aktivitesini, dolaylı yoldan, bir inhibitör protein olarak bilinen lipokortinin salınımını artırarak baskılar Fosfolipaz A2 inhibisyonu, AA salınımını azaltarak, PG ler, TX, ve LT oluşumunu da inhibe eder ve SAİİ nin antienflamatuvar etkisinin en önemli mekanizmasını oluşturur. 150 Non Steroidal Antienflamatuvar İlaçlar (NSAİİ) Klasik NSAİİ ler ağrı, ateş, kızarıklık ve ödemin giderilmesinde etkili oldukları için enflamasyonla seyreden hastalıkların tedavisinde en fazla tercih edilen ilaçlardır. 151, 152 Bu ilaçların antienflamatuvar etkileri, SAİİ lerinkinden daha düşüktür. Fakat yukarıda belirttiğimiz üç etkinin bir arada bulunması NSAİİ lerin kullanımını oldukça artırmıştır. Ayrıca günümüzde enflamasyon, ağrı ve ateşte NSAİİ lerin öncelikli 22

43 kullanılmasının en önemli nedenlerinden biri de narkotik analjezikler gibi bağımlılık yapmaması 153 ve etkilerine karşı tolerans gelişmemesidir. 154 NSAİİ lerin kısa tarihçesine bir göz atıldığında, ilk kez 1820 de kolşisin, 1860 da salisilik asitin tanımlandığı ve ilk Aspirin tabletinin 1898 de sentezlendiği dikkati çeker. 155 NSAİİ isminin 1949 da ilk kullanılışı fenilbutazon un sentezlenmesi ile eş zamanlıdır de bu serüven Dr. John Wyane' in etki mekanizmaları konusunda yaptığı çalışmalar ve ilk siklooksijenaz enzimini tanımlaması ile yeni bir boyut kazanırken, John Wyane e de Sir ünvanı ve Nobel yolu açılmıştır da ise, serüvende yeni bir durak olan, prostoglandin endoperoksit sentetaz (COX) enzimi elde edilmiş, böylece NSAİİ lerin etki mekanizmaları, yan etkileri ve güvenlik profili üzerine olan çalışmalar hızlanmıştır. Bu konuda son gelişme 1990 ların başında COX un tek bir molekül olmadığını birden fazla izomerlerinin bulunduğunu ve her bir izomerin farklı işlevlerde rol aldığı gösterilmiştir. Böylece klinik çalışmalar da yeni bir boyut kazanmıştır. 157,158 Sınıflandırma: 1. Salisilatlar a- Asetil salisilik asit, salisilik asit, metil salisilat ve sodyum salisilat b- Diflunisal 2. Paraaminofenol türevleri a- Asetaminofen b- Fenasetin 3. Pirazolon türevi ilaçlar a- Aminopirin b- Propifenazon c- Metamizol sodyum 23

44 d- Fenilbutazon e- Oksifenbutazon 4. Profenler (Fenil propiyonik asit türevleri) a- İbuprofen b- Naproksen c- Fenbufen d- Tiaprofenik asid e- Ketoprofen f- Fenoprofen kalsiyum g- Flurbiprofen h- İndoprofen k- Zomepirak 5. Fenilasetik asid türevleri a- Nabumeton b- Fenklofenak c- Diklofenak sodyum 6. İndol asetik asid türevleri a- İndometazin b- Asemetasin c- Tolmetin d- Ketorolak e- Sulindak 7. Fenamik asid türevleri a- Mefenamik asid b- Flufenamik asid 24

45 c- Etofenamat 8. Oksikamlar ve diğer ilaçlar a- Piroksikam b- Tenoksikam c- Prokuazon d- Azapropazon e- Metotrimeprazin 9. COX-2 inhibitörleri a- Meloksikam b- Nimesulid c- Etodolak d- Selekoksib e- Rofekoksib COX enzim aktivitesi ile membran fosfolipitlerinden PG sentezine giden yol kontrol edilir. Bu enzimin NSAİİ ile inhibisyonu, PG sentezinde azalma oluşturur. LO yolunun inhibisyonu ise, LT lerin sentezini inhibe eder. NSAİİ lerin Etki Mekanizmaları: NSAİİ lerin antienflamatuvar etki mekanizmaları COX ve LO ürünlerinin sentezinin inhibisyonu, toksik oksijen radikallerinin ve lizozomal enzim salınımının engellenmesi, nötrofil agregasyonu, adezyon ve kemotaksisinin önlenmesi, oksidatif fosforilizasyonun uncoplingi şeklinde sıralanabilir. PG sentez yolağındaki enzim COX enzimidir. 159 Bu enzim, AA yı stabil olmayan PGG2 ve PGH2 ye çevirir. Bugün COX 1 ve COX 2 diye adlandırılan iki COX formu olduğu bilinmektedir. 160 COX 2 enflamatuvar bölgede sitokinler, enflamatuvar mediatörler, endotoksinler ve mitojenik ajanlar tarafından indüklenir COX 1 dediğimiz temel form ise trombositler, damar endoteli, mide mukozası, 25

46 böbrek, pankreas langerhans adacıkları, seminal veziküller ve beyin gibi birçok normal hücre ve dokuda bulunur. 151,164 Bununla birlikte, COX 2, böbrek ve beynin bazı bölgelerinde üretilebilir. 165,166 COX 1 midede bulunurken, COX-2 midede bulunmaz. Bu da selektif COX 2 inhibitörlerinin gastrointestinal sistem (GİS) üzerindeki yan tesirlerinin daha az olduğunu gösterir. AA dan 5-lipooksijenaz enzimi aracılığıyla LO ürünleri oluşur. NSAİİ ler COX yolunu inhibe ederek PG sentezini önlerler, ancak LO yolunu inhibe edemezler ve LK oluşumunu önleyemezler. Aspirin kovalent bağ yaparak, hem COX 1 hem de COX 2 enzim sentezini inhibe eder. Geri dönüşlü COX inhibitörü olan tüm diğer NSAİİ lerin primer olarak etkisi ilacın farmakokinetik klirensi ile ilişkilidir. NSAİİ ler kabaca yarılanma ömrü 6 saatten kısa ve 10 saatten uzun olan iki gruba ayrılır. İnsan vücudunda terapötik dozlardaki aspirin ve diğer NSAİİ lerin PG biyosentezini azalttığına ilişkin birçok önemli kanıtlar vardır 77,157,167 ve bu ilaçların antienflamatuvar etkinlikleri ile, COX u inhibe edebilme potansiyelleri arasında anlamlı bir korelasyon görülmüştür. 40,149 Buna rağmen bazı istisnalar bulunmaktadır, fakat bu istisnalar in vivo ortamı taklit edemeyen deneysel ortamların kullanılmasına bağlanmaktadır. 168 Birçok bulgu NSAİİ lerin primer terapötik etkisinin PG sentez inhibisyonu ile oluştuğunu göstermiştir. Ayrıca NSAİİ ler supresör T lenfositlerini situmüle ederek, yardımcı T lenfositlerin IL 1 salgılamalarını baskılar. Enflamasyonda aktive olan makrofaj ve fibroblastlardan, IL 1 den başka sitokinler de salınmaktadır. IL 6, TNF ve IFN de enflamasyonda rol oynarlar. NSAİİ ler, IL 1 ve IL 6 yapımını ve salınımını inhibe ettikleri çeşitli araştırmalarda gösterilmektedir. Enflamatuvar eklem hastalıklarında sinoviyal dokuda ve kartilaj yüzeylerinde polimorf nüveli lökosit sayısı artmakta ve bunlardan diğer mediyatörler gibi proteolitik enzimler de salınmaktadır. Bu enzimler enflamasyonun başlamasına ve aynı zamanda periartiküler kemiğin yıkımına 26

47 sebep olmaktadır. NSAİİ ler lizozomal membran stabilizasyonu sağlayıp, lizozomal enzimlerin salınımını önleyerek de etkilerini göstermektedirler. Aynı zamanda siklik adenozin mono fosfat (camp) düzeyini artırarak da, lizozomal enzim salınımını inhibe ettikleri ileri sürülmektedir. 169 NSAİİ lerin iltihaplı dokuda serbest oksijen radikallerinin oluşmalarını inhibe ettikleri veya oluşanları bağlayarak inaktive ettikleri çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. 170 NSAİİ lerin antienflamatuvar etkilerine katkıda bulunan diğer özellikleri ise sırayla; nötrofil agregasyonu, adezyon ve kemotaksisinin önlenmesi, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat oksidaz (NADPH oksidaz) ve fosfolipaz C aktivitesinin antagonizma edilmesi olarak sayılabilir. 156,171,172 NSAİİ lerin Kullanıldığı Yerler: Bu ilaçlar, analjezik olarak kullanıldıklarında, genellikle diş ağrısı gibi hafif şiddette ağrılara karşı etkin olurlar. 153 Merkezi sinir sistemi üzerinde opiatların istenmeyen etkilerine sahip değildirler (solunum bozukluğu, fiziksel bağımlılıkta artış). NSAİİ ler ateşli durumlarda vücut sıcaklığını düşürürler, fakat normal vücut ısısını değiştirmezler. Gerçekte seçkin COX 2 inhibitörleri etkin antipiretik etkilidirler. Romatizmal eklem iltihapları ve kemik eklem iltihaplarının tedavileri NSAİİ lerin temel klinik uygulamaları arasında bulunur. 173 Hastaların, rofecoksib ve selekoksib le yapılan kronik tedavilerinde, gastrik toksisitesiz bir şekilde enflamasyonun baskı altına alınması, selektif COX 2 inhibitörlerinin diğer NSAİİ lerden daha avantajlı olduğunu göstermektedir. Genel olarak NSAİİ ler sadece hastalıktan kaynaklanan enflamasyon ve ağrıların yarattığı semptomlarda rahatlamayı sağlar, hastalığın dokulara verdiği patolojik zararın ilerlemesini engelleyemez. 27

48 NSAİİ lerin diğer kullanım alanları PG biyogenezini önleme kapasitelerine bağlıdır. PG ler duktus arteriosusun gelişiminde de yer edinmektedir. Bu nedenle indometazin (İND) ve benzeri ajanlar yeni doğanlarda kapanmamış duktusları kapatmak için kullanılmaktadır. Diğer yandan non-selektif NSAİİ lerin hamile kadınlarda kullanımı, intrauterin duktus arteriozusun prematüre kontraksiyonuna sebep olabilir. Fetal hayatta COX 1 ve COX 2 tarafından sentezlenen PG lerin (vazodilatatör PG), duktus arteriosusun açıklığını sürdürmesinde etkili olduğu gözlenmektedir. 174 Fetal duktusun açık kalmasını sağlayan izoformların oluşmasını önlediği için, gebe kadınlarda selektif COX 2 inhibitörlerinin kullanımında tedbirli olmak gerekir. Menstürasyon esnasında endometrium tarafından salınan PG ler, primer dismenorede ki diğer semptomların ve sert krampların nedeni olabilir ki bu durumun tedavisi NSAİİ lerle sağlanmaktadır. Yeni bir çalışma, selektif COX-2 inhibitörü refekoksibin, dismenore tedavisinde, naproksen sodyum kadar iyi olduğunu ortaya koymuştur. Sistemik mastositozisli hastalardaki hipotansiyon ve şiddetli vazodilatasyonun major mediatörünün, mast hücrelerinden fazla oranda salınan PGD2 olduğu bulunmuştur. Bu hastaların sadece antihistaminiklerle tedavisi efektif değildir, ancak tedaviye NSAİİ lerin eklenmesi ile efektif olarak bu epizotlar önlenebilmektedir. 175 PGE2 bazı kanserlerdeki humoral hiperkalsemi ile ilişkili bulunmuştur. NSAİİ ler ile tedavi bazı hastalarda serum kalsiyum düzeylerini efektif bir şekilde düşürmektedir. 176 NSAİİ lerin önemli bir kullanım alanıda kolon kanserinin önlenmesidir. Epidemiolojik çalışmalar sık olarak aspirin kullanımının kolon kanserinin insidansında önemli ve çarpıcı bir azalma meydana getirdiğini göstermektedir. 177 İlginç olarak bu azalış 325 mg lık tabletlerden haftalık 4 ya da 6 tane alınacak kadar az bir dozla sağlanmaktadır. 28

49 NSAİİ lerin Yan Etkileri: NSAİİ lerin kullanımına bağlı görülen en sık yan etkiler GİS e ait yan etkilerdir. GİS semptomları; dispepsi, 178 gastrik erozyon, peptik ülser, üst GİS kanaması, 178 barsak enflamasyonu gibi geniş bir yelpaze içinde dağılmıştır. 179,180 GİS intoleransı % 30, endoskopik ülser prevalansı ise % arasında rapor edilmektedir. Avrupa da, üst GİS kanaması nedeniyle her gün hastaneye yatırılmakta olan 1000 kişiden 400 ünde kanama/perforasyon doğrudan NSAİİ lere bağlanmaktadır. Genitoüriner sistemde; glomerüler filtrasyonda azalma, akut böbrek yetmezliği, papiler nekroz, serum kreatinin seviyesinin yükselmesi, su retansiyonu, proteinüri oluşabilmektedir Solunum sisteminde ise; bronkospazm, astım provakasyonu 186 ve pnömonitis görülmesi nadir değildir. Karaciğerde; toksik hepatit, 187 kolestatik sarılık, karaciğer yetmezliği, 188 Reye sendromu 189 gibi çeşitli rahatsızlıklar oluşabilir. Nöropsikiyatrik yan etkileri baş ağrısı, baş dönmesi, sersemlik, tinnutus, depresyon, konfüzyon, hallusinasyon gibi problemlerin ortaya çıkışıyla görülmektedir. 139 Kognitif disfonksiyon, hafıza kaybı, irritabilite, uykusuzluk, konsantrasyon bozukluğu, unutkanlık, kişilik değişiklikleri ve hatta paranoid reaksiyonların da görüldüğü bildirilmektedir. 86 Yaşlı hastalarda bu yan etkilerin daha fazla olduğu, yine bu yan etkilerin yüksek doz kullanımında daha sık ortaya çıktığı bilinmektedir. Dermatolojik olarak yan etkiler; ürtiker, 190 lökositoklastik vaskülit, eritema multiforme, 191,192 ilaç erüpsiyonu, morbiliform erüpsiyonlar, vezikülobüllöz erüpsiyonlar, eksfoliyatif eritrodermi, fotosensitivite reaksiyonları 193 şeklinde ortaya çıkabilmektedir. Ayrıca Stevens Johnson Sendromu, toksik epidermal nekroliz gibi toksik etkilerden de bahsedilmektedir. Hematolojik yan etkiler ise kanamaya eğilim, 194 aplastik anemi, 195 trombositopeni, agranülositozdur

50 NSAİİ ler; PG sentezini inhibe etmeleri nedeniyle (antinatriüretik etkileri ve vazokonstriksiyona eğilim yaratmaları) hipertansiyonlu hastalarda kan basıncını yükseltmektedir. 196,197 NSAİİ lerin salisilatlarda olduğu gibi glikozaminoglikan sentezini bozduğu ve kıkırdak matriksinin temel maddesi olan proteoglikan kaybını artırdığı çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. Enflamasyon ile seyreden eklem hastalıklarında proteoglikan sentezini bozmakta ve ekstrasellüler matriksin rezorbsiyonunu artırmaktadırlar. 180 NSAİİ lerin Kontrendikasyonları: NSAİİ ler, gastrointestinal kanama hikâyesi veya semptomları bulunan şahıslarda kullanılmamalıdır. Hamilelik süresini uzattığı, düşük doğum ağırlıklı bebek ve doğum öncesi ve sonrası kanama eğilimi arttırdığı için gebelerde de kullanılmamalıdır. 154 Özellikle viral enfeksiyon geçiren çocuklarda aspirin başta olmak üzere NSAİİ kullanımı ölümcül olabilen Reye Sendromu oluşturduğu için, çocukluk çağı viral enfeksiyonlarında kullanılmamalıdır. 189 Yan etkilerde bahsettiğimiz gibi, NSAİİ ler, astımı proveke ettikleri için astım hikâyesi olan şahıslarda kontrendikedir Salisilatlar Asetilsalisilik asit (ASA): Aspirin adıyla tanınan, bu grup içinde en fazla kullanılan ve en ucuz olanıdır. ASA; PG, prostasiklin, TXA2 sentezini inhibe eden COX lara özgül olmayan bir antienflamatuvar, analjezik ve antipiretik etkili ilaçtır. 198 ASA, COX-1 i COX-2 ye göre daha fazla inhibe eder ve bu inhibisyon irreversibldır. 199 Farmakokinetiği: ASA mideden kolaylıkla absorbe olabilir. Oral alımdan 20 dakika sonra kanda minumum etkin düzeylere, 1-2 saat sonra ise maksimum düzeylere çıkarak analjezik etkisini gösterir. ASA karaciğer ve kanda salisilata hidrolize edilir. 30

51 Etki Mekanizmaları: A) Antienflamatuvar Etkileri: ASA, eikosanoid mediatörlerinin sentezini inhibe etmesinin yanında kallikrein sisteminin kimyasal mediyatörlerini de engeller. Bunun sonucunda lezyonlu damarlarda granülositlerin yapışmasını inhibe eder, lizozomları stabilize eder ve polimorf nüveli lökositlerin ve makrofajların iltihap odağına göçünü frenler. 200 B) Analjezik Etkileri: ASA nın iltihap odağındaki periferik etkileri yanında aynı zamanda subkortikal bölgede ağrı uyarılarını da inhibe ettiği düşünülmektedir. Kasiskelet sistemi ağrıları ve vasküler orijinli ağrılarda etkindir. C) Antipiretik Etkileri: ASA yükselen vücut sıcaklığını düşürür. Normal vücut sıcaklığı üzerine etkisi hafiftir. Vücut sıcaklığını düşmesi yüzeysel damarların vazodilatasyonuna bağlıdır. Ayrıca ısı kaybı terleme yoluyla da olmaktadır. 201 D) Platelet Etkileri: ASA, TX sentezini inhibe eder. Buna bağlı olarak trombosit agregasyonu oluşmaz ve kanama zamanı uzar. 202 TXA 2 trombositlerin şeklini değiştirmesine, granüllerini boşaltmasına ve agrege olmalarına neden olan bir AA ürünüdür. ASA, COX enziminin irreversibl asetilasyonuyla TXA 2 sentezini inhibe eder. 199 Diğer salisilatlar COX u inhibe ederler ancak COX u asetilleyemedikleri için inhibitör etkileri kısadır ve yan etkileri reversibldir. ASA nın etkisi irreversibl olduğundan trombosit agregasyonunu yeni trombositler meydana gelinceye kadar bozar. Klinikte Kullanımı: ASA antienflamatuvar ve analjezik etkilerinden dolayı romatoid artrit, gut, romatizmal ateş, juvenil romatoid artrit, spondiloartropati gibi hastalıkların tedavisinde kullanılır. 203,204 Bu hastalıklarda aspirinin tercih edilmesi 31

52 yüksek dozlarda ortaya çıkan güçlü antienflamatuvar etkisinden kaynaklanmaktadır. Bunların dışında artralji, myalji gibi ağrılı durumlarda da kullanılabilmektedir. Antipiretik etkisinin güçlü olması nedeniyle ateş tedavisinde sıklıkla kullanılan ASA, düşük dozlarda da platelet agregasyonunu inhibe ettiği için kardiovasküler alanda 205 ve serebrovasküler trombusun kronik tedavisinde de kullanılır. Aynı zamanda kesin olmamakla birlikte kolon kanseri profilaksisinde de kullanılmaktadır. 198,206 Yan Etkileri: A) Gastrointestinal Sistem (GİS) Etkileri: ASA, GİS de özellikle midede mukoza ile direkt temas sonucu yüzeyel peteşi ve ülser oluşmasına neden olmaktadır. Bunların sonucunda ise gizli kanama, akut kanama veya perforasyon ortaya çıkabilmektedir. 207,208 Bu etkileri alınan tabletin mide mukozasını zedelemesi, iyonize olmayan salisilatın mideden absorbsiyonu ya da koruyucu PG lerin salınımının inhibisyonuna bağlı olarak gelişmektedir. 209 Araştırmalarda ASA nın peptik ülsere neden olduğu gösterilememişse de; epidemiyolojik araştırmalarda ASA kullananlarda mide ülseri oranının arttığı, daha az olarak da duedonum ülseri sıklığının arttığı görülmüştür. B) Kanama ve Hemostaz Etkileri: Aspirin heparin ve diğer antikoagülan ilaçların etkilerini potansiyalize eder. Yüksek dozda aspirin karaciğerde protrombin ve diğer pıhtılaşma faktörlerinin sentezini doza bağımlı olarak azaltmaktadır. K vitamini ile bu azalma tersine çevrilebilir. Aspirin kullanımı protrombin zamanını ve koagülasyon zamanını uzatmaktadır. 32

53 C) Santral Sinir Sistemi (SSS) Etkileri ve Salisilizm: Yüksek dozlarda salisilat kullanımı baş ağrısı, baş dönmesi, uyuşukluk, tinnitus, işitme kaybı, bazen bulantı-kusma ve diyareye sebep olabilir. 210 Toksisite sınırında olan salisilat düzeylerinde ise ventilasyonun artması, respiratuvar alkaloz ve daha sonra da solunum merkezinin depresyonu ve asidoz tablosu gelişir. 211 Plazma salisilat düzeylerinin mg/dl olması ile solunum merkezi stimüle olarak solunumun dakika hacmi artar ve böylece derin ve hızlı solunum gelişir. Salisilat düzeyi arttıkça solunum merkezi ve vazomotor merkez deprese edilir. Asidoz, damarlarda dilatasyon ve dolaşım kollapsı meydana getirir. Ayrıca bu sırada hücre potasyumunun mobilizasyonu sonucu hiperkalemi oluşur. D) Hipersensitivite: Hipersensitivite ASA alanların %15 inde görülebilmektedir. Bronkokonstriksiyon ve bronşial astım şeklinde görüleceği gibi ürtiker, anjionörotik ödem şeklinde de görülebilir. Bu yan etkiler PG sentezinin inhibisyonu sonucu gelişmektedir. Fetal anaflaktik şok nadirdir. 212 E) Diğer Etkileri: ASA diğer NSAİİ ler gibi PG sentezi inhibisyonuna bağlı olarak böbrek kan akımını ve glomerül filtrasyon hızını azaltır. Böbrek tübülüslerinde sodyum ve su reabsorbsiyonunu artırarak ıtrahlarını azaltır. Böylece vücutta su ve tuz retansiyonu gelişir. Uzun süre aspirin kullanımı papiller nekroz ve analjezik nefropatisi gibi bazen kalıcı olan böbrek bozukluklarına neden olmaktadır. 213 Yüksek dozlarda ASA (4 gr veya üstü), ürat ekskrasyonunu artırır ürik asit düzeylerini düşürür. Buna karşılık düşük dozlarda (2 gr veya altında) hiperürisemiye neden olarak gut atağını provake edebilir

54 ASA bağlı gelişen hepatit genellikle semptom vermez. Nadiren bulantı, iştahsızlık, sigaradan tiksinme, hepatomegali gelişebilir. Transaminaz düzeyleri yükselebilir ancak karaciğer fonksiyon testleri aspirin kesildikten birkaç hafta sonra normale döner. Hepatotoksisite daha çok çocuklarda ve karaciğer hastalığı olanlarda görülmektedir. ASA nın glukoz toleransı üzerine etkisi çok azdır. Yüksek dozda salisilat alındığında sempatik bir etkiyle, adrenal medulladan katekolamin salgılanarak glikojenoliz, hiperglisemi ve glikozüri yapabilir. Diabetes mellitusu olan bir hastada yüksek doz salisilat glikoz utilizasyonunu arttırır ve glisemiyi düşürür. Ayrıca insülin gereksinimini azaltır. Diflunisal: Salisilik asidin difluorofenil türevi olan diflunisal ASA ya göre daha yeni bir antienflamatuvar ajandır. Antienflamatuvar etkisi ile birlikte analjezik ve daha zayıf olan antipiretik etkileri de vardır. Plazma yarılanma ömrü ASA ya yakın veya daha uzundur. En sık görülen yan etkileri; dispeptik şikâyetler, bulantı, kusma, diyare ve karın ağrısıdır. Nefrotoksisite ve hepatotoksisitesi zayıftır. Oral antikoagülan kullananlarda protrombin zamanını uzatabilir. 214 Sodyum Salisilat: Sodyum salisilatın analjezik, antipiretik ve antienflamatuvar etkisi ASA ya göre zayıftır. Tromboksan sentazı zayıf inhibe ettiği için antiagregan etkisi belirgin değildir. COX enzimini ASA ya göre zayıf inhibe etmesine rağmen romatizmal hastalıklarda ASA kadar etkili olduğu bilinmektedir. Diğer salisilat türleri sistemik etki oluşturmak için kullanılmazlar. 2. Paraaminofenol Türevleri Parasetamol (Asetaminofen): Bu grupta, günümüzde artık sadece parasetamol kullanılmaktadır. Analjezik ve antipiretik etkinliği bakımından aspirine alternatif bir 34

55 ilaçtır. Ancak aspirin gibi antienflamatuvar etkinliği olmadığı için enflamasyon hadiselerinin tedavisinde kullanılmaz. 215 Çok iyi tolere edilir. Çok az yan etkiye sahip olmasına rağmen aşırı doz alınması öldürücü sonuçlar doğurabilir. Asetaminofenin zayıf antienflamatuvar etkinliği, yüksek peroksit içeren ortamlarda (enflamasyonlu dokularda da olduğu gibi), COX u inhibe edememesine bağlıdır. 214 Tersine antipiretik etkinliğinin varlığı da beyin gibi peroksitlerin az olduğu ortamlarda COX inhibisyonu sağlamasına bağlanmaktadır. Asit-baz dengesini bozmaz. Gastrik irritasyona neden olmaz. Trombositlere, kanama zamanına ve ürik asit atımına etkisi yoktur. Yarılanma ömrü 2 saat olan bu ilacın tamamı GİS den emilir. Özellikle aspirinin kontrendike olduğu durumlarda analjezik ve antipiretik amaçlı kullanımı uygundur. 216 İntoksikasyonunda ağır karaciğer hasarı oluşur. 217 Çok nadir olarak methemoglobinemi, hemolitik anemi, nefropati, larinks ödemi ve bronkospazm yapabilir. 211, Pirazolon Türevleri: Bu grupta; metamizol, aminopirin, propifenazon, fenilbutazon ve oksifenbutazon yer alır. Metamizol: Güçlü analjezik ve zayıf antipiretik, antienflamatuvar etkili bir ilaçdır. 218 Vücutta aktif metaboliti olan 4-metil aminoantipirine dönüşür. 218 Bu aktif madde ise COX inhibisyonu yapar. Metamizolun klinik kullanımında hem oral hem de parenteral formları vardır. Yaptığı COX inhibisyonu ve antienflamatuvar etkinliği zayıf olmasına karşılık analjezik etkinliği oldukça güçlüdür. Omuriliğe uzanan ve ağrı inhibisyonu yapan yolakları aktive etmesi de analjezik etkisine katkıda bulunur. 218 Ateşli durumlarda, enflamasyonlu ağrılarda, dismenore gibi hafif ve orta şiddetteki ağrılarda kullanılır. GİS ile ilgili yan etkileri nadir değildir. Anemi, trombositopeni ve agranülositoz gibi hematolojik yan etkiler yapabilir. 35

56 4. Fenilpropiyonik Asit Türevleri: Bu grup ilaçlar analjezik, antienflamatuvar ve antipiretik etki gösterirler. COX un her iki izoformunu da inhibe ederler. 219 İbuprofen: Mide barsak kanalından % 80 oranında ve çabuk absorbe edilir. Bir saat içerisinde analjezik etkisi başlar. Yüksek oranlarda plazma proteinlerine bağlanır. Yarılanma ömrü 1 2 saat olup sinoviyal dokuda plazmadakinden daha uzun süre kalır. Biyoyararlanımı açısından aç karnına alınması tavsiye edilebilir. İyi tolere edilen bir ilaçtır. Aspirine göre GİS yan etkileri daha az olarak ortaya çıkmaktadır. 219 Diğer NSAİİ lerde görülen renal, hepatik ve hematolojik yan etkiler nadir de olsa beklenebilir. Antikoagülan ilaçlar ile etkileşimi nadirdir. Nadiren allerjik kaynaklı kemik iliği depresyonu yapabilir. 215 Son yapılan çalışmalarda ibuprofenin Alzheimer tedavisinde kullanıldığı ve olumlu sonuçlar alındığı gösterilmiştir. 220 Yenidoğan ve prematürelerde kullanılması patent duktus arteriozus açıklığını kapatmada oldukça yararlıdır. 221 Naproksen: Fenilpropiyonik asit türevleri içinde yarılanma ömrü en uzun olandır. Plazma proteinlerine yüksek oranda bağlanır. İltihabi dokuda lökosit aktivasyonu ve migrasyonu üzerinde belirgin inhibitör etki meydana getirmektedir. 211 Aspirin gibi trombosit agregasyonunu inhibe ederek kanama zamanını uzatır. Antienflamatuvar etkisi yeterli dozlarda ( mg) verildiğinde İND ve aspirin kadar güçlüdür. Çocuklarda uzun süreli kullanımının güvenilirliği saptanmış bir ilaçtır (10 mg/kg/gün). Yan etkileri açısından aspirine benzerse de bu etkiler daha az ve daha hafiftir. Genel olarak GİS ile ilgili yan etkiler çoğunluktayken daha az olarak baş ağrısı, baş dönmesi ve depresyon görülebilir. 215,222 Ketoprofen: Fenilpropiyonik asit türevi olup, hem COX u hem de LO yu inhibe etme özelliği göstermektedir. Hem santral hem de periferik analjezi etkisi 36

57 vardır. 223 Ankilozan spondilit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik snovitte kullanılır. 224 Yan etkileri naproksene benzemekle beraber ketoprofende kontakt ve fotokontak reaksiyonlar daha sık görülür. 190 Tiaprofenik asit: Diğer NSAİİ lerden farklı olarak kıkırdak dokusundaki proteoglikan sentezini inhibe etmemesi ile dikkati çekmektedir. Araştırmalarda kıkırdaktaki katabolik etkisinin azaldığını gösterir şekilde stromelysin düzeylerinde belirgin azalma olduğu saptanmıştır. Osteartrozda kıkırdak proteinlerini yıkan kollajenaz ve proteoglikanaz enzimlerini azaltır. Bu enzimlere paralel olarak proteoglikan yıkım enzimleri (metalloproteazları) azalttığı ayrıca sinovial sıvıda PGE2 ve prekürsörlerini de azalttığı gösterilmiştir. Uzun süreli araştırmalarda kıkırdak matriks biyosentezi üzerinde toksik etkisinin gözlenmemesi osteoartit gibi uzun süreli NSAİİ gereksinimi olan hastaların tedavisinde tercih edilme nedeni olabilir. Yan etkileri diğer propiyonik asit türevlerinde olduğu gibi görülmektedir. 5. Fenilasetik Asit Türevleri: Bu grubun üyeleri; diklofenak (DIC), nabumeton ve fenklofenaktır. Diklofenak (DIC): Fenilasetik asidin basit bir türevi olup, flurbiprofen ve meklofenamata benzer. COX un güçlü bir inhibitörüdür ve İND ye yakın antienflamatuvar etki gösterir. DIC ile hem COX 1 ve COX 2 hem de LO ın inhibe edildiği ve ayrıca lökositlerde AA konsantrasyonunu azalttığı bildirilmiştir. 211,222 Oral yolla alındığında süratle absorbe olur. Hastalar tarafından iyi tolere edilir. Doz alındıktan 1 2 saat sonra maksimum plazma konsantrasyonları elde edilir. Yarılanma ömrü kısadır (1 2 saat kadar). Sinovial sıvıya geçebilmektedir. Aspirin ile birlikte kullanılırsa DIC ın plazma düzeyleri azalır. Rektal, parenteral ve topikal kullanımı 37

58 mümkündür. Yan etkileri diğer NSAİİ lerde görülen yan etkilere benzer. Ancak daha az ve daha hafif bulgularla seyredebilmektedir. 215 Nabumeton: Asidik yapıda olmayan naftilalkanon türevidir. Zayıf COX inhibisyonu sağlar. Ön ilaç olarak alındıktan sonra karaciğerde naftil asetik aside dönüşür. 225 Bu metabolit naproksene benzer. Nonasidik olan bu ilaç oral yolla alındığında mide mukozasında koruyucu PG (COX 1) sentezi üzerindeki bozucu etkisini minimuma indirir. Yan etkileri diğer NSAİİ ye göre daha az görülmekte ve hafif seyretmektedir. 6. İndolasetik Asit Türevleri İndometazin (İND): Bir indol türevi olan İND, NSAİİ ler arasında en etkili antienflamatuvar etkiye sahip olanıdır. 226 PG sentezini güçlü bir şekilde inhibe eder. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak inaktive ettiği gösterilmiştir. 211 Bazı araştırmalarda da İND nin kondrosit metabolizması üzerinde olumsuz etkileri olduğu ve proteoglikan sentezini inhibe ettiği belirtilmektedir. Ankilozan spondilit, osteoartrit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik snovitte kullanılır. 215,227 İND nin yan etkileri doza bağımlı olarak artış göstermektedir. Günlük dozun (150 mg) artırılması yan etkilerin sıklığını ve şiddetini arttırmaktadır. Yüksek doz uygulamalarda olguların en az 1/3 ünde tedavinin kesilmesini gerektiren reaksiyonlar ortaya çıkabilmektedir. GİS yan etkilerinin yanısıra % ye yakın oranlarda vasokonstriktör etki ile birlikte başağrısı, baş dönmesi, konfüzyon, depresyon veya hallusinasyon görülebilir. Kan basıncında yükselmeye neden olabilir. Hematolojik yan etkiler görüleceği gibi yine renal yan etkileri açısından da önemsenmelidir. Böbrek 38

59 fonksiyonları sağlıklı olmayan kişilerde kullanımı sakıncalıdır. Son olarak kemik iliğini deprese edici etkisinden dolayı çocuklarda kullanılmamalıdır. Ketorolak: Trimetamin propiyonik asidin pirolopirol türevidir. Yapısı itibariyle tolmetine benzer. Güçlü COX inhibitörü özelliği yanında güçlü analjezik etkisi de bulunmaktadır. 211 Suda çözünebilir olması nedeniyle daha çok parenteral kullanımlarına yer verilmektedir. Romatizmal hastalıklarda denenmiş olup ancak tercih edilmemiştir. Daha çok postoperatif ağrılı durumlarda kısa süreli (2 5 gün) olarak analjezi için kullanılır. Sülindak: Sülfoksid grubu içeren karaciğerde biyotransformasyonu sonucu sülfide çevrildikten sonra etkin hale gelen bir ön ilaçtır. Sülfid safra ile atıldıktan sonra barsaktan reabsorbe olur. Mideden inaktif halde geçtiğinden gastrik yan etkilerinin oldukça azaldığı düşünülmektedir. Renal PG ve prostasiklin sentezini fazla inhibe etmediği ve bu nedenle de böbrek üzerine olan yan etkilerinin daha az olduğu düşünülmektedir. 222 Araştırmalarda hipertansiyonlu hastalarda tercih edilmesi gerektiği vurgulanmıştır. Çünkü antihipertansif ilaçların etkinliğinde azalmaya neden olmadığı belirtilmektedir. SSS nin yan etkileri İND ye göre daha çok olarak görülmektedir. Kemik iliği üzerine yan etkiler, gastrointestinal yan etkiler, renal yan etkiler ve hipersensitivite reaksiyonları görülebilir Fenamik Asit Türevleri: Mefanemik asit, flufenamik asit ve etofenamat bu grubun üyeleridir. Mefanemik asit: Fenamatlar grubunda yer alan mefenamik asit antienflamatuvar etkisini PG sentezini inhibe ederek göstermektedir. 185 Analjezik etkisi aspirine eşdeğer, antienflamatuvar etkisi ise aspirinden daha zayıftır. Yan etkileri nedeniyle uzun süre 39

60 kullanılmaması gerekmektedir. Araştırmalarda GİS ve renal yan etkiler ile kemik iliği üzerine önemli yan etkileri rapor edilmektedir. 222 Uzun süreli tedavilerde nefrotoksik yan tesirleri görülmüştür. Çocuklarda kullanılmamaktadır. Flufenamik asit: Antieflamatuvar etkisi mefenamik asitten daha güçlü olmamasına rağmen analjezik etkisi daha zayıftır. 211 Yan etkileri açısından mefenamik aside benzer özellikler göstermektedir. Etofenamat: Flufenamik asidin lipofilik ester türevidir. Doku içine nüfuz etme özelliği nedeniyle topikal kullanımları tercih edilir. 8. Oksikamlar: Bu grupta; piroksikam, tenoksikam ve meloksikam yer alır. Piroksikam: Enolik asidin oksikam türevidir. Güçlü siklooksijenaz inhibisyonu yapan ancak lipooksijenaz yolunu etkilemeyen bir ilaçtır. 150 Eliminasyon yarılanma ömrünün oldukça uzun bir süre (50 saat) olması nedeniyle günde tek doz kullanımı olanak dâhilindedir. 228 Oral olarak hızla absorbe olmakta, 3 5 saat içerisinde maksimum etkin plazma düzeylerine ulaşmaktadır. En sık görülen yan etkisi GİS de olup, ilaç alanların % 20 sinde görülür. 215,229 Tenoksikam: Güçlü COX inhibisyonu sağlayan tenoksikam bir oksikam türevidir. Farmakolojik etkileri piroksikama benzer. Tek farkı eliminasyon yarılanma ömrü piroksikamdan daha uzundur (60 70 saat). Günde tek doz kullanımı mümkündür. Daha çok GİS yan etkileri gözlenmektedir. Diğer yan etkiler açısından ise oksikamlarda bildirilen yan etkilerin ortaya çıktığı görülmektedir. 40

61 9. COX 2 Selektif İnhibitörleri: Bu grup içinde meloksikam, nimesulid, rofekoksib ve selokoksib vardır. Meloksikam: Yeni bir enolik asit türevi olarak çıkarılan bu ilacın selektif COX 2 inhibisyonu yaptığı bazı araştırmalarda gösterilmektedir. 230,231 Oral yolla alındıktan 5 6 saat sonra maksimum plazma düzeylerine çıkmaktadır. Eliminasyon yarılanma ömrü ortalama 20 saattir. Rektal veya intramuskuler kullanımı da mümkündür. Hastalar tarafından iyi tolere edilir. 232 Yüksek oranda plazma proteinlerine bağlanır. Atılımı idrar ve feçesle olur. Zayıf bir PGE2 inhibitörü olması nedeniyle gastrik yan etkilerin az olduğunu gösteren çalışmalar rapor edilmekte ve bu ilaç ile ilgili araştırmalar devam etmektedir. Nimesulid: Sülfonanilid grubu içermesi nedeniyle diğer enol ve karboksil grupları ihtiva eden NSAİİ den farklıdır. Selektif COX 2 inhibitörüdür. 233 Nimesulidin COX 2 inhibisyonu doza bağımlıdır. Doz arttıkça COX 2 selektivitesi azalıp daha çok COX 1 inhibisyonu oluşur. 233 Ayrıca PG sentezi inhibisyonundan farklı olarak oksijen radikallerinin oluşumunu ve MPx enziminin serbestleşmesini de inhibe etmektedir. 234, 235 Bununla paralel olarak nimesulidin beyinde de oksijen kökenli serbest radikallerini azalttığı bildirilmiştir. 236 Yan etkileri diğer NSAİİ ler ile benzerlik göstermektedir. Ancak gastrointestinal yan etkilerinin daha az olduğu üzerinde durulmaktadır. Hatta steroidlerle beraber nimesulid verilmesi steroidlerin mide dokusuna olan hasarını bile önlemektedir. 237 Son yıllarda spesifik olarak COX 2 enzimini inhibe eden ilaçlar gündeme gelmiştir. Bu ilaçlar diğer NSAİİ ler gibi analjezik, 238 antienflamatuvar ve antipiretiklerdir. 241 Yapılan araştırmalarda mide dokusunda COX 1 reseptörlerinin çok fazla olduğu, COX 2 reseptörlerinin ise az olduğu bulunmuştur. Buna paralel olarak NSAİİ kullanımına bağlı gelişen mide dokusu hasarının COX 2 inhibitörü 41

62 kullanılarak en aza indirilebileceği gösterilmiştir. Yapılan birçok çalışma COX 2 inhibitörü ilaçların GİS üzerindeki yan etkisinin oldukça az olduğunu 237,239,240, göstermiştir. Bu grup ilaçlara koksib grubu ilaçlar denilmektedir. Bu ilaçların analjezik ve antienflamatuvar etkilerinin diğer NSAİİ kadar olduğu ancak TXA2 yi inhibe etmedikleri için trombosit fonksiyonlarını, platelet agregasyonunu ve kanama zamanını etkilemedikleri araştırmalarda gösterilmektedir. 242,244,245 Rofekoksib ve Selokoksib: Bu ilaçlar COX-2 yi nimesulid ve meloksikama göre yüzlerce kat daha fazla inhibe ederler. 195 Yiyeceklerle etkileşimleri minimaldir. Gastrointestinal emilimi tama yakındır. 246 Yarı ömürleri uzun olduğu için, günlük tek doz yeterlidir. Metabolizması lineer olmadığından ilacın yeterli kan düzeyine ulaşması için belli bir düzeyde birikmesi gerekmektedir. Karaciğerde sitozolik enzimlerle inaktive edildiği için ilaç etkileşiminin az olması en önemli avantajlarından biridir. İlacın % 72 si idrarla, % 14 ü feçes yoluyla atılır. 86,241,246 Akut ağrı ve primer dismenorede yüksek doz önerilirken, romatoid artrit ve osteoartrozda düşük doz kullanımı önerilmekte olup etkisi naproksen sodyumla eşdeğerdir. 239,240 Yapılan çalışmalar spesifik COX 2 inhibitörü olan rofekoksib ve selekoksibin aspirin gibi kolon kanserini önlemede etkin olduğunu bu nedenle profilaktik olarak kullanılmasının yarar sağlayabileceğini göstermiştir. 247,248 Diğer yeni bir gelişme ise bu ilaçların Alzheimer hastalığının gelişmesini ve ilerlemesini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. 249 COX 2 lerin kardiyovasküler sisteme olan etkileri yapılan birçok çalışmayla gösterilmiştir. İlk olarak bu ilaçların kan basıncını yükselttiği gösterilmiş olup, bu etki selekoksib kullanan hastalarda rofekoksib kullananlara göre daha az görülmektedir. 250, 251 Vasküler endotelde PGI2 sentezi ağırlıklı olarak COX 2 üzerinden olmaktadır ve bu etki özellikle endotel hücrelerinde çeşitli enflamatuvar olaylar sonucu artış göstermektedir. 252 Yapılan çalışmalar kalpte geç faz iskemik hasarda COX 2 42

63 mediatörlerinin koruyucu etkili olduğunu göstermiştir. 253 Teorik olarak vasküler endotelde COX 2 enzimi üzerinden olan PGI2 sentezinin koksibler ile inhibe edilmesi, buna karşın trombositlerde tromboksan üretiminin COX 1 üzerinden devam etmesi koksiblerin özellikle trombojenik açıdan önemli bir risk taşıyabileceğini düşündürmektedir. Bu etkinin klinik anlamı yapılan prospektif ve retrospektif çalışmalarda halen incelenmektedir. 254,255 Ayrıca yapılan bir çalışma da COX 2 inhibitörlerinin ovulasyonu bozduğunu ve bu ilaçların potansiyel bir infertilite etkeni olabileceğini göstermiştir. 256 COX 2 selektif inhbitörlerinin böbrekler üzerinde etkisi mezanjiolitik hasar, albüminemi ve glomerüler endotelial hücre hasarına bağlı olarak gelişen glomerulonefrittir. 257 Bu nedenle kronik kullanılmaları halinde böbrek fonksiyon testleri ile hasta periodik olarak kontrol edilmelidir Zambakgiller Veratrum album (Beyaz çöpleme) Ülkemizde de yayılış gösteren, içeriğinde zehirli steroidal alkaloit ve glikozit bulunduran bir bitki türüdür. 19,258 Avrupa ve Kuzey Asya da yüksek rakımlı dağlarda ve ormanlık alanlarda yayılış gösterir. Ülkemizde Zigana Dağları ile Toros Dağlar ında orman açıklıklarındaki çayırlarda yayılış göstermekte ve halk arasında çöpleme, akçöpleme, beyaz çöpleme, kökenfiye ve çemah isimleriyle bilinmektedir. 19, Yetiştiği yerler kış boyunca karla kaplıdır ve azotça zengin içeriğe sahip alanlardır. Veratrum album, bulunduğu yerdeki bitkilere kıyasla daha erken büyümeye başlar

64 Şekil 2.2. Veratrum album un toprak üstü kısımları Şekil 2.3. Veratrum album un toprak altı kısımları Veratrum album, 1,5 metreye kadar yükselebilen, sapsız, dayanıklı, uzun ömürlü ve otsu bir bitkidir. Yaprakları geniş, oval ve paralel damarlıdır. Çiçekleri beyaz ve yeşildir. Tohumları tek kapsüllüdür. Bitki yalnızca bir rizoma sahiptir. Rizomu ortalama 8 cm uzunluğunda, 2-3 cm kalınlığında ve koyu kahverengidir. Rizomun bütün yüzeyinde 3-4 mm çapında ve ortalama 30 cm uzunlukta, açıktan koyuya doğru 44

65 kahverengi olan, silindirik kökler vardır. Bitkinin kök ve rizomları % 1-2 oranında steroidal alkaloit içerir. 19,264 Rizom bitkide ayrıca karbonhidrat ve azot deposu görevi görmektedir. 265 Toksik özelliğinden dolayı otçullar tarafından tüketilmezler. 263 Veratrum album, halk hekimliğinde, tedavi amaçlı, yaygın olarak kullanılmış ve oldukça zehirli bir bitkidir. Tadı acı ve tozları çok aksırtıcıdır. İshal ve alerji yapıcı etkiye sahiptir. Bitki çok tahriş edici olduğu için halk hekimliğinde dâhilen kullanılmamaktadır. İnfüsyonu (% 0.5) bazı deri hastalıklarına ve vücut parazitlerine (uyuz) karşı haricen kullanılmaktadır. Rizomları nezle ve sinüzit sonucu meydana gelen tıkanıklıklarda burnu açmak amacıyla kullanılmaktadır. Bu amaçla rizomlardan elde edilen tozun çok az bir kısmı buruna çekilmek suretiyle kullanılır. 258 Veratrum preparatları, kan dolaşımı bozuklukları tedavisin yanı sıra zararlı böcekler ile mücadelede yıllardır kullanılmışlardır. Son zamanlarda tıpta sentetik ilaçların, ziraatte ise sentetik böcek ilaçlarının yerini almaya başlamıştır. 266 Çok eski dönemlerden beri böcek kaçırıcı veya böcek öldürücü etkisi ile bilinen Veratrum album un alkaloitleri özellikle insanlar ve soğukkanlı hayvanlar için son derece zehirlidir. Toksik etkilerinin uyarılabilir hücrelerin membranlarında dayanıklı sodyum kanallarının geçirgenliğini artırmalarından kaynaklandığı tespit edilmiştir. 267,268 Cilt kanserine karşı ümit verici antikanser özellik gösteren cyclopamine maddesi ilk kez 1964 te ABD de yayılış gösteren Veratrum californicum türünden izole edilmiş ve karakterize edilmiştir. 269,270 Cyclopamine maddesinin kanserli hücrelerin çoğalmasında önemli olan Hedgehog sinyal yolunun güçlü bir antagonisti olduğu rapor edilmiştir. 28,268, Cyclopaminin bu özelliği bu maddenin prostat, akciğer, cilt, meme, yumurtalık, pankreas gibi kanser türlerinin yanı sıra sedef hastalığı gibi genetik hastalıkları da başarılı bir şekilde tedavi ettiği tespit edilmiştir. 268,276,277,

66 Cyclopamine maddesine son zamanlarda yapılan bir çalışma ile Veratrum dahuricum türünde de rastlanmıştır. 283 Veratramine ve germine alkaloitlerinin de cyclopamine kadar olmasa da antitümör etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu açıdan günümüzde ve de gelecekte Veratrum türleri ve bu türlerin içerdiği bazı alkaloitlerin kanser tedavisinde önemli bir yer tutacağı görülmektedir. Bununla beraber, ülkemizde yetişen Veratrum album türünde cyclopamin maddesinin olup olmadığı üzerine herhangi bir kayda rastlanmamıştır. Cyclopamine maddesinin yanı sıra bu maddeden sentezlenen bazı cyclopamine türevlerinin de antikanser özellikleri rapor edilmiştir. 279 Veratrum türlerinden izole edilen O-acetyljervine, jervinone, protoveratrine A, protoveratrine B, germitetrine, neogermitrine, germidine, germerine ve jervin maddelerinin kan basıncını düşürücü etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. 287 Veratrum viride den izole edilen cryptenamine alkaloidinin de tansiyon düşürücü etkisi olduğu rapor edilmiştir. 288 Protoveratrine A, dolaşım sistemindeki etkilerinin yanında, son yıllarda güçlü bir insektisit olarak da umut vermektedir. 289 Canlı deneylerinde rizom ve köklerinin etanol ekstraktı kullanılan Veratrum taliense den 13 steroidal alkaloit elde edilmiştir. Veratrum nigrum un rizom ve köklerinden 3 melanojenez inhibitörü belirlenmiştir. 25 Veratrum dahuricum bitkisinden izole edilen çeşitli steroidal alkaloitlerin antitümör aktivite gösterdiği belirlenmiştir. 283 Aynı bitkinin başka bir çalışmada antiplatelet aktiviteye sahip olduğu anlaşılmıştır. 28 Neoverataline A, neoverataline B ve jervin metabolitlerinin Veratrum taliense den izole edildiği bir çalışmada ise bu steroidal alkaloitlerin güçlü antifungal etki gösterdiği belirlenmiştir. 290 Veratrum dahuricum türünden izole edilen bir stilben glikozitin kan pıhtılaşmasını azaltıcı etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Aynı çalışmada izole edilen resveratrol maddesinin antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu belirtilmiştir

67 Alkaloitler Alkaloitler, alkali özellik gösterdikleri için baz gibi anlamına gelen alkaloit adını almışlardır. Bitkilerden elde edilen, kuvvetli fizyolojik ve farmakolojik aktivite gösteren, halka içinde bir veya birden fazla azot atomu taşıyan bazik karakterli maddelerdir. Hemen hemen tüm bitkilerde az veya çok miktarlarda sentezlenirler. Özellikle azotlu ve sıcak bölgelerde, gübrece zengin topraklarda yetişen türler alkaloitlerce zengindirler. Alkaloitler bitkilerde hücre öz suyunda çözünmüş olarak bulunmakla birlikte serbest ya da tuzları halinde de bulunabilirler. 291 Alkaloitler oldukça geniş bir sınıfı temsil eden metabolitlerdir. Basit yapıda olabildikleri gibi karmaşık yapıda da olabilirler. Yapı bakımından en basit alkaloitlerden biri nikotindir. İlk defa saf olarak izole edilen alkaloit 1805 yılında haşhaş bitkisinin sakız ve tohumlarından elde edilmiştir. 292 Kimyasal yapılarına göre pirolidin, piperidin, piridin, tropan, pirolizin, kinolizin, kinolein, izokinolein, imidazol, indol, purin, steroidal ve terpenik alkaloitler olarak sınıflandırılırlar. 264,291 Molekül yapısında steroit iskeleti taşıyan alkaloitler steroidal alkaloitler olarak adlandırılır. Steroidal alkaloitler içerdikleri karbon atomu sayısına göre basitçe 21, 24 ve 27 karbonlu iskelet yapılı olarak gruplandırılır. 264 Zambakgiller familyasındaki steroidal alkaloitler 27 karbonludur. Bu grup 27 karbonlu kolestan iskeletinin beş veya altı karbosiklik ya da heterosiklik halka ile birleşmesiyle oluşan steroit yapısıdır. 27 karbonlu steroidal alkaloitler karbon iskelet yapısına göre steroidal alkaloitler ve izosteroidal alkaloitler olarak iki grupta incelenebilir. Birinci gruptakiler genellikle Solanum steroidal alkaloitleri olarak bilinirler ve Solanidine ve Verazine gruplarını içerirler. 47

68 İkinci gruptaki izosteroidal alkaloitler ise, steroit iskeletindeki C halkasının bir karbon atomu kaybedip, D halkasının bir karbon atomu kazanması şeklindeki halka düzenlenmesi ile yapının C-nor-D-homo formuna dönüştüğü yapılardır. Bu tür maddelere Abnormal Steroidal Alkaloit adı da verilmektedir. Bu tür steroidal alkaloitler Cevanine, Veratramine ve Jervin gruplarını içerirler. Veratrum türlerinde izosteroidal alkaloit yapıdaki bileşikler yaygındır. 25,27,29,264, Antioksidanlar Serbest Radikaller Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron ihtiva eden atom veya moleküllerdir. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça aktiflerdir ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler. Serbest radikaller üç yolla meydana gelirler ) Kovalent bağlı bir molekülün her bir grubunda ortak elektronlardan birinin kalarak homolotik olarak bölünmesi. X : Y X + Y 2) Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir. X : Y X : - + Y + 3) Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e A 48

69 Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil radikalleridir. 294 Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonuncu genellikle hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise nispeten daha yavaş reaksiyona girmesini sağlar. Oksijenin son indirgenme ürünü genellikle sudur, ancak kısmi redüksiyonla çok sayıda yüksek derecede reaktif ürünler de oluşturabilmektedir. Serbest Radikal Çeşitleri Süperoksit Radikali (O 2 ): Hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron olarak indirgenmesi sonucu serbest süperoksit radikal anyonu (O 2 ) meydana gelir. O 2 + e O 2 Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez. Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılmamasına rağmen, yüksek derecede toksik olduğuna dair birçok deliller vardır. 295,296 Bununla beraber oksidatif hasarda nadiren rol alırlar, çünkü hızlı bir şekilde süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen perokside (H 2 O 2 ) çevrilirler. Buna ilaveten asidik durumlarda hidrojen peroksit ve peroksil (HO 2- ) radikallerini üreten spontan protonasyona uğrarlar

70 Bu süperoksit radikallerinin asıl zararları, hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır. O 2 + O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olan NO ile birleşmesi sonucu reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir. O 2 + NO ONOO - Böylece NO in normal etkisi inhibe edilir. Ayrıca peroksinitritlerin doğrudan proteinlere zararlı etkileri vardır ve azot protoksit (NO 2 - ), hidroksil radikali ( OH ) ve nitronyum iyonu (NO + ) gibi başka toksik ürünlere de dönüşürler. Süperoksit anyonu hem oksitleyici hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin, dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium ve sitokrom c yi indirger. Redüktan olarak görev yaptığında, ferrisitokrom c nin redüksiyonunda bir elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir. 293 Süperoksit ile perhidroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir. 297 HO 2 + O 2 + H + H 2 O 2 + O 2 50

71 Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit meydana getirebilmektedir. 298 Fe 2+ + O 2 Fe 3+ + O 2 Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2 Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir. 299 Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ): Asidik ortamda moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu hidrojen peroksit meydana gelir. 297,300 O 2 + e- + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e- + 2H + H 2 O 2 Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi süperoksitin dismutasyonu ile olur. Süperoksit molekülü proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar. 298 Bu dismutasyon ya spontandır ya da SOD tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4.8 de en hızlıdır. SOD tarafından katalizlenen dismutasyon ise daha geniş bir ph aralığında olur. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Hidrojen peroksit kendi başına serbest radikal değildir, çünkü ortaklanmamış bir elektron içermemektedir. 295,301 Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif oksijen türleri içine girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe ve Cu gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en 51

72 reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir. 297 H 2 O 2 + O 2 OH + OH - + O 2 Bu reaksiyona Haber - Weiss Reaksiyonu adı verilir. Haber - Weiss Reaksiyonu katalizör varlığında veya katalizörsüz cereyan eder. Fakat katalizörsüz reaksiyon oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe 3+ ) süperoksit tarafından ferro demire (Fe 2+ ) indirgenir. Sonra bu ferro demir kullanılarak Fenton reaksiyonu ile hidrojen peroksitten OH ve OH - üretilir. 302 Reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekildedir. 298 O 2 + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH - Hidroksil radikali ( OH): Hidroksil radikali ( OH) hidrojen peroksidin geçiş metallerinin varlığında indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir. 297 Suyun yüksek enerjili iyonize edici reaksiyona maruz kalması sonucunda da hidroksil radikali oluşur. H - O H H + OH Son derece reaktif bir oksidan radikaldir. Oluştuğu yerde büyük hasara neden olur. Hidroksil radikali birçok biyolojik molekülden hidrojen atomu koparır. Bunlardan birisi de tiollerdir. R-SH + OH RS + H 2 O 52

73 Meydana gelen sülfür radikali oksijenle birleşerek RSO 2 ve RSO gibi oksisülfür radikallerini meydana getirir. Bu radikaller de biyolojik moleküllerde hasar yapıcı etkiye sahiptir. Belki de hidroksil radikalinin en iyi tanımlanmış biyolojik hasarı LPO yu uyarmasıdır. Bu durum hidroksil radikallerinin membranlara yakın bir yerde üretilmesi ve membran fosfolipid zincirinin yağ asidi tabakasına atak yapması ile meydana gelir. Bu radikalin AA gibi doymamış yağ asitlerine olan ilgisi daha fazladır. Singlet oksijen ( 1 O 2 ): Singlet oksijen ( 1 O 2 ) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu oluşur. 293 Diğer radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller (R ), peroksil radikalleri (ROO ), alkoksil radikalleri (RO ), tiyol radikalleri (RS ) gibi önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO ) veya tiyol peroksil (RSO 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler. Serbest Radikallerin Kaynakları Biyolojik kaynakları: 1) Aktive olmuş fagositler: (Respiratory Burst). 293,298 2) Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin 53

74 3) Radyasyon 303 4) Alışkanlık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular 5) Çevresel ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler, pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar 6) Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir. İntrasellüler kaynakları: 1) Küçük moleküllerin oto oksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler, filavinler, tetrahidropterinler, antibiyotikler 300,304,305 2) Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, dioksijenaz, hemoglobin. Birçok enzimin katalitik siklusu esnasında serbest radikaller açığa çıkar. Ksantin oksidaz serbest radikal oluşturan enzimler içinde en çok araştırılmış olanıdır. 298 Normalde nikotin amid dinükleotid (NAD) bağımlı dehidrojenaz olarak etki eder ve herhangi bir serbest radikal üretimine sebep olmaz. Fakat in vivo olarak oluşturulan iskemi, enzimin dehidrojenaz formundan oksidaz formuna dönüşmesine ve süperoksit radikalinin üretimine sebep olur. 300 Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer ve substratlarının çoğu aynı olup, süperoksit radikali üretir. Benzer şekilde triptofan dehidrojenaz gibi enzimler de radikal oluşumuna sebep olurlar. 298,306 3) Mitokondriyal elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest radikal kaynaklarından biri elektron transport zincirinden elektron sızıntısıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar. 298 Böylece NAD + 54

75 bağlı substratlar, süksinat, adenin dinükleotid fosfat (ADP) ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek mitokondriyal radikal üretimine etki ederler. 4) Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri: (Sitokrom P-450, sitokrom b5) Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Membrana bağlı sitokrom P 450 ve b5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler. 5) Peroksizomlar, oksidazlar, flavoproteinler: Peroksizomlar çok önemli hücre içi hidrojen peroksit kaynağıdırlar. Bu organeldeki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil COA oksidaz gibi oksidazlar süperoksit üretmeden bol miktarda hidrojen peroksit üretimine sebep olurlar. Ancak peroksizomlarda katalaz (CAT) aktivitesi de çok yüksek olduğu için bu organelden sitozole ne kadar hidrojen peroksit geçtiği bilinmemektedir ) Aktive olmuş fagositler: Bakterisidal rollerinin sonucu olarak süperoksit üretirler. 297,303,307 7) Plazma membranı: Plazma membranı serbest radikal oluşum reaksiyonlarının kritik bir bölgesidir. Ekstraselüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücre komponentleri ile reaksiyona girmeden önce plazma membranını geçmek zorundadırlar. Bu geçiş sırasında membranda toksik maddeleri üreten reaksiyonlar başlatabilirler. Membranda yer alan ve fosfolipitler, glikolipitler, gliseridler ile sterollerin bünyesinde bulunan doymamış yağ asitleriyle okside olabilen ve amino asit içeren transmembran proteinleri serbest radikal hasarından çabuk etkilenirler. LPO veya yapısal olarak önemli proteinlerin oksidasyonunun sebep olduğu artmış membran permeabilitesi 55

76 transmembran iyon gradiyentinin bozulmasına, sekretuar fonksiyonlarının kaybına ve integre sellüler metabolik proseslerin inhibisyonuna sebep olur. 298 Hidrojen peroksit, membranları neredeyse su kadar kolay geçebilme özelliğine sahiptir. Saldırgan süper oksit radikal anyonu membranları ve transmembranal anyon kanallarını geçerek hücreye girer. Aynı zamanda polianyonik hücre yüzeyi, çevre doku sıvısından 2 3 ph daha düşük olduğu tahmin edilen bir mikro çevre sağlayan çoğu çözünmüş H + den oluşan son derece zıt bir konsantrasyonu çeker. Bu pratik çevre süper oksitin protonla reaksiyonu sonucu perhidroksil radikalinin oluşumunu sağlar. 298 H - + O 2 HO 2 Perhidroksil (HO 2 ), süper oksitten daha güçlü bir oksidandır, bu nedenle lipitlerin ve proteinlerin hidrofobik kısımlarını daha iyi parçalayabileceği ve toksik etkilerinin daha fazla olabileceği düşünülmektedir. Bu sebeple saldırgan oksijen radikallerine karşı bir bariyer oluşturan hücre yüzeyleri, diğer radikal türlerine reaktif bir forma modifiye eden ve daha permeabl bir kapı görevi görür. Serbest radikallerin fagositik hücre plazma membranında, NADPH-oksidaz aracılı üretimi, serbest radikallerin önemli bir biyolojik kaynağıdır. 297 Fagosit kökenli serbest radikaller hem oluştukları hücreye, hem de yakınında bulunan hücrelere hasar verirler. LO ve COX gibi plazma membranıyla bağlantılı enzimler ile mikrozomlar tarafından serbest radikal üretimi, bu enzimlerin predominant substratı olan AA metabolizması ile ilişkili pek çok yeni buluş ve biyolojik açıdan önemli ürünlerin meydana gelmesinden dolayı ilginçtir. Bu ürünler PG leri, TX leri, LT leri ve anaflaksinin slow-reakting substratını içerir (Şekil 2.4). Son zamanlarda araşidonat metabolizmasında yer alan bu enzimatik proseslerin otokatalitik LPO ya öncülük etmesi bu konuya olan ilgiyi artırmıştır

77 Şekil 2.4. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller AA metabolizması reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. 298 AA nın biyoaktif ürünlere dönüşümü esnasında geniş spektrumlu oksijen, karbon ve hemoprotein radikalleri oluşur ve bunlar doku hasarına yol açar. 308 PG sentezi esnasında hidroksil radikali veya diğer radikallerin üretimi, siklooksijenazın feed-back regülasyonuna yol açar, PG biyosentezinin hız ve süresini modüle eder ve PG sentezinden sonra ikinci ulak ve sitotoksik etkilerini hızlandırır. COX, ksenobiyotikleri daha toksik türlere metabolize etme yeteneğine de sahiptir. 309,310 Trombositlerde TX sentezinin imidazol ve nordihidroguiaretik asit gibi radikal toplayıcılarla inhibe edilmesi, PG endoperoksitinin TX lere dönüşümünün bir serbest radikal reaksiyonu sonucu olabileceği düşüncesini kuvvetlendirmektedir. 298 LO kaynaklı peroksitler oksidan-sensitif COX aktivitesini modüle edebilir. 310 Bu sebeple, PG ve TX lerin biyosentezi, biyosentetik enzimin kendisi ve diğer hücre komponentleri ile reaksiyon yeteneğine sahip hemoprotein-oksijen ve karbon merkezli serbest radikallerin oluşmasıyla sonlanır. 57

78 Serbest radikallerle PG metabolizması birbirleriyle yakından ilişkilidir. Reaktif oksijen metabolitleri fosfolipaz aktivasyonu yolu ile PG, PGE2, PGF2, 6-keto PGF1α ve tromboksan B2 (TXB2) sentezini gerçekleştirirler. PGE2 ve PGI2 adenilat siklazı aktive ederek siklik adenozin mono fosfat (camp) sentezini artırırlar ki, süperoksit de camp sentezini artırıcı etkiye sahiptir. Bu bilgiler reaktif oksijen türlerinin PG sentezi yolu ile camp konsantrasyonunu artırdıklarını doğrulamaktadır. 293 Hayvan hücrelerinde süperoksitin bir başka kaynağı da askorbik asit, tioller (glutatyon, sistein gibi) adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin oto oksidasyonudur. 293 Oksidatif stres yapıcı durumlar: İskemi, travma, intoksikasyon. 293 Hücrelerde serbest radikal üretimi bazı yabancı toksik maddeler tarafından da büyük oranda artırılabilir. Bu tip maddeler dört grupta toplanabilir ) Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit (NO 2 ) 311 gazını buna örnek verebiliriz. NO 2 gazı radikalik bir madde olup aynı zaman da iyi bir LPO başlatıcısıdır. 2) Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Mesela toksik bir madde olan karbontetraklorür (CCl 4 ) karaciğerde sitokrom P 450 tarafından triklorometil (CCl 3 ) serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyonu sonucu meydana gelen peroksil radikali de güçlü L başlatıcısıdır. CCl 3 +O 2 CCl 3 O 2 3) Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun tipik bir örneği paraguattır. 58

79 4) Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Mesela parasetamolün karaciğerde sitokrom P 450 tarafından metabolizması sonucu glutatyonla reaksiyona girerek ve miktarını azaltan bir ürün meydana getirir. Serbest Radikallerin Etkileri Serbest radikaller hücrelerin lipit, protein, deoksi ribonükleik asit (DNA), karbohidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşenlerine etki ederler. Mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller permeabiliteyi bozarlar ve hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu artırırlar. Proteaz, fosfolipaz, elastaz, COX, ksantin oksidaz, LO, triptofan dioksijenaz ve galaktoz oksidaz gibi litik enzimleri aktifleştirirken alfa-1- antitripsin gibi bazı savunma sistemlerini de inaktive ederler. 295 Serbest radikallerin etkileri aşağıdaki şekilde gruplandırılabilir: Membran lipitlerine etkileri (Lipit peroksidasyonu): Biyomoleküllerin tüm büyük sınıfları serbest radikaller tarafından etkilenmesine karşın, bunlar arasında en hassas olanı lipitlerdir. LPO bir serbest radikal kaynağıdır, oksijenle karşılaşan LPO ya uğraması (oto oksidasyonu) sadece besinlerin bozulmasından (acıma) sorumlu olmayıp aynı zamanda, kanser, yangısal hastalıklar, ateroskleroz, yaşlanma vb. gibi olaylara neden olabilen doku hasarından da sorumludur. Bu yıkıcı etkiler metilenle kesintiye uğramış çift bağlar içeren doymamış yağ asitlerinden, peroksit oluşması sırasında üretilen serbest radikaller (ROO, RO, OH ) tarafından başlatılır. Membranlardaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış (çift) bağları serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipit radikallerinin hidrofobik yapıda olması yüzünden reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde meydana gelir. Bundan da membran permeabilitesi ve mikro vizkozitesi ciddi bir şekilde etkilenir. Polidoymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidatif yıkımı lipit peroksidasyonu 59

80 (LPO) olarak bilinir ve oldukça zararlıdır. Çünkü LPO kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve bu oto katalitik reaksiyonu sonucu oluşan lipit peroksit, membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak, hızlı hücre ve doku bozulmalarına neden olurken lipit, alkol ve aldehitler gibi istenmeyen yan ürünler oluşur. 298,312,313 Bu ürünlerin ya hücre düzeyinde metabolize edilirek veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarak birçok hastalığa ve doku hasarına neden olurlar. 314 Bu ürünlerden en çok bilineni malondialdehittir (MDA). 315,316 Serbest radikaller tarafından zar lipitlerine direkt saldırı dönüşümlü ve dönüşümsüz kardiyak etkilerin oluşumuna yol açar. LPO sonucunda, bazıları serbest radikal aktivitesinin göstergeleri olarak kullanılan, birçok ürün oluşur. LPO nun başlangıç aşamalarında dien konjugatlarının oluşumu ile bir moleküler düzenlenme oluşur. İnsanlarda en sık görülen linoleik asitin 9,11 izomeridir. Daha sonraki yayılma evresinde daha ileri LPO ve fragmentasyon (parçalanma) oluşur. Ortaya çıkan son ürünlerden biri yukarıda bahsedildiği gibi MDA dır. 317 Olayın tamamı aşağıdaki şekilde özetlenebilir ) Başlama safhası LOOH + metal (n)+ LOO + metal (n-1)+ + H + X + LH L + XH 2) İlerleme safhası L + O 2 LOO LOO + RH LOOH + R, vb 60

81 3) Sonlanma safhası LOO + LOO LOOL + O 2 LOO + L LOOL L + L LL Olayı başlatan moleküler öncüller genel olarak hidroperoksit ürün LOOH olduğundan LPO, potansiyel yıkıcı etkileri olan bir zincir tepkimesidir. Gerek insanlar ve gerek doğada LPO yu denetlemek ve azaltmak için antioksidanlar kullanılır. Propil gallat, butillenmiş hidroksianizol (BHA) ve butillenmiş hidroksitoluen (BHT) antioksidan olarak kullanılan gıda katkılarıdır. Doğada görülen antioksidanlar yağda çözünen ß-karoten ile E vitaminini (tokoferol), ve suda çözünen C vitaminini kapsar. 293,313 Proteinlere etkileri: Serbest radikallerin doymamış ve sülfür içeren moleküllerle olan reaktivitesi sebebiyle, triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi amino asit içeren proteinler bu serbest radikallerden kolayca etkilenirler. Bu etkilenmenin sonucunda da sülfür radikalleri ve karbon merkezli radikaller oluşur. 298 Bu istenmeyen reaksiyonlar sonucu immünoglobulin G (Ig) ve albümin gibi çok sayıda disülfid bağı bulunduran proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Nitekim serum proteinlerinde, kataraktlı lens proteinlerinde ve enflamatuvar eklem hastalığı olan kişilerin sinoviyal sıvılarındaki IgG lerinde serbest radikal hasarı tespit edilmiştir. 293 Sitoplazmik ve membran proteinleri, ozon ve protoporfirin IX gibi okside edici ajanlara maruz kaldıktan sonra çapraz bağlanarak dimerleşir veya daha büyük agregatlara dönüşür. Prolin ve lizin; süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona 61

82 uğrayabilmektedirler. 293 Hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar gören proteinlerdendir. Örneğin; oksi hemoglobinin O 2 veya hidrojen peroksit ile reaksiyonu methemoglobin oluşumuna sebep olmaktadır. 297,298 O HbFe 2+...O 2 2H+ Hb-Fe 3+ + H 2 O 2 + O 2 2H + H 2 O 2 + 2Hb-Fe 2+ -O 2 2Hb-Fe H 2 O + O 2 Nükleik asit ve DNA ya etkileri: İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Sitotoksite büyük oranda, nükleik asit baz modifikasyonundan doğan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer bozukluklara bağlıdır. 293,318 Hidroksil radikalinin hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde, radyasyonun sebep olduğu hücre ölümünden büyük oranda (% 80 oranında) sorumlu bir ajan olduğu düşünülmektedir. 298 Aktivite olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit membranlardan kolayca geçtikten sonra hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta ölümüne yol açabilir. Bu yüzden DNA serbest radikallerden kolay zarar görülebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir. Çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematosuz (SLE) ve romatoid artritte (RA) dolaşımında anti-dna antikorları bulunur. Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları, hidroksil radikali prekürsörlerinin konsantrasyonunu azaltarak DNA yı korur. 293 Karbohidratlara etkileri: Serbest radikallerin karbohidratlar üzerine de önemli etkileri vardır. Monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksitler 62

83 ve okzalaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik hastalıkların patolojik proseslerinde de önemli rol oynarlar. 293 Okzalaldehitler DNA, ribo nükleik asit (RNA) ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz bağlar oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkiye sahiptirler. Böylece kanser ve yaşlanma olaylarında da önemli rol oynarlar. 293 Serbest radikaller enflamatuvar cevap ve sekonder doku hasarının modülasyonunda da önemli rol oynar. İltihap hücreleri ile ilişkili doku hasarında risk altında bulunan kollagen ve hiyaluronik asit gibi ekstraselüler doku komponentlerinin, enflamatuvar osteoatiritle etkilendikleri görülmüştür. 298 Kıkırdak dokunun esas öğesi olan kollagen süperoksit anyonu ile hasarlanır ve jelasyonu önlenir. 319 SOD kollagen jelasyonunu süperoksit inhibisyonundan korur. Eklem sıvısının vizkositesinin devamı için gerekli olan hiyaluronik asit süperoksit anyonu ile depolimerize edilebilir. 319,320 Süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali toplayıcıları süperoksit oluşturan sistemden hyaluronik asitin depolimerizasyonunu önler. Ekstraselüler sıvının çok düşük seviyede SOD ve CAT aktivitesine sahip olması nedeniyle redükte oksijen türlerinin küçük miktarları bu bölümlerde yaygın hasara sebep olabilirler. 298 Revers, pasif Arthus reaksiyonunun, karregenin ile indüklenen bacak ödeminin inhibisyonu aktive olmuş lökositlere bağlı akciğer kapiller endotelyal hücre hasarı ve pulmoner ödemin azalması SOD un antienflamatuvar etkilerinin örnekleridir. 170, Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinir. Antioksidanlar, (doğal) endojen ve ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Antioksidanlar aynı zamanda serbest radikal 63

84 oluşumunu engelleyen ve mevcut radikalleri etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılırlar. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılan antioksidanlar hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunurlar. A) Doğal (Endojen) Antioksidanlar 1) Primer Antioksidanlar (Enzimler) Süperoksit dismutaz (SOD): Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen bu enzim, beyinde yaygın bir şekilde bulunur ve aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. İnsanlarda iki tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan dimerik Cu ve Zn ihtiva eden CuZnSOD ile mitokondri de bulunan tetramerik Mn ihtiva eden MnSOD 298,318 izomerlerdir. SOD nin Fe ihtiva eden izomeri (FeSOD) ise sadece mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunur. Genel olarak hücrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu, Zn-SOD dir. Cu, Zn-SOD ilk defa, 1969 da, Mc Cord ve Fridovic tarafından hayvan, bitki dokuları ve mayadan saflaştırılmış ve tanımlanmıştır. 322 Molekül kütlesi Daltondur. İki alt ünitesi vardır ve bunların her birinde bir Cu ve bir Zn atomu bulunmaktadır. Ayrıca her alt birimde bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril grubu ve bir de asetillenmiş terminal amino grubu bulunmaktadır. Cu/Zn-SOD enziminin ayrı formları bulunmaktadır. Sitoplazmada bulunanın dışında bazı hayvanların plazmasında Dalton molekül kütleli Cu/Zn-SOD bulunduğu tespit edilmiştir. Mn-SOD mitokondrial bir enzimdir ve prokaryatların sitozolünden elde edilebilmektedir. İlk kez 1970 yılında Keele ve arkadaşları tarafından izole edilmiştir. 269 Buradaki mangan +3 değerliklidir ve iki alt birimden oluşmuştur. Her alt birimde bir Mn atomu vardır ve Dalton molekül kütlesine sahiptir. Mitokondrial SOD hemen hemen total SOD un % 60 ını içerir. Zira süperoksit sitozole göre mitokondride hemen hemen iki kat daha fazla oluşur. Tüm SOD lar fizyolojik şartlarda süperoksite 64

85 karşı etkin bir koruma sağlarlar. 294 Her iki enzimin katalizlediği reaksiyon aynıdır. Enzimin fizyolojik fonksiyonu LPO yu inhibe ederek oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır. 296 Normalde metabolizma sırasında hücreler tarafından fazlaca süperoksit üretilmesine rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler düzeyleri düşük tutulur. SOD fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla oranda SOD bulunur. Katalaz (CAT): Doğada yaygın bir şekilde mevcut olduğu ilk defa 1901 de O. Leew tarafından bulunmuştur. Yine ilk defa 1937 de Summer ve Dounce tarafından karaciğerden kristal formda izole edilmiştir. Molekül kütlesi Daltondur. Dört alt üniteden oluşmuştur. Peroksizomlarda, lizozomlarda ve mitokondride bulunur. Kandaki CAT aktivitesi büyük ölçüde eritrositlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle insan eritrositleri CAT yönünden çok zengindir. Glutatyon peroksit (GPx) esas olarak mitokondri ve sitozolde bulunurken, CAT peroksizomlarda bulunur. Eritrositlerde mitokondri olmadığı halde yüksek aktivitede CAT ve GPx vardır. CAT 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksizomlarda lokalizedir. 318 Büyük moleküllü lipit hidroperoksidlere etki etmezken, hidrojen peroksidi oksijen ve suya parçalar. 154 CAT 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Glutatyon peroksidaz (GPx): GPx hidroperoksidlerin indirgenmesinden sorumlu, tetramerik 4 selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Memeli eritrositlerinden ilk defa Mills ve arkadaşları tarafından karakterize edilmişlerdir. Daha 65

86 sonra yapılan araştırmalarla enzim hakkındaki bilgiler artırılmıştır. Dominant olarak sitozolik bir enzimdir ve mitokondride düşük düzeylerde bulunur. GPx aktivitesindeki azalma, hidrojen peroksitin artmasına ve bu da hücre hasarına yol açar. GPx'in beyin düzeyleri düşüktür. Prostetik grup olarak selenyum (Se) içeren metalloenzimdir. Beyinde, beyin selenyumunun çok az bir kısmını içerdiğinden dolayı diyetle elde edilebilirliğinden çok fazla etkilenmez. GPx sitozolik hasara karşı etkin koruyucu bir mekanizma sağlar. Bu enzim, hidrojen peroksiti ve lipid peroksitlerini indirgenmiş glutatyonu (GSH) kullanarak redüksiyon yoluyla uzaklaştırır. GPx aşağıdaki reaksiyonları katalize eder. 318 H 2 O 2 + 2GSH ROOH + 2GSH GPx GPx GSSG + 2H 2 O GSSG + ROH + H 2 O Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz da (PLGPx) monomerik, selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger Membrana bağlı en önemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduğu zaman, PLGPx membranı peroksidasyona karşı korur. 293,318 H 2 O 2 + 2GSH PLGPx GSSG + H 2 O ROOH + 2GSH PLGPx GSSG + ROH + H 2 O PLOOH + 2GSH PLGPx GSSG + PLOH + H 2 O 66

87 Hidroperoksitlerin redükte olması ile meydana gelen yükseltgenmiş glutatyon (GSSG), glutatyon redüktazın (GR) katalizlediği aşağıdaki reaksiyon ile tekrar GSH a dönüştürülür. 323 GSSG + NADPH + H + Glutatyon Redüktaz 2 GSH + NADP Glutatyon redüktaz (GR): GR, Daltonluk alt birimlere sahip bir dimerdir. Görevi GSSG yi GSH a çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH dan gelen elektronlar okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce NADPH dan sıkıca bağlı bulunan flavin adenin dinükleotide (FAD) transfer edilirler. Daha sonraki alt birimlerdeki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar: FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP + alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara benzerler. FAD ve NADP + nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek şekilde geniş ölçüde aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir alt biriminin FAD alanı ile diğer alt birimin ara yüz alanından meydana geldiği belirtmek gerekir. 324 GR GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR nin GSSG yi GSH ye çevrimi için gereken NADPH ı sağlar

88 Glutatyon-S-Transferaz (GST): GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi göstererek bir savunma mekanizması oluştururlar. 318 ROOH + 2GSH GST GSSG + ROH + H 2 O GST ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyonu aktaran proteinlerdir. GST, bunun yanı sıra hem, bilirubin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve deksametazon gibi hidrofobik bileşiklere de yüksek bir afiniteyle bağlanabilmektedir. E.coli den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilirken en çok da sıçan karaciğerinden saflaştırılmıştır. GST ler en az 7 alt üniteden oluşan homodimer veya heterodimerlerdirler. Spesifik GST alt ünitelerinin fenobarbitol, 3-metilşolantren, trans-stilben oksit gibi çeşitli ksenobiyotikler tarafından indüklenmesinden ve dokuya spesifik bir tarzda ekspresse olmasından beri, GST gen ailesi gen ekspresyonunun dokuya özel düzenlenmesi ve indüksiyonunun araştırılmasında yararlı bir model sistemi olmuştur. 325 GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere LPO lara karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi koruyucu mekanizma oluştururlar. 318 GST ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip GST lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik olarak, yabancı maddeleri glutatyonda ki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini 68

89 sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir ürüne metabolize olabilirler. GSH den glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür. 318 LTC4 ün sentezi GST tarafından katalizlenmekte olup, GST ler PG sentezinde PG izomeraz etkisine de sahiptirler ) Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar) Lipit fazda bulunanlar antioksidanlar α, β, γ (-) tokoferoller (E vitamini) ve β- karoten dir. Sıvı fazda (hücre sitozolü veya kan plazmasında) bulunanlar ise askorbik asit, miyoglobulin, melatonin, hemoglobin, üre, ferritin, sistein, metionin, seruloplazmin, albümin, laktoferrin, bilirubin ve glutatyondur. Glutatyon (GSH): GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir: γ-l-glutamil-l-sisteinilglisin (şekil 2.5). GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül adenozin tiri fosfat (ATP) harcanır. 326 Şekil 2.5. GSH ın molekül yapısı 69

90 L-Glutamat + L-Sistein + ATP -Glutamil sistein + Glisin +ATP -Glutamilsistein sentetaz Glutatyon sentetaz -Glutamil sistein + ADP +P i GSH + ADP + P i GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Eritrosit hücrelerinde GSH/GSSG oranı yaklaşık 500 dür. GSH, aktif bölgesinde selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde hidrojen peroksit ve organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidan etki sergiler ve hidrojen peroksiti alyuvarlardan uzaklaştırır. Hidrojen peroksit birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir. Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P 450 redüktaz ve ksantin oksidaz gibi enzimlerle oluşur. 313,326,327 GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye edebilir. GSH yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul edebiliriz. GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfit-sülfidril değişimi tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi uzaklaştıran enzim GPx e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur. GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH ye indirgenerek GSH miktarı düzenlenir. 328 Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır. Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif oksijen ara ürünlerini suya indirger. İkinci mekanizma ise oksijen 70

91 radikallerini kimyasal olarak inaktive eden vitamin C, E ve β-karoten gibi diyetle alınan antioksidanlarla ilgilidir. 329 Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu ( SH) oksitlenecek olursa inaktive ya da inhibe olur. GSH, Gama-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel SH gruplarını içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. GSH hücrede bir ko-enzimden ziyade var olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak üzere GSH çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. GSH nin hücre içi derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir ) Diğer Sekonder Antioksidanlar: İnsan vücudunda oldukça az miktarlarda bulunmasına karşın vitaminlerin vücuttaki etkinlikleri oldukça fazladır. Bunların bir bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C vücut hücrelerinin hasarını önleyerek normal işlevlerini sürdürmeleri ve bazı zararlı maddelerin etkilerinin azaltılmasında (antioksidan etki) yardımcı olurlar. Antioksidanlar, hücreyi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. β-karotenin, askorbik asitin ve tokoferolün antioksidan etkileri yıllardan beri bilinmektedir. β- Karoten organizmada A vitaminin parsiyal oksijen öncülü olmasının yanı sıra bir antioksidan olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr da 150 torr dan daha iyi antioksidan olduğu, 760 torr da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir. Hücrelerin dışında β-karoten nöbet tutarken; hücre duvarından, içeri girmek isteyen saldırganlara karşı savunmayı ise eser elementlerden selenyumun da yardımıyla E vitaminini üstlenmiştir. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktonundan ibarettir. Yüksek 71

92 yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest radikallere son darbeyi vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirleri ortadan kaldırılmaya çalışmaktadır. E vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan korumaktır. İnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka oluşturur. 330 B) Ekzojen Antioksidanlar pterin aldehit 1) Ksantin oksidaz inhibitörleri: Tungsten, allopürinol, oksipürnol, folik asit, 2) Soya fasulyesi inhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dönüşümünü inhibe ederler. 3) NADPH oksidaz inhibitörleri: Adenozin lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid anti-enflamatuvar ilaçlar, cetiedil, difenilin iyodoniyum 4) Recombinant süperoksit dismutaz 5) Troloks-c: E vitamini analoğu 6) Endojen antioksidan aktiviteyi artıran maddeler: Glutatyon peroksidaz aktivitesini artırırlar. Bunlar; Ebselen ve Asetil sisteindir. 7) Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol ve albümin 8) Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin ve seruloplazmin 9) Nötrofil adezyon inhibitörleri 72

93 10) Sitokinler: Tümör Nekroz Faktör (TNF) ve Interlökin ) Barbitüratlar 12) Demir şelatörleri C) Gıda Antioksidanları 1) Butillenmiş hidroksitoluen (BHT) 2) Butillenmiş hidroksianisol (BHA) 3) Sodyum benzoat 4) Etoksiguin 5) Propilgalat 6) Fe - superoksid dismutaz Antioksidan Etki Tipleri: Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler Toplayıcı etki (scavenging etki): Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya reaktif olamayan yeni bir moleküle çevirme işlemine toplayıcı etki denir. 2. Bastırıcı etki (quencher etki): Serbest oksijen radikalleri ile etkileşip onlara bir hidrojen atarak aktivitelerini azaltan veya inaktif şekle dönüştüren etkiye bastırıcı etki denir. 3. Onarıcı etki (repair etki): Genellikle DNA daki hasarların tamir edilmesinde bu etki devamlı geçerlidir. 73

94 4. Zincir kırıcı etki (chain breaking etki ): Serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye zincir kırıcı etki denir. Serbest radikaller ve bunları etkisizleştirmek için kullanılan veya üretilen antioksidanlar hakkında mevcut bilgiler arttıkça bunlara olan ilgi de bilim adamları tarafından her geçen gün artmaktadır. Bu bağlamda hemen her sahada yapılan çalışmaların antioksidan özellikler ile birlikte değerlendirme çalışmaları da ön plana çıkmaktadır. 74

95 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma Chemicals Company (Germany) den temin edilmiştir Deneylerde Kullanılan Cihazlar Soğutmalı santrifüj : Hettich Universal 32 R UV-Visible Spektrofotometre : Thermo Spectronic-HEλIOS β ph metre : Schott CG 842 Hassas terazi : Scaltec SPB 31 Derin dondurucu : Sanyo MDF Magnetik karıştırıcılar : Boeco MSH 300 Otomatik pipetler : Eppendorf Buzdolabı : Profilo Saf su cihazı : GFL 2012 Çalkalayıcılı su banyosu : Memmert Homojenizatör : Ika-Werke Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör) : BSI Kompresör : Milipore UV Lambası 254nm - 366nm : Model Mineralight 75

96 3.3. Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları 1. MPx Homojenat Tamponu (50 mm ph 6.0, % 0.5 HTAB (MA, hexadecy three methyl ammonium bromide) içeren Fosfat Tamponu: 1.02 g KH 2 PO 4 ve 0.75 g HTAB alınarak 125 ml saf suda çözüldü, ph sı ph metre ile 6.0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 150 ml ye tamamlandı. 2. MPx Ölçüm karışımı 50 mm KH 2 PO 4 ph 6 (MA, ) olan mg/ml o-dianizidin-hcl ve % H 2 O 2 içeren 45 ml ölçüm karışımı): A mg/ ml o-dianizidin-hcl 45 ml: (MA, 317.2), 7.5 mg o-dianizidin-hcl B - % H 2 O 2 (%30 luk) 45 ml için: 83.3 μl % 30 luk H 2 O 2 den alınarak 500 ml ye tamamlanmış çözeltiden 4.5 ml alındı. C 50 mm KH 2 PO 4 ph 6,0: g KH 2 PO 4 alındı. Bu üç tartım alındı, 40 ml saf suda çözüldü, ph sı 6.0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 45 ml ye tamamlandı. 3. LPO homojenatı tamponu ( % 10 KCl ): 10 g KCI alınarak 100 ml saf suda çözüldü. 4. LPO ölçüm karışımı: A - % 8 Sodyum lauril sülfat (SLS): 0.8 gr SLS alınıp distile su ile 10 ml de çözüldü. B - % 0.08 Tiyobarbütirik (TBA): 0.48 gr TBA alınarak 1-2 damla 1 M NaOH ilavesi ile hacmi 60 ml ye tamamlandı. C % 20 Asetik asit: 13 ml glasiyel asetik asit alındı üzerine 65 ml distile su eklendi. 76

97 Tamponu): 5. SOD homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, 10 mm EDTA içeren Fosfat 1.7 g KH 2 PO 4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 6. SOD ölçüm karışımı: A 0.3 mm Ksantine: g ksantine alınarak hacmi distile su ile 40 ml ye tamamlandı. B 0.6 mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi distile su 20 ml ye tamamlandı (2 damla 5 M NaOH ile çözündü). C 150 μm NBT (Nitro blue tetrazolium): g NBT alınarak 20 ml distile suda çözüldü. D 0.4 M Na 2 CO 3 : 0,5088 g alınarak 12 ml distile suda çözüldü. E 1.2 g / L BSA (Bovine Serum Albumine): g tartıldı ve 6 ml distile suda çözüldü. 7. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (167 U/L Xanthine oksidaz): Orijinal ambalajından (1 ml sinde 32 mg protein ve 0.3 U enzim ihtiva eden enzim) μl alındı ve üzerine 2 ml soğuk 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 çözeltisi eklendi. 8. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 ): g (NH 4 ) 2 SO 4 alındı ve 3 ml distile suda çözüldü. (bu çözelti her seferinde taze olarak hazırlandı ve soğuk olarak kullanıldı). 77

98 9. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (0.8 mm CuCl 2 ): g CuCl 2 alındı ve 100 ml distile suda çözüldü. 10. CAT homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, %1 Triton x-100 içeren Fosfat Tamponu): 1.7 g KH 2 PO 4 ve 2.5 ml Triton x-100 alınarak 200 ml saf suda çözüldü. ph 7.8 e ayarlanarak son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 11. CAT ölçüm karışımı (40 mm ph 7.0 de H 2 O 2 içeren 50 mm Fosfat Tamponu): 1020 μl H 2 O 2 ve 1.7 g KH 2 PO ml saf suda çözüldü ve ph 7.0 ye ayarlandıktan sonra son hacim 250 ml ye tamamlandı. 12. GPx homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, 30 mm KCI içeren Fosfat Tamponu): g KH 2 PO 4 ve g KCI alınarak 1-2 damla 5 M NaOH ile 90 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 ye ayarlandıktan sonra son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 13. GPx ölçüm karışımı: A - 50 mm Fosfat tamponu: g KH 2 PO 4 alınarak hacmi saf su ile 100 ml ye tamamlandı. B - 1 mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi 10 ml ye tamamlandı. (1 damla 5 M NaOH ile çözünür) C 1 mm GSH: g GSH alınarak 10 ml saf suda çözüldü. D 0,2 mm B-NADPH: g alınarak 10 ml saf suda çözüldü. E 1 mm NaN 3 : g tartıldı ve 100 ml saf suda çözüldü. F 1 EU/ml GR: 5.2 μl GR alındı ve 10 ml saf suda çözüldü. 78

99 14. GPx enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 0.25 mm H 2 O 2 ): μl H 2 O 2 alınarak ve hacmi 1000 ml ye distile su ile tamamlandı. 15. GSH Homojenat Tamponu (50 mm ph 7.4, Tris - HCI Tamponu): g Tris-HCI alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.4 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 16. GSH ölçüm tamponu (200 mm ph 8.2, 0.2 mm EDTA içeren Tris-HCI Tamponu): 6.05 g Tris-HCI ve g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 8.2 ye ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 17. GSH miktarını ölçmek için gereken çözelti ( 10 mm DTNB ): g DTNB alındı ve 10 ml ye metanol ile tamamlandı. Tamponu): 18. GST Homojenat Tamponu (50 mm ph 7.8, 10 mm EDTA içeren Fosfat 1.7 g KH 2 PO 4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü, ph sı bir ph metre kullanılarak 7.8 e ayarlandı ve son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 19. GST Ölçüm karışımı (0.11 M Fosfat Tamponu): 3.02 g KH 2 PO 4 alınarak 75 ml saf suda çözüldü, ph sı ph metre kullanılarak 6.5 e ayarlandı ve son hacim 200 ml olacak şekilde saf su ile seyreltildi. A - 30 mm Glutatyon çözeltisi: g glutatyon tartıldı, bir miktar saf suda çözüldü ve hacmi saf su ile 5 ml ye ayarlandı. 79

100 B - 30 mm CDNB: 0.03 CDNB (1-chloro-2,4-dinitro-benzene) tartıldıktan sonra az bir miktar % 99.9 saflıktaki etil alkolde çözüldü ve hacmi aynı etil alkol ile 5 ml ye tamamlandı. 20. GR Homojenat Tamponu (50 mm K-Fosfat Tamponu, ph 7.8): 1.7 g KH 2 PO 4 alınarak 200 ml saf suda çözüldü, ph sı ph metre kullanılarak 7.8 e ayarlandı ve hacmi saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 21. GR ölçüm karışımı: sırayla 3 ml de A 0.2 M Fosfat Tamponu (ph 7.2 mm EDTA içeren): g EDTA ve KH 2 PO 4 45 ml saf suda çözüldü, ph sı ph metre kullanılarak 7.0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 50 ml ye tamamlandı. B - 2 mm NADPH (MA, 833.4), 10mM Tris-HCl ph 7.0 içinde): g Tris alınarak 45 ml saf suda çözüldü, ph sı ph metre yardımıyla HCI çözeltisi ilave edilerek 7.0 a ayarlandı ve hacmi saf su ile 50 ml ye tamamlandı. 2 mm NADPH çözeltisini hazırlamak için g β-nadph alındı ve hacmi yukarıda hazırlanan Tris- HCl çözeltisi ile 5 ml ye tamamlandı. C- 20 mm GSSG (MA, 612.6) : g alınarak bir miktar saf suda çözüldü ve hacmi saf su ile 5 ml ye tamamlandı Deney Bitkisi Bitki Materyali Çalışmalarda kullandığımız Veratrum album bitkisinin rizomları ve toprak üstü kısımları, 2009 yılı Temmuz ve Ağustos aylarında Zigana Dağları nın kuzey eteklerinde yer alan Hamsiköy yakınlarındaki ormanlık alanlardan toplandı. Bitkinin tür teşhisi 80

101 Atatürk Üniversitesi, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Meryem ŞENGÜL tarafından yapıldı. Bitki örneği Atatürk Üniversitesi, Kazım Karabekir Eğitim Fakültesi herbaryumunda muhafaza edilmektedir Alkaloitçe zengin NH 4 OH-benzen ile ekstraksiyon ve üzerinde yapılan kromatografik çalışmalar Bitki Ekstresinin Hazırlanması Veratrum album un toprak altı kısımları doğrudan güneşe maruz bırakılmadan gölgede kurutulduktan sonra blenderde öğütüldü. Öğütülen materyalin 1300 gramı %7.5 (3.4 mol) seyreltilmiş NH 4 OH ile muamele edildikten sonra benzen (5L) ile 40 ºC sıcaklıkta geri soğutucuda ekstrakte edildi. Ekstre süzüldü ve süzüntü 50 ºC sıcaklıkta ve düşük basınçta döner buharlaştırıcı ile yoğunlaştırıldı. Bu işlemin sonunda 24 gram ekstre elde edildi. Benzen ekstresi üzerinde yapılan kromatografik çalışmalar Benzen ekstresi önce kloroformda çözülerek ince tabaka kromatografisi (İTK) ile kloroform, kloroform-metanol (95:5) ve kloroform-metanol (90:10) çözücü sistemlerinde yürütüldü ve UV 254, UV 366 nm ve vanilin/h 2 SO 4 revalatörü ile kontrol edildi. Bu işlemin amacı İTK da silikajel kolon kromatografisi (SKK) da uygun çözücü sistemlerini belirlemekti. Uygun elüent sistemleri belirlendikten sonra benzen ekstresini fraksiyonlarına ayırmak üzere, 350 g silika jel 60 ( mesh) kloroform ile süspansiyon haline getirildi ve 3.6 x 74 cm ebatlarındaki kolona dolduruldu. Benzen ekstresi (24 g) kloroformda çözüldü ve kolona tatbik edildi. Elüsyona kloroform ile başlandı ve kloroform-metanol (95:5) sistemiyle devam edildi. Fraksiyonlar 25 ml 81

102 hacimler halinde toplandı, İTK ile kontrol edildi ve aynı Rf değerli lekeleri içeren fraksiyonlar birleştirildi. Böylece fraksiyonlar VA (3.80 g), fraksiyonlar VB (4.65 g), fraksiyonlar VC (3.90 g), fraksiyonlar VD (3.10 g), fraksiyonlar VE (3.0 g), fraksiyonlar VF (4.40 g) olarak kodlandı. Bu fraksiyonlardan VE ile VF fraksiyonları üzerinde yapılan çalışmalarda majör bir madde içerdiği tespit edildi. VE fraksiyonu üzerinde yapılan kromatografik çalışmalar: VE fraksiyonunu (3.0 g) çözmek üzere üzerine aseton eklendiğinde çökme meydana geldi. Çöken kısım sıvı kısımdan ayrıldı ve metanol ile yıkandı ve İTK ile kontrol edildi. İTK da tek leke olduğu tespit edilen maddenin saf olduğu anlaşıldı VA-1 (1.30 g). Çöken kısım ayrıldıktan sonra geriye kalan sıvı kısmında İTK ile yapılan kontrolünde majör olarak saflaştırılan maddeyi içerdiği anlaşıldı. Bu maddenin miktarını artırmak üzere sıvı kısım (1.70 g) yeniden kloroform-metanol (90:10) elüent sistemiyle SKK yapıldı ve 1.2 gram daha saflaştırıldı. VF fraksiyonu üzerinde yapılan kromatografik çalışmalar: VF fraksiyonu (4.40 g) İTK ile yapılan kontrolünde VE fraksiyonu gibi majör olarak VA-1 maddesini içerdiği gözlendi. SKK çalışmaları sonucu bu fraksiyondan da 2.90 g VA-1 maddesi saflaştırıldı Deney Hayvanları Tez çalışmamızda g ağırlığındaki Wistar erkek ratlar kullanıldı. Akut enflamasyon deneyleri ve biyokimyasal analizler için toplam 48 adet rat kullanılmıştır. Deney hayvanları Atatürk Üniversitesi, Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi Laboratuvarlarından temin edildi. Hayvanlar deneye alınmadan önce gruplara ayrıldı ve standart şartlar altında muhafaza edildi. 82

103 3.6. Karragenin kullanılarak akut enflamasyon oluşturulması Deneylerin bu serisinde Jervin nin 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarının ve pozitif kontroller (DIC ve İND) nin 25 mg/kg lık dozlarının antienflamatuvar etkileri CAR ile oluşturulan enflamasyonlu pençe ödeminde araştırıldı. 331,332 Hayvan gruplarına 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarda Jervin sonda ile oral yoldan uygulandı. Saf molekülün antienflamatuvar etkisi 25 mg/kg lık dozlarda uygulanan diklofenak sodyum ve İND nin antienflamatuvar etkisi ile karşılaştırıldı. Sağlıklı gruba ise aynı hacimde çözücü olarak distile su verildi. CAR enjekte edilmeden önce hayvanların ayak hacimleri diz eklemine kadar plethismometrede ölçüldü. İlaçlar verildikten bir saat sonra bütün sıçanların ayak pençesine 0.1 ml CAR (% 1) enjekte edildi. CAR ın oluşturduğu enflamasyonlu pençe hacim artışı (pençe ödemi), her saat başı beş kez ölçüldü. Jevin in antienflamatuvar etkisi sağlıklı grubundan (sadece distile su verilen grup) elde edilen sonuçlarla karşılaştırılarak tespit edildi Biyokimyasal Ölçümler Antienflamatuvar etkilerin mekanizmalarının aydınlatılmasına ışık tutmak amacı ile akut enflamasyon deneyleri sonrası rat pençelerinde bazı biyokimyasal incelemeler yapıldı. Rat pençeleri 5. saatte plathismometriksel ölçümlerden hemen sonra biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. Pençelerin enzim aktiviteleri ölçülmeden önce pençelerin tırnakları hassas bir şekilde pençeden ayrıldı ve üç gün içerisinde pençe homojenatları hazırlandı. Pençe homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda MPx, CAT, GPx, SOD, GR, GST, enzim aktiviteleri ve GSH ile LPO miktarları literatürlere dayalı, uygun metotlar kullanılmak suretiyle tespit edildi. Tüm ölçümler oda sıcaklığında ve altı tekerrür halinde gerçekleştirildi. 83

104 Biyokimyasal analizler için pençe doku homojenatlarının hazırlanması Pençe dokuları bir havan içinde sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildikten sonra 0.5 g tartılarak üzerine her parametre için farklı bir tampon çözelti sisteminin 4.5 ml si ilave edildi ve sonra da bir ultra-turraks homojenizatörde 10 dakika süreyle buz üzerinde homojenize edildi. Homojenatlar bir süzgeç kağıdından süzüldükten sonra soğutmalı santrifüj kullanılarak her enzim için literatürlerde belirtilen hızlarda 4 o C de santrifüj edildi ve üstte kalan berrak kısım da (süpernatant) enzim aktiviteleri tayin edildi. 333,334 Tümör Nekroz Faktör-α (TNF- ) ölçümü: Ölçüm prensibi: TNF- miktarı ratlardan alınan serumlarda BOSTER (BOSTER BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Inc., Fremont, California, USA) marka EK0526 katalog numaralı kit kullanılarak ölçüldü. Kitin ölçüm prensibi standart enzim bağlı sandviç elisa metoduna dayanmaktadır. Rat TNF- ya spesifik monoklonal antibody ile kaplanmış 96 lık plate kullanıldı. Deney örnekleri ve biyotinlenmiş poliklonal ölçüm antikorları (standart) kuyulara eklendi ve devamında PBS (Phosphate buffer solution) tamponu ile yıkandı. Her kuyuya Avidin-Biyotin-Peroksidaz kompleksi eklendi ve bağlanmamış konjugat PBS tamponu ile yıkanarak uzaklaştırıldı. HRP (Horseradish peroxidase) substratı TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) HRP enzimatik reaksiyonunu görselleştirmesi için kullanıldı. TMB, HRP tarafından katalizlenen reaksiyon sonucunda ürün olarak mavi renk ortaya çıkardı. Asit solüsyonu eklenerek oluşan mavi renk sarıya dönüştü. Sarı rengin yoğunluğuna bağlı olarak elisa reader ile örneklerdeki TNF- miktarı belirlendi. Kitte mevcut olan standartlar ile oluşturulan grafik ile hesaplamalar yapıldı (Şekil 3.6). 84

105 Absorbans 450 nm TNF-α Standart Grafiği 3,5 3 R² = 0,9998 2,5 2 1,5 1 0, Şekil 3.6. TNF miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik İnterlökin-1β (IL-1 ) Ölçümü: Ölçüm prensibi: IL-1 miktarı ratlardan alınan serumlarda, BOSTER (BOSTER BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Inc., Fremont, California, USA) marka EK0393 katalog numaralı kit kullanılarak ölçüldü. Kitin ölçüm prensibi standart enzim bağlı sandviç elisa metoduna dayanmaktadır. Rat IL-1 ya spesifik poliklonal antikor ile kaplanmış 96 lık plate kullanıldı. Deney örnekleri ve biyotinlenmiş ölçüm antikorları (standart) kuyulara eklendi ve devamında PBS (Phosphate buffer solution) tamponu ile yıkandı. Her kuyuya Avidin-Biyotin-Peroksidaz kompleksi eklendi ve bağlanmamış konjugat PBS tamponu ile yıkanarak uzaklaştırıldı. HRP (Horseradish peroxidase) substratı TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) HRP enzimatik reaksiyonunu görselleştirmesi için kullanıldı. TMB, HRP tarafından katalizlenen reaksiyon sonucunda ürün olarak mavi renk ortaya çıkardı. Asit solüsyonu eklenerek oluşan mavi renk sarıya dönüştü. Sarı rengin yoğunluğuna bağlı olarak elisa reader ile 85

106 Absorbans 450 nm örneklerdeki IL-1 miktarı belirlendi. Kitte mevcut olan standartlar ile oluşturulan grafik ile hesaplamalar yapıldı (Şekil 3.7). 1,2 IL-1β Standart Grafiği 1 R² = 0,9997 0,8 0,6 0,4 0, Şekil 3.7. IL-1 miktarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Miyeloperoksidaz (MPx) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: MPx enzimleri nötrofillerin solunum patlaması esnasında hidrojen peroksit vasıtası ile hipoklorik asit üretirler ve kofaktör olarak Hem e ihtiyaç duyarlar. Aktivite ölçüm ortamındaki hidrojen peroksit, MPx vasıtasıyla harcanırken oluşan hipoklorit absorbansta bir artışa sebep olur. Ölçüm prensibi, meydana gelen absorbans artışının 460 nm de ölçülmesi esasına dayanır. Oluşan hipoklorit miktarından MPx aktivitesi hesaplanabilir. MPx ölçümü: MPx aktivitesi Bradley in belirttiği yöntem esas alınarak ölçüldü. 335 Bu amaçla 0.1 g doku alınarak üzerine 10 ml 50 mm fosfat tamponu (ph 6.0) ilave edilerek homojenize edildi. Oluşan homojenat 3500 g 4 o C de 30 dakika 86

107 santrifüj edilerek süpernatantlar MPx aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine 2.8 ml ölçüm tamponu, 0.12 ml homojenat tamponu ve 0.12 ml numune çözeltisinden ilave edildiği anda kronometre çalıştırıldı. Kuvartz küvet spektrofotometrede 460 nm dalga boyunda 30 saniye aralıklarla ve 5 dakika süreyle ölçülerek absorbans azalması köre karşı kaydedildi. MPx aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)=10 mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛh 2 O 2 ), (µmol -1 x mm -1 ) alınarak A=ɛ.b.c formülünden 460 nm de, dakikada 1 mmol hidrojen peroksitin harcanmasını sağlayan EÜ hesaplandı. Formül pratik olarak mmol/min = A/39.4 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. MPx aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 6 tekrar halinde yapıldı. Lipid peroksidasyon (LPO) miktarı ölçümü: Ölçüm prensibi: Serbest radikallerin hücre zarında oluşturduğu LPO nun son ürünlerinden olan MDA düzeyini belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğu MDA nın tiyobarbitürik asit (TBA) ile verdiği reaksiyonu temel alır. Bir molekül MDA iki molekül TBA ile stabil kırmızı renk oluşturmak üzere reaksiyona girer. LPO ölçümü, Ohkawa ve arkadaşlarının metoduna göre MDA nın asidik ortamda TBA ile oluşturduğu rengin 532 nm de ölçülmesi prensibine dayanarak yapıldı. 336 LPO ölçümü: 0.5 g doku üzerine 4.5 ml %10 KCl ilave edilerek homojenize edildi. Homojenatlar, 5000 g 4 o C de 20 dakika santrifüj edildi ve bu süpernatantlar, LPO miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 250 μl homojenat, 100 μl % 8 sodyum lauril sulfat (SLS), 750 μl % 20 asetik asit, 750 μl % 87

108 Absorbans (532 nm) 0.08 TBA ve 150 μl distile su pipetlenerek vortekslendi. Karışım 100 o C de 60 dakika inkubasyona bırakıldıktan sonra üzerine 2.5 ml n-bütanol ilave edildi ve ölçüm alındı. LPO miktarının hesaplanması: Oluşan kırmızı renkli maddenin absorbansı 532 nm de 3 ml lik cam küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan MDA stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten yararlanarak ölçümler yapıldı (Şekil 3.8). Numunelerin LPO miktarları, nmol MDA/g doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 6 tekrar yapılarak verildi. LPO Standart Grafiği 0,7 0,6 0,5 0,4 y = 64,79x + 0,01 R² = 0,9883 0,3 0,2 0, ,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 MDA Konsantrasyonları (nm) Şekil 3.8. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Ksantin, ksantin oksidaz enzimi vasıtasıyla ürik aside dönüştürülürken meydana gelen süperoksit radikalleri, şayet ortamda NBT (nitroblutetrazolium) mevcutsa, NBT ile reaksiyona girerek formazon boyası oluştururlar. Bu bileşik 560 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir. Şayet 88

109 ortamda SOD enzimi varsa süperoksit radikalleri bu enzim tarafından hidrojen peroksite dönüştürüldüğü için formazon oluşumu azalacak buna bağlı olarak da 560 nm de ölçülen absorbans azalacaktır. Absorbanstaki azalmanın miktarı bize SOD aktivitesini verecektir. Özetle; SOD aktivitesi aşağıda verilen II nolu reaksiyonun inhibe edilme derecesiyle ölçülebilmektedir. I Ksantin XO Ürik Asit + Süperoksit (O 2 ) II NBT O 2 - Formazon III 2O 2 + 2H + SOD O 2 + H 2 O 2 SOD ölçümü: SOD aktivitesi Sun ve arkadaşları (1988) tarafından tarif edilen yönteme göre ölçüldü. 337 Pençe dokuları homojenize edildikten sonra g de 1 saat santrifüj edildi. Cam bir spektrofotometre küvetine 2450 μl ölçüm karışımı (0.3 mm ksantin, 0.6 mm EDTA, 150 μm NBT, 0.4 M Na 2 CO 3, 1.2 g/l BSA), 500 μl supernatant, 50 μl ksantin oksidaz eklendikten sonra karıştırılarak yaklaşık 20 dakika inkubasyona bırakıldı ve 100 μl 0.8 mm CuCl 2 ilave edilerek reaksiyon sonlandırıldı. SOD aktivitesi nin hesaplanması: Oluşan formazon miktarları 560 nm de 3 ml lik kuvartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak aşağıdaki geliştirilen formülden aktivite değerleri EÜ elde edildi ve SOD aktivitesi mmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi 6 tekrar yapılarak verildi. EÜ/mg doku = ΔAkör ΔAnumune / ΔAkör 89

110 Katalaz (CAT) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Aktivite ölçüm ortamındaki hidrojen peroksitin CAT vasıtasıyla suya dönüşümü sağlanırken meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm de ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Harcanan hidrojen peroksit miktarından CAT aktivitesi aşağıda bahsedilen yönteme göre hesaplanmıştır. CAT ölçümü: CAT ın aktivitesi Aebi'nin (1984) belirttiği kurallar uygulanarak ölçüldü g doku alınarak üzerine 4.5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (ph 7.8) ilave edilerek homojenize edildi. Oluşan homojenat g de 4 o C de 60 dakika santrifüj edilerek süpernatantlar CAT aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine son konsantrasyonu 20 mm olacak şekilde hidrojen peroksit çözeltisinden 1.5 ml konularak numune çözeltisinden 1.5 ml ilave edildiği anda kronometre çalıştırıldı. Kuvartz küvet alt üst etme sonrası spektrofotometrede 240 nm dalga boyunda 15 saniye aralıkla 3 dakika süreyle ölçülerek absorbans azalması köre karşı kaydedildi. CAT aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b) = 10 mm, azalma katsayısı (ɛh 2 O 2 ), (mmol -1 x mm -1 ) alınarak A= ɛ.b.c formülünden 240 nm de, dakikada 1 mmol hidrojen peroksit harcanmasını sağlayan enzim miktarı (EÜ) hesaplandı. Formül pratik olarak mmol/min = A/39.4 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. CAT aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak mmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 6 tekrar halinde yapıldı. 90

111 Glutatyon peroksidaz (GPx) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: Aktivite ölçümü GPx ve GR arasındaki dönüşümlü tepkimelere dayandırılmıştır. GPx ortamdaki GSH ve hidrojen peroksiti H 2 O ya dönüştürerek GSSG sentezler. GR ise oluşan GSSG yi pentoz fosfat yolundan gelen NADPH ı kullanarak tekrar GSH a dönüştürür. Bu esnada harcanan NADPH miktarı 340 nm de belirlenebilir. Absorbans azalması ile GPx aktivitesi arasında doğrudan bağlantı kurulması esasına dayanarak ölçüm yapıldı. GPx ölçümü: GPx aktivitesi, Lawrence ve Burk un belirttiği metot kullanılarak ölçüldü g doku üzerine 4.5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (30 mm KCl içerir ve ph 7.8) ilave edilerek homojenize edildi. Homojenatlar, g de 20 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar GPx aktivitesi ölçümünde enzim kaynağı olarak kullanıldı. Kuvartz spektrofotometre küveti içerisine 2400 μl ölçüm karışımı (son konsantrasyonlar 50 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 1 mm GSH, 0.2 mm β-nadph, 1 mm NaN 3 ve 1 EU/ml GR olacak şekilde) ve 300 μl supernatant konularak birkaç dakika inkubasyona bırakıldı ve sonra 300 μl 0.25 mm hidrojen peroksit konulur konulmaz kronometre çalıştırıldı. Alt üst etme sonrası spektrofotometre de 340 nm dalga boyundaki absorbans azalması, 15 saniye aralıkla 5 dakika süreyle, köre karşı kaydedildi. GPx aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)= 10mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛnadph), 6.22 (mmol -1 x mm -1 ) alınarak A= ɛ.b.c formülünden 340 nm de, dakikada 1 µmol NADPH ın harcanmasını sağlayan EÜ hesaplandı. GPx aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 6 tekrar halinde verildi. 91

112 Total glutatyon (GSH) miktarı ölçümü: Ölçüm prensibi: Ölçüm ortamındaki DTNB [5,5'-Ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)] disülfit bir kromojendir ve sülfhidril gruplu bileşikler tarafından kolayca indirgenir. Meydana gelen sarı renk 412 nm de spektrofotometrik olarak ölçülebilir. GSH miktarının ölçülmesi: Sedlak ve Lindsay in geliştirdiği yöntem esas alınarak gerçekleştirildi. 340 Bu amaçla 0.5 g doku üzerine 4.5 ml 50 mm Tris-HCl (ph 7.4) ilave edilerek homojenize edildi. Homojenatlar, g 4 o C de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar, GSH miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 1500 μl ölçüm tamponu (0.2 mm EDTA içeren 200 mm Tris- HCl, ph = 8.2), 500 μl süpernatant, 100 μl DTNB ve 7900 μl metanol pipetlenerek vortekslendi. Karışım 37 o C de 30 dakika inkubasyona bırakıldı ve sonra ölçümleri alındı. GSH miktarının hesaplanması: Oluşan sarı renk miktarları 412 nm de 3 ml lik kuvartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan GSH stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten (Şekil 3.9) yararlanarak ölçümler yapıldı. Numunelerin GSH miktarları, nmol/mg doku olarak tarif edildi. Her bir faktörün etkisi altı tekrar yapılarak belirlendi. 92

113 Absorbans (412 nm) GSH Standart Grafiği 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,7879x - 0,0154 R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 GSH Konsantrasyonları (nm) Şekil 3.9. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Glutatyon S-transferaz (GST) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: GST ölçüm ortamındaki 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) ile ortama ilave edilen GSH 340 nm de ölçülebilen bir kompleks oluşturmaktadır. GST bu kompleks oluşumunu katalizlediği için oluşan renk şiddeti ile GST aktivitesi arasında doğru orantı vardır. Böylece 340 nm de ölçülen renk şiddetinden GST aktivitesi kolayca hesaplanabilir. GST ölçümü: Rat dokusundan elde edilen homojenatların GST aktiviteleri Habig ve Jakoby tarafından belirtilen prosedür doğrultusunda belirlendi. 341 Son konsantrasyonları: 0.1 M KH 2 PO 4 tamponu (ph 6.5), 1 mm CDNB ve 1 mm GSH olacak şekilde reaktifler 3 ml lik kuvartz küvete pipetlendi. GSH katılır katılmaz küvet altüst edilerek absorbanslar 3 dakika boyunca ve 15 saniyede bir kaydedildi. 3 dakikalık zaman aralığındaki absorbans değişiminin lineer olduğu kısımdan dakika başına absorbans değişimi tesbit edildi. 93

114 GST aktivitesi nin hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans artışı olan aralıktan dakika başına absorbans azalması ile hesaplandı. Işık yolu (b)=10 mm, ekstinksiyon katsayısı (ε) = 9.6 (mmol -1 x cm -1 ) alınarak A=ε.b.c formülünden 340 nm de, dakikada 1 mmol konjugatın üretilmesini sağlayan EÜ hesaplandı. Formül pratik olarak mmol/min = (A/9.6) x 300 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. GST aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak nmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 6 tekrar halinde yapıldı. Glutatyon redüktaz (GR) aktivitesinin ölçümü: Ölçüm prensibi: GSSG aktivite ölçüm ortamındaki NADPH vasıtasıyla GSH indirgenmesi sağlanırken, NADPH dan gelen absorbans azalmasının 340 nm de ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Harcanan NADPH miktarından GR aktivitesi aşağıda bahsedilen yönteme göre hesaplanmıştır. GR ölçümü: GR aktivitesi Carlberg ve Mannervik in yönteminde tarif edildiği şekilde ölçüldü. 342 Bu amaçla 0.5 g doku alınarak üzerine 5 ml 50 mm K-fosfat tamponu (ph 7.8) ilave edilerek homojenize edildi. Oluşan homojenat g de 4 o C de 20 dakika santrifüj edildi. Çökelek uzaklaştırıldı ve süpernatantlar GR aktivitesi ölçümünde kullanıldı. 1.5 ml ölçüm tamponu, 1.2 ml homojenat, 0.15 ml NADPH ve son konsantrasyonu 20 mm olacak şekilde GSSG çözeltisinden 0.15 ml ilave edildiği anda kronometre çalıştırıldı. Kuvartz küvet alt üst etme sonrası spektrofotometrede 340 nm dalga boyunda 30 saniye aralıklarla 5 dakika süreyle ölçülerek absorbans azalması köre karşı kaydedildi. GR Aktivitesi nin Hesaplanması: Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına absorbans azalması hesaplandı. Işık yolu (b)=10 94

115 mm, ekstinksiyon katsayısı (ɛnadph 2 ), 0,00622 (µmol -1 x mm -1 ) alınarak A=ɛ.b.c formülünden 340 nm de, dakika başına NADPH harcanmasından EÜ hesaplandı. Formül pratik olarak mmol/min = A/6.22 x 30 şekline getirildi ve bütün aktiviteler bu formülde yerine konulan absorbans değerlerinden hesaplandı. GR aktivitesi, seyrelme faktörleri dikkate alınarak µmol/dakika/mg doku olarak tarif edildi. Deneyler 6 tekrar halinde yapıldı İstatistiksel Analizler İstatistiksel analizler SPSS 20.0 software programı kullanılarak yapıldı. Bütün ölçümlerde istatistiksel farklılıklar ve önem seviyeleri one-way variance analyzes (ANOVA) testi ile belirlendi ve p<0.05 seviyesindeki sonuçlar önemli kabul edildi. Çoklu karşılaştırmalarda Duncan s multiple comparison testi uygulandı 95

116 4. BULGULAR Yaptığımız çalışmalardan elde ettiğimiz veriler, bu bölümde tablo ve şekiller ile gösterilmiştir. Pençe ödemi deneyine ait veriler sağlıklı gruba göre mukayese edilerek % inhibisyon olarak ifade edilmiş, biyokimyasal parametrelere ilişkin veriler ise istatistiksel olarak değerlendirilip; CAR grubu sağlıklı grup ile, muamele grupları ise CAR grubu ile karşılaştırılmak suretiyle değerlendirilmeye alınmıştır. Deney verileri tablolar halinde verilmiş ve değişik muamele grupları arasındaki farkın daha iyi görülmesi amacıyla da, verilerin ortalamalarına göre hazırlanan diyagramlar sunulmuştur. Bulgular kısmında sunulan veriler, 6 tekerrür olarak yapılan deney sonuçlarının ortalaması ± standart hata (± SE) olarak gösterilmiştir. Bütün verilere SPSS 20.0 software programı kullanılarak one-way variance analyzes (ANOVA) testi uygulanmış p<0.05 ve p<0.01 seviyesindeki sonuçlar önemli kabul edilmiştir. Çoklu karşılaştırmalarda ise Duncan s multiple comparison testi uygulanmıştır Veratrum album dan Saflaştırılan Jervin in Spektral Verilerle Yapısının Aydınlatılması: Bu bölümde Veratrum album dan izole edilen majör steroidal alkoloit olan molekül yapısı IR, UV, 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT 13 C-NMR, 1 H- 1 H COSY, HMBC ve HETCOR spektroskopik yöntemlerle Jervin olarak aydınlatılmıştır

117 Şekil Jervin in kimyasal yapısı Amorf, toprak rengi bir katı olarak izole edilen VA-1 in kimyasal yapısı UV, IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1 H- 1 H COSY, 13 C- 1 H HETCOR ve 13 C- 1 H HMBC yöntemleri ile elde edilen bilgilerden, bir steroidal alkaloit olan Jervin olarak aydınlatılmıştır. (Şekil 4.10) VA- 1 UV spektrumunda (λmax nm, CH 3 Cl) moleküldeki özellikle; π π* ve n π* geçişlerinden dolayı 251 nm de maksimum absorbans vermiştir. Jervin bileşiğinin IR spektrumunda (Şekil 4.11) 3297 cm -1 de gözlenen keskin absorbans bandı karakteristik NH titreşiminden kaynaklanmakta olup maddenin steroidal alkoloit tipli bir madde olduğunu göstermektedir cm -1 de gözlenen geçiş absorbans bandları ise moleküldeki OH grubundan kaynaklanmaktadır. Molekülde çok fazla sayıdaki alifatik CH titreşimlerine ait absorbanslar ise cm -1 arasında gözlenmiştir. IR spektrumundaki 1708 cm -1 de ki kuvvetli absorbans bandı ise C=O grubuna aitken, C=C gerilme titreşimleri ise 1463 cm -1 ve civarlarında küçük pik olarak 97

118 gözlenmiştir. Moleküldeki C-O titreşim bandı ise 1060 cm -1 de çok kuvvetli olarak gözlenmiştir. 344,345 Şekil Jervin in IR spektrumu Jervin in 1 H-NMR spektrumunda (Şekil 4.12) bir steroidal alkoloit yapısına uygun olarak δ= ppm arsında çok sayıda alifatik protona ait sinyal gözlenmiştir. Spektrumda 4 adet metil grubuna ait iki singlet (δ=0.98 ppm, H-19 ve δ=2.15 ppm, H-18) ve iki adet dublet (δ=0.93 ppm, J=6.22 Hz, H-27 ve δ=0.94 ppm, J=5.95 Hz, H-21) sinyal gözlenmiştir. H-23 protonu bir adet H-22 ve iki adet de H-24 protonları ile etkileşerek δ=3.29 ppm de dt sinyali (J 1 =10.25 Hz, J 2 =4.03 Hz) vermiştir. H-26 diastropik hidrojenlerden birisi δ=3.06 ppm de (H-26a, dd, J 1 =12.4 Hz, J 2 =4.03 Hz) ve δ=2.31 ppm de t (J=12.5 Hz) sinyal vermiştir. δ=3.49 ppm de gözlenen multiplet sinyal ise H-3 protonuna aittir. Jervin bileşiğinin 13 C-NMR spektrumunda (Şekil 4.13) steroidal alkoloit yapısıyla uyumlu olarak toplam 27 karbon sinyali gözlendi. Keton karbonil karbonuna 98

119 ait sinyal δ= ppm de gözlenirken, C-12, C-5, C-13 ve C-6 olefinik karbonlara ait sinyaller ise sırasıyla, δ=146.0 ppm, δ=142.6 ppm, δ=137.4 ppm ve δ=121.1 ppm de gözlenmiştir. δ=85.8 ppm de gözlenen karbon sinyali ise C-17 kuarterner karbonuna ait sinyaldir. Bileşiğin DEPT spektrumu da (Şekil 4.14) yapıyla uyumlu olup, 4 adet CH 3, 8 adet CH 2 ve 9 adet CH gruplarına ait karbon sinyali gözlenmiştir. DEPT spektrumunda gözlenmeyen 6 adet karbon sinyali ise kuarterner karbon atomlarına aittir. Jervin bileşiğinin 1 H- 1 H COSY (Şekil 4.16) ve 13 C- 1 H HMBC (Şekil 4.17) spektrumları da kimyasal yapısını doğrulamaktadır. Bileşiğin 13 C- 1 H HMBC (Şekil 4.17) spektrumunda δ=0.98 ppm deki -CH 3 (19) protonlarına ait olan sinyal δ=142.6 ppm deki C-5 karbon sinyali ile korele olmuştur. δ=0.93 ppm ve δ=0.94 ppm de gözlenen H-21 ve H-27 CH 3 hidrojenlerine ait birbiri ile çakışan iki dublet sinyal uzak bağ etkileşimi ile C-17 (δ=85.8 ppm), C-22 (δ=66.8 ppm), C-26 (δ=54.8 ppm), C-24 (δ=39.1 ppm) ve C-25 (δ=31.7 ppm) karbon sinyalleri ile korele olmuştur. H-18 metil grubu protonuna ait singlet sinyal ise beklenildiği gibi üç bağ üzerinden δ=85.8 ppm deki C-17, δ=146.0 ppm de rezonans olan C-12 ve δ=137.4 ppm de rezonans olan C- 13 karbonları ile korele olmuştur. Benzer şekilde δ=0.98 ppm deki metil grubuna ait sinyal (H-19) üç bağ etkileşimi üzerinden δ=62.8 ppm deki C-9 ve δ=37.0 ppm deki C-1 karbon sinyali ile korele olmuştur. Bileşiğin kimyasal yapısının Jervin olduğu 2D-NMR spektrumları ile de doğrulanmıştır. Bileşiğin 13 C- 1 H HETCOR spektrumunda (Şekil 4.18) δ=121.1 ppm deki karbon sinyali δ=5.35 ppm deki H-6 protonuna ait sinyal ile, δ=76.6 ppm de rezonans olan C-23 sinyali δ=3.29 ppm deki proton sinyali ile korele olmuştur. C-26 karbonuna ait δ=54.8 ppm deki karbon sinyali δ=3.06 ppm ve δ= 2.31 ppm deki diastropik hidrojenlere ait hidrojen sinyalleri ile korele olmuştur. Jervin in kimyasal 99

120 yapısı ayrıca literatürde daha önce yayınlanmış spektral verilerle de mukayese edilerek desteklenmiştir. 38,346,347 Şekil Jervin in 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu 100

121 Şekil Jervin in 13 C NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu 101

122 Şekil Jervin in DEPT 13 C-NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu 102

123 Şekil Jervin in DEPT 13 C-NMR (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu (0-80 ppm arası genişletilmiş spektrum) 103

124 Şekil Jervin in 1 H- 1 H COSY (CDCl 3, 400 MHz) Spektrumu 104

125 Şekil Jervin in HMBC (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu 105

126 Şekil Jervin in 13 C- 1 H COSY ( HETCOR) (CDCl 3, 400 MHz) spektrumu 106

127 4.2. Makroskopik Bulgular Karragenin (CAR) ile deneysel olarak oluşturulan pençe ödemleri üzerine Jervin in ve pozitif kontrol olarak kullanılan diklofenak (DIC) ile indometazin (İND) nin etkileri: Deneylerin bu serisinde Jervin in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarının ve pozitif kontroller (DIC ve İND) nin 25 mg/kg lık dozlarının antienflamatuvar etkileri CAR ile oluşturulan enflamasyonlu pençe ödeminde araştırıldı. 331,332 Hayvan gruplarına Jervin; 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarda, pozitif kontroller olarak DIC ve İND 25 mg/kg lık dozlarda sonda ile oral yoldan uygulanırken sağlıklı gruba yalnızca distile su verildi. İlaçlar verildikten bir saat sonra bütün sıçanların sağ ayak pençelerine 0.1 ml CAR (% 1 lik) enjekte edildi. CAR enjekte edilmeden önce hayvanların ayak hacimleri diz eklemine kadar plethismometrede ölçüldü. Deney gruplarında oluşan enflamasyonlu pençe hacim artışı (pençe ödemi), her saat başı beş kez ölçüldü. Jervin in antienflamatuvar etkileri CAR grubundan elde edilen sonuçlarla karşılaştırılarak tespit edildi. Pençe ödeminin en yüksek seviyede olduğu 4. saatteki sonuçlar Tablo 4.1 de ve saatlere bağlı olarak elde edilen ölçüm sonuçları ise Şekil 4.19 da sunuldu. Tablo 4.1 de görüldüğü gibi CAR grubunda enflamasyonlu pençe hacmi sağlıklı gruba göre 1.17 ml artış gösterdi. Jervin in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarının ve pozitif kontroller DIC ve İND nin 25 mg/kg lık dozları CAR tarafından oluşturulan enflamasyonu dördüncü saatte sırası ile % 50.4, 63.2, 68.4, 73.5, 53.0 ve 67.5 oranında azalttığı tespit edildi. Jervin in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarında bu artış sırası ile 0.58±0.02, 0.43±0.01, 0.37±0.02 ve 0.31±0.01 olarak belirlendi. Bu sonuçlara göre Jervin in bütün dozlarda antienflamatuvar aktiviteye sahip olduğu ve en etkili antienflamatuvar aktiviteye de 400 mg/kg lık dozda sahip olduğu ilk bakışta dikkati 107

128 çekmektedir. Diğer yandan DIC ve İND nin ise pençe hacimlerini 4. ssatte sırası ile 0.55±0.01 ve 0.38±0.01 e düşürdüğü belirlendi. Tablo 4.1. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pençe hacimleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkileri. Muameleler N Doz mg/kg vücut ağ. Pençe hacimleri arasındaki fark (ml) (Enflamasyonun 4. saatinde) Antienflamatuvar etki (% İnhibisyon) CAR+JERVİN ±0.02d ±0.01c ±0.02a,b ±0.01a 73.5 CAR+DIC ±0.01d 53.0 CAR+IND ±0.01a,b 67.5 CAR (Kontrol) ±0.06e - Sonuçlar, 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması (± standart hata) olarak verilmiş ve muamele grupları kontrol grubu (CAR) ile mukayese edilerek p<0.05 ve p<0.01 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Farklı harfler DUNCAN testine göre değerlerin istatiksel olarak farklı olduğunu göstermektedir. 108

129 Pençe hacmi (ml) Pençe hacimleri arasındaki fark (ml) (Enflamasyonun 4. saatinde) 1,4 1,2 e 1 0,8 0,6 0,4 d c a,b a d a,b 0,2 0 CAR + Jervin (50 mg/kg) CAR + Jervin (100 mg/kg) CAR + Jervin (200 mg/kg) CAR + Jervin (400 mg/kg) CAR + DIC CAR + IND CAR (Kontrol) Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pençe hacimleri üzerine Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkilerinin değişimini gösteren diyagram. Diğer yandan Şekil 4.20, CAR enjeksiyonununun pençe hacimlerini ilk dört saatte artırırken 4. saatten sonra azalttığını göstermektedir. Muamele gruplarında da benzeri durumun söz konusu olduğu belirlendi. Bu yüzden antienflamatuvar etki tespit edilirken deneylerin 4. saatindeki pençe hacimleri dikkate alındı. 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 CAR + Jervin (50 mg/kg) CAR + Jervin (100 mg/kg) CAR + Jervin (200 mg/kg) CAR + Jervin (400 mg/kg) CAR + DIC CAR + IND CAR (Kontrol) Saatler Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence hacimleri üzerine saatlere bağlı olarak Jervin, indometazin (İND) ve diklofenak (DIC) ın antienflamatuvar etkilerinin değişimini gösteren diyagram. 109

130 4.3. Biyokimyasal Bulgular Antienflamatuvar etkilerin mekanizmalarının aydınlatılmasına ışık tutmak amacı ile akut enflamasyon deneyleri sonrası rat pençelerinde bazı biyokimyasal incelemeler yapıldı. Rat pençeleri plathismometriksel ölçümlerden hemen sonra biyokimyasal incelemeler için -20 o C de saklandı. Pençelerin enzim aktiviteleri ölçülmeden önce pençelerin tırnakları hassas bir şekilde pençeden ayrıldı. Pençelerin enzim aktivitelerini ölçmek için üç gün içerisinde pençe homojenatları hazırlandı. Pençe homojenatlarından elde edilen süpernatantlarda CAT, GPx, SOD, GST, GR, MPx enzim aktiviteleri ve GSH ile LPO miktarları literatürlere dayalı, uygun metotlar kullanılmak suretiyle tespit edildi. Tüm ölçümler oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Ayrıca aynı ratlardan alınan serum örneklerinde de Tnf-α ve IL-1β düzeyleri belirlendi Rat serumlarında tümör nekroz faktör-α (Tnf-α) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri: Jervin in 50, 100 ve 400 mg/kg lık dozlarının ve pozitif kontrol (İND) nin 25 mg/kg lık dozlarının rat serumlarında belirlenen TNF-α seviyelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.2 ve Şekil 4.21 de gösterilmiştir. Tablo 4.2 den görüldüğü üzere Tnf-α seviyeleri sağlıklı grupta 1.63±0.10, CAR grubu 13.53±0.52, İND grubunda 6.11±0.31 ve CAR ile birlikte uygulanan Jervin in 50, 100 ve 400 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile 9.68±0.40, 8.16±0.19 ve 4.84±0.28 olarak tespit edilmiştir. 110

131 TNF-α (pg/ml) Tablo 4.2. Rat pençelerinde karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. Saatinde alınan serum örneklerinde tümör nekroz faktör (TNF-α) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri. Muameleler Doz (mg/kg) N Tnf-α (pg/mg serum) CAR+ JERVİN ±0.40e ±0.19d ±0.28b CAR+IND ±0.31c CAR ±0.52f SAĞLIKLI 1.63±0.10a Sonuçlar, 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması (±standart hata) olarak verilmiş ve p<0.05 ve p<0.01 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Farklı harfler DUNCAN testine göre değerlerin istatiksel olarak farklı olduğunu göstermektedir. 13 f 10 e d 7 4 b c a 1 CAR + JERVİN (50 mg/kg) CAR + JERVİN (100 mg/kg) CAR + JERVİN (400 mg/kg) CAR + IND (25 mg/kg) CAR SAĞLIKLI Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda serum örneklerinde tümör nekroz faktör (Tnf-α) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri gösteren diyagram. Tablo 4.2 ve Şekil 4.21 den da çok net bir şekilde görülebileceği üzere sağlıklı gruba göre CAR grubunda TNF-α seviyeleri artmıştır ve CAR ile birlikte uygulanan 111

132 İND ve Jervin in tüm dozlarında TNF-α seviyeleri düşük düzeyde bulunmuştur (p>0.01) Rat serumlarında İnterlökin-1β (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri: Jervin in 50, 100 ve 400 mg/kg lık dozlarının ve pozitif kontrol (İND) nin 25 mg/kg lık dozlarının rat seumlarında belirlenen IL-1β seviyelerini gösteren sonuçlar Tablo 4.3 ve Şekil 4.22 de gösterilmiştir. Tablo 4.3 den görüldüğü üzere IL-1β seviyeleri sağlıklı grupta 53.16±0.63, CAR grubunda 107.3±0.79, İND grubunda 90.51±0.94 ve CAR ile birlikte uygulanan Jervin in 50, 100 ve 400 mg/kg dozları ile muamele edilen gruplarda ise sırası ile 97.60±0.63, 84.44±0.79 ve 65.33±0.65 olarak tespit edilmiştir. 112

133 IL- 1β (pg/ml) Tablo 4.3. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. Saatinde alınan serum örneklerinde İnterlökin-1β (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri. Muameleler Doz (mg/kg) N İnterlökin-1β (pg/mg serum) CAR+ JERVİN ±0.63d ±0.79c ±0.65b CAR+IND ±0.94c CAR ±0.79e SAĞLIKLI 53.16±0.63a Sonuçlar, 6 rat taki (N) ölçümün ortalaması (±standart hata) olarak verilmiş ve p<0.05 ve p<0.01 seviyesinde istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Farklı harfler DUNCAN testine göre değerlerin istatiksel olarak farklı olduğunu göstermektedir. 110 e 100 d c 90 c b 60 a 50 CAR + JERVİN (50 mg/kg) CAR + JERVİN (100 mg/kg) CAR + JERVİN (400 mg/kg) CAR + IND (25 mg/kg) CAR SAĞLIKLI Şekil Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda serum örneklerinde İnterlökin-1β (IL-1β) seviyeleri üzerine Jervin ve indometazin (İND) nin etkileri gösteren diyagram. 113