altona altona RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 always a drop ahead. 08/2014 altona Diagnostics GmbH Mörkenstr Hamburg Almanya

Transkript

1 altona DIAGNOSTICS altona DIAGNOSTICS RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit /2014 altona Diagnostics GmbH Mörkenstr Hamburg Almanya phone fax always a drop ahead.

2 RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 aşağıda sıralanan cihazlarla kullanılmak üzere hazırlanmıştır: Mx 3005P QPCR System (Stratagene) VERSANT kpcr Molecular System AD (Siemens) ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research) Rotor-Gene Q5/6 plex Platform (QIAGEN) CFX96 system/dx real-time system (BIO-RAD) in vitro diagnostik kullanım amaçlı Ürün No.: rxns Store at -25 C C MAN TR-01 Ağustos 2014 altona Diagnostics GmbH Mörkenstraße 12 D Hamburg

3 İçindekiler 1. Kullanım Amacı Kit Bileşenleri Muhafaza Etme Gerekli Olan ama Ürünle Teslim Edilmeyen Malzemeler Ve Cihazlar Sınırlamalar ve Önlemler Kalite Kontrol Teknik Yardım Ticari Markalar ve Ret Beyanları Sembollerin Açıklaması Temel Bilgiler Ürün Tanımı Uyarılar ve Önlemler Kullanma Talimatı Örnek Hazırlama Master Mix Hazırlanışı Reaksiyon Hazırlanışı Gerçek Zamanlı PCR Aletlerini Programlama Ayarlar Floresan Detektörleri (Boyalar) Sıcaklık Profili ve Boya Alma Veri Analizi Diagnostik Test Çalışmalarının Geçerliliği Geçerli Diagnostik Test Çalışması Geçersiz Diagnostik Test Çalışması Sonuçların Yorumlanması Performans Değerlendirmesi Analitik Hassasiyet Analitik Özgüllük Kesinlik

4 1. Kullanım Amacı Ebola ve Marburg virüsüne spesifik RNA'nın kalitatif saptanması ve diferansiyasyonu için gerçek zamanlı PCR teknolojisi temelinde in vitro bir diagnostik testtir. 2. Kit Bileşenleri Kapak Rengi Mavi Mor Yeşil Kırmızı Turuncu Beyaz Bileşen Master A Master B Dahili Kontrol Pozitif Kontrol Hedefi Ebola Pozitif Kontrol Hedefi Marburg PCR derecesinde Su Şişe Sayısı Gerekli Olan ama Ürünle Teslim Edilmeyen Malzemeler Ve Cihazlar Uygun real time (gerçek zamanlı) PCR aleti (Bölüm 6: Ürün Tanımı) Uygun nükleik asit ekstraksiyon sistemi veya kiti 2 ml reaksiyon tüpleri için rotorlu masaüstü santrifüjü 96 kuyulu reaksiyon plakaları kullanılıyorsa mikrotitre plakaları için rotorlu santrifüj Vorteks karıştırıcı Karşılık gelen (optik) kapatma materyalli 96 kuyulu uygun reaksiyon tüplüğü veya reaksiyon tüpleri Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli pipet uçları (tek kullanımlık) Pudrasız eldivenler (tek kullanımlık) Hacim [µl/şişe] NOT 3. Muhafaza Etme Lütfen aletlerin üreticinin talimat ve önerilerine göre kurulduğundan, kalibre ve kontrol edildiğinden ve bakımının yapıldığından emin kuru buzla sevk edilir. Kit bileşenlerinin donmuş bir şekilde teslim edilmesi gerekir. Kitler teslim alındığında, bir olunuz. veya birkaç bileşen donmuş durumda değilse veya tüpler sevkiyat sırasında zarar görmüş ise, yardım için altona Diagnostics GmbH ile irtibat kurun. Tüm bileşenler teslim alındıktan sonra (must-have) -25 C C'de saklanmalıdır. Master reaktiflerin tekrarlı bir şekilde çözülüp dondurulmasından (iki kezden fazla) kaçınılmalıdır. Bu durum analiz performansını etkileyebilir. Reaktifler ara sıra kullanılacaklarsa bölüntüler halinde dondurulmalıdır. +4 C'de saklama iki saatlik bir süreyi geçmemelidir. Master A ve Master B ışıktan korunmalıdır. 6 7

5 5. Temel Bilgiler Ebola ve Marburgvirüs, Filoviridae ailesi içinde yer alır. Marburgvirus türü Marburg marburgvirus (MARV) adlı tek bir tür içerir. Ebolavirus türü beş sınıfa ayrılır: Bundibugyo ebolavirus (BEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SEBOV), Tai Forest ebolavirus (TAFV) ve Zaire ebolavirus (ZEBOV) [1]. Güneydoğu Asya'da endemik RESTV hariç tüm bilinen Ebola ve Marburg virüs türleri Afrika'da yaygındır. Filovirüslerin doğal kaynakları meyve yarasalarıdır [2] [3]. İnsanlara geçtikten sonra filovirüsler %20-90 şeklinde yüksek mortalite oranına sahip şiddetli bir hemorajik ateşe neden olabilir (tekli vakalarda türe ve bakterinin kaynağına bağlı olarak) [4]. Bulaşma şeklini belirlemek genellikle zordur. Enfekte vahşi hayvanları avlama, kesme ve tüketme virüsün insan popülasyonuna girmesinin olası yollarındandır. Yarasalarla doğrudan temasın da olası bir enfeksiyon yolu olduğu gösterilmiştir [5]. Birçok memeli türü filovirüs enfeksiyonlarına duyarlıdır. Özellikle şempanzeler ve goriller Ebolavirus epidemilerinden önemli ölçüde etkilenen kategoriye aittirler. Sonuç olarak bu büyük maymun popülasyonlarında belirgin bir azalma olmuştur [6]. Semptomlar hastalık başlangıcında pek belirgin değildir ve genellikle halsizlik, ateş ve vücudun çeşitli kısımlarında ağrı şeklinde ortaya çıkar. [7]. Salgın başlangıcında hastalık genellikle Afrikanın güney Sahra bölgesinde sık görülen Malarya, Tifo veya diğer ateşli hastalıklarla karıştırılır. Akut hastalık sırasında enfeksiyöz virüs titresi ve RNA titresi genellikle yüksektir ve viremi seviyesi hastalığın sonucuyla negatif korelasyon gösterir [8]. Kanama ve diğer kan kaybetme türleri de Ebola ve Marburg ateşinde ölümcül sonuç göstergelerindendir [7]. Laboratuvar yoluyla tanı koyma tercihen plazma, serum ve hatta tüm kan örneklerinde RT-PCR kullanımı yoluyla yapılır. Serolojik testler destekleyici diagnostik araçlar olarak faydalıdır ama hastalığın primer tanısı için faydalı değildir. Hatta birçok hastada (özellikle ölümle sonuçlananlarda) hastalık sırasında saptanabilir antikor titresinin hiç oluşmadığı saptanmıştır. [9]. Filovirüs tespiti için birçok gerçek zamanlı RT-PCR protokolü yayımlanmıştır, ama bunların hiçbirisi ne bir dahili amplifikasyon kontrolü içermiş ne de bir RT-PCR reaksiyonunda Ebola ve Marburg virüsünü saptayıp sınıflandırabilmiştir yılında Panning ve onun meslektaşları tarafından hazırlanan ve L genini hedef alan protokol L geni analizinin ne kadar duyarlı ve spesifik bir tahlil olduğunu göstermiştir. [10]. O zamandan beri bu tahlil filovirüse tanı koymak için dünya çapında birkaç referans laboratuvarı tarafından kullanılmıştır. Yine de mevcut son sekans bilgiler ve yeni Ebola türlerinin (BEBOV) ortaya çıkması mevcut yöntemleri sürekli olarak kontrol edip güncelleme gereğini ortaya koymuştur L geni analizinin bazı zayıf yönleri vardır ve bu nedenle altona Diagnostics GmbH tarafından filovirüslerin L geni temelinde yeni bir analiz geliştirilmiştir. Viral polimerazı kodlayan filovirüs L geni yüksek ölçüde korunmuş sekans unsurları içerir. Enzimatik olarak aktif yerleri kodlayan bölgelerdeki mutasyonlar genellikle işlev kaybıyla sonuçlanır. Bu mutantlar, viral tür benzerleri arasından kaybolur ve RT-PCR tabanlı analizin özgüllüğü üzerine negatif bir etki yapmazlar. Bu nedenle için hedef sekans olarak L genini kullanmaya karar verdik. Diagnostik RT-PCR'larda RNA virüslerinin L genini seçme işlemi geçmişte Lassa virüsü, filovirüsler ve diğer RNA virüsleri için de başarıyla sonuçlanmışır [10 12]. bir birinci basamak diagnostik test olarak önerilir. Bu test ilgili filovirüs türlerini saptamak üzere tasarlanmıştır. altona Diagnostics GmbH ikinci basamak bir analiz de sunmaktadır. RealStar Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 virüs genomundaki diğer sekansları hedefler ve böylece doğrulayıcı bir diagnostik sonuç oluşturma olasılığını sunar. RealStar Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 ayrıca tüm ilgili filovirüslerin türlerine kadar ayırt edilmesini mümkün kılar. Filovirüs enfeksiyonlarından şüphelenilmesi ve bunların doğrulanmasının toplum sağlığı ve vaka yönetimi üzerine büyük etkisi vardır. Tüm vakaların kamu sağlığı ve biyogüvenlikten sorumlu ilgili makamlara hemen bildirilmesi gerekir (Almanya içinde: Robert Koch Institut, Berlin; ve yerel Landesgesundheitsämter -Ülke Sağlık Merkezlerine- ). Diagnostik işlem (örn. önerilen ayırıcı tanı, olası A ve B örneği kullanımı) uzman referans kurumlarıyla tartışılmalıdır. 8 9

6 [1] Carroll SA, Towner JS, Sealy TK, McMullan LK, Khristova ML, Burt FJ, et al. Molecular Evolution of Viruses of the Family Filoviridae Based on 97 Whole-Genome Sequences. J Virol 2013;87: [2] Towner JS, Amman BR, Sealy TK, Carroll SAR, Comer JA, Kemp A, et al. Isolation of Genetically Diverse Marburg Viruses from Egyptian Fruit Bats. PLoS Pathog 2009;5:e [3] Leroy EM, Epelboin A, Mondonge V, Pourrut X, Gonzalez J-P, Muyembe-Tamfum J-J, et al. Human Ebola Outbreak Resulting from Direct Exposure to Fruit Bats in Luebo, Democratic Republic of Congo, Vector-Borne Zoonotic Dis 2009;9: [4] Kortepeter MG, Bausch DG, Bray M. Basic Clinical and Laboratory Features of Filoviral Hemorrhagic Fever. J Infect Dis 2011;204:S810 S816. [5] Van Paassen J, Bauer MP, Arbous MS, Visser LG, Schmidt-Chanasit J, Schilling S, et al. Acute liver failure, multiorgan failure, cerebral oedema, and activation of proangiogenic and antiangiogenic factors in a case of Marburg haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis 2012;12: [6] Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquière S, Kilbourne A, Froment J-M, et al. Multiple Ebola virus transmission events and rapid decline of central African wildlife. Science 2004;303: [7] Roddy P, Howard N, Van Kerkhove MD, Lutwama J, Wamala J, Yoti Z, et al. Clinical Manifestations and Case Management of Ebola Haemorrhagic Fever Caused by a Newly Identified Virus Strain, Bundibugyo, Uganda, PLoS ONE 2012;7:e [8] Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, et al. Rapid Diagnosis of Ebola Hemorrhagic Fever by Reverse Transcription-PCR in an Outbreak Setting and Assessment of Patient Viral Load as a Predictor of Outcome. J Virol 2004;78: [9] Gupta M, MacNeil A, Reed ZD, Rollin PE, Spiropoulou CF. Serology and cytokine profiles in patients infected with the newly discovered Bundibugyo ebolavirus. Virology 2012;423: [10] Panning M, Laue T, Ölschlager S, Eickmann M, Becker S, Raith S, et al. Diagnostic Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Kit for Filoviruses Based on the Strain Collections of all European Biosafety Level 4 Laboratories. J Infect Dis 2007;196:S199 S204. [11] Blasdell KR, Adams MM, Davis SS, Walsh SJ, Aziz-Boaron O, Klement E, et al. A reverse-transcription PCR method for detecting all known ephemeroviruses in clinical samples. J Virol Methods 2013;191: [12] Vieth S, Drosten C, Lenz O, Vincent M, Omilabu S, Hass M, et al. RT-PCR assay for detection of Lassa virus and related Old World arenaviruses targeting the L gene. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007;101: NOT Filovirüslerin moleküler evrimi nedeniyle zaman içinde mutasyonların birikiminin herhangi bir PCR temelli test sisteminde yalancı negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası gereği mevcuttur. 6. Ürün Tanımı, filovirüse spesifik RNA'nın kalitatif olarak saptanması için gerçek zamanlı PCR teknolojisini temel alan bir in vitro diagnostik test sistemidir. Analiz, ilgili insan patojenleri olan tüm filovirüs türleri ve Restonvirüsü saptamak üzere tasarlanmıştır. Reaktif sistemi, olası RT-PCR inhibisyonunu tanımlamak ve reaktifler veya kitin bütünlüğünü doğrulamak üzere bir heterolog amplifikasyon sistemi (Dahili Kontrol) içerir. Test, gerçek zamanlı RT-PCR teknolojisini temel alır ve RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cdna) dönüştürmek için revers transkriptaz (RT) reaksiyonu, spesifik hedef sekansların amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve amplifiye edilmiş DNA'nın saptanması için hedefe spesifik problar kullanır. Problar, floresan raportör ve söndürücü boyalarla etiketlenmiştir. Ebolavirus RNA için spesifik problar FAM floroforu ile etiketlenmiştir. Marburgvirus RNA için spesifik problar Cy5 ile aynı özelliklere sahip bir floroforla etiketlenmiştir. Dahili Kontrol (IC) hedefi için spesifik prob, JOE floroforu ile etiketlenmiştir. Ayırt edilebilir boyalarla bağlantılı problar kullanılması gerçek zamanlı PCR aletinin karşılık gelen detektör kanallarında Ebola ve Marburg virüsüne spesifik RNA'sının ve ayrıca Dahili Kontrolün paralel olarak saptanması ve ayırt edilmesini mümkün kılar

7 RNA virüslerinin nispeten hızlı moleküler evrimi nedeniyle zaman içinde mutasyonların birikiminin herhangi bir RT-PCR temelli test sisteminde yalancı negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası gereği mevcuttur. Analiz tasarımı Aralık 2013'te Genebank'te yayımlanmış sekans bilgisini temel alır. Henüz bilinmeyen yeni suşlar ve türlerin oluşması bir primer/prob seti güncellemesini gerekli kılabilir. Test, tek bir tüp analizinde üç süreçten oluşur: Hedef RNA'nın cdna'ya revers transkripsiyonu Hedef cdna ve Dahili Kontrolün PCR amplifikasyonu PCR amplikonlarının floresan boya etiketli problarla eş zamanlı saptanması şu gerçek zamanlı PCR aletleriyle kullanılmak üzere geliştirilmiş ve doğrulanmıştır: Mx 3005P QPCR System (Stratagene) VERSANT kpcr Molecular System AD (Siemens) ABI Prism 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research) Rotor-Gene Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) CFX96 system/dx real-time system (BIO-RAD) şunlardan oluşur: İki Ana reaktif (Master A ve Master B) Şablon Dahili Kontrol (IC) İki Pozitif Kontrol: Pozitif Kontrol Hedefi Ebola Pozitif Kontrol Hedefi Marburg PCR sınıfı su Master A ve Master B reaktifleri tek bir reaksiyon kurulumunda revers transkripsiyonu, PCR aracılıklı amplifikasyonu ve hedef saptamayı (Filovirüse spesifik RNA ve Dahili Kontrol) mümkün kılacak tüm bileşenleri (tampon, enzimler, primerler ve problar) içerir. 7. Uyarılar ve Önlemler Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır. Numunelere daima enfeksiyöz ve/veya biyolojik olarak tehlikeliymiş gibi ve güvenli laboratuvar işlemleriyle uyumlu şekilde muamele edilmelidir. Numunelerin muamelesi sırasında koruyucu tek kullanımlık pudrasız eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması kullanın. Numune ve kit bileşenlerinin mikrobiyal ve nükleaz (DNase/RNase) kontaminasyonundan kaçının. Daima aerosol bariyerli, DNase/RNase içermeyen tek kullanımlık pipet uçları kullanın. Kit bileşenlerinin kullanımı sırasında daima koruyucu tek kullanımlık pudrasız eldivenler kullanın. Şu işlemler için ayrılmış ve bölünmüş çalışma alanları kullanın: (i) numune hazırlama, (ii) reaksiyon kurulumu ve (iii) amplifikasyon/saptama aktiviteleri. Laboratuvarda iş akışı tek yönlü olarak ilerlemelidir. Daima her bölgede tek kullanımlık eldivenler kullanın ve farklı bölgelere girmeden bunları değiştirin. Ayrı çalışma alanlarına ayrı malzeme ve ekipman tahsis edin ve bunları bir alandan ötekine taşımayın. Pozitif olan ve/veya olabilecek materyali kitin tüm diğer bileşenlerinden ayrı olarak saklayın. Amplikonlarla kontaminasyondan kaçınmak için amplifikasyondan sonra reaksiyon tüplerini/plakaları açmayın. Yerel, bölgesel ve/veya ulusal düzenlemeler veya akreditasyon organizasyonlarının kılavuz ilkeleri veya gerekliliklerine göre ek kontroller test edilebilir. Kitin son kullanma tarihi geçmiş bileşenlerini kullanmayın. Örnek ve test atığını yerel güvenlik düzenlemelerinize uygun olarak atın

8 8. Kullanma Talimatı 8.1 Örnek Hazırlama için başlangıç materyali ekstraksiyon yapılmış RNA'dır. Ekstraksiyon yapılmış RNA'nın kalitesinin tüm test sisteminin performansı üzerine çok önemli bir etkisi vardır. Nükleik asit ekstraksiyonu için kullanılan sistemin gerçek zamanlı PCR teknolojisiyle uyumlu olduğundan emin olmak gerekir. Şu nükleik asit ekstraksiyon kiti önerilir: Ön muamele ve örnek hazırlama açısından ek bilgi ve teknik destek için Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun: e-posta: telefon: +49-(0) Master Mix Hazırlanışı Tüm reaktifler ve örnekler kullanımdan önce tamamen çözülmeli, karıştırılmalı (pipetleme veya hafif vorteksleme ile) ve kısa süre santrifüje konmalıdır. QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) Etanol içeren yıkama tamponları içeren bir spin kolon temelli örnek hazırlama işlemi kullanıyorsanız nükleik asit elüsyonu öncesinde yeni bir toplama tüpü kullanılarak yaklaşık x g (~ devir/dk) hızında 10 dakika boyunca ek bir santrifügasyon adımı kuvvetle önerilir. NOT, bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü ya da örnek hazırlama işlemi (nükleik asit ekstraksiyonu) kontrolü ve RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılabilecek bir heterolog Dahili Kontrol (IC) içerir. Eğer IC bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılır ama örnek hazırlama işlemi için bir kontrol olarak kullanılmazsa, Master Mix şu pipetleme şemasına göre oluşturulur: Ekstraksiyonun verimliliği ve ekstraksiyonu yapılan nükleik asidin stabilitesi açısından taşıyıcı RNA kullanılması elzemdir. Etanol gerçek zamanlı PCR'da güçlü bir inhibitördür. Örnek hazırlama sisteminiz etanol içeren yıkama tamponları kullanıyorsa, nükleik asit elüsyonundan önce tüm etanol izlerini giderdiğinizden emin olmanız gerekir. Reaksiyon Sayısı (rxns) 1 12 Master A 5 µl 60 µl Master B 15 µl 180 µl Dahili Kontrol 1 µl 12 µl Master Mix Hacmi 21 µl 252 µl 14 15

9 Eğer IC örnek hazırlama işlemi için bir kontrol ve bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılıyorsa IC'nin nükleik asit ekstraksiyonu işlemi sırasında eklenmesi gerekir. Nükleik asit ekstraksiyonu için hangi yöntem/sistem kullanılırsa kullanılsın, IC numuneye doğrudan eklenmemelidir. IC daima numune/izis tamponu karışımına eklenmelidir. Eklenmesi gereken IC hacmi daima ve sadece elüsyon hacmine bağlıdır. Elüsyon hacminin %10'unu temsil eder. Örneğin nükleik asit elüsyonu 60 µl elüsyon tamponu veya suda yapılacaksa numune/ lizis tamponu karışımına örnek başına 6 µl IC eklenmelidir. NOT Dahili kontrolü asla doğrudan numuneye eklemeyin! 8.3 Reaksiyon Hazırlanışı Uygun bir optik 96 kuyulu reaksiyon plakası veya uygun optik reaksiyon tüpünün gerekli her kuyusuna 20 μl Master Mix pipetleyin. Örnekten 10 μl (nükleik asit ekstraksiyonundan elüt) veya kontrollerden 10 μl (Pozitif veya Negatif Kontrol) ekleyin. Her çalışma için Pozitif Kontrollerin her birinden birer adet ve en az bir Negatif Kontrol kullanıldığından emin olun. Örnekleri ve kontrolleri yukarı aşağı pipetleme yoluyla Master Mix ile iyice karıştırın. 96 kuyuluk reaksiyon plakasını uygun bir optik yapışkan filmle kapatın ve reaksiyon tüplerini uygun kapaklarla kapatın. 96 kuyuluk reaksiyon plakasını bir mikrotitre plakası rotorunda 30 saniye boyunca yaklaşık 1000 x g (~ 3000 devir/dk) hızında santrifüje edin. Eğer IC örnek hazırlama işlemi sırasında eklenmişse Master Mix şu pipetleme şemasına göre hazırlanır: Reaksiyon Sayısı (rxns) 1 12 Reaksiyon Kurulumu Master Mix 20 µl Örnek veya Kontrol 10 µl Toplam Hacim 30 µl Master A 5 µl 60 µl Master B 15 µl 180 µl Master Mix Hacmi 20 µl 240 µl 16 17

10 9. Gerçek Zamanlı PCR Aletlerini Programlama 9.3 Sıcaklık Profili ve Boya Alma Farklı gerçek zamanlı PCR aletlerinin kurulumu ve programlanması hakkında temel bilgi için lütfen ilgili aletin kılavuzuna başvurun. ürününün belirli gerçek zamanlı PCR aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun. 9.1 Ayarlar Sıcaklık profili ve boya alınmasını tanımlayın: Revers Transkripsiyon Evre Döngü Tekrarı Alma Sıcaklık Zaman Tutma 1-55 C 20:00 dk Denatürasyon Tutma 1-95 C 02:00 dk Şu ayarları tanımlayın: - 95 C 00:15 dk Amplifikasyon Döngüleme C 00:45 dk Ayarlar - 72 C 00:15 dk Reaksiyon Hacmi 30 µl Rampa Hızı Pasif Referans 9.2 Floresan Detektörleri (Boyalar) Floresan detektörleri (boyalar) tanımlayın: Varsayılan Yok 10. Veri Analizi Belirli gerçek zamanlı PCR aletlerinde veri analizi hakkında temel bilgi için lütfen ilgili aletin kılavuzuna başvurun. ürününün farklı gerçek zamanlı PCR aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun. Saptama Detektör Adı Reporter Quencher Ebolavirüse spesifik RNA Ebolavirüs FAM (Yok) Marburg virüsüne spesifik RNA Marburg virüsü Cy5 (Yok) Dahili Kontrol IC JOE (Yok) 18 19

11 10.1 Diagnostik Test Çalışmalarının Geçerliliği 10.2 Sonuçların Yorumlanması Geçerli Diagnostik Test Çalışması Geçerli bir diagnostik test çalışması için şu kontrol koşulları karşılanmalıdır: Örnek Kimliği FAM Saptama Kanalı Cy5 Saptama Kanalı JOE Saptama Kanalı Sonuçların Yorumlanması Kontrol Kimliği FAM Saptama Kanalı Cy5 Saptama Kanalı JOE Saptama Kanalı A POZİTİF NEGATİF POZİTİF* Ebolavirüse spesifik RNA saptandı. Pozitif Kontrol Ebolavirüs POZİTİF NEGATİF POZİTİF B NEGATİF POZİTİF POZİTİF* Marburg virüsüne spesifik RNA saptandı. Pozitif Kontrol Marburg virüsü NEGATİF POZİTİF POZİTİF Negatif Kontrol NEGATİF NEGATİF POZİTİF C NEGATİF NEGATİF POZİTİF Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA saptanmadı. Örnek, Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA'yı saptanabilir miktarlarda içermiyor Geçersiz Diagnostik Test Çalışması Bir diagnostik test çalışması şu durumlarda geçersizdir: (i) çalışma tamamlanmadıysa veya (ii) geçerli bir diagnostik test çalışması için kontrol koşullarından herhangi biri karşılanmadıysa. Geçersizbir diagnostik test çalışması durumunda testi kalan saflaştırılmış nükleik asitleri kullanarak tekrarlayın veya orijinal örneklerle tekrar başlayın. D NEGATİF NEGATİF NEGATİF PCR inhibisyonu veya reaktif hatası. Testi orijinal örnekten tekrarlayın veya yeni bir örnek toplayın ve test edin. * JOE saptama kanalında Dahili Kontrolün saptanması, FAM saptama kanalı veya Cy5 saptama kanalında pozitif sonuçlar için gerekli değildir. Örnekte yüksek filovirüs yükü azalmış veya bulunmayan Dahili Kontrol sinyallerine neden olabilir

12 11. Performans Değerlendirmesi 11.1 Analitik Hassasiyet analitik hassasiyeti, %95 pozitiflik oranıyla saptanabilen Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA molekülleri konsantrasyonu (μl elüt başına kopya) olarak tanımlanır. Analitik hassasiyet, bilinen konsantrasyonda MARV Popp, SEBOV Gulu ve ZEBOV Gabon 2003 için spesifik in vitro transkriptlerin (İVT) dilüsyon serilerinin analiziyle belirlenmiştir. MARV Popp, ZEBOV Gabon 2003 ve SEBOV Gulu için %95 LoD (saptama limiti) hesaplanması için oluşturulan veriler sırasıyla aşağıda Tablo 1, 2 ve 3'te özetlenmiştir. Tablo 1: MARV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR sonuçları, MARV Popp Tablo 2: ZEBOV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR sonuçları, Giriş Kons. [kopya/µl] Replikat Sayısı ZEBOV Gabon 2003 Pozitif Sayısı Belirlenme Oranı [%] Dahili Kontrol 31, Geçerli Geçerli 3, Geçerli 1, ,7 Geçerli 0, ,3 Geçerli 0, ,3 Geçerli 0, ,3 Geçerli 0, Geçerli NTC Geçerli Giriş Kons. [kopya/µl] Replikat Sayısı Pozitif Sayısı Belirlenme Oranı [%] Dahili Kontrol 31, Geçerli Geçerli 3, Geçerli 1, Geçerli 0, ,7 Geçerli 0, ,7 Geçerli 0, Geçerli 0, ,3 Geçerli NTC Geçerli 22 23

13 Tablo 3: SEBOV spesifik RNA analitik hassasiyeti hesaplamak için kullanılan RT-PCR sonuçları, Giriş Kons. [kopya/µl] Replikat Sayısı SEBOV Gulu Pozitif Sayısı Belirlenme Oranı [%] Dahili Kontrol 31, Geçerli Geçerli 3, ,3 Geçerli 1, ,3 Geçerli 0, Geçerli 11.2 Analitik Özgüllük RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kitinin analitik özgüllüğü oligonükleotidlerin (primerler ve problar) kapsamlı bir şekilde seçilmesiyle sağlanır. Oligonükleotidler tüm bilinen Ebola ve Marburg virüsü varyantlarının saptanacağından emin olmak için sekans karşılaştırma analizi kullanılarak halka açık mevcut sekanslarla kontrol edilmiştir. analitik özgüllüğü Marburg virüsü ve Ebola virüsü ile ilişkili ve/veya benzer belirtilere yol açabilecek farklı patojenlerden ekstraksiyonla alınmış bir genomik RNA/DNA panelinin test edilmesiyle değerlendirilmiştir. 0, Geçerli 0, Geçerli 0, Geçerli NTC Geçerli analitik hassasiyeti Probit analiziyle belirlenmiştir. MARV'a özgül RNA için: 1,16 kopya/μl [%95 güven aralığı: 0,22-11,67 kopya/μl] ZEBOV'a özgül RNA için: 1,39 kopya/μl [%95 güven aralığı: 0,69-5,32 kopya/µl] SEBOV'a özgül RNA için: 6,75 kopya/μl [%95 güven aralığı: 4,25-24,58 kopya/µl]

14 Tablo 4: analitik özgüllüğünü göstermek üzere test edilen organizmalar Tablo 4 devam: analitik özgüllüğünü göstermek üzere test edilen organizmalar Organizmalar FAM (Hedef Ebola) Cy5 (Hedef Marburg) JOE (IC) Organizmalar FAM (Hedef Ebola) Cy5 (Hedef Marburg) JOE (IC) Japon ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli Saint Louis ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli Batı Nil virüsü, NY99 Negatif Negatif Geçerli Batı Nil virüsü, Uganda Negatif Negatif Geçerli Sarı Humma virüsü Negatif Negatif Geçerli Murray Vadisi ensefaliti virüsü Negatif Negatif Geçerli Zika virüsü Negatif Negatif Geçerli Kene ile taşınan ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli Usutu virüsü Negatif Negatif Geçerli Dang virüsü 1 Negatif Negatif Geçerli Dang virüsü 2 Negatif Negatif Geçerli Dang virüsü 3 Negatif Negatif Geçerli Dang virüsü 4 Negatif Negatif Geçerli Hepatit C virüsü Negatif Negatif Geçerli Batı Nil virüsü NY99 D Negatif Negatif Geçerli Hepatit A virüsü Negatif Negatif Geçerli Hepatit E virüsü Negatif Negatif Geçerli CCHFV Afg Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü Nig08-A37 Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü CSF Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü Lib /121 Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü AV Negatif Negatif Geçerli Junin virüsü XJ Negatif Negatif Geçerli Machupo virüsü Carvallo Negatif Negatif Geçerli Sabia virüsü SPH Negatif Negatif Geçerli Guanarito Virüsü INH Negatif Negatif Geçerli VSV Indiana Negatif Negatif Geçerli Rift Vadisi ateşi virüsü MP 12 Negatif Negatif Geçerli Hantaan virüsü Negatif Negatif Geçerli ZEBOV Gabon 2003 Pozitif Negatif Geçerli ZEBOV Mayinga Pozitif Negatif Geçerli ZEBOV 2014/Gueckedou-C05 Pozitif Negatif Geçerli SEBOV Gulu Pozitif Negatif Geçerli TAFV Pozitif Negatif Geçerli RESTV Pozitif Negatif Geçerli MARV Musoke Negatif Pozitif Geçerli MARV Popp Negatif Pozitif Geçerli MARV Leiden Negatif Pozitif Geçerli belirtilen organizmalardan hiçbiriyle reaksiyona girmemiştir

15 11.3 Kesinlik kesinlik verileri, analiz içi değişkenlik (bir deney içinde değişkenlik), analizler arası değişkenlik (farklı deneyler arasında değişkenlik) ve lotlar arasında değişkenlik (farklı üretim lotları arasında değişkenlik) şeklinde belirlenmiştir. verileri ortalama değer, standart sapma, varyans ve varyasyon katsayısı olarak eşik döngüsü (C t ) değerleri temelinde ifade edilmiştir. Örnek başına en az atı replikat, analiz içi değişkenlik, analizler arası değişkenlik ve lotlar arası değişkenlik için analiz edilmiştir. Toplam varyans üç analiz kombine edilerek hesaplanmıştır. Tablo 5: ZEBOV RNA spesifik saptama sisteminin kesinlik verileri Kesinlik Analiz İçi Analizler Arası Lotlar Arası Örnek konsantrasyonu [kopya/μl] Ortalama C t değerleri Standart Sapma Varyans Varyasyon Katsayısı (%) 30 31,56 0,17 0,03 0, ,80 0,12 0,01 0, ,85 0,32 0,10 1, ,07 0,34 0,12 1, ,76 0,40 0,16 1, ,03 0,44 0,20 1,35 Tablo 6: MARV RNA spesifik saptama sisteminin kesinlik verileri Kesinlik Analiz İçi Analizler Arası Lotlar Arası Toplam Varyans Örnek konsantrasyonu [kopya/μl] Ortalama C t değerleri Standart Sapma Varyans Varyasyon Katsayısı (%) 30 30,71 0,27 0,07 0, ,82 0,25 0,06 0, ,86 0,24 0,06 0, ,06 0,32 0,10 0, ,83 0,21 0,05 0, ,03 0,30 0,09 0, ,79 0,23 0,05 0, ,96 0,29 0,09 0,92 Dahili kontrol saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri sırasıyla 30 ve 10 viral hedef kopya içeren örnekler için tablo 7 ve 8'de özetlenmiştir. Toplam Varyans 30 31,70 0,35 0,12 1, ,95 0,38 0,15 1,

16 Tablo 7: IC saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri 30 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile belirlenmiştir Tablo 8: IC saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri 10 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile belirlenmiştir Kesinlik 30 kopya/μl Ortalama C t değerleri Standart Sapma Varyans Varyasyon Katsayısı (%) Kesinlik 10 kopya/μl Ortalama C t değerleri Standart Sapma Varyans Varyasyon Katsayısı (%) Analiz İçi ZEBOV 28,98 0,05 0,00 0,19 MARV 28,90 0,09 0,01 0,32 Analiz İçi ZEBOV 29,09 0,05 0,00 0,17 MARV 29,02 0,07 0,01 0,26 Analizler Arası ZEBOV 29,32 0,36 0,13 1,23 MARV 29,26 0,39 0,15 1,32 Analizler Arası ZEBOV 29,41 0,34 0,12 1,16 MARV 29,34 0,34 0,12 1,17 Lotlar Arası ZEBOV 29,26 0,43 0,19 1,48 MARV 29,22 0,43 0,18 1,47 Lotlar Arası ZEBOV 29,32 0,43 0,19 1,48 MARV 29,28 0,41 0,17 1,40 Toplam Varyans ZEBOV 29,16 0,37 0,14 1,29 MARV 29,11 0,38 0,15 1,31 Toplam Varyans ZEBOV 29,24 0,37 0,14 1,26 MARV 29,19 0,35 0,13 1,

17 12. Sınırlamalar ve Önlemler 13. Kalite Kontrol Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır. Bu analizin uygun şekilde yapılması için iyi laboratuvar uygulamaları şarttır. Kit ve reaksiyon adımlarının bileşenlerinin saflığını korumak için çok dikkatli olunmalıdır. Tüm reaktifler safsızlık ve kontaminasyon açısından yakından izlenmelidir. Herhangi bir şüpheli reaktif atılmalıdır. Testin optimum performansı için uygun numune toplama, taşıma, saklama ve işleme işlemleri gereklidir. Test doğrudan numune üzerinde kullanılmamalıdır. Bu analizin kullanılmasından önce uygun nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerinin kullanılması gerekir. RT-PCR inhibitörlerinin varlığı yalancı negatif veya geçersiz sonuçlara neden olabilir. Testin primer ve/veya problarının kapsadığı virüs genomu hedef bölgelerinde olası mutasyonlar patojenlerin varlığının saptanamamasıyla sonuçlanabilir. Her diagnostik testle olduğu gibi sonuçları tüm klinik ve laboratuvar bulguları dikkate alınarak yorumlanmalıdır. altona Diagnostics GmbH ISO EN sertifikalı Kalite Yönetimi Sistemi uyarınca her lotu tutarlı ürün kalitesini garanti etmek üzere önceden belirlenmiş spesifikasyonlara göre test edilir. 14. Teknik Yardım Müşteri Desteği için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun: e-posta: telefon: +49-(0) Ticari Markalar ve Ret Beyanları RealStar (altona Diagnostics GmbH); Mx 3005P (Stratagene); ABI Prism (Applied Biosystems); LightCycler (Roche); Rotor-Gene, QIAamp (QIAGEN); VERSANT (Siemens); CFX96 (BIO-RAD). Bu belgede kullanılan tescilli isimler, ticari markalar vs. bu şekilde işaretlenmemiş olsalar bile kanunen koruma altında olmadıkları düşünülmez., Avrupa in vitro diagnostik direktifi 98/79/EC uyarınca bir CE işaretli diagnostik kittir. Tüm ülkelerde sağlanmamaktadır altona Diagnostics GmbH; tüm hakları saklıdır

18 16. Sembollerin Açıklaması Notlar In vitro diagnostik tıbbi cihaz Ürün numarası Lot kodu İçindekiler n test/reaksiyon için yeterlidir (rxns) Sıcaklık sınırlaması Versiyon Son kullanma tarihi Dikkat Kullanma talimatına başvurun Üretici 34 35

19 36 37