elektroforezi yöntemiyle belirlemek ve morfolojik olarak farklı olduğu belirlenen

Transkript

1 II. Amaç ve Kapsam Bu çalışmanın amacı, Clethrionomys cinsindeki allozimik varyasyonları jel elektroforezi yöntemiyle belirlemek ve morfolojik olarak farklı olduğu belirlenen populasyonların genetik farklılıklarını ortaya koymaktır. Ayrıca, farklı populasyonların genetik mesafelerini belirlemek ve taksonların populasyon genetiğine katkı sağlamaktır. Taksonomik problemleri çözmek, cinsin sistematiğine ve Türkiye faunasına katkıda bulunmak projenin amaçları arasındadır. Palaearktik bölgede Clethrionomys cinsinin C. glareolus, C. rutilus ve C. rufocanus türleri yayılış göstermektedir (Ellerman and MorrisonScott, 1951, Corbet, 1978). Bu türlerden C. glareolus Türkiye de yayılış göstermektedir. Neuhauser (1936) C. glareolus u Abant (Bolu), Karadere (Zonguldak) ve Tosya (Kastamonu) dan, Osborn (1962), Felten et al (1971), ve Çolak ve Kıvanç (1991) Uludağ (Bursa), Bürnük Bektaşağa (Sinop), Akçakoca (Bolu), Biçik (Giresun), Uludağ (Bursa), Düzce, Çat (Rize), Sümela (Trabzon) dan kaydetmişlerdir.. Çolak et al. (1997) ise bu türün karyolojik özelliklerini ortaya koymuşlardır. Osborn (1962) ve Çolak ve Kıvanç (1991) a göre bu tür Türkiye de kesintili yayılış göstermektedir. Araştırıcılar Kuzey Anadolunun batı kesimiyle doğu kesimi arasında morfolojik farkların bulunduğunu özellikle Şile örneklerinin farklı olduğunu ortaya koymuşlardır. Bu kesintili yayılış biçimi türün farklı populasyonları arasındaki gen akışını kesmektedir. Böylece bu populasyonlar birbirinden ayrı kalarak farklılaşmakta ve evrimleşmektedirler. Bu gibi populasyonların bir çoğunun yok olma tehlikesiyle karşı karşıya olduğu bilinmektedir. Bu özellikteki türlerin genetik yapıları üzerinde araştırmalar yapılmaktadır. Leitner ve Hartl (1988) Doğu Avusturya da yayılış gösteren C. glareolus un 1

2 genetik varyasyonlarını çalışmışlar ve populasyonlar arasında genetik farklılığın yüksek olduğunu ortaya koymuşlardır. Hall and Semeonoff (1985), Britanya daki 20 lokaliteden C. glareolus örneğinin plazma esteraz polimorfizmini nişasta jel elektroforezi ile çalışmışlardır. Kuzey ve güney populasyonlarında allel dağılımlarını karşılaştırmışlar ve bu allellerin populasyon yoğunluğuna ve hayatta kalma üzerine etkilerini tartışmışlardır. Borkowska (1999) Kuzeydoğu Polonya daki C. glareolus un 5 populasyonu arasındaki genetik ve morfolojik varyasyonları elektroforetik olarak çalışmıştır. 37 enzim lokusundan 14 ünün polimorfik olduğunu belirterek, farklı populasyonlarda polimorfik lokusların oranları ve heterozigotluk oranlarını karşılaştırarak tüm populasyonlarda önemli heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Ayrıca allel frekanslarında mevsimsel varyasyonun bulunduğunu belirtmiştir. Frisman ve arkadaşları (2002) Okhotsk denizi bölgesindeki Clethrionomys cinsine ait kırmızı sırtlı sıçanların (C. rutilus, C. rex, C. rufocanus) genetik farklılaşması ve gencoğrafik varyasyon ilişkisini çalışmışlardır. 17 lokaliteden 159 örneğin 16 protein sistemini nişasta jel elektroforezi ile incelemişlerdir. İncelenen 25 lokustan 6 lokusun monomorfik olduğunu bildirmişlerdir. Türler ve populasyonlar arasında karşılaştırmalar yaparak taksonomik problemlerin çözümüne çalışmışlardır. Redeker ve arkadaşları (2006) Danimarka nın doğusundaki üç ormandan topladıkları 161 Clethrionomys glareolus un 9 mikrosatellit lokusunu incelemişlerdir. Populasyonların içinde genetik çeşitliliği (diversity) yüksek bulmuşlardır. Spesifik habitat gereksinimleri olan 2

3 bu türün yaşadığı ormanların, doğal veya insan etkisiyle bozulmasının populasyonun altyapılanmasına ve böylece populasyonlar arasında dağılım sınırlanmasına sebep olabilir. Bu yüzden populasyonlar arasında bariyer etki sini incelemişlerdir. İnceledikleri 5 lokalitenin birinde darboğaz benzeri durum için genetik kanıt bulunmuştur. Clethrionomys glareolus un sadece yıldan yıla değil aynı zamanda mevsimden mevsime bazen yüksek yoğunluk dalgalanmaları sergilediği bilinmektedir. Bu yüzden, belirlenen darboğaz benzeri durumun, yoğunluğun düşük olduğu evrede az sayıdaki birey yüzünden olabileceği belirtilmiştir. Gebczynski ve arkadaşları (1993) 21 lokus tarafından kodlanan proteinlerdeki elektroforetik varyasyonu C. glareolus un güney ve doğu Polonya daki beş populasyonunda analiz etmişlerdir. Populasyon içi varyasyonu yüksek populasyonlar arasında Nei nin ortalama mesafesini bulmuşlardır. Nisbeten yüksek Fıs değerleri, yüksek seviyede farklılaşmayı göstermektedir. Allel frekanslarındaki varyasyon yüksektir ve bu da önemli coğrafik genetik heterojeniteyi göstermektedir. Genetik ve coğrafik mesafeler arasında uyumlu bir ilişki tespit etmemişlerdir. Yapılan literatür araştırmaları sonucu, Türkiye de Clethrionomys cinsine ait Clethrionomys glareolus türü ve bu türe ait C. glareolus ponticus alt türünün yayılış gösterdiğini, bu cins üzerinde genetik (izozim ve allozim) araştırmaların yapılmadığını ortaya koymuştur. Bu taksondaki genetik farklılaşmalar ve evrimsel değişikliklerin derecesi bu çalışmada belirlenmeye çalışılmıştır. 3

4 III. Materyal ve Yöntem Bu proje çalışması hem arazide hem de laboratuarda iki aşamalı olarak yürütülmüştür. Canlı olarak laboratuvara getirilen örneklerden elektroforetik çalışmalarda kullanılmak üzere kan ve doku alınmıştır. Alınan kan ve dokular elektroforetik çalışmalarda kullanılmak üzere 70 derecedeki derin dondurucuda saklanmıştır. Örneklerin teşhisi Çolak ve Kıvanç (1991) a göre yapılmıştır. Bu çalışmada değerlendirilecek örneklerin ağırlığı ile beraber 4 dış karakterin (tüm boy, kuyruk, ard ayak ve kulak uzunluğu) ölçüsü alınmış ve daha sonra örnekler standart müze materyali şeklinde tahnit edilerek Ankara Üniversitesi Fen Fakültesinde korunmuştur. Çalışmada kullanılan örneklerin laboratuar numaraları ve lokaliteleri Tablo 2.1 de listelenmiştir. Canlı örneklerden karyotip çalışmalarını takiben, elektroforetik çalışmalarda kullanılmak üzere kas, karaciğer, böbrek ve kalp doku örnekleri alınmıştır. Bu çalışmada değerlendirilecek örneklerin ağırlığı ile beraber 4 dış karakterin (tüm boy, kuyruk, ard ayak ve kulak uzunluğu) ölçüsü alınmıştır. Nişasta jel elektroforezi yöntemi kullanılarak çalışılması planlanan 12 enzimin (Esteraz, İzositrat dehidrojenaz, Malat dehidrojenaz, Malik enzim, Fosfoglukomütaz, Alfagliserofosfat dehidrojenaz, Glukofosfat izomeraz, Nukleosid fosforilaz, Adenozin deaminaz, 6 fosfoglukonat dehidrojenaz, Aconitaz, Hekzokinaz) yanı sıra 4 enzim sistemi (Süperoksit dismutaz, Fumaraz, Glukoz 6 fosfat dehidrojenaz, Laktat dehidrojenaz) daha çalışmaya dahil edilmiştir. Elektroforez işleminde kas doku örnekleri kullanılmıştır. Kas dokuları, buz içine yerleştirilmiş ependorf tüpte distile su içinde cam çubuk yardımıyla homojenize edilmiştir. Homojenatlar hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için soğutmalı mikrosantrifüjde +4 C de rpm de 3 dakika santrifüjlenmiştir. Homojenatlar nişasta jellere 3MM Whatman filtre kağıtlarına emdirilerek yüklenmiştir. Homojenatlar Poliakrilamid jellere yüklenmeden önce 4

5 1:1 oranında %10 luk sükroz+brom fenol mavisi ile karıştırılmış ve bu karışımdan 2030 µl yüklenmiştir. Tablo 2.1. Türkiye nin çeşitli yerlerinden toplanan ve elektroforetik analizlerde kullanılan Clethrionomys glareolus örneklerinin laboratuar kayıt numaraları ve lokaliteleri. Sıra Örnek No LOKALİTE Sıra Örnek No LOKALİTE Sıra Örnek No LOKALİTE Şileİstanbul UludağBursa KüreKastamonu SümelaTrabzon Zonguldak Kandıraİzmit BürnükSinop Kızılcahamam Zonguldak AkçakocaDüzce GöktepeSinop KışlaGiresun BicikGiresun ÜnyeOrdu AbantBolu BulancakGiresun ÇatRize ÇakallıSamsun GürgentepeOrdu BorçaGiresun " Bulancak Giresun UlubeyOrdu ÜnyeOrdu ZONGULDAK 5

6 Bu çalışmada Nişasta ve Poliakrilamid jel elektroforezi ile incelenen 16 enzim sistemi, uluslar arası kod numaraları ve kısaltmaları Tablo 2.2 de verilmiştir. Tablo Bu çalışmada incelenen enzimlerin adları, kısaltmaları, uluslar arası enzim kod numaraları No Enzim adı Kısaltma Enzim kodu 1. Esterase Est E.C Glucose6 phosphate dehydrogenase G6pdh E.C Glucose6 phosphate isomerase Gpi E.C Aconitase Aco E.C Glycerol3phosphate dehydrogenase αgpdh E.C (αglycerophosphate dehydrogenase) 6. Hexokinase Hk E.C Isocitrate dehydrogenase Idh E.C Lactate dehydrogenase Ldh E.C Malate dehydrogenase Mdh E.C Malic enzyme Me E.C Phosphoglucomutase Pgm E.C Superoxide dismutase Sod E.C Fumarase Fum E.C Phosphogluconate dehydrogenase Pgd E.C Adenosine deaminase Ada E.C Nükleoside phosphorylase Np E.C Nişasta jel elektroforezi yöntemi kullanılarak aşağıdaki enzim sistemlerinin analizleri yapılmıştır (Hillis and Moritz, 1990, Harris and Hopkinson, 1976; Ayala ve ark. 1972): Aconitase (Aco), Glucose6 phosphate dehydrogenase (G6pdh), Glucose6 phosphate isomerase (Gpi), αglycerophophate dehydrogenase (αgpdh), Isocitrate dehydrogenase (Idh), Malate dehydrogenase (Mdh), Malic enzyme (Me), Phosphoglucomutase (Pgm), Superoxide dismutase (Sod), Fumaraz (Fum), Phosphogluconate dehydrogenase (Pgd), Adenosine deaminase (ADA), Nükleoside phosphorylase (Np), Hexokinase (Hk), Lactate dehydrogenase (Ldh). 6

7 Bu analizlerde % oranında hidrolize patates nişastası (Sigma) kullanılmıştır. Nişasta her bir enzim için uygun tamponla karıştırılmış, bek alevinde ısıtılarak kaynatılmış, su trompu kullanılarak hava kabarcıklarının çıkarılmasını takiben jel kalıplarına dökülmüştür. Jeller katılaştıktan sonra yüzey tabakası misina ipi ile kesilerek atılmış ve örnek homojenatlarına batırılmış olan küçük filtre kağıtları düzgün bir sıra oluşturacak şekilde nişasta jele batırılarak yüklenmiştir. Jel tabakaları enzime uygun tampon konulmuş elektroforez tankına yerleştirilmiş ve tanktaki tampona batırılarak ıslatılmış emici temizlik bezleri ile jel ve tampon arasında köprü oluşturulmuştur. Jellere 79 V/cm akım uygulanarak 2.55 saat koşturulmuştur. Elektroforezden sonra jeller her bir enzim için uygun tampon, boya, substrat ve kofaktörleri içeren karışımlarda veya agar içeren karışım jel üzerine yayılarak (agar overlay) 37 C deki etüvde karanlık koşullarda bantlar belirinceye kadar inkübe edilmiştir. Boyamadan sonra reaksiyonu durdurmak için jeller metanolsuasetik asit (45:45:10) karışımında fikse edilmiştir. Işıklı kutu üzerine yerleştirilen jellerin üzerine konulan asetat kağıtları ile çizimleri ve değerlendirmeleri yapılarak dijital fotoğraf makinesi ile fotoğrafları çekilmiştir. Poliakrilamid jel elektroforezi (NATIVEPAGE) yöntemi (Sambrook et al.,1989) kullanılarak ise Esterase (Est), Hexokinase (Hk), Lactate dehydrogenase (Ldh) ve Malic enzyme (Me) enzim sistemleri incelenmiştir. Poliakrilamid jeller; sıkıştırma jeli % 4, ayırma jeli %7.5 oranında olmak üzere Sambrook ve arkadaşlarının (1989) yöntemine göre hazırlanmıştır. Elektrot tamponu olarak Laemmli (1970) nin tamponu kullanılmıştır. Sıkıştırma jeline 80 V, ayırma jeline ise 150 V akım uygulanmış, izleme boyası jelin bitimine 0.5 cm kalınca elektroforez durdurulmuştur. Elektroforezden sonra jeller her bir enzim için uygun tampon, boya, substrat ve kofaktörleri içeren karışımlarda 37 C deki etüvde karanlık koşullarda bantlar belirinceye kadar inkübe edilmiştir. Boyamadan sonra reaksiyonu 7

8 durdurmak için jeller metanolsuasetik asit (45:45:10) karışımında fikse edilmiştir. Işıklı kutu üzerine yerleştirilen jellerin üzerine konulan asetat kağıtları ile çizimleri ve değerlendirmeleri yapılarak dijital fotoğraf makinesi ile fotoğrafları çekilmiştir. İzozimler anoda en yakından başlanılarak numaralandırılmıştır. Allozimler ise en hızlı göç eden allel A olacak şekilde mobilitelerine göre alfabetik olarak isimlendirilmişlerdir. İstatistik analizlerde; [populasyonlar arası genetik uzaklık (D), polimorfik lokus sayısı (P), lokus başına alel sayısı (A), gözlenen heterozigotluk (Ho), HardyWeinberg eşitliği altında beklenen heterozigotluk (He), Shannon un İnformation İndeksi (I) ve populasyonlar arası farklılaşma miktarı (Fst) ] Popgen 32 (Yeh et al., 1999) programı kullanıldı. 8

9 III. Analiz ve Bulgular Clethrionomys glareolus un Yayılışı: Türkiye de kuzey Anadolu bölgesinde yayılış göstermektedir. Bu çalışmada toplanan örneklerin alındığı lokaliteler Şekil 3.1 de gösterilmektedir. Şekil Clethrionomys glareolus un Türkiye deki yayılışı. 1. UludağBursa; 2. Kandıra İzmit; 3. Şileİstanbul; 4. AkçakocaDüzce; 5. AbantBolu; 6. Zonguldak; 7.Kızılcahamam; 8. Küre Kastamonu; 9. BürnükSinop; 10. GöktepeSinop; 11. ÇakallıSamsun; 12. ÜnyeOrdu; 13. GürgentepeOrdu; 14. UlubeyOrdu; 15. BulancakGiresun; 16. GöreleGiresun; 17. SümelaTrabzon; 18. İkizdereRize. Habitat Özellikleri: Clethrionomys glareolus Rize den Şile ye kadar olan bir alanda ormanlarda yayılış göstermektedir. Rize de kayının dominant olduğu ve seyrek çam ormanlarının bulunduğu alanlardan elde edildi. Zemini kayın yapraklarıyla kaplı ve düz olan alanları tercih etmektedirler. Bu alanlarda orman altında yaygın bir şekilde kırmızı orman gülü bulunmaktadır. Sümela da bu hayvan ancak bir lokaliteden elde edildi. Zemini orman gülü yaprağı ve kayın yapraklarıyla kaplı alanları tercih etmektedir. Ayrıca seyrek çam, fındık ve kızıl ağaç bulunmaktadır. Orman altında çok yoğun bir şekilde kırmızı orman gülü formasyonu mevcuttur (Şekil ) 9

10 Şekil 3.2. Clethrionomys glareolus un Şile/İstanbul daki habitatı Şekil Clethrionomys glareolus un Zonguldak taki habitatı 10

11 Şekil Clethrionomys glareolus un Göktepe/Sinoptaki habitatı Şekil Clethrionomys glareolus un Sümela/Trabzon daki habitatı 11

12 Şekil Clethrionomys glareolus un İkizdere/ Rize deki habitatı Post Karakterleri: 101 örneğe ait postlar lokalite lokalite değerlendirildi. Uludağ dan incelenen 7 postta dorsal renk kırmızımsı kahverengidir. Bazı örneklerde (n=3) bu renk daha koyudur. Yanlara doğru renk açılmaktadır. Karın altıyla vücut yanlarını ayıran belirgin bir hat yoktur. Kuyruk iki renklidir. Üstte koyu kahverengi, alta ise açık renktedir. Karın altı kurşuni renkte olup kahverengi izlidir. Bazı örneklerde (n=2) karın renginde kızıllaşmalar vardır ve ayaklar ön arka ayaklar üste soluk beyaz ve ince kıllarla kaplıdır. Ayakların altı çıplaktır. 12

13 Şile (İstanbul) den incelen 7 örnekte dorsalde çok belirgin koyuluk vardır. Kızılımsı koyu kahverengidir. Bu renklenme Uludağ örneklerinde olduğu gibi burun ucundan kuyruğun başlangıcına kadar devam etmektedir. N=4 örnekte karın altında kızıllaşmalar mevcuttur. Kandıra (İzmit) dan 7 örnek post özellikleri bakımından Şile örnekleriyle aynıdır. Akçakoca (Düzce) dan alınan 7 örnekten 3 tanesinde dorsalde kızıllaşma vardır. Diğer örnekler daha açık renktedir. Diğer özellikleri bakımından Şile örnekleri gibidir. Zonguldak tan alınan 7 örnekten 4 tanesinde dorsalde belirgin bir kızıllaşma vardır. Diğer özellikleri Şile örneklerinde olduğu gibidir. Abant (Bolu) tan 13 örneğin postu incelendi. 5 örnekte dorsalde koyu kızıllık hakimdir. Diğer örnekler ise biraz daha soluktur. Karın altı soluk beyazımsıdır. Diğer özellikleri bakımından Şile örnekleriyle aynıdır. Küre (Kastamonu) deki 7 örnekten 3 örnekte diğer lokalitelerden farklı olarak dorsal renk belirgin bir şekilde açık kızıl renktedir. Bu örneklerin karın altları da daha beyazımsıdır. Diğer özellikleri Şile örnekleriyle aynıdır. Bürnük (Sinop) ten alınan 6 örnekte dorsal farklı olarak sarımsı kızıldır. Bu renklenme diğer lokalitelerden belirgin bir şekilde farklıdır. Karın altında sarımsı izler yoğunluktadır. Göktepe (Sinop) deki 11 örnek de Bürnük örneklerinde olduğu gibidir. Bu populasyonda belirgin farklar vardır. Dorsalde parlaklık hakimdir. Karın altında sarımsı iz hakimdir. Çakalllı (Samsun) dan 2 örnekte dorsal renk açık kızılımsıdır. Sinop örneklerine göre daha koyudur. Karın altı soluk beyazımsıdır. Ünye, Ulubey ve Gürgentepe (Ordu) den 13 örnekte n=4 örnek dorsalde koyu kızılımsı diğer örneklerde koyu kahverengi kızılımsı izlidir. Karın altı kirli beyaz ve sarımsı izlidir. Giresun 5 örnekte dorsalde koyu kahverengi ancak çok belirgin bir kızıllaşma mevcuttur. N= 2 örnekte kızıllaşma daha azdır. Sümela (Trabzon) 4 örnekten 3 tanesinde dorsalde belirgin bir kızıllaşma var ancak renk bakımından örnekler koyudur. 13

14 İkizdere (Rize) n=5 örnekte dorsalde koyu renk hakimdir ve kızılımsıdır. Karın altı belirgin bir şekilde koyudur ve sarımsı izlidir (Şekik 3.7). Şekil İkizdere/Rize den bir Clethrionomys glareolus örneği Morfolojik Özellikleri Morfolojik analizlerde, toplam 104 Clethrionomys örneğinin ağırlık ve 4 dış karakter ölçüsü alındı (Tablo 3.1). 14

15 Tablo 3.1. Clethrionomys glareolus örneklerinin cinsiyet, ağırlık ve dış karakter ölçüleri.(tüm boy, Kuyruk, Ardayak ve Kuyruk uzunlukları) Cinsiyet Ağırlık (gr) Tüm boy uzunluğu (cm) Kuyruk uzunluğu (cm) Ard yak uzunluğu (cm) Kulak uzunluğu (cm) LOKALİTE Örnek No 4994 Şileİstanbul E D E D D E E E D E E KandıraKocaeli D D D D D E AkçakocaDüzce D D E E D D D AbantBolu E D D E E D E D D E UludağBursa E D KüreKastamonu E E D

16 Tablo Devam Cinsiyet Ağırlık LOKALİTE (gr) Örnek No 5006 E D D E BürnükSinop E E E D D D GöktepeSinop E D D E D D E D E D E GürgentepeOrdu E E D UlubeyOrdu E E E D E D E SümelaTrabzon D D D E D E Kızılcahamam E D 12 Tüm boy uzunluğu (cm) Kuyruk uzunluğu (cm) Ard yak uzunluğu (cm) Kulak uzunluğu (cm)

17 Tablo Devam Cinsiyet Ağırlık Tüm boy Kuyruk Ard yak Kulak LOKALİTE (gr) uzunluğu uzunluğu uzunluğu uzunluğu Örnek No (cm) (cm) (cm) (cm) 5164 E Zonguldak D E D E E E D KışlaGiresun D 5302 BiçikGiresun E BulancakGiresun E E BorçaGiresun D ÜnyeOrdu E E D D ÇatRize D İkizdereRize E E D D D ÇakallıSamsun D E " E

18 Allozim Analizleri Clethrionomys örneklerinin kas dokuları ile yapılması planlanan allozim analizinde 12 enzim sistemine (Aldolaz, Esteraz, Glukoz6fosfat dehidrojenaz, Glukoz6fosfat izomeraz, Gliseraldehit3 fosfat dehidrojenaz, Gliserol3 fosfat dehidrojenaz, Heksokinaz, Izositrat dehidrojenaz, Laktat dehidrojenaz, Malat dehidrojenaz, Malik enzim, Fosfoglukomutaz, Süperoksit dismütaz, Fumarat dehidrojenaz) ilave olarak laboratuarımızda bulunan kimyasal maddelerle 4 enzim sistemi (Fosfoglukonat dehidrojenaz, Adenozin deaminaz, Nükleozid fosforilaz) daha incelenmiştir. Böylece toplam 16 enzim sistemi nişasta jel elektroforezi ile incelenmiştir. Nişasta jel elektroforezi ile değerlendirilebilecek düzeyde aktivite bantları sergilememiş olan Hekzokinaz enzimi ile bir lokus sergileyen Malik enzim, üç lokus sergileyen Esteraz ve beş lokus sergileyen Laktat dehidrojenaz enzimleri daha kesin çözüm sağlayan poliakrilamid jel elektroforezi (NativePAGE) yöntemiyle de araştırılmıştır. Jellerde gözlenen bant fenotiplerine göre belirlenen enzim lokuslarındaki genotipler EKc de verilmiştir İncelenen enzim sistemlerinden 10 enzim sistemi bir lokus tarafından kodlanırken, Izositrat dehidrojenaz, süperoksit dismutaz, akonitaz ve malat dehidrojenaz enzimleri 2, Esteraz enzimi 3, ve Laktat dehidrojenaz enzimi 5 izozime sahiptir. Ancak esteraz ve laktat dehidrojenaz enzimi için kodlama yapan lokuslardan Est2 ve Ldh1 lokusları izlenebilir sonuçlar vermediği için analiz edilememiştir. Böylece incelenen 16 enzim sistemi toplam 26 lokus sergilemiştir. Bu 26 lokusun 24 ü analiz edilmiştir. Analiz edilen 24 lokus içinde 12 lokus (Idh1, Sod1, Sod2, Aco1, Aco2, NP, Fum, Mdhm, G6pdh, Hk, Gpi, Est3) monomorfiktir ve çalışılan tüm populasyonlarda aynı allel için fikse olmuştur. Diğer 12 lokus ise polimorfiktir ve çalışılan populasyonların en az 18

19 birisinde veya daha fazlasında birden fazla allel sergilemiştir. Polimorfik lokuslardan, Idh2 lokusunda A ve B olmak üzere 2 allel, αgpdh lokusunda A,B,C olmak üzere 3 allel, Me 2 allel (A ve B), Pgm 3 allel (A, B, C), Pgd 2 allel (A, B), Mdhs 3 allel A, B, C), Ada 2 allel (A, B), Est 1 de üç allel (A,B,C), Ldh2, Ldh3, Ldh4, ve Ldh5 lokuslarında ise üçer allel (A, B, C) bu çalışmada tespit edilmiştir (Tablo 3.2). Allozim analizi taze veya taze dondurulmuş doku örnekleriyle yapılabilir. Laboratuara canlı getirilebilen 99 örnekten 94 örnek analiz edilebilir sonuçlar vermiştir. Diğer örnekler morfolojik analizlerde kullanılmıştır. Bu örnekler toplandıkları lokalitelere göre analizlerde kolaylık (populasyon sayısını azaltmak) açısından 8 gruba (populasyon) ayrılmıştır. Bu gruplara dahil olan örnek sayısı (N) ve lokaliteler aşağıdaki gibidir: Grup1 (N=11): ŞileİSTANBUL (11) Grup2 (N=24): KandıraİZMİT (6) +AkçakocaDÜZCE (7) +UludağBURSA ( 2) +Zonguldak(7) Grup3 (N=12): AbantBOLU (10) +KızılcahamamANKARA (2) Grup4 (N=7) : KüreKASTAMONU (7) Grup5 (N=19): BürnükGöktepeSİNOP (6+11)+ÇakallıSAMSUN (2) Grup6 (N=13): GürgentepeUlubeyÜnyeORDU (3+6+4) Grup7 (N=6): KışlaBicikBulancakBorçaGİRESUN ( ) Grup8 (N=4): SümelaTRABZON (4) Polimorfik ve monomorfik lokusların populasyonlara (gruplara) göre allel frekansları Tablo 3.2 de verilmiştir. 19

20 20 Tablo 3.2. Clethrionomys glareolus un 8 populasyonunda gözlenen toplam 24 lokustaki allel frekansları Lokus Allel Populasyonlar IDH1 A B C IDH2 A B C AGPD A B C ME A B C PGM A B C SOD1 A B C SOD2 A B C ACO1 A B C ACO2 A B C PGD A B C NP A B C FUM A B C MDHS A B C MDHM A B C ADA A B C

21 Tablo devam Lokus Allel Populasyonlar G6PDH A B C HK GPI EST1 EST3 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C Enzim Özellikleri 1. Esteraz (Est, E.C ) Poliakrilamid jel elektroforezi ile anoda göç eden 3 lokus belirlenmiştir. Bu lokuslardan Est3 monomorfik olup çalışılan tüm örneklerde aynı allel için fikse olmuştur. Est1 ve Est2 lokuslarında polimorfizm tespit edilmiştir. Ancak Est2 lokusu jellerde düşük aktivite gösterdiğinden incelenen tüm bireylerde genotipleri tespit etmek mümkün olmamıştır ve bu yüzden analizlere dahil edilmemiştir. Est1 lokusunda ise üç allel tespit edilmiştir. 21

22 Bunlardan en hızlı göç eden allel A olarak, diğerleri ise azalan mobilitelerine göre alfabetik olarak (B ve C) adlandırılmıştır. Bu lokusta heterozigot bireylerde gözlenen 2 bantlı fenotip nedeniyle enzimin alt ünite yapısının monomerik olduğunu söyleyebiliriz. Bu lokusta A alleli yüksek frekansta gözlenirken, C alleli düşük frekansta olup bu allel sadece 1 homozigot (CC) ve iki heterozigot (1 BC ve 1 AC) bireyde gözlenmiştir (Şekil 3.8). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin NativePAGE ile incelenmiş Esteraz enzimi zimogramı. Est1, Est2 ve Est3 lokusları. 22

23 2. Glukoz6 fosfat dehidrojenaz ( G6pdh, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Glukoz6fosfat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler G6pdh lokusunda aynı allel için fikse olmuştur (Şekil 3. 9.). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Glukoz6fosfat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (G6pdh). 3. Glukoz6 fosfat izomeraz (Gpi, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Glukoz fosfat izomeraz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler Gpi lokusunda aynı allel için fikse olmuştur (Şekil 3.10). 23

24 Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Glukoz fosfat izomeraz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Gpi). 24

25 4. Aconitaz (Aco, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve akonitaz enzimi bir anoda bir de katoda göç eden iki izozim sergilemiştir. Anodal formu Aco1 ve katodal formu ise Aco2 olarak adlandırılmıştır. İncelenen tüm bireyler her iki lokusta da monomorfiktir yani aynı allel için fikse olmuştur (Şekil 3. 11). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Akonitaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden Aco1 ve katodal göç eden Aco2 lokusları. 25

26 5. αgliserofosfat dehidrojenaz (Gliserol3 fosfat dehidrojenaz) (αgpdh, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve αgliserofosfat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden tek bir polimorfik lokus sergilemiştir. Bu lokusta B alleli yüksek frekansta gözlenirken, A ve C alelleri sadece heterozigot bireylerde düşük frekansta gözlenmiştir ( 6 AB ve 1 BCgenotip). Heterozigot bireylerde gözlenen üç bantlı fenotip bu enzimin dimerik yapıda olduğunu göstermektedir (Ortadaki bant altünitelerin rastgele bir araya gelmesinden oluşan heteromerik banttır. (Şekil 3.12). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş αgliserofosfat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir polimorfik lokus (α Gpdh) ve A, B, C allelleri 26

27 6. Hekzokinaz (Hk, E.C ) Nişasta jel ile incelendiğinde başarılı sonuç alınamamıştır (Şekil 3. 13). Poliakrilamid jel elektroforezi ile incelendiğinde anoda göç eden 1 lokus belirlenmiştir. İncelenen tüm bireyler Hk lokusunda aynı allel (A) için fikse olmuştur (Şekil 3. 14). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin Nişasta jel ile incelenmiş Hekzokinaz enzimi zimogramı. Hk lokusunun allelleri tanımlanamamıştır. Anodal ve katodal SOD aktivitesi akromatik zonlar şeklinde izlenmektedir. Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Hekzokinaz enzimi zimogramı. Monomorfik tek bir Hk lokusu. 27

28 7. İzositrat dehidrojenaz (Idh, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve izositrat dehidrojenaz enziminin anoda göç eden iki izozimi (Idh1 ve Idh2) tespit edilmiştir. Orijine (jele yükleme noktasına veya katoda) yakın olan Idh1 lokusu monomorfiktir ve incelenen tüm bireyler aynı allel için fikse olmuştur (Şekil 3.15). Anoda yakın olan Idh2 lokusu ise düşük düzeyde polimorfizm göstermiştir. A alleli sadece 6. (Ordu) ve 7. (Giresun) populasyonlarda birer bireyde (AB heterozigot genotipte) gözlenirken, diğer populasyonlarda B alleli fikse olmuştur. Enzim dimerik yapıdadır (Şekil 3. 15). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş İzositrat dehidrojenaz enzim zimogramı. Idh1, Idh2 lokusları. 28

29 8. Laktat dehidrojenaz (Ldh, E.C ) Nişasta jel elektroforezi ile incelendiğinde 5 lokus tarafından kodlanan bu enzim oldukça karışık bant profili sergilemiş ve allelleri tanımlamakta güçlük çekilmiştir (Şekil 3. 16). Bu yüzden daha keskin çözüm sağlayan NativePAGE ile tekrar incelenmiştir (Şekil 3. 17).. Poliakrilamid jel elektroforezi ile anoda göç eden 5 lokus belirlenmiştir ( Ldh1, Ldh2, Ldh 3, Ldh4 ve Ldh5). Lokuslar orijinden başlanarak mobilitelerine göre numaralandırılmıştır. Orijine en yakın olan Ldh1 lokusu zorlukla izlenirken diğer dört lokus oldukça net izlenebilmiştir. Değerlendirmedeki zorluk yüzünden Ldh1 lokusu analizlere dahil edilmemiştir. Ldh1 lokusu dışında diğer tüm lokuslar polimorfik olup, her bir lokusta üçer allel (A, B, C) gözlenmiştir. Heterozigot bireylerde gözlenen 5 bantlı fenotip enzimin tetramer olduğunu açıkça göstermektedir (Ortadaki 3 heteromerik bant ile). Ayrıca incelenen 3. (Bolu) populasyondaki bazı bireylerde muhtemelen lokuslar arası heteromerik bantlar yüzünden oldukça karışık bant profili bu bireylerde allelleri belirlemeyi zorlaştırmıştır. Genotiplemede hata yapmaktan kaçınmak için bu bireylerin Ldh lokusları değerlendirilmemiştir. (Şekil 3. 17). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin Nişasta jel ile incelenmiş Laktat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Ldh1, Ldh2, Ldh3, Ldh4 ve Ldh5 lokusları. 29

30 Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Laktat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Ldh1, Ldh2, Ldh3, Ldh4 ve Ldh5 lokusları. 30

31 9. Malat dehidrojenaz (Mdh, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve malat dehidrojenaz enzimi bir anoda (Mdhs) bir de katoda (Mdhm) göç eden iki izozim sergilemiştir. Anodal formu sitozolikmalat dehidrojenaz (Mdhs) ve katodal formu ise mitokondriyalmalat dehidrojenaz (Mdhm) olarak adlandırılmıştır. Her iki lokusta da allelik bantların anodal yönünde daha az yoğunluklu subbantlar belirlenmiştir. Mdhm lokusunda incelenen tüm bireyler monomorfiktir yani aynı allel için fikse olmuştur. Mdhs lokusu ise polimorfik olup incelenen populasyonlarda 3 allel gözlenmiştir. B alleli yüksek sıklıkta gözlenirken, A ve C allelleri nadir allellerdir. Heterozigotlarda gözlenen 3 bantlı fenotip enzimin dimerik yapıda olduğunu göstermektedir (Şekil 3. 18). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden sitozolik Mdhs, ve katodal göç eden mitokondriyal Mdhm lokusları. 31

32 Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malat dehidrojenaz enzimi zimogramı. Anodal göç eden sitozolik Mdhs, ve katodal göç eden mitokondriyal Mdhm lokusları. 10. Malik enzim (Me, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve allel tanımlamakta güçlük çekilmiştir. Malik enzimin anoda göç eden tek bir izozimi tespit edilmiştir. (Şekil 3.19). Malik enzim ayrıca NPAGE ile incelenerek daha keskin bantlar elde edilmiş ve genotipler belirlenmiştir. Bu lokusta, 5. (Sinop) populasyondan bir birey AA genotipine sahip olup, incelenen diğer tüm bireyler monomorfiktir ve BB genotipine sahiptir. Bu lokusta heterozigot bireye rastlanmadığı için enzimin altünite yapısı hakkında bir şey söylemek mümkün değildir. (Şekil 3. 20). 32

33 Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Malik enzim zimogramı. Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin Native PAGE ile incelenmiş Malik enzim zimogramı. 33

34 11. Fosfoglukomutaz (Pgm, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Fosfoglukomutaz enzimi anoda göç eden tek bir polimorfik lokus sergilemiştir. Pgm lokusunda 3 allel belirlenmiş olup en yaygın allel B dir. Bu lokusta da allelik bantların anodal yönünde daha az yoğunluklu subbantlar belirlenmiştir. Boyama süresinin artışıyla bantların sayısı ve yoğunluğu artmıştır. Heterozigotlarda heteromerik bantların görülmemesi enzimin monomerik yapıda olduğuna işaret eder (Şekil 3. 21). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fosfoglukomutaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir lokus (Pgm). 34

35 12. Superoksit dismutaz (Sod, E.C ) Superoksit dismutaz enzimi bazı enzimlerin boyanması sırasında akromatik zonlar halinde kazara veya şans eseri gözlenebilen bir enzimdir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile incelendiğinde (Me ve Hk jellerinde) anoda göç eden 2 lokus (Sod1 ve Sod2) belirlenmiştir. Süperoksit dismutaz enzimini incelemek için, hekzokinaz ve malik enzim jelleri değerlendirildikten sonra ışığa maruz bırakılmış ve koyulaşan zemin üzerinde akromatik zonlar (beyaz bantlar) halinde beliren Sod bantları değerlendirilmiştir. İncelenen tüm bireyler Sod lokuslarında aynı allel için fikse olmuştur (Bk. Şekil ve Şekil 3. 20). Ayrıca nişasta jellerinde incelenen Hk (Şekil 3. 20) ve G6pdh (Şekil 3.21 ve Bk. Şekil 3. 9) jellerinde bir anodal ve bir de katodal hareket eden 2 Sod lokusu belirlenmiştir. Bu jellerde de incelenen Clethrionomys örneklerinde polimorfizm gözlenmemiştir. Her iki lokusda da aynı allel fikse olmuştur. Anodal enzimin aktiviesi kalın bantlar şeklinde daha yoğun olarak izlenmiştir. Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta ile incelenmiş G6pdh enzimi jeli ışığa maruz bırakıldıktan sonra akromatik zon şeklinde beliren Süperoksit dismutaz fenotipi. Anoda ve katoda göç eden iki Sod lokusu. 35

36 13. Fumaraz (Fumarat hidrataz) (Fum, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Fumaraz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen populasyonlarda tüm bireyler Fum lokusunda aynı allel (A) için fikse olmuştur. (Şekil 3. 22). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fumaraz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Fum). 36

37 14. Fosfoglukonat dehidrojenaz (Pgd, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Fosfoglukonat dehidrojenaz enzimi anoda göç eden iki allelli (A,B) tek bir polimorfik lokus sergilemiştir. İncelenen populasyonlarda B alleli yüksek frekansta gözlenirken A alleli 3 homozigot (4. grup Kastamonu populasyonu) ve 6 heterozigot ( 2.grup AkçakocaBolu; UludağBursa ve 3. grup AbantBolu populasyonları) bireyde izlenmiştir (Şekil 3. 23). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Fosfoglukonat dehidrojenaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir lokus (Pgd). 37

38 15. Adenozin deaminaz (Ada, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Adenozin deaminaz enzimi anoda göç eden oldukça polimorfik olan tek bir lokus sergilemiştir. İncelenen tüm populasyonlarda ADA lokusunda A ve B allelleri tespit edilmiştir. Heterozigot bireylerde gözlenen iki bantlı fenotip enzimin monomerik yapısını göstermektedir (Şekil 3.24). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Adenozin deaminaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir polimorfik lokus (ADA). 38

39 16. Nükleozit fosforilaz (Np, E.C ) Nişasta jel ile incelenmiş ve Nükleozit fosforilaz enzimi anoda göç eden tek bir monomorfik lokus sergilemiştir. İncelenen tüm bireyler Np lokusunda aynı allel (A) için fikse olmuştur. (Şekil 3.25). Şekil Clethrionomys glareolus örneklerinin nişasta jel ile incelenmiş Nükleozit fosforilaz enzim zimogramı. Anoda göç eden tek bir monomorfik lokus (Np). 39

40 İstatistik Analizler İstatistiksel analizlerde; polimorfik lokus sayısı (P), lokus başına allel sayısı (A), gözlenen heterozigotluk (Ho), HardyWeinberg eşitliği altında beklenen heterozigotluk (He), populasyonlar arası genetik benzerlik (I:Identity) ve genetik uzaklık (D:distance), Shannon un İnformation İndeksi (I) ve populasyonlar arası farklılaşma miktarı (Fst) Popgen 32 (Yeh et al., 1999) programı kullanılarak analiz edildi. Allozim çalışmaları sonucu 12 lokus polimorfik bulunmuştur. Polimorfik lokuslar (Idh2, αgpdh, Me, Pgm, Pgd, Mdhs, Ada, Est 1, Ldh2, Ldh3, Ldh4, ve Ldh5) incelenen populasyonlara göre 2 veya 3 allel göstermiştir. Polimorfik lokusların yüzdesi % 12 dir. Bu lokusların tüm populasyonlarda gösterdikleri alleller ve frekansları Tablo 3.2 de gösterilmiştir. Tüm lokuslarda görülen genik varyasyon istatistiklerinin özeti ve ortalamaları Tablo 3.3 de gösterilmiştir. Gözlenen ortalama allel sayısı (na)= ; Etkili allellerin ortalama sayısı (ne)= ve ortalama Shannon informasyon indeksi (I)= olarak tespit edilmiştir. Tüm lokuslarda görülen heterozigotluk ve genetik çeşitlilik indeksleri ve ortalamaları Tablo 3.4 de gösterilmiştir. Gözlenen ortalama heterozigotluk H o (Obs_Het) = ; beklenen heterozigotluk H e (Exp_Het) = ; Nei nin beklenen heterozigotluğu = ve ortalama heterozigotluk = dir. 40

41 Tablo Tüm lokuslarda genik varyasyon istatistiklerinin özeti (Nei, 1987) Lokus Sample Size na* ne* I* IDH IDH AGPD ME PGM SOD SOD ACO ACO PGD NP FUM MDHS MDHM ADA G6PDH HK GPI EST EST LDH LDH LDH LDH Ortalama St. Sapma * na = Gözlenen allel sayısı * ne = Etkili allel sayısı [Kimura and Crow (1964)] * I = Shannon's Information index [Lewontin (1972)] 41

42 Tablo Tüm lokuslarda heterozigotluk istatistiklerinin özeti Lokus Sample Size Obs_Hom Obs_Het Exp_Hom* Exp_Het* Nei** Ave_Het IDH IDH AGPD ME PGM SOD SOD ACO ACO PGD NP FUM MDHS MDHM ADA G6PDH HK GPI EST EST LDH LDH LDH LDH Mean St. Dev * Expected homozygosty and heterozygosity were computed using Levene (1949) ** Nei's (1973) expected heterozygosity Polimorfik lokusların sayısı : 12 Polimorfik lokusların oranı : % İncelenen tüm lokuslarda gen akışı ve Fistatistiklerinin özeti (Nei, 1987) Tablo 3.5 de gösterilmiştir. Buna göre ortalama F is = ; ortalama F it = ; ortalama F st = ve F st den hesaplanan gen akışı (Nm) ortalama tür. 42

43 Tablo Tüm lokuslarda gen akışı ve Fistatistiklerinin özeti (Nei, 1987) Locus Sample Size F is F it F st Nm* IDH1 188 **** **** **** IDH AGPD ME PGM SOD1 188 **** **** **** SOD2 188 **** **** **** ACO1 188 **** **** **** ACO2 188 **** **** **** PGD NP 188 **** **** **** FUM 188 **** **** **** MDHS MDHM 188 **** **** **** ADA G6PDH 188 **** **** **** HK 188 **** **** **** GPI 188 **** **** **** EST EST3 188 **** **** **** LDH LDH LDH LDH Ortalama * Nm = Fst den hesaplanan gen akışı (Fst = 0.25(1 Fst)/Fst.) Nei (1972) in orijinal genetik mesafe (D:distance) ve genetik benzerlik (I: identity) değerleri Tablo 3.6 da gösterilmiştir. En yüksek benzerlik (I) değeri olup 5. Grup ve 8. Grup arasındadır. En düşük I değeri ise ile 1. ve 4. Gruplar arasındadır. En yüksek ve en düşük mesafe (D) değerleri ise sırasıyla ve olarak bulunmuştur. Genetik mesafe değerleri ve Cavalli Sforza katsayısı kullanılarak oluşturulan dendrogram (NJ: Neighbourjoining tree yakın bağlantı ağacı) Şekil 3.26 da gösterilmiştir. 43

44 Tablo Nei'nin orijinal Genetik benzerlik (I: identity) ve Genetik mesafe (D:distance) tahminleri (Nei, 1972) =================================================================== pop ID =================================================================== 1 **** **** **** **** **** **** **** **** =================================================================== Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal). Şekil Genetik mesafe değerleri ve Cavalli Sforza katsayısı kullanılarak oluşturulan dendrogram (NJ: Neighbourjoining tree yakın bağlantı ağacı) Grup1: ŞileİSTANBUL Grup2 KandıraİZMİT+AkçakocaDÜZCE+UludağBURSA+Zonguldak Grup3: AbantBOLU +KızılcahamamANKARA Grup4: KüreKASTAMONU Grup5 : BürnükGöktepeSİNOP+ÇakallıSAMSUN Grup6 : GürgentepeUlubeyÜnyeORDU Grup7 : KışlaBicikBulancakBorçaGİRESUN Grup8 : SümelaTRABZON 44

45 Dendrograma göre C. glareolus a ait 8 populasyon üç küme oluşturdu (Şekil 3.26). Buna göre birinci kümede SİNOP + SAMSUN (Grup 5), ikinci kümede TRABZON (Grup 8) populasyonu yer alırken, üçüncü küme ise Grup 2 (KandıraİZMİT +AkçakocaDÜZCE +UludağBURSA+ZONGULDAK), Grup 1 (ŞileİSTANBUL), Grup 6 (Gürgentepe UlubeyÜnyeORDU), Grup 7 (KışlaBicikBulancakBorçaGİRESUN), Grup 3 (Abant BOLU +KızılcahamamANKARA) ve Grup 4 (KüreKASTAMONU) populasyonlarından oluşmaktadır. Üçüncü kümedeki populasyonlar iki alt küme oluşturmuştur. Birinci altkümede Grup 2, Grup 1, Grup 6, Grup 7 populasyonları yer alırken, Grup 3 ve Grup 4 populasyonları birlikte ikinci altkümeyi oluşturmuştur. 45

46 V. Sonuç ve Öneriler Nişasta ve poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleri ile, 94 örneğin 16 enzim sistemine ait 24 lokus analiz edildi. Bu lokuslardan 12 tanesi polimorfik özellik gösterdi. Diğer 12 lokus aynı allele fikse olmuş ve monomorfik özellikteydi. Polimorfik lokusların oranı (P) % 50, lokus başına ortalama allel sayısı (A) 1.83, Shannon enformasyon indeksi ise dir. Ortalama heterozigotluk , F st değeri ve gen akışı (N m ) ise tür. Genetik mesafe değerlerine dayanılarak oluşturulan dendrograma göre incelenen populasyonlar 3 küme oluşturdu. Birinci kümede SİNOP + SAMSUN, ikinci kümede TRABZON populasyonu yer alırken, üçüncü küme ise iki altküme oluşturmuştur. Birinci altkümede KandıraİZMİT +AkçakocaDÜZCE +UludağBURSA+ZONGULDAK, Şile İSTANBUL, GürgentepeUlubeyÜnyeORDU, KışlaBicikBulancakBorçaGİRESUN populasyonları yer alırken, ikinci altküme AbantBOLU +KızılcahamamANKARA ve KüreKASTAMONU populasyonlarından oluşmaktadır. Clethrionomys glareolus en yaygın palearktik rodent türlerinden biridir. İngiliz adalarından Baykal gölüne ve Kola Peninsula dan Anadoluya kadar yayılış gösterir. Önceki çalışmalar geniş alanları işgal eden türlerin daha küçük alanları işgal eden türlerle karşılaştırıldığında daha yüksek genetik varyasyona sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, Clethrionomys glareolus un genetik özellikleri sadece birkaç populasyonda belirlenmiştir. Polonya daki bir orman populasyonunda H= ve P=%30 olarak belirlenmiştir. Danimarka daki bir populasyonda H=0.006 ve P=%12, Avusturya daki populasyonlarda H= ve P=%822 dir. Yugoslavya daki Clethrionomys glareolus populasyonları arasında genetik varyasyon (dissimilarity) bildirilmiş ancak H ve P değerleri verilmemiştir. Bazı İsveç populasyonlarında genetik varyasyon bildirilmiş ve hepsinde komşu populasyonlar arasındaki H ve P değerleri coğrafik olarak uzak populasyonlarda olduğu gibidir. 46

47 Hall ve Semeonoff (1985), Britanya daki Clethrionomys glareolus örneklerinin plazmasındaki esteraz polimorfizmini nişasta jel elektroforezi ile çalışmışlardır. Plazma örneklerinde belirledikleri tek bir esteraz (Es1) lokusunda üç allel (F,S,O) belirlemişlerdir. Bu çalışmada Kuzey Anadolu da yayılış gösteren C. glareolus örneklerinin kas dokularında ise 3 Esteraz lokusu belirlenmiş ve bunlardan EST1 lokusunda varyasyon bulunmuştur. Bazı populasyonlarda 2 (A,B) bazılarında ise 3 allel (A,B,C) tespit edilmiştir. Hall ve Semeonoff F allelinin kuzeyde S allelinin ise güneyde yaygın olduğunu belirtmişler ve S alleline sahip hayvanların yüksek populasyon yoğunluğunda daha fazla hayatta kalabildiklerini belirtmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca, elektroforetik jellerdeki Es1 lokusu ürünlerinin eserin ve diazinon inhibitörlerine dirençli ve termal olarak stabil (62 o C de 15 dk) olduklarını belirlemişlerdir. Bizim araştırmamızda allellerin dağılımı her populasyona göre değiştiği ve coğrafik olarak ilişkili olmadığı ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada enzim karakterizasyonu yapılmamıştır. Borkowska (1999) Kuzeydoğu Polonya daki Clethrionomys glareolus un birbirine minimum 10 km, maksimum 50 km uzaklıktaki 5 populasyonu arasındaki genetik ve morfolojik varyasyonları çalışmıştır. Genetik polimorfizmi belirlemek için hayvanların kan plazması, böbrek, karaciğer ve tükrük bezlerini kullanarak 37 enzim lokusunu nişasta, selüloz asetat ve agaroz jel elektroforezi ile araştırmışlardır. 37 lokustan 14 ü polimorfik (Ldh2, Me 2, Dia, Cat, Aat2, Pgm1, Pgm2, Pgm3, EstB3, EstD, Amyl2, Pep2, Acy, Mpi) bulunurken bunlardan beşinin (Me2, Dia, Pgm3, EstB3, Amyl2) tüm populasyonlarda polimorfik olduğu bulunmuştur. Çalışılan populasyonlarda polimorfik lokusların oranı P: 0,162 0,270 arasında; gözlenen ortalama heterozigotluk (Ho) ise 0,0740,095 arasındadır ve tüm 47

48 populasyonlarda önemli heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Beş populasyonun dördünde allel frekanslarında mevsimsel varyasyonun varlığı F istatistikleri ile gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda birbirine çeşitli uzaklıktaki 18 populasyon 8 grup altında toplanarak analiz edilmiştir. Polimorfik lokusların oranı % 50 dir. Ldh, Est ve Pgm lokusları bu çalışmada da polimorfiktir. Kuzey Anadolu populasyonlarındaki genetik varyasyon Kuzey doğu Polonya populasyonlarından daha yüksek bulunmuştur. Ortalama gözlenen heterozigotluk ise olup, Kuzey doğu Polonya populasyonları ile aynıdır. ADA, EST ve LDH lokusları dışında tüm lokuslarda önemli heterozigot eksikliği tespit edilmiştir. Polonya populasyonlarında mevsimsel varyasyon rapor edilmiştir. Bizim örneklerimiz ise yaz aylarında toplandığı için mevsimsel bir ilişki aranmamıştır. Frisman ve arkadaşları (2002) Okhotsk denizi bölgesindeki Clethrionomys cinsi kırmızı sırtlı sıçanların (C. rutilus, C. rex, C. rufocanus) genetik farklılaşması ve gencoğrafik varyasyon ilişkisini çalışmışlardır. 17 lokaliteden 159 örneğin kan ve böbrek dokularında 13 enzim ve 3 enzim olmayan protein olmak üzere 16 protein sistemini nişasta jel elektroforezi ile incelemişlerdir. 16 proteini kodlayan 25 lokusu yorumlayabilmişler ve 6 lokusun ( Ldhreg, Mor1, Mor2, Aat2, Sod1, Sod2) monomorfik olduğunu bildirmişlerdir. Bizim çalışmamızda da her iki SOD lokusu monomorfik bulunmuştur. Frisman ve arkadaşlarının çalışmasında Böbrek dokusunda Ldh 5 veya daha fazla (heterozigotlarda) aktivite zonu göstermiştir. Yavaş mobiliteli 1 veya 2 bant gösteren Ldhreg lokusu bazı lokalitelerden yakalanan hayvanlarda izlemek mümkün olmamış ve bu yüzden bu lokus genetik indis hesaplamalarından çıkarılmıştır. Bizim kas dokuları ile çalışmamızda da, Ldh 5 lokus tarafından kodlandığı açıktır. Bazı örneklerde aktvite zonları yeterince ayırd edilemediği için analizlerden çıkarılmıştır. Frisman ve arkadaşları Esteraz lokuslarında sadece maksimum (EST1) ve minimum (EST4) anodal mobiliteli lokusları yorumlayabilmiş ve analizlerde kullanmıştır. Biz de benzer şekilde sadece Est 1 ve Est3 lokuslarını değerlendirebildik. 48