Alt Ekstremite skemi Reperfüzyonu sonucunda Geliflen Akci er Hasar n n Önlenmesinde Farkl Bir Ajan: FK 506 (Takrolimus)

Transkript

1 Alt Ekstremite skemi Reperfüzyonu sonucunda Geliflen Akci er Hasar n n Önlenmesinde Farkl Bir Ajan: FK 506 (Takrolimus) PREVENTION OF LUNG INJURY BY FK 506 FOLLOWING HIND LIMB ISCHEMIA AND REPERFUSION MODEL IN RATS Dr. Atike Tekeli, Dr. SerdarAkgün, Dr. Ali Civelek, Dr. Selim flbir, Dr. Koray Ak, *Dr. Gamze Demirtafl, *Dr. Serap fiirvanc, *Dr. Serap Arbak, **Dr. lhan Yayl m, Dr. AdnanÇobano lu Marmara Üniversitesi T p Fakültesi Kalp Damar Cerrahisi Ana Bilim Dal, stanbul * Marmara Üniversitesi Histoloji Ana Bilim Dal, stanbul ** stanbul Üniversitesi DETAM, stanbul Özet A m a ç : skemi ve reperfüzyonu takiben doku hasar n n büyük bir bölümü reperfüzyon s ras nda oluflur. Hayvan deneylerinde alt ekstremite iskemi ve reperfüzyonunu takiben nötrofil infiltrasyonuna ve serbest oksijen radikallerine ba l olarak akci erde hasar olufltu u gösterilmifltir. FK506'n n güçlü bir immunosupresif olmas n n yan s ra nötrofil infiltrasyonunu modüle etti i düflünülmektedir. Bu çal flmada s çan alt ekstremite iskemi reperfüzyonunu takiben oluflan akci er hasar n önlemede FK506'n n rolü araflt r lm flt r. Materyal ve Metod: 22, sa l kl, gr a rl nda, erkek, Spraque-Dawley s çana üç gün boyunca farkl dozlarda FK506 ve normal saline solusyonu, intraperitoneal olarak enjekte edilmifltir. Dördüncü gün s çanlar n bilateral alt ekstremitelerine 2 saat boyunca turnike metodu ile iskemi, 2 saat de reperfüzyon uygulanm flt r, sonras nda denekler sakrifiye edilerek akci er dokular ç kar lm fl, biyokimyasal olarak lipid peroksidasyonun son ürünü olan malondealdehyde (MDA) ve konjuge dienler (CD) ile glutathione (GSH) düzeyine bak lm fl histolojik olarak da preperatlar fl k mikroskobu alt nda incelenmifltir. B u l g u l a r : Profilaktik FK506 uygulanan hayvanlarda lipid peroksidasyon ürünü olan MDA düzeyinde istatistiksel olarak azalma saptanm flt r (MDA ± 5.33, p < 0,01). Total GSH ve CD de erlerinde istatistiksel olarak anlaml bir fark tespit edilememifltir. Histopatolojik olarak FK506 alan grupta kontrol grubuna göre nötrofil infiltrasyonu ve akci er hasar bulgular daha az olarak g ö z l e n m i fl t i r. S o n u ç : Akci er dokusunda tesbit edilen düflük MDA seviyeleri FK506 tedavisinin iskemi ve reperfüzyon ile ortaya ç kan serbest oksijen radikallerinin oluflumunu azaltt n düflündürmektedir. Ancak FK506'n n glutathione sistemi üzerine belirgin bir etkisi saptanamam flt r. Anahtar kelimeler: Alt ekstremite, iskemi reperfüzyonu, akci er hasar, FK506 Summary Türk Gö üs Kalp Damar Cer Derg B a c k g r o u n d : The major part of tissue damage occurs upon reperfusion and is mediated by activated neutrophils that release oxygen free radicals. Following hind limb ischemia and reperfusion, injury in the lung due to neutrophil infiltration and oxygen free radicals has been demonstrated in animal models. In addition to being a potent immunosuppressant, FK506 modulates neutrophilic infiltration. To test this effect we looked at the role of FK506 in prevention of lung injury following hind limb ischemia and reperfusion model in rats. M e t h o d s : Twenty-two male Spraque-Dawley rats were randomized to receive FK506 at doses of 0.3 mg/kg/day, 0.5 mg/kg/day, 1mg/kg/day or normal saline via intraperitoneal injections as pretreatment. On the fourth day the animals were subjected to 2 hours of ischemia to their hind limbs using ourniquet method. After 2 hours of ischemia, tourniquets were released and the extremities were reperfused for 2 hours. Lung tissue assays were performed for lipid peroxidation products malondealdehyde (MDA) and conjugated diens (CD), and total glutathione (GSH). Lung tissues were also examined histopathologically under light microscopy. R e s u l t s : Animals that were pretreated with FK506 showed the least lipid peroxidation product (MDA ± 5.33, p < 0.01). To t a l glutathione levels and conjugated dien levels showed no significant difference. Histopathologic examination showed less neutrophil infiltration and less lung tissue damage in the study groups. C o n c l u s i o n : Lower levels of malondealdehyde (MDA) found in lung tissue suggest that pretreatment with FK506 reduces the production of oxygen free radicals that are accelerated by ischemia and reperfusion. There is no significant effect of FK 506 on glutathione system. Keywords: Lower limb ischemia-reperfusion, lung injury, FK506 Turkish J Thorac Cardiovasc Surg Sunuldu u Kongre: 50. European Society of Cardiovascular Surgery Kongresi, 7-11 Haziran, Budapeflte, Dos Santos ödülü Adres: Dr. Atike Tekeli, Marmara Üniversitesi Hastanesi Kalp Damar Cerrahisi Ana Bilim Dal, Tophanelio lu Cad. 13, Altunizade, 81090, stanbul 242

2 Türk Gö üs Kalp Damar Cer Derg Girifl Alt ekstremite iskemi ve reperfüzyonu s k karfl lafl lan ve klinik aç dan önemli bir olayd r. Reperfüzyonla birlikte serbest oksijen radikalleri ve inflamatuar mediatörlerin etksiyle hem lokal hem de sistemik hasar oluflumu bafllam fl olur (1-3). Kan ak m n n yeniden sa lanmas ekstremiteyi kurtarmas na karfl n, multisistem organ disfonksiyonu geliflebilir ve mortaliteye neden o l a b i l i r. Polimorfonükleer lökositler (PMN) iskemi reperfüzyon hasar nda önemli rol oynamaktad rlar. Bu hasar miyokard dokusunda, böbreklerde ve akci erlerde gözlenebilir (4). Akci er dokusu alt ekstremite iskemi reperfüzyon hasar n n en çok etkiledi i hedef org a n d r. Bunun etyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte, reperfüzyon s ras nda baz hümoral mediatörlerin bu hedef organ hasar nda rol oynad düflünülmektedir (5,6). FK506 (Tacrolimus, Prograf Fujisawa CO.) Streptomyces tsukubaensis toprak mantar ndan üretilen immunosupresif bir ajand r. Karaci er, barsak, böbrek ve miyokard iskemi ve reperfüzyon hasar nda FK506'n n etkili oldu u gösterilmifltir [7-10]. FK506 nötrofil infiltrasyonunu modüle eder ve nötrofil agregasyonunu ve hücrelerin adherensini artt ran tumor nekrosis faktör üretimini inhibe eder [11 ]. Bu çal flma FK506 n n profilaktik tedavisinin bilateral alt ekstremite iskemi reperfüzyonu sonras oluflan akci er hasar n korumadaki etkisini araflt rmak amac yla yap lm flt r. Materyal ve Metod Deneysel çal flmam z Marmara Üniversitesi T p Fakültesi Etik Komitesi taraf ndan denetlenmifl ve uygun bulunmufltur. 22, gr, erkek, Spraque-Dawley s çan dört gruba ayr lm fl ve deneklere 3 gün boyunca 0.3 mg/kg/gün, 0.5 mg/kg/gün, 1.0 mg/kg/gün dozlar nda FK506 ve normal saline solusyonu intraperitoneal olarak enjekte edilmifltir (Tablo 1). Dördüncü gün hayvanlara intraperitoneal olarak ketamine hydrochloride (Ketalar, Parke-Davis) 100 mg/kg enjekte edilerek uyutulmufl ve bilateral alt ekstremiteleri trafllanm flt r. Tüm hayvanlar n bilateral alt ekstremitelerine turnike metodu uygulanarak 2 saat boyunca iskemi uygulanm fl, arteriyal ak m n kayboldu u doppler USG yoluyla doppler sinyallerinin al namamas ile gösterilmifltir. 2 saat sonra turnikeler aç larak 2 saat boyunca reperfüzyon yap lm fl, arteryal ak m n kontrolü yine doppler USG ile yap lm flt r. Dördüncü saatin sonunda hayvanlara yüksek doz thiopental (Pentothal Sodyum, Fako) enjekte edilerek sakrifikasyon yap lm fl ve median sternotomi ile akci er dokusu ç kar larak histopatolojik ve biyokimyasal (MDA, CD, GSH düzeyleri) analiz yap lm flt r. Biyokimyasal Analiz: Akci er dokular s v nitrojende dondurulmufl ve ölçümler bafllayana kadar -80 C' de saklanm flt r. 20 micron kal nl ndaki preperatlar haz rlanm fl ve tüm gece boyunca vakumla kurutulmufltur (20 C'de). Dondurulup kurutulmufl preperatlar -20 C'de saklanm flt r. Tablo 2. Malondealdehyde (MDA) mean de erleri (nmol/mg). P de erleri kontrol ve çal flma gruplar aras ndaki fark göstermektedir. NS, istatistiksel olarak anlaml de il. Tablo 3. Konjuge dien mean de erleri (_mol/mg). NS, istatistiksel olarak anlaml de il. Tablo 4. Glutathione (GSH) mean de erleri (nmol/mg). NS, istatistiksel olarak anlaml de il. Tablo 1. Çal flma gruplar, FK506 dozlar. Gruplar FK506* dozu n Grup 1** - 5 Grup mg/kg/gün 6 Grup mg/kg/gün 6 Grup mg/kg/gün 5 * FK506 alt ekstremite iskemi ve reperfüzyonu öncesi 3 gün boyunca intraperitoneal olarak enjekte edilmifltir. ** Kontrol grubu, bu gruba sadece normal saline solusyonu enjekte edilmifl ve alt ekstremite iskemi ve reperfüzyonu uygulanm flt r. 243

3 Doku Malondealdehyde Çal flmas : Akci er dokusunda lipid peroksidasyon çal flmas, lipid peroksidasyonunu son ürünü olan MDA d ü z e y i n i n ölçülmesiyle yap lmaktad r. Homogenatlar 20mg dondurulup kurutulmufl dokuya % butylated hydroxytoulene ve % 0.07 sodyum dodecyl sulfate içeren 1.5ml so uk saline solusyonu oran nda, Potter tipi cam homogenizer kullan larak yap lm flt r. Butylated hydroxytoulene saline solusyonu her kullan mdan 10 dakika önce nitrojen gaz na tabi tutulmufltur. Homojenat ethanol chloroform (3:2) ile y kan r ve hemoglobin u z a k l a fl t r l r. MDA thiobarbitürik asid ile kalorimetrik reaksiyonla çal fl l r ve konsantrasyonu nmol/mg protein olarak ölçülür. Glutathione Çal flmas : Dokudaki glutathione düzeyi nmol/mg olarak Ellman'a göre çal fl lm flt r [18]. Konjuge Dien Çal flmas : Konjuge dienlerin oluflumu spektrofotometre ile 250 C'de 234nm (A234)' deki absorbans n artmas ile belirlenir [19]. Histopatolojik Çal flma: Spesimenler % 10 formalin ile fikse edilerek parafine gömülmüfl ve 4 mikron kal nl nda kesiler al n p hematoksilin ve eosin ile boyanm flt r. Bütün örnekler fl k mikroskopisi alt nda incelenmifltir. statistiksel Çal flma: De erler mean ± Standart Deviasyon (SD ) olarak belirtilmifltir. Kruskal Wallis nonparametrik ANOVA ve Dunn's multiple comparison testleri çal flma ve kontrol grubunu karfl laflt rmak için kullan lm fl ve p de eri < 0.05 ise anlaml olarak kabul edilmifltir. Resim 1. Kontrol grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, alveolar yap n n bozuldu u,interstisyel ve periarteriyal ödem gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X 66. Resim 2. Kontrol grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, artm fl lökositik infiltrasyon gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X 66. Resim 3. 1mg / kg / gün FK506 alm fl çal flma grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, kontrol grubuna göre daha az periarteryal ve interstisyel ödem ve daha az bozulmufl alveoler yap ile daha az nötrofil infiltrasyonu gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X 66. Resim mg / kg / gün FK506 alm fl çal flma grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, kontrol grubuna göre daha az bozulmufl alveoler yap ile daha az nötrofil infiltrasyonu gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X

4 Türk Gö üs Kalp Damar Cer Derg Resim mg / kg / gün FK506 alm fl çal flma grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, normale yak n alveolar yap ve az say da nötrofil infiltrasyonu gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X 66. Bulgular Biyokimyasal Bulgular: FK506 verilen hayvanlarda lipid peroksidasyon ürünü olan M D A düzeyinde azalma tesbit edilmifl ve bu azalma istatistiksel olarak anlaml bulunmufltur (Tablo 2). Total glutathione ve konjuge dien düzeyleri aç s ndan çal flma ve kontrol gruplar aras nda anlaml bir fark saptanmam flt r (Tablo 3-4). Histopatolojik Bulgular: Farkl dozlarda FK506 alan çal flma grubunun fl k mikroskopisinde nötrofil infiltrasyonunda azalma tesbit e d i l m i fl t i r. Daha az intraalveolar kanama, kan damarlar etraf nda daha az ödem ve intraalveolar septum kal nl normale yak n olarak gözlenmifltir. Ancak kontrol grubunda (normal saline solusyonu alan grup) alveolar yap tamamen b o z u l m u fl t u r. Alveolar septa kal nlaflm fl ve interstisyel ödem tesbit edilmifltir. Alveoller etraf nda büyük odaklar oluflturan lökositik infiltrasyon, intraalveoler fibrin depozitleri ve intraalveoler kanama büyük boyutta bir akci er hasar n n g ö s t e rgesidir (Resim 1-6). Ta r t fl m a skemi reperfüzyon hasar n n temelinde reperfüzyon esnas nda dokunun oksijenasyonu sonucu ortaya ç kan oksijen radikalleri bulunmaktad r [1]. Reperfüze olmufl doku serbest oksijen radikalleri oluflumuna ba l nekrotik de ifliklikler gösterebilir. Reaktif oksiradikaller birçok kaynaktan sal nabilir, bunlar n aras nda en önemli olan ise aktive olmufl nötrofillerdir [11 ]. skemi reperfüzyon hasar nda nötrofillerin rolü genifl olarak çal fl lm fl ve bu rolün önemi vurgulanm flt r [6,12,13]. Reperfüzyonu takiben oluflan akci er hasar ndaki en önemli patolojik olay, aktive nötrofiller taraf ndan sal nan serbest radikallerin neden oldu u endotel hücre hasar d r [14]. Plasmada bulunan proinflamatuar ajanlardan kompleman faktörleri, sitokinler (IL-6, IL-8, TNF), platelet activating faktör ve lökotrienler de endotel hücre hasar na sebep olmaktad r [20,21]. Pulmoner vasokonstriksiyon, hipertansiyon, ve artm fl pulmoner vasküler geçigenlik endotel hücre fonksiyonu Resim mg / kg / gün FK506 alm fl çal flma grubu akci er dokusu fl k mikroskopisi resmi, alveolar duvar yapan hücrelerin normale yak n dizilimi gösterilmifltir. Hemotoxylin ve eosin boyamas. Büyütme X 132. bozulmas n n en s k görülen sonuçlar d r [4]. Bu nedenle akci er hasar n n oluflumunu engellemek için yap lmas gereken en önemli fley nötrofil infiltrasyonunun önlenmesidir [15]. FK506 (Tacrolimus) güçlü bir immunosupresif olmas n n yan s ra enflamasyon s ras nda nötrofil infiltrasyonunu da modüle etmektedir [16]. M D A lipid peroksidasyonun son ürünüdür ve bu çal flmada lipid peroksidasyonunun ciddiyetini tesbit etmek için kullan lm flt r. Çal flmam zda s çanlar n bilateral alt ekstremitelerinde oluflturulan iskemi ve reperfüzyon akci er dokusunda MDA seviyelerinin yükselmesine sebep olmufltur. Kontrol grubundaki artm fl MDA düzeyleri, histolojik çal flmada tespit edilen nekroz ve artm fl nötrofil infiltrasyonu ile iyi bir korelasyon g ö s t e r m i fl t i r. Kontrol grubunda gözlenen MDA d ü z e y l e r i FK506 verilen gruplarda belirgin olarak azalm flt r. FK506' n n doku hasar n önlemedeki etkisi, büyük olas l kla nötrofil kemotaksisini, infiltrasyonunu ve faktör sal n m n inhibe etmesine ve serbest oksijen radikallerinin sal n m n azaltmas na ba l d r. Ancak mekanizma tam olarak a ç k l a n a m a m fl t r. FK506' n n nötrofil infiltrasyonunu, sitokin ve lenfokinlerin sal n m na olan etkisi ile modüle etti i düflünülmektedir [8,15,17]. Bu çal flmada doku GSH düzeyleri de ölçülmüfl ancak FK506 'n n glutathione sistemi üzerine belirgin bir etkisi tespit e d i l e m e m i fl t i r. Bu da bize FK506' n n intraselüler koruma etkisinin glutathione sisteminden farkl bir sistem üzerinden olabilece ini düflündürmüfltür. Bu hipotezi do rulamak için daha fazla çal flmaya gerek vard r. Histopatolojik olarak lökositik infiltrasyon aç s ndan çal flma gruplar nda kontrol grubuna göre belirgin bir azalma g ö z l e n m i fl t i r. Sonuç olarak, histopatolojik incelemede gözlenen artm fl nötrofil infiltrasyonu ve dokuda artm fl MDA düzeyleri doku hasar ile nötrofil infiltrasyonu ve serbest radikal oluflumu aras nda yak n bir iliflkiyi düflündürmektedir. Çal flmam z n sonuçlar na göre alt ekstremite iskemi ve reperfüzyonu ile iliflkili akci er hasar n n FK506 kullan m ile düzeldi i ve uzak o rgan hasar na neden olan nötrofil infiltrasyonunun engellendi i saptanm flt r. Ancak kesin etki mekanizmas n n tesbiti için ileri çal flmalara ihtiyaç vard r. *Bu deneysel çal flma Fujisawa CO taraf ndan desteklenmifltir. 245

5 Kaynaklar 1. Prem JT, Eppinger M, Lemmon G, Miller S, Nolan D, Peoples J.The role of glutamine in skeletal muscle ischemia/reperfusion injury in the rat hind limb model. Am J Surg 1999;178: Klausner Jm, Paterson IS, Valeri R, Hechtman HB. Limb ischemia induced increase in permeability is mediated by leucocytes and leukotriens. Ann Surg 1988;208: Klausner JM, Paterson IS, Kozbik L, Valeri R, Shepro D, Hechtman HB. Oxygen free radicals mediate ischemiainduced lung injury. Surgery 1989;105: Bengisun U, Koksoy C, Bengisun JS, Bayraktaroglu G, Camur A, Aras N. Ischemia and reperfusion injury: prevention of pulmonary hypertension and leukosequestration following lower limb ischemia. Prostagland Leukot Essent Fatty Acids 1997;56: Fantini GA, Conte MS. Pulmonary failure following lower torso ischemia: clinical evidence for remote effect of reperfusion injury. Am J Surg 1995;61: sbir S, Akgün S, Ak K, Zeybek Ü, Ayd n M, Civelek A, Tekeli A, Çobano lu A. Akut alt ekstremite iskemi/ reperfüzyon hasar n n akci er serbest oksijen radikalleri üzerine olan etkisi. TGKDCD 2000;8:2, Dhar Dk, Nagasue N, Kimoto T, et el. The salutary effect of FK506 in ischemia reperfusion injury of the canine liver. Transplantation 1992;54: Kubes P, Hunter J, Granger DN. Effects of cyclosporine A and FK506 on ischemia reperfusion injury induced neutrophil infiltration in the cat. Dig. Dis. Sci. 1991;36: Sakr M, Zetti G, McClain C, et al. The protective effect of FK506 pretreatment against renal ischemia reperfusion injury in rats. Transplantation 1992;53: Nishinaka Y, Sugiyama S, Yokota M, et el. Protective effect of FK506 on ischemia reperfusion induced myocardial damage in canine heart. J Cardiovasc Pharmacol 1993;21: Cetinkale O, Bilgic L, Bolayirli M, Sengul R, Ayan F, Burcak G. Involvement of neutrophils in ischemia reperfusion injury of inguinal island skin flaps in rats. Plast Reconstr Surg 1998;102: Lee C, Kerrigan CL, Tellado JM. Altered neutrophil function following reperfusion of an ischemic myocutenous flap. Plast Reconstr Surg 1992;89: Cetinkale O, Bilgic L, Ayan F, Kandilci A. Neutrophil mediated injury ischemic skin flaps: Ameloration of ischemic injury by cyclosporine in the rat. Ann Plast Surg 1996;37: Messent M, Griffiths MJD, Evans TW. Pulmonary vascular reactivity and ischemia reperfusion injury inthe rat. Clin Sci. 1993;85: Reilly PM, Schiller HJ, Bulkley GB. Pharmacologic approach to tissue injury mediated by free radicals and other reactive oxygen metabolites. Am J Surg 1991;161: Cetinkale O, Konukoglu D, Senel O, Kemerli GD, Yazar S. Modulating the functions of neutrophils and lipid peroxidation by FK506 in a rat model of thermal injury. Burns 1999;25: Kawano K, Kim YI, Goto S, Ono M, Kobayashi M. A protective effect of FK506 in ischemically injured rat livers. Transplantation 1991;52: Ellman GL. Tissue sulphydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959;82: Julier K, Maekness MI, Dean JD, Durington PN. Susceptibility of low and high density lipoproteins from diabetic subjects to in vitro oxidative modification. Brit Diab Assoc Diab Med 1999;16: Graeme MR. Ischaemia / reperfusion, inflammatory responses and acute lung injury. Thorax 1997;52: Tilney Nl, Paz D, Ames J, Gasser M, Laskowski I, Hancock W W. Ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 2001;33: