LC-MS/MS KLİNİK KİMYA UYGULAMALARI NELERDİR? Dr. Erdim Sertoğlu

Transkript

1 LC-MS/MS KLİNİK KİMYA UYGULAMALARI NELERDİR? Dr. Erdim Sertoğlu KLİNİK BİYOKİMYA UZMANLARI DERNEĞİ ULUSLARARASI KATILIMLI KONGRE VE LAB EXPO KÜTLE SPEKTROMETRESİ VE KLİNİK LABORATUVARLARDA KULLANIMI KURSU, İZMİR EYLÜL 2014

2 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

3 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı Örnek-KAH Hastaların > %90 ı 21-hidroksilaz gene (CYP21A2) gen mutasyonu 17- hidroksiprogesteron ve androstenedion, kortizol Nadir formları 3-β-hidroksisteroid dehidrogenaz ve 11-hidroksilaz eks Serum veya plazmada 17-hidroksiprogesteron, androstenedion, pregnenolon, 17-hidroksipregnenolon, deoksikortizol ve deoksikortikosteron ölçümü RIA LC-MS/MS Gold standart Pregnenolone by LC- MS/MS, Serum or Plasma 17-Hydroxypregnenolone Quantitative by LC- MS/MS, Serum or Plasma Adrenal Steroid Quantitative Panel by HPLC-MS/MS, Serum or Plasma 11-Deoxycortisol Quantitative by HPLC- MS/MS, Serum or Plasma 17-Hydroxyprogesterone Quantitative by HPLC- MS/MS, Serum or Plasma Congenital Adrenal Hyperplasia Treatment Panel 11-Beta Hydroxylase Deficiency Congenital Adrenal Hyperplasia Panel 21-Hydroxylase Deficiency Pregnenolone 17-Hydroxypregnenolone 11-Deoxycortisol 11-Deoxycortisol 17-Hydroxyprogesterone Testosterone Testosterone 17-Hydroxyprogesterone 17-Hydroxyprogesterone 17-Hydroxyprogesterone 11-Deoxycortisol 17-Hydroxypregnenolone 17-Hydroxypregnenolone Androstenedione 17-Hydroxyprogesterone Androstenedione Pregnenolone Androstenedione Dehydroepiandrosterone Dehydroepiandrosterone

4 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı Drug Testing (28) Monitoring of Drugs (28) Opioids (18) Meconium Drug Screening (16) Newborn Drug Screening (16) Umbilical Cord Drug Screening (16) Amenorrhea (11) Congenital Adrenal Hyperplasia (8) Mass Spectrometry (117) Polycystic Ovarian Syndrome (8) Toxicology (93) Schizophrenia (8) Therapeutic Drug Monitoring (50) Hypogonadism, Male (6) Therapeutic Drug Management (49) Immunosuppresive Drugs (6) Endocrinology (38) Organ Transplantation (6) Drugs of Abuse (36) Infertility (5) Pain Management (34) Epilepsy (4) Steroids (27) Seizure Disorders (4) Liver Disease (18) Adrenal Hyperfunction (2) Metabolic Disorders (18) Adrenal Insufficiency (2) Hormones (12) Cushing Syndrome (2) Biochemical Genetics (11) Hypopituitarism (2) Genetics (11) Megaloblastic Anemia (2) Oncology (11) Nicotine & Metabolites (2) Opiods (11) Pheochromocytoma (2) Meconium (10) Tumor Markers (2) Neonatal Drug Testing (10) Vitamins (2) Toxicology Screening (9) IBD (1) Chemistry (8) Inflammatory Bowel Disease (1) Benzodiazepines (6) RA (1). Rheumatoid Arthritis (1). TPMT (1). Thiopurine Methyltransferase Activity (1)

5 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı Örnek-KAH Androstenedione 17- Hydroxyprogesterone 17- Hydroxypregnenolone Testosterone, Females or Children Dehydroepiandrosterone

6 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- MS/MS Kullanımı 11,114 10,674 7,737 1, LC-MS/MS LC-MS/MS + Clinical 15% 12% 16% 16% 15% 17% 20% 18% 19% 20% 21%

7 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- MS/MS Kullanımı (+) (-) Yüksek sensitivite Yüksek spesifite Immunoassay lere kıyasla yeni testlerin daha düşük maliyetle ve daha hızlı geliştirilebilmesi Numune başına daha düşük maliyet (reaktifler açısından) Aynı numunedeki birden fazla analiti eşzamanlı ölçme imkanı Çok yönlülük Matrikse bağımlı olmaması (tükrük, BOS, idrar vb) Otomasyona uyum? Fırsatlar Giderek MS teknolojinin daha da benimsenmesi (kit üreticileri tarafından) Daha kullanıcı dostu araçlara doğru gelişim LC-MS/MS analizi için onaylanmış/geliştirilmiş kitlere olan ilgi Peptidlerin ve proteinlerin kantitatif ölçümü Birbiri ile ilişkili metabolitlerin analizi Yüksek cihaz maliyeti Sınırlı örnek hacmi (verimlilik) Yöntem geliştirme, validasyon, kullanım ve sorun giderme için uzman personel ihtiyacını Otomasyon uyumsuzluğu Onaylanmış/geliştirilmiş kitlerin azlığı/yokluğu (Referans metod yokluğu) Analizin kompleksliği Engeller LC-MS/MS dışı yeni cihazların ve kitlerin geliştirilmesi ve hızla rutine sokulmaları Gittikçe artan yetişmiş personel ihtiyacı Kit üreticilerinin ilgisi? Immünoassay'lerdeki yeniliklerle rekabet zorluğu van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012; :18-32.

8 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- Yaygın Kullanılan Yöntemlerin Karşılaştırılması MS/MS Kullanımı Örnek Hazırlama Yöntemlerin Karşılaştırılması Viette V, et al. Current role of liquid chromatography coupled to mass spectrometry in clinical toxicology screening methods. Clin Chem Lab Med. 2011;49(7): Review. Wu AH, et al. Role of liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology. Clin Toxicol (Phila). 2012;50(8): Review.

9 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- Örnek Çeşitliliği MS/MS Kullanımı

10 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- Kaynak Çeşitliliği MS/MS Kullanımı

11 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- MS/MS Kullanımı Yetişkin insan serumundaki düşük molekül ağırlıklı biyobelirteçlerin dinamik ağırlıkları. MMA, metilmalonik asit; DHEA (-S), dehidroepiandrosteron (-sülfat); 25 (OH) D, 25-hidroksivitamin D; 17OHP, 17-hidroksiprogesteron; 11-DOC, 11-deoksikortizol; DHT, dihidrotestosteron; 1,25 (OH) 2, 1.25-dihidroksivitamin D; T 4, tiroksin; T 3, triiodotironin; T, total; F, serbest; Lut, luteal;, erkek;, kadın van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012; : Kushnir MM et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry applications in endocrinology. Mass Spectrom Rev. 2010;29(3):

12 Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC- MS/MS Kullanımı Steroid ölçümleri (Endojen steroidler, vitamin D, katekolaminler ve metanefrinler vs) Doğumsal Metabolizma Hastalıkları (amino asit bozuklukları, yağ asitleri ve bozuklukları, organik asidüriler) Toksikoloji analizleri Teröpatik ilaç düzeyi analizleri Safra asidi analizleri Porfirialar Karbonhidratlar Fosfolipitler

13 Endokrinoloji Uygulamaları Steroid Hormon Metabolizması Koal T, et al. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile-analysis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012;129(3-5):

14 Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler Steroid hormonların analizinde immunoassay'lerin dezavantajları: Bir defada bir analit ölçümü Özellikle düşük konsantrasyonlarda, düşük antikor spesifitesi Sınırlı dinamik aralık=sensitivite Matriks interferansları Farklı immünolojik kitler=yüksek varyabilite (farklı referans aralıklar) ÇÖZÜM??? Fizyolojik ve patolojik hormon durumunu ayırt etmede Geniş steroid panellerinin eş zamanlı, hızlı ve güvenilir ölçümleri

15 Steroidler Endokrinoloji Uygulamaları

16 Steroidler Endokrinoloji Uygulamaları LLOQ = ng/ml, ULOQ= ng/ml Intra-day validation: <8.8%, Inter-day validation: <18.6% Recovery

17 Steroidler Endokrinoloji Uygulamaları A) Kortizol B) Kortikosteron C) 11-deoksikortizol D) Androstenedion E) Deoksikortikosteron F) Testosteron G) 17-OH progesteron H) DHEA I) Progesteron Fanelli F, et al. Serum steroid profiling by isotopic dilution-liquid chromatography-mass spectrometry: comparison with current immunoassays and reference intervals in healthy adults. Steroids. 2011;76(3):

18 Endokrinoloji Uygulamaları 1) Primer Aldosteronizm Primer hiperaldesteronizm Sekonder hipertansiyon Tanı Serum, plazma veya idrar aldosteron ölçümü GC-MS Referans yöntem Rutin kullanımı? Rutinde en yaygın RIA standardizasyonu ve harmonizasyonu? 60 pmol/l calibrator A patient serum with 704 pmol/l aldosterone Linearity= pmol/l LLOQ= 30 pmol/l Recovery= % Within run ve between-run imprecision= <5.8% ve <7.5% Sonuç? LC-MS/MS aldosterone concentrations in normotensive subjects ranged from <69.4 to pmol/l (<2.5 to 22.9 ng/dl) Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2):113-8.

19 Endokrinoloji Uygulamaları 2) Addison Hastalığı Before After addition of aldosterone (69.4 pmol/l; 2.5 ng/dl) Linearity= pmol/l ( ng/dl) LLOQ= 69.4 pmol/l (2.5 ng/dl), with inter- and intraday recovery and imprecision of 91.4% 94.5% and <9.5% Sample collected midmorning from a seated normotensive subject (147.0 pmol/l; 5.3 ng/dl) Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2): Taylor PJ, et al. Measurement of aldosterone in human plasma by semiautomated HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Chem. 2009;55(6):

20 Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu Tanı 1) Hiperkortizolizmin tespiti (plazma tükrük ve idrar serbest kortizol, ACTH seviyesi) Linearity = nmol/l Interassay CVs= % LLOQ= 70 pmol/l Recovery = % The upper limit of the reference range= 3.0 nmol/l 2) LDDS Immunoassay yöntemleri (-) GC-MS LOD ~30 nmol/l (1 µg/dl) + derivatizasyon + ~ 45 dk LDDS: Düşük doz deksametazon supresyon testi Turpeinen U, et al. Determination of cortisol in serum, saliva and urine. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab Dec;27(6): Turpeinen U, et al. Determination of salivary cortisol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Scand J Clin Lab Invest 2009;69:592 7.

21 Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu Serumda, gece yarısı tükürükte ve 24 saatlik idrarda farklı yöntemlerle kortizol ölçümleri NSC= Night-time Salivary Cortisol. a Urine quantity is expressed as nmol/24 h LC MS/MS LLOD nmol/l [1] < Immunoassay LLOD nmol/l [2]. The upper limit for late-night salivary cortisol using LC MS/MS has varied between 2.7 and 3.0 nmol/l [3]. 1. Baid SK, et al. Radioimmunoassay and tandem mass spectrometry measurement of bedtime salivary cortisol levels: a comparison of assays to establish hypercortisolism. J Clin Endocrinol Metab 2007;92: Gatti R, et al. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin Biochem Aug;42(12): Inder WJ, et al. Measurement of salivary cortisol in 2012 laboratory techniques and clinical indications. Clin Endocrinol (Oxf) 2012;77:

22 Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen E2 fertilite, oligo-amenore, menopoz, ovulasyon indüksiyonu takibi, IVF hazırlığı E2 ve E1 eş zamanlı ölçümü seks-steroid metab. bozuklukları, erkeklerde östrojen eks., ted. takibi, meme kanseri, erkek osteoporozu İmmunoassayler yeterli mi?

23 Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen Percent agreement of E 2 values obtained by the 6 different immunoassay methods with the corresponding values measured by LC-MS/MS. Jaque J et al. Deficiencies in immunoassay methods used to monitor serum Estradiol levels during aromatase inhibitor treatment in postmenopausal breast cancer patients. Springerplus. 2013;2(1):5.

24 Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen - E 2 LLOQ ve LOD 0.5 ve 0.25 pg/ml (1.8 ve 0.9 pmol/l) - E 2 ULOL 60 pg/ml (220.2 pmol/l) -Recovery % Within run ve between-run imprecision= <9.21% ve <5.38% Premenopozal kadınlarda referans aralıklar pg/ml; pmol/l pg/ml; pmol/l pg/ml; pmol/l Premenopozal kadınlarda 0.5 pg/ml; 1.8 pmol/l Ray JA, et al. Direct measurement of free estradiol in human serum by equilibrium dialysis liquid chromatography tandem mass spectrometry and reference intervals of free estradiol in women. Clinica Chimica Acta 413 (2012)

25 Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron Testosteron replasmanı veya anti-androjen ted. takibinde Standard 5.0 nmol/l İnternal Standard dideuterated testosterone (291.1/98.7) Immünoassaylarin doğruluğu? <1.73 nmol/l (<50 ng/dl) Serum referans aralık: nmol/l nmol/l Hasta= 6.7 nmol/l (MRM 289.2/97.1) Within-run ve between-run= <12.1% ve <4.3% Total variation <10% Linearity= nmol/l LLOD= 0.15 nmol/l LLOQ= 0.25 nmol/l with a coefficient of variation 12.1%. Savolainen K, et al. High-throughput analysis of testosterone in serum samples by on-line solid phase extraction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem Lab Med. 2011;49(11):

26 Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron Dolaşımdaki Testosteronun Dağılımı Mean F, et al. Study on the binding of dihydrotestosterone, testosterone and oestradiol with sex hormone binding globulin. Clin Chim Acta 1977; 80: farklı immunoassay ve LC-MS/MS yönteminin karşılaştırılması

27 Endokrinoloji Uygulamaları 6) Konjenital Adrenal Hiperplazi

28 Endokrinoloji Uygulamaları 7) Katekolaminler ve Metanefrinler HPLC-EC LC-MS/MS Inter-assay imprecision NMN <13% ve MN <9.8% NMN ve MN recovery 100% ve 96% Linearite nmol/l Lagerstedt SA, et al. Measurement of plasma free metanephrine and normetanephrine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for diagnosis of pheochromocytoma. Clin Chem. 2004;50(3):