T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 T.C. GAZİSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ TARIMSAL ATIKLARDAN ENZİMATİK YLLA KSİLLİGSAKKARİT ÜRETİMİ Şeyda BSTANCI TKAT 2009 Her hakkı saklıdır

2 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ... vii ŞEKİLLER DİZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ...ix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Türkiye de Üretilen Tarımsal Atıklar Lignoselülozik Materyaller ve Özellikleri Selüloz Lignin Hemiselüloz Hemiselülozun kaynağına göre yapısı Hemiselülozun eldesi ve uygulanan ön işlemler Hemiselülozu parçalayan enzimler ve bunların üreticileri Hemiselülozun ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları Ksilooligosakkaritler Ksilooligosakkaritlerin sağlık açısından önemleri Ksilooligosakkaritlerin fiziksel özellikleri ve kullanım alanları Ksilooligosakkaritlerin elde edilme yöntemleri tohidroliz Enzimatik hidroliz Asit hidroliz Ksilanazlar Endoksilanazlar iv

3 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Yöntem Atıkların Karakterizasyonu Nem Kül Lignin Selüloz Ksilan Çözünürlükler Soğuk suda çözünürlük Sıcak suda çözünürlük Alkol-benzen çözünürlük Diklorometanda Çözünürlük Atık Ksilanın Karakterizasyonu Üronik asit Şeker kompozisyonu Ksilanın Büyük Ölçekte Özütlenmesi Ksilanların Enzimle Hidrolizasyonu Bradford metodu ile enzimin protein miktarını belirleme Ksilanaz aktivitesi Enzimatik hidrolizasyon İndirgen Şeker TLC İstatiksel Analiz BULGULAR ve TARTIŞMA Atıkların Karakterizasyonu Atık Ksilanın Karakterizasyonu Ksilanın Özütlenmesi Ksilanın Enzimle Hidrolizasyonu Enzimin Ksilanaz Aktivitesi ph Değeri ve Hidrolizasyon v

4 Sıcaklık Derecesi ve Hidrolizasyon Enzim Konsantrasyonu ve Hidrolizasyon Substrat Konsantrasyonu ve Hidrolizasyon Süre ve Hidrolizasyon SNUÇ KAYNAKLAR EKLER EK EK EK EK ÖZGEÇMİŞ vi

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi TARIMSAL ATIKLARDAN ENZİMATİK YLLA KSİLLİGSAKKARİT ÜRETİMİ Şeyda BSTANCI Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman : Yrd. Doç. Dr. Özlem AKPINAR Ksilooligosakkaritler (Kler), ksiloz içeren oligosakkaritlerdir ve genellikle tarımsal atıklardan alkali ortamda izole edilen ksilanın hidrolizasyonu ile elde edilirler. Bu çalışmada tarımsal atıklardan ayçiçeği, buğday, pamuk ve tütün sapları ksilooligosakkarit üretimi için kullanılmıştır. Öncelikle atıkların nem, kül, selüloz, lignin, ksilan içerikleri ve farklı çözgenlerde çözünebilirlikleri belirlenmiştir. İncelenen atıkların nem içerikleri %4-6, kül içerikleri %3-7, selüloz içerikleri %32-44, ksilan içerikleri %19-29, soğuk suda çözünürlükleri %4-9, sıcak suda çözünürlükleri %7-12, diklorometanda çözünürlükleri %1-6, alkol-benzende çöüznürlükleri %1-6 arasında bulunmuştur. Ayçiçeği, buğday, pamuk ve tütün saplarından alkali ile elde edilen ksilanların %85-95 ksiloz, %3-15 glükoz ve %7-12 arasında üronik asit içerdikleri bulunmuştur. Ayrıca buğday saplarından elde edilen ksilanın bütün bunlara ek olarak %11 civarında arabinoz içerdiği belirlenmiştir. Elde edilen ksilanlar Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolize edilerek ksilooligosakkarit üretilmiştir. Ksilooligosakkarit verimi üzerine ph, sıcaklık, hidroliz periyodu, substrat konsantrasyonu ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelenmiştir. ptimum hidroliz koşulları 4 U/mL enzim konsantrasyonu, 50 C, 30 dakika, ph 4,6 ve %2 ksilan konsantrasyonu olarak belirlenmiştir. T. longibrachiatum ksilanazının diğer ksilanlara göre en iyi, dallı yapıdaki buğday arabinoksilanını hidrolize ettiği saptanmıştır. TLC analizi T. longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizlenen ksilanların hidroliz ürünlerinin farklı miktarlarda oligosakkaritler (X2, X3, X4, X5, X6 ve X7) ile monosakkaritlerden oluştuğunu göstermiştir. Çalışmada kullanılan bütün ksilanlar yapıdaki farklılıklara bakılmaksızın farklı polimerizasyon derecesine sahip K üretmiştir. 2009, 68 sayfa Anahtar Kelimeler: Ksilooligosakkaritler, ksilan, ayçiçek sapları, buğday sapları, pamuk sapları, tütün sapları i

6 1.GR Ksilooligosakkaritler (Kler), β(1-4) baıyla balanmı ksiloz ünitelerinden olumaktadır. laç sanayiinde, hayvan yemlerinde ve gıdalarda prebiyotik olarak kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda fonksiyonel gıdaların öneminin artması ile popüler bir gıda katkı maddesi olmutur. Bunlar, sindirim sistemi tarafından parçalanmadıı için genelde prebiyotik olarak da adlandırılmaktadır ve salık açısından da pek çok yararları vardır (Erdoan ve Akpınar, 2008). Kler, sindirilemeyen oligosakkaritler olarak sınıflandırılmaktadır. Bunlar, ksiloz monomerleri arasındaki baın konfigürasyonunda olmasından dolayı insan sindirim enzimleri (amilaz, -glikozidaz, maltaz, sükraz) tarafından hidrolizasyona dayanıklıdır. Sindirim sistemi tarafından hidrolize ve absorbe edilmediinden baırsakta yaayan bakterilere substrat olarak hizmet ederler. Baırsak mikroflorasını daha salıklı bir kompozisyona doru deitirirler. Kolesterol seviyesini düürebilme ve kalsiyumun kullanılabilirliini arttırma gibi özelliklere sahiptir. Aynı zamanda kısmen tatlı, ph ve sıcaklık deiimlerine karı stabil, su tutma kapasitesi yüksek bir üründür ve gıdaların donma noktasını deitirebilme gibi etkiye sahip fonksiyonel birer oligosakkarittir (Voragen, 1998; Ebringerova ve ark., 2000; Roberfroid, 2000; Vazquez ve ark., 2000; Alonso ve ark., 2003; Moure ve ark., 2006; Erdoan ve Akpınar, 2008). Kler doal olarak meyveler, sebzeler, bambu filizleri, bal ve sütte bulunmalarına karın, ekmek ve bira yapımında doal olarak üretilirler; ancak bu kaynaklardan elde edilmesi yüksek maliyetli ve düük verimli olmasından dolayı, ekonomik deildir. Endüstriyel olarak ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden üretilirler (Vazquez ve ark., 2000). Lignoselülozik doaya sahip olan tarımsal atıklar etanol, glikoz, ksiloz, ksilitol ve ksilooligosakkaritler gibi çeitli kimyasalların üretimi için, yenilenebilir bir kaynak olarak kullanılabilirler. Uygun bir lignoselülozik materyalden elde edilen ksilan; enzim, asit ve ısı ile hidroliz (otohidroliz) edilerek Kler üretilebilir (Erdoan ve Akpınar, 2008).

7 2 Ksilooligosakkaritlerin elde edilmesi oldukça zahmetli ve pahalıdır; ancak bunların yaygın olarak kullanılması, bunların ucuz bir kaynaktan toksik bileikler oluumuna izin vermeden, verimli bir biçimde üretilmesine balıdır. Ksilanın asit ile hidrolizi esnasında Klerin yanında furfural gibi istenmeyen bileiklerin de elde edilmesi söz konusudur. Isı ile hidroliz (otohidroliz) de ise Kler ksilan özütlenmesine ihtiyaç duymadan direkt olarak lignoselülozik materyallerden üretilmektedir; ancak bu yöntemde de hidroliz olayının daha ileri giderek furfural gibi istenmeyen maddeler oluturma riski vardır. Enzimle hidroliz daha spesifik ve ılımlı koullarda gerçekletii için ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadıı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olumamaktadır. Ayrıca enzimatik hidrolizde, enerji ihtiyacı da daha düüktür; ancak enzimatik yolla üretilen Klerin polimerizasyon derecesi ve verimi kullanılan enzim kaynaına ve ksilan kaynaına balı olarak deimektedir (Erdoan ve Akpınar, 2008). Türkiye de yılda yaklaık 55 milyon ton tarımsal atık üretilmektedir (Anonim, 2007a). Üretilen bu atıklar, çounlukla ya yakılmakta ya da tarlada çürümeye bırakılmaktadır. Bunlar hayvan yemi olarak deerlendirilebilir; fakat bu kullanım önemli bir ekonomik deere sahip deildir. Günümüzde artan çevresel endieler, bu bol bulunan tarımsal atıkların çevreye dost teknolojilerle ortadan kaldırılmaları üzerine odaklanılmasına sebep olmutur (Erdoan, 2007). Bu materyallerin deeri daha yüksek bir ürüne dönütürülmesi hem bu atıkların uygun bir ekilde ortadan kalkmasına sebep olacak, hem de çiftçiye ek bir gelir sunacak ve kırsal alanlarda i imkanı yaratacaktır. Laboratuvarımızda yapılan daha önceki çalımalarda, Aspergillus niger den elde edilen ksilanaz ile tütün saplarının (Erdoan, 2007) ve pamuk saplarının (Akpinar ve ark., 2007), K üretimi için kullanılabilir olduu gösterilmitir. Bu aratırmada ise bu atıklar ve bunlara ek olarak buday ve ayçiçei saplarından Trichoderma longibrachiatum dan elde edilen ksilanaz ile K üretimi yapılmıtır. Aratırma kapsamında, yukarıda adı geçen atıklardan elde edilen ksilanlardan üretilen K profili ve verimi karılatırılmıtır.

8 2. KAYNAK ÖZETLER 2.1. Türkiye de Üretilen Tarımsal Atıklar Tarımsal atıklar; bitkisel üretim, hayvansal üretim ve tarım ürünlerinin ilenmesi sonucunda açıa çıkan atıklardır. Yaygın bir ekilde bulunan bu atıklar, taıma ve içilik maliyetleri nedenleri ile toplanıp deerlendirilememektedir. Tarlada kalan tarımsal atıklar (mısır sapı, yulaf sapı, eker kamıı, pamuk sapı, mısır sapı, ayçiçei sapı, saman ve tütün sapı vb.,) hayvan yemi veya yakacak olarak deerlendirilebilmekte; ancak bu kullanımların önemli bir ekonomik deeri yoktur (Öztürk ve Baçetinçelik, 2006). Genellikle, atıklar ya tarlalarda çürümeye bırakılmakta ya da yakılmaktadır. Bu tip uygulamaların hem ekosistem, hem de insan salıı için olumsuz etkileri vardır. Türkiye de üretilen tarımsal ürünlerden, yaklaık olarak yıllık toplam milyon ton tarımsal atık olumaktadır. Tarımsal üretim ve oluan tarımsal atık verileri Çizelge 2.1 de verilmitir (Öztürk ve Baçetinçelik, 2006). Buna göre en fazla üretilen tarımsal ürünler sırası ile 22,4 milyon tonla buday, 8,32 milyon tonla arpa, 2,29 milyon tonla pamuk, 2,20 milyon tonla mısırdır ve bunu ayçiçei izlemektedir. Üretim miktarlarına balı olarak da Türkiye de en fazla atık bırakan tarımsal ürünler buday, arpa, pamuk, mısır ve ayçiçeidir. Çalımamızı yürüttüümüz il olan Tokat ta üretilen tarımsal ürünler ve oluan atık miktarları ise Çizelge 2.2 de verilmitir (Anonim, 2007a; Erdoan, 2007). Buna göre en fazla üretilen tarımsal ürünler sırası ile 368 bin tonla buday, 70,8 bin tonla arpa, 17 bin tonla mısır ve 5 bin tonla tütündür. Yine atık miktarı da üretilen ürün miktarlarına balı olarak en fazla buday, mısır, arpa ve tütündedir. Bölgede ayçiçei üretimi dier ürünlere göre fazla olmasa da atık bakımından tarımsal ürünler arasında beinci sıradadır.

9 4 Çizelge 2.1. Türkiye yıllık tarla ürünleri üretim ve atık miktarları (Öztürk ve Baçetinçelik, 2006). Ürünler Atıklar Üretim (ton) Alan (ha) Toplam Atıklar (ton) Buday Saman Arpa Saman Çavdar Saman Yulaf Saman Mısır Sap Pirinç Saman Tütün Sap Pamuk Sap Ayçiçei Sap Çizelge 2.2. Tokat ili yıllık tarla ürünleri üretim ve atık miktarları (Anonim, 2007a; Erdoan, 2007). Tarla Ürünleri Üretim (ton) Alan (ha) Toplam Atık (ton) Buday Tütün Ayçiçei Arpa Çavdar Yulaf Mısır Soya Pirinç Lignoselülozik Materyaller ve Özellikleri Lignoselülozik materyaller (LM), çeitli tarımsal atıklar (sap, saman, kabuk gibi), her yıl yapraklarını döken aaçlar ve ine yapraklı (kozalaklı) aaçlar, kentsel katı atıklar (kaıt ve aaç ürünleri), kaıt ve pulp endüstrisi atıkları ile otsu bitkilerden olumaktadır. Bu materyallerin kompozisyonları kaynaına göre deimektedir; ancak

10 5 temel olarak selüloz (%35-50), hemiselüloz (%20-35) ve lignin (%10-25) den oluur. LM nin dier bileenleri proteinler, yalar ve küldür (Saha, 2003). ekil 2.1 de LM nin yapısı gösterilmektedir. Hemiselülozun büyük bir çounluunu oluturan ksilan, kovalent ve kovalent olmayan balarla hücre duvarının yapısal bütünlüünde önemli rol oynamaktadır. Bitki hücre duvarında ksilan veya hemiselüloz, lignin ve selüloz arasındadır. Ksilanın önünde lignin bariyeri mevcuttur ve lignin ksilanın 4--metil-Dglikoronik asit birimlerine ester baları ile balıdır (Beg ve ark., 2001; Saha, 2003 ve 2005; Butt ve ark., 2008). Deerinin düük olması, bol bulunması ve kolay elde edilmesi sebepleri ile LM önemli bir biyokütle kaynaıdır ve geni ölçekte yakıt ve kimyasal üretiminde kullanım potansiyeline sahiptir (Yang ve ark., 2007). ekil 2.1. Lignoselülozik biyokütlenin polimer yapısı (Ramirez, 2008).

11 Selüloz Selüloz, yüksek bitkilerin hücre duvarının ana yapı taıdır. Sebzeler ve tahıl ürünleri gibi birçok lifli gıdanın kuru aırlıının %20-50 sini oluturur. Selüloz, bitki hücre duvarında hemiselüloz ve ligninle birlikte bulunur. Ana zinciri den fazla -D- (1,4)- balı glikopiranozil birimlerini içerir ve düz bir zincir yapısına sahiptir. ekil 2.2 de selülozun kimyasal yapısından da görüldüü gibi, selülozda fonsiyonel gruplar hidroksil (-H) gruplarıdır. Bu -H grupları birbirleri e veya -, N-, S- grupları ile hidrojen baı olutururlar (Ramirez, 2008). Selülozun molekül aırlıı, bitkinin yetitii yer ve bitki çeidine göre deiir. Uzayan molekül, düz erit formundadır ve moleküller içi ve moleküller arası hidrojen baları ile birbirine balıdır. Doal selüloz, bütün bu düzenli kristal yapıyla beraber kristal olmayan (amorf) bölgelerden de olumutur. Amorf selülozun suyu hızlı bir ekilde absorbe etme yetenei vardır. Bu yetenek bitkiye yapısal dayanıklılık, esneklikte artı ve kırılmalara karı direnç salar. Selüloz, higroskopik (nem çekici) bir materyaldir, suda çözünmez fakat su, zayıf asit ve birçok çözücüde iebilir (Shelton ve Lee, 2000). H 4 H H H H H H 1 H H 4 H H H H H H H 1 H 4 H H H H H H H 1 4 H H H H H 1 H H H H Selobiyoz Glukoz ndirgen uç ekil 2.2. Selülozun kimyasal yapısı. Selüloz, birçok alanda kullanılmaktadır. Selülozdan termokatalitik ilemlerle elde edilen mikrokristal selüloz; farmakoloji, kozmetik ve gıda sanayiinde kullanılmaktadır. Mikrokristal selüloz, asit hidrolizi ile selülozun amorf bölgelerinin çıkartılması ile elde edilir. Toz formda dolgu maddesi, diyet amaçlı gıda ve tıbbi tabletlerde balayıcı, jel

12 7 formda viskoziteyi düzenleyici, pasta ve krema gibi ürünlerde emülsifiye edici olarak kullanılmaktadır (Laka ve Chernyavskaya, 2007). Selülozun türevlerinden en çok kullanılanı karboksimetil selüloz (CMC), anyonik, düz, suda çözünen bir polimer olup selülozun sırası ile NaH ve sodyum monoklor asetat ile muamelesinden üretilir. CMC çözeltileri kararlı ve viskoz olduundan gıdaların reolojik özelliklerini düzenlemede kullanılır (Shelton ve Lee, 2000). nsan sindirim sisteminde selülozu parçalayan selülaz enzimleri bulunmaz fakat otçul hayvanlar ikembe mikrofloralarında selülozu parçalayarak deerlendirebilirler. Selülaz enzimi; mikroorganizmalar (bakteri ve küf gibi), bitkiler ve memeli olmayan hayvanlar tarafından üretilir. Selülaz enzim sistemi, selülozu glikoza hidrolize eder. Doada selülazlar; endoselülazlar (endo-1,4-ß-d-glikan-4-glikanohidrolaz, EC ), ekzoselülazlar (ekzo-1,4-ß-d-glikan-4-sellobiyohidrolaz, EC ) ve β glikozidazdan (ß-D-glikozit glikohidrolaz, EC ) oluur (Saha, 2005). Endoselülazlar, glikoz birimleri arasındaki -1,4 glikozidik baı rastgele hidrolizleyerek farklı uzunluklarda oligosakkaritler olutururlar. Ekzoglikanazlar, selülozu indirgen ve indirgenmeyen uçlarından balayarak hidrolize ederler ve glikoz veya sellobiyoz olutururlar. -glikozidazlar, sellobiyoz ve sellodekstrinleri glikoza hidrolize ederler (Saha, 2005). Selülazlar tekstil, gıda, kaıt, hayvan yemi gibi çeitli alanlarda kullanılmaktadır (Doi ve ark., 2003). Clostridium, Cellulomanas, Bacillus, Thermonospora gibi bakteriler ve Trichoderma, Fusarium, Humicola, Penicillium ve Schizophyllum gibi küfler selülaz enzimlerinin en etkili üreticileridirler. Selüloz, glikoza hidrolize edilerek mikrobiyal veya kimyasal yöntemlerle etanol, bütanol ve organik asitler, aseton veya gliserol gibi çeitli ürünlere dönütürülebilir (Howard ve ark., 2003) Lignin Lignin, kompleks, hidrofobik, aromatik yapılı bir polimerdir. Bitki hücre duvarının ayrılmaz bir parçasıdır ve bitki hücre duvarında selüloz ve hemiselüloz karbonhidrat

13 8 matriksine gömülmütür (Palonen, 2004). Lignin; bitkiye mekanik destek, çözgen iletimi ve mikrobiyal parçalanmalara karı direnç gibi özel fonksyonlar kazandırır. Lignin, 3 boyutlu, fenilpropan yapıda, p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol birimlerinden olumu kompleks yapılı bir a eklinde tanımlanır (ekil 2.3) (Castro, 1994). Yumuak odunsu bitkilerin yapısındaki lignin genelde koniferil alkolden oluurken, sert odunsu bitkilerin yapısındaki lignin ise eit miktarlarda koniferil ve sinapil alkolden olumutur (Hortling ve ark., 2004). Polisakkaritlerin aksine lignin, hidrofobik (su sevmeyen) bir polimerdir. Bu özellik bu polimere farklı fiziksel ve kimyasal özellikler kazandırır. Lignin, kimyasal ve enzimatik parçalamalara karı doadaki en dirençli polimerlerden birisidir ve klasik olarak lignin, lignoselülozik materyallerin %72 (w/w) sülfürik asitte çözünmeyen kısmı olarak tanımlanır. Ligninin kompleks yapısında güçlü kovalent balar vardır, C-C ve eter baları lignini asit ve alkali hidrolitik olaylarına karı dirençli yapar. Bu ba, ılımlı oksidasyon, nitrobenzen oksidasyonu gibi ilemlerle kırılır. Aynı zamanda bitki hücre duvarındaki veya mikroorganizmalarla üretilen peroksidazlar ya da lakkazlar bu monomerleri okside ederek lignini parçalayabilirler (Castro, 1994). Lignin, dioksan gibi organik çözücülerde yava çözünür (Shelton ve Lee, 2000). Selüloz ve hemiselülozun aksine lignin, fermentasyon prosesleri ile deerlendirilemez (Anonim, 2007b). Bununla beraber birçok alternatif kullanımı mevcuttur. Bu kullanımlara; kimyasal dönüüm ürünleri (vanilin, dimetilsülfit, fenoller, benzen türevleri gibi.), çeitli makromoleküler (dispersantlar, emülsiyon stabilizatörü, pıhtılatırıcı ve çökeltici maddeler, vs.), karbonlatırma, pirolizletirme (aktif karbon, karbon veya grafit lifleri ve köpükler), toprak ve gübre uygulamaları örnek gösterilebilir (Alma, 1999).

14 9 ekil 2.3. Ligninin ve biyosentezinde öncü alkollerin kimyasal yapısı (Castro, 1994) Hemiselüloz Hemiselüloz, tek ve çok yıllık bitkilerin toplam kütlesinin %20-30 nu oluturan, hücre duvarında selüloz ve ligninle beraber bulunan önemli bir heretojen polimerdir. Hemiselüloz, 5 C lu pentoz ekerler (ksiloz, arabinoz gibi) ile 6 C lu heksoz ekerler (mannoz, glikoz, galaktoz gibi ) ve eker asitlerinden olumu heterojen bir polimerdir. Hemiselülozun ekerleri D-ksilopiranoz, D-glikopiranoz, D-galaktopiranoz, L- arabinofüranoz, D-mannopiranoz ve D- glikopiranosilüronik asit ile iz miktarlarda dier ekerlerdir. Bu ekerlerin kimisi asetil ve metil grupları ile esterlemitir. Ana iskelet

15 10 yapısı -1,4 baı ile balı ekerlerden oluan hemiselüloz, -1,2, -1,3 ve -1,6 noktalarında dallanma gösterir. Hemiselülozlar, yapılarında bulunan ekerlere göre aaıda verilen biçimlerde gruplandırılır (Sorenson ve ark., 1999). Ksilanlar (-1,4-D-ksiloz iskeleti) Arabinoksilanlar (-1,4-D-ksiloz iskeleti) Glikoronoksilanlar (-1,4-D-ksiloz iskeleti) Mannanlar (-1,4-D-mannoz iskeleti) Glikomannanlar (-1,4-D-glikoz : -1,4-D-mannoz iskeleti) (1:3) Galaktomannanlar (-1,4-D-mannoz iskeleti) Galaktoglikomannanlar (-1,4-D-glikoz : -1,4-D-mannoz iskeleti) (1:3) Glikoronomannanlar (-1,4-D-mannoz ve -1,2 D-glikoronik asit iskeleti) Arabinogalaktanlar (-1,3)-( -1,6)-D-galaktoz iskeleti) -(1,3)-D-glikanlar -(1,3) --(1,4)- D-glikanlar Selülozun aksine hemiselüloz, kimyasal açıdan homojen deildir. Selülozun polimerleme derecesi (DP) iken hemiselülozun DPsi arasında deimektedir (Saha, 2003 ve 2005; Ebringerova ve ark., 2005) Hemiselülozun kaynaına göre yapısı Hemiselülozların yapısı lignoselülozik materyallerin kaynaına göre deimektedir. Hemiselüloz, sert odunsu ve yumuak odunsu yapılarda farklılık gösterir. Sert odun hemiselülozları genellikle 4--metil glikoronoksilan eklinde sınıflandırılmı yüksek asetillemi heteroksilandan oluurken yumuak odun hemiselülozları glikomannan, galaktoglikomannan ve ksilana sahiptir. Yumuak odun hemiselülozları (genellikle heksozanlar) asit hidrolize, sert odun hemiselülozlarından (genellikle pentozanlar) daha dirençlidir. Sert odun ksilanları asit hidrolize oldukça dayanıksızdırlar ve oldukça ılımlı koullar altında otohidrolize urarlar (Ramos, 2003).

16 11 HC H 3 C H A Ac R H Ac H H H H Ac H H R B H R H H H H H R H H CH 2 H H CH 2 H H H 3 C H HC CH CH 2 C H C R H H H H H H H H R H H CH H H 3 C CH H CH 2 H H H 3 C D R H H H H H H H H R H H CH H H 3 C CH H H 3 C H H E H H H H H H H H H H H H H ekil 2.4. Deiik kaynaklardan elde edilen hemiselülozların yapısı. A: -asetil-4-metilglikoronoksilan (sert odunsu bitkiler); B: Arabinoksilan (buday kepei); C: Arobinoksilan (çimen); D: Arabino-4--metilglikoronoksilan (yumuak odunsu bitkiler); E: Galaktomannan (Keçiboynuzu gamı).

17 12 Birçok bitki materyalinin ksilanı 1,4 balı -D-ksilopiranoz birimlerinin homopolimerik iskelet zincirinden olumutur. Ksilozun yanında ksilanlar; arabinoz, glikoronik asit veya onun 4--metil eteri ile asetik, ferulik ve p-kumarik asitlerini içerir. Dallanma sıklıı ve kompozisyonu ksilanın kaynaına balıdır. Bununla birlikte daha homojen ksilanlar, hasır otu, doal sakızlı bitki tohum kabuu ve tütün saplarında bulunmaktadır. Yumuak odun heteroksilanlarında arabinofüranosil birimleri p-kumarik asitler ve ferulik asitlerle esterlemitir. Sert odun ksilanlarında ise ksiloz birimlerinin %60-70 i asetillemitir. Sert odun ksilanlarının ( ) DPsi yumuak odun ksilanlarından (70-130) daha yüksektir (Saha, 2003 ve 2005). ekil 2.4 de çeitli kaynaklarda bulunan hemiselülozların yapısı verilmitir Hemiselülozun eldesi ve uygulanan ön ilemler Lignoselülozik biyokütlenin kompozisyonu kaynaına göre çeitlilik göstermektedir. Bu materyallerin yapısı çok komplekstir (Saha, 2003). Hemiselüloz, hücre duvarında lignin ve selülozla beraber bulunduundan, lignoselülozik biyokütlenin deerlendirilebilmesi ve hemiselülozun elde edilmesi amacı ile bazı ön ilemlerin uygulanması gereklidir. Ön ilemler; fiziksel veya kimyasal olabilir. Fiziksel ilemlerde genellikle materyalin boyutu deiik öütme yöntemleri ile küçültülür; ancak bu ilem kompleks yapıda olan lignoselülozik materyaller için yeterli deildir. Bunlar, kimyasal yöntemler gibi daha güçlü ön ilemlere ihtiyaç duyarlar. Kimyasal ilemlerde ise lignoselülozik materyaller; yüksek sıcaklık, seyreltik asit, alkali, organik çözgen, amonyak, kükürtdioksit, karbondioksit veya dier kimyasallarla muamele edilerek, materyal enzimlerin daha kolay hidroliz edebilecei duruma getirilir. Çizelge 2.3 te lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön ilem metodları verilmitir (Saha, 2003). Böylelikle lignoselülozik materyaller farklı ekillerde deerlendirilmeye hazır hale gelir (Jeffries ve Jin, 2000). Hemiselülozun ph stabilitesinden dolayı alkali ortamda lignoselülozik materyallerden özütlenmesi oldukça yaygın olarak kullanılan bir ilemdir. Bazı durumlarda hammadde,

18 13 lignin ya da pektik maddelerin uzaklatırılması için, okside edici ajanlar, tuzlar ya da alkollerle ön ileme tabi tutulabilir (Vazquez ve ark., 2000). Lignoselülozik biyokütledeki hemiselülozun alkali özütlenmesi için NaH, KH, Ca(H) 2, NH 3, H 2 2 ya da bu bileiklerin karıımı kullanılır (Yoon ve ark., 2006; Sun ve ark., 2002; Pellerin ve ark., 1991; Zilliox ve Debeire, 1998 ). En çok kullanılan ajanlar KH ve NaH çözeltileridir. Genellikle ksilan içeren hemiselülozun izolasyonunda KH ın kullanımı daha çok tercih edilmektedir; çünkü fazla alkalinin asetik asitle nötralizasyonu esnasında potasyum asetat formu etanolde daha iyi çözünmektedir. Buna karın NaH çözeltisi, daha çok özütlenmesi daha zor olan mannoz içeren hemiselülozun özütlenmesinde kullanılmaktadır (Lai, 2000). Çizelge 2.3. Lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön ilem metodları (Saha, 2003). Metot Örnek Termo-Mekaniksel Öütme, kesme tohidroliz Su buharı, yüksek basınç Asit uygulaması Sulu asit (H 2 S 4, HCI), konsantre asit (H 2 S 4, HCI) Alkali uygulaması Sodyum hidroksit, amonyum, alkali hidrojen peroksit rganik solvent uygulaması Metanol, etanol, bütanol, fenol Hemiselülozu parçalayan enzimler ve bunların üreticileri Hemiselülazlar, hemiselülozdaki glikozidik baları hidrolize ederler ve hidroliz ettii substrata göre isimlendirilirler. Hemiselülozun heterojen yapısına ramen selülozla karılatırıldıında hidrolizasyonu daha iyi bilinmektedir. Hemiselülozların parçalanmasında gerekli olan ana enzimler ksilanazlar ve mannanazlar gibi endoenzimlerdir. Endoksilanazlar ve endomannanazlar sırası ile ksilanların ve glikomannanların iç balarını rastgele hidrolize ederek oligomerik ürünler meydana getirirler. Sonraki aamalarda bu ara ürünler bir takım ekzoenzimler (-ksilozidaz ve -

19 14 mannozidaz) ve yan grup kırıcı enzimler (-arabinozidaz, -galaktozidaz, - glikoronozidaz veya esterazlar gibi) ile monomerlere hidroliz edilirler (Harjunpaa, 1998). Farklı hemiselülazların ksilan ve galaktoglikomannan üzerine etkisinin ematik gösterimi ekil 2.5 te verilmitir. lerideki bölümlerde ksilanazlar ve endoksilanazlar daha ayrıntılı bir ekilde açıklanmıtır. ekil 2.5. Ksilan (A) ve galaktoglikomannan (B) üzerine farklı hemiselülazların etkisinin ematik gösterimi (Harjunpaa, 1998).

20 Hemiselülozun ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları Hemiselülozun kimyasal yapısı, özelliklerini etkileyen en önemli faktördür. Hemiselülozlar; adsorbant, yapıtırıcı, jelletirici ajan, emülsifiyer, kalınlatırıcı ve gıda katkısı olarak gıda, kozmetik veya ilaç endüstrisinde kullanılmaktadırlar. Ksilan türevlerinden karboksimetilksilanlar, kaıdı astarlamada deterjan, yumaklatırıcı ve yapıtırıcı olarak kullanılır. Antitümoral ve lipolitik aktivitelerinden dolayı ksilan sülfat türevlerinin tıpta önemli uygulamaları bulunmaktadır. Dier kaynaklardan elde edilen hemiselülozlar da stabilizör olarak ilaçlarda veya gıda endüstrisinde (meyve suyu stabilitesinde) kullanılmaktadır. Glikomannanlar, gıda endüstrisinde (balık yumurtası substitüyesi) kullanılırken arabinogalaktanlar madencilikte (demir ve bakır cevherlerinin ilenmesi) veya ilaç endüstrisinde (tablet balayıcı veya emülgatörü gibi) uygulama alanı bulurlar. Farklı hemiselülozlardan elde edilen jeller, kozmetik, ilaç ve fotorafçılık endüstrisinde uygulama bulmulardır (Popa ve Spiridon, 1998). Hemiselülozun parçalanma ürünleri de farklı kimyasalların üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır (Popa ve Spiridon, 1998). Bunlardan birisi de yakıt etanol üretimidir. Lignoselülozik maddelerden yakıt etanol üretiminde hemiselülozik ekerlerden yararlanılmaktadır. Ksilozu etanole fermente edebilme yeteneindeki mayalar Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis ve Candida shehate dir. Hemiselülozun bir dier önemli ekeri olan arabinozu ise sadece birkaç maya türü etanole fermente edebilir. Bazı bakteriler örnein Escherichia coli, Klebsiella, Erwinia, Lactobacillus, Bacillus ve Clostridium hemiselülozda bulunan ekerleri fermente edebilirler; ancak sınırlı miktarda etanol üretirler. Bu bakteriler genellikle hemiselülozdan daha çok asit (asetat, laktat, propiyonat, vb.,) ve çözgen (aseton, bütanol, 2,3-bütandiol, vb.,) üretmek amacıyla kullanılırlar (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007). Hemiselülozun parçalanma ürünlerinden üretilen 2,3-bütandiol, baka bir adla bilinen 2,3-bütilen glikol (2,3-BG) sıvı yakıt, çözücü, çeitli sentetik polimer ve reçinelerin ön maddesi olarak deerli bir kimyasaldır J/g ısıtma deeri ile yakıt katkısı ve sıvı yakıt olarak kullanılan metanol ( J/g) ve etanolle ( J/g) karılatırılınca daha avantajlıdır. 2,3-BG nin dehidrasyon ürünü endüstriyel çözücü metil etil keton,

21 16 çok düük kaynama noktası nedeni ile yakıta daha çok uygundur. Daha ileri dehidrasyon ürünü olan 1,3-bütandien polimer endüstrisinin önemli bir monomeri ve sentetik kauçuun balangıç maddesidir. 2,3-bütandiol katalitik dehidrojenasyonu ile oluturulan diasetil, yüksek deerli gıda katkı maddesidir. Çok farklı kimyasallar 2,3- BG den kolayca hazırlanabilir. Endüstriyel ölçekte pulp, kaıt ve gıda endüstrisi atıkları gibi çeitli zirai atıklardan 2,3-BG üretimi ile ilgili çalımalar yapılmaktadır (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007). Hemiselülozdan üretilen bir dier önemli madde de ksilitoldur. Ksilitol, 5 karbonlu eker alkolüdür, çounlukla alkali ortamda ksilanın hidrolizasyonundan elde edilen ksilozun indirgenmesi ile üretilir. Ksilitol, birçok meyvede doal olarak bulunan bir tatlandırıcıdır. Doal olarak hu aacı, böürtlen, çilek, yeil salata, karnabahar, erik, fıstık, muz ve mantarda da bulunur ve insan vücudunda doal olarak 5-15 g/gün ksilitol üretilmektedir. Bitkilerden dorudan elde edilebilir; ancak ticari olarak hemiselülozdan üretilmektedir. Ksilitol, beyaz kristal eklinde olup nane gibi serinleten ho bir tadı vardır. Erime ısısı oldukça düük derecede olduu için, ferahlık ve serinlik hissi verir ve herhangi bir alerjik etkisi yoktur; fakat fazla miktarda alınması ishale neden olabilir. Sükrozla benzer derecede tatlılıa sahiptir ve görünüü ve tadı ekere benzemektedir. Ksilitol, aızda fermente olmaz ve hayvan ve insan deneylerinde çürük önleyici olduu görülmütür. Aızdaki plak miktarını azalttıı ortaya çıkmıtır. Minenin remineralizasyon sürecini uyarır ve floritle sinerjik etki göstererek aız hijyeni ürünlerinin etkinliini arttırır. Fermente edilebilen ekerlerin yerine tatlandırıcı kullanıldıında çürük olumadıı ve ekerlemelerde, sakızlarda, alkolsüz içeceklerde, çeitli ilaçlarda, pastillerde sükrozun yerine ksilitol kullanılmasının çürük riskini azaltıcı olduu ifade edilmektedir. Alkolsüz içecekler, dondurma, sakız ve ekerlemeler gibi çeitli ürünlerde ksilitol kullanılmaktadır. Japonya, Finlandiya, skandinav ülkeleri ve Sovyetler Birlii nde diyabetik ürünlerde, Almanya daysa damar içi beslenme ürünlerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Ksiloz, ksilitole kimyasal veya biyoteknolojik olarak dönütürülebilir. Kimyasal ilemlerde yüksek basınç (50 atm üstü) ve yüksek sıcaklık ( C) kullanımı ve pahalı katalizörlere (Raney-Nikel) ihtiyaç duyulmasından dolayı biyoteknolojik olarak üretimi daha çok tercih edilmektedir. Biyoteknolojik olarak öncelikle hemiselüloz ksiloza parçalanır, daha sonra üretilen

22 17 ksiloz ksilitole fermente ettirilir. Birçok maya ve küf, ksiloz metabolizmasının ilk adımında ksilozun ksilitole indirgenmesini katalizleyen NADPH a sahiptir (Biswas ve Vashistha, 1997; Bostancı ve ark., 2007). Hemiselülozdan elde edilen ekerler, laktik asit üretiminde de kullanılabilinir. Laktik asit, her insanın vücudunda oluan doal organik bir bileiktir. Laktik asit, geçmite ticari olarak büyük ölçüde ekimi sütten elde edilmekte idi, ancak bugün mikrobiyal fermentasyonla veya kimyasal sentezle üretilmektedir. Bu amaçla lignoselülozik maddeler; bol, ucuz ve yenilenebilir olduklarından laktik asit üretiminde tercih edilmektedir. Laktik asit; gıda, kozmetik, farmakoloji ve kimya endüstrisinde geni çapta kullanılmaktadır (Wee ve ark., 2006; Bostancı ve ark., 2007). Hemiselüloz parçalanma ürünlerlerinin bir dier kullanım alanı, ferulik asit üretimidir. Ferulik asit, çeitli bitki hücre duvarlarında bulunan bir sinamik asittir. Sinamik asitler, kan damarlarını koruyucu ve antioksidan etkili fitokimyasal maddelerdir. Mısır lifi yaklaık %3 ferulik asit içerir. Buday kepei dier bir ferulik asit (%0,5-1) kaynaıdır (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007). Hemiselülozun bir dier önemli kullanım alanı ve bu tezin konusunu oluturan ksilooligosakkarit üretimidir. Endüstriyel olarak ksilanca zengin lignoselülozik maddelerden üretilirler. Bu konu ksilooligosakkaritler (Kler) bölümünde daha geni bir ekilde açıklanmıtır Ksilooligosakkaritler Kler, ksiloz birimlerinin -1,4 glikozidik baı ile birlemesinden oluan (ekil 2.6) ve daha çok ksilobiyoz, ksilotriyoz ve ksilotetroz içeren eker oligomerleridir (Hopkins ve ark., 1998). Klerin polimerizasyon derecesi (DP) genellikle 2-10 arasında deimektedir ve buna balı olarak da molekül aırlıkları düük olmaktadır. Kler, sindirilemeyen oligosakkaritler sınıfına girdii için salık üzerinde prebiyotik ve fonksiyonel gıda bileeni olarak kullanım alanlarına sahiptir. Kler doal olarak

23 18 meyveler, sebzeler, bal ve sütte bulunur. Endüstriyel olarak da ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden elde edilen ksilanın uygun metodlarla parçalanması ile Kler üretilir (Roberfroid, 2000; Vazquez ve ark., 2000). H H H H H H n-1 H H ekil 2.6. Ksilooligosakkaritlerin kimyasal yapısı (n=ksiloz ünitelerinin sayısı) Ksilooligosakkaritlerin salık açısından önemleri Klerde ksiloz birimleri arasındaki ba -1,4 baı olduu için, bu baı insan ve hayvan sindirim enzimleri parçalayamamaktadır. Sindirilemeyen bu oligosakkaritler, baırsakta yaayan bifidobakteriler ve laktobasilluslar için substrat olarak hizmet ederek bu yararlı bakterilerin aktivitelerini ve üremelerini arttırır (Van Loo ve ark., 1999). nsan vücudunda sindirilememesi ve kolondaki bir veya sınırlı sayıdaki bakterilerin gelimesini ve/veya aktivitesini seçici olarak artırdıklarından dolayı, prebiyotik olarak adlandırılmaktadır (Gibson ve Roberfroid, 1995). Prebiyotikler, ince baırsaktan geçerken ince baırsak ve pankreatik enzimlerce sindirilmeden kalın baırsaa gelirler ve burada bifidobakteriler gibi yararlı bakteriler tarafından fermente olurlar. Fermantasyon sonucunda kısa zincirli ya asitleri (asetat, butirat, propiyonat gibi), hidrojen gazı ve C 2 oluur. Açıa çıkan bu ya asitleri, baırsak ph ını düürüp asidik ortam olumasını salayarak, zararlı bakteri enzimlerinin çalımasını önler ve baırsak mukozasının fonksiyonunu artırarak, patojenik mikrofloranın buraya balanarak çoalmasını engellemektedirler. Aynı zamanda bu bakteriler doal antimikrobiyal maddeler (nisin, bifidosin, laktasin gibi) salgılayarak Clostridium ssp., Bacteroides, E. coli, Salmonella gibi hastalık yapıcı bakterilerin geliimini engeller (Fooks ve ark., 1999). Klerin fermantasyonu sonucu oluan gaz, kısa zincirli ya asitleri ve laktat sindirim sistemi hareketini etkilemekte ve dıkı atılımını kolaylatırarak kabızlıı

24 19 önlemektedirler (Van Loo ve ark., 1999). Kler, koroner kalp hastalıına yol açan düük younluklu kolesterol (LDL) düzeyinin kanda azalmasına neden olur (Voragen, 1998). Kler, Ca ve Mg minerallerinin biyolojik kullanımını arttırarak çözünmeyen minerallerin çözünmesine yardımcı olur. Bu açıdan kemik erimesi yani osteoporoz hastalıına da iyi gelir (Tungland ve Meyer, 2002). Kler, kan ekerini etkilemedii için glisemiks (karbonhidratların kandaki glikoz seviyesi) deildir. Bu sebeplerle diyabetik gıdalarda rahatlıkla kullanılabilir. Aızdaki sindirim enzimlerince de sindirilemediinden di çürümelerine neden olmaz. Tatlandırıcı olarak ekerleme, içecekler, sakız, di macunu gibi ürünlerde kullanım alanı bulur (Roberfroid, 2000). Klerin de kullanım miktarının belli bir dozu vardır. Fazla miktarlarda tüketilmesi aırı gaz ve laksatif etkiye neden olur (Mancilla-Margalli ve Lopez, 2002). Japonya da maksimum K kullanım dozu 0,12 g/kg vücut aırlııdır (Moure ve ark., 2006) Ksilooligosakkaritlerin fiziksel özellikleri ve kullanım alanları Klerin tatlılık derecesi düüktür, nem çekme özellii donma noktasını ve camsı geçi özelliini etkiler. Molekül aırlıkları arttıkça viskoziteleri de artar. Bunun sonucunda aızda dolgunluk hissine sebep olurlar. Dolgu maddesi ve aroma arttırıcı olarak gıdalarda kullanılır. Kler düük polimerleme derecesine (DP=2-10) ve düük molekül aırlıa sahip oldukları için suda kolay çözünürler. Tatlılıı sükrozun tatlılıının %30-60 ı kadardır. Klerde zincir uzunluu arttıkça tatlılık azalmaktadır. ph stabiliteleri yapılarında yer alan baı nedeniyle dier ekerlere ( balı heksozlar gibi) göre daha iyidir. Niasta su karıımının bekletilmesi sırasında niastanın çözünürlüünü kaybedip kristal hale gelmesi eklinde tanımlanan niasta retrogradosyonu soukta hızlanmakta ve ekmein bayatlamasına neden olmaktadır bu olayı Kler engellemektedir (Voragen, 1998). ekil 2.7 de Klerin kullanım alanları verilmitir. Birçok gıda uygulamalarının yanında gıda dıı uygulamalarda da Klere ihtiyaç duyulmaktadır. Fiziksel ve fizikokimyasal özellikleri sebebi ile gıda uygulamalarında takviye edilmi gıdalar, sinbiyotik gıdalar,

25 20 özel gıdalar (diyet) ve yeni gelitirilmi gıdalarda gıda bileeni olarak gıda dıı uygulamalarda ise hayvan besleme, tarımsal uygulamalar, farmakoloji uygulamalarda Kler kullanılır (Vazquez ve ark., 2000). Takviye Edilmi Gıdalar Gıda Uygulamaları Gıda Bileenleri Sinbiyotik Gıdalar (canlı mikroorganizmalar ile) Özel Gıdalar -beziteye Karı -ç Beslenme Yeni Gelitirilen Gıdalar (enzimatik sentez ile) Hayvan Besleme Uygulamaları -Balıklar -Evcil Hayvanlar Gıda Dıı Uygulamalar Tarımsal Uygulamalar -Büyümeyi Uyarıcı ve Hızlandırıcı -lgunlatırma Ajanı -Verim Artırıcı Farmakoloji Uygulamaları -Mide-baırsak Enfeksiyonlarından Koruyucu Aktif Ajan larak -steoperoz -Deri ve Saç Bozuklukları -Kulak ltihabı -Kaıntı ve Cilt Hastalıkları ekil 2.7. Klerin kullanım alanları (Vazquez ve ark., 2000).

26 Ksilooligosakkaritlerin elde edilme yöntemleri Kler, ksilan içeren zengin lignoselülozik materyallerden üretilir. Ksilan, hemiselülozun balıca bileenidir (Kulkarni ve ark., 1999). Uygun bir LM den elde edilen ksilan; otohidroliz, enzimatik ve asit hidroliz ile hidrolize edilerek Kler üretilir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006) tohidroliz tohidroliz, sadece lignoselülozik madde ve su kullanarak hemiselülozun hidrolitik depolimerize olması ile selüloz ve ligninden ayrılması ilemidir. LM, ısı ve basınç etkisi ile sulu ortamda hidrolize olur. Suyun otoiyonizasyonu ve LM de bulunan üronik asit, asetik asit gibi asidik bileiklerin iyonizasyonundan oluan hidronyum iyonları hemiselülozu parçalayarak çözünür ekerlerine, eker parçalanma ürünlerine dönütürür. tohidroliz likörü, Kler, dier eker oligomerleri, monosakkaritler, asetil ve üronik asit oligomerleri, serbest asetik asit, furfural ve dier bileenlerden oluur (Parajo ve ark., 2004). tohidroliz, C leri arasında lignoselülozik materyalin yapısına göre belirli bir sürede gerçekleir. Hidrotermal proses sonucunda likörde yüksek konsantrasyonda istenmeyen eker dıı bileenlere rastlanabilir. Bu nedenle Klerin saflatırılması büyük önem taır. Klerin saflatırılmasını basitletirmek için otohidrolizden önce hammaddeye ön ilem yapılabilir. Örnein, otohidrolizden önce LM çözücü ile muamele edilerek hammaddeden istenmeyen maddeler uzaklatırılabilinir. Eer belirlenen son moleküler aırlık istenenden fazla ise enzimatik ilemlerle DP azaltılabilir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdoan ve Akpınar, 2008). Buhar veya otohidroliz uygulamaları dier uygulamalara göre hidrolizasyon için sudan baka kimyasala ihtiyaç duymamasından dolayı, çevreye daha dost görünen bir teknolojidir (Alonso ve ark., 2003). Reaksiyonun tek aamada gerçeklemesi, korozyon sorununun yaanmaması, zararlı atıkların olumaması ve çevreye zararsız olması otohidrolizde belli balı avantajları olutururken, heksoz ve pentoz ekerlerin yüksek

27 22 sıcaklıkla birlikte furfural gibi istenmeyen maddeler oluturabilmesi, hidrolizasyon liköründe Kler ile birlikte lignin ve selüloz parçalanma ürünlerinin bulunması, oluan Klerin polimerizasyon derecesinin gıdalar için istenen büyüklükten yüksek olmasından dolayı ek ilem gerektirmesi dezavantajlarıdır (Garrote ve ark., 1999; Erdoan ve Akpınar, 2008). Literatürde, Garrote ve ark. (2001 ve 2002) mısır koçanı, Kabel (2002) çeitli lignoselülozik atıklardan; Parajo ve ark. (2004) Eucalyptus globulus odunu, mısır koçanı, pirinç kepei ve arpa kabuundan; Nabarlatz ve ark. (2005 ve 2007) ise badem kabuu, mısır koçanı, zeytin çekirdei, pirinç kabuu, buday kepei ve arpa kepeinden K üretmilerdir Enzimatik hidroliz Ksilan içeren lignoselülozik materyallerden, dorudan enzimatik hidrolizle Klerin üretimi sadece turunçgil kabukları gibi hassas materyaller için uygundur. Bu nedenle, Klerin üretimi 2 aamada gerçekleir; lignoselülozik biyokütleden ksilanın alkali özütlenmesi ve bunu takiben de ksilanın enzimatik hidrolizidir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdoan ve Akpınar, 2008). Genel olarak tarımsal atık saplarından enzimatik yolla K üretim akı eması ekil 2.8 de verilmitir. Enzimle hidroliz dier yöntemlerle karılatırıldıında daha spesifiktir çünkü sıcaklık (40-50ºC) ve asitlik (ph 4,5-7) açısından daha ılımlı koullarda gerçekleir. Bu yüzden ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadıı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olumamaktadır. Ayrıca enerji ihtiyacı da daha düüktür; ancak bu yöntemde hidroliz için gereken enzimlerin üretimi oldukça zahmetli, pahalı ve zaman alıcıdır (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdoan ve Akpınar, 2008 ). Ksilanazlar, ksilanın -1,4 baını hidrolizleyerek ksilanı ksiloza hidrolizleyen enzimlerdir. Ksilanın ksiloza tamamen hidrolizi için en az 3 tane enzime ihtiyaç

28 23 duyulur. Bu enzimler; endoksilanazlar, -ksilozidazlar ve esterazlardır. Ksilooligosakkarit (K) üretiminin gerçeklemesi enzim kompleksinin endoksilanaz aktivitesine balıdır. Klerin enzimatik olarak üretimleri ve ksiloz üretimini engellemek için enzim kompleksi düük ekzoksilanaz ve/veya -ksilozidaz aktivitesine sahip enzim kompleksleri istenir. Enzimatik hidroliz sonucu oluan Klerin DPsi kullanılan enzimle deiir. Bu sorun enzimatik hidrolizin en büyük dezavantajını oluturur (Sun ve ark., 2002; Erdoan ve Akpınar, 2008). T arı msal atık sapı Selü loz Lig nin Alkali Eks traksiyo nu Tarımsal At ık Sapı Ksilanı Ks ilanaz Enzimatik Hid ro liz Ksiloo ligo sakkaritler ekil 2.8. Tarımsal atık saplarından K üretim akı eması. Literatürde enzimatik hidroliz ile mısır koçanından (Playne ve Crittenden, 1996), yulaf ksilanından (Jaskari ve ark., 1998), K üretmilerdir. Silveira ve ark. (1999) farklı ksilanlar ve kaıt pulpundan Trichoderma harzianum türlerinden (CNP 17) elde edilen ksilanaz ile, Zhu ve ark. (2006) mısır koçanından enzimatik hidrolizle K üretmilerdir. Yang ve ark. (2007) Thermobifida fusca dan elde edilen ksilanaz ile küspe, mısır koçanı, buday kepei ve yerfıstıı kabuu ksilanından, Hussin ve ark. (2008) Trichoderma viride den elde edilen ksilanaz enzimi ile palmiye ksilanından K

29 24 üretmilerdir. Bunların dıında enzimatik hidrolizle lignoselülozik materyallerden Pellerin ve ark. (1991), Chen ve ark. (1997), Nishimura ve ark. (1998), Ai ve ark. (1991), Swennen ve ark. (2005), Yoon ve ark. (2006) sırası ile mısır koçanı, hu aacı, sert odunsular, badem kabuklarından ve Akpınar ve ark. (2007) pamuk saplarından K üretmilerdir Asit hidroliz Ksilanın enzimatik hidrolizinin pek çok avantajları olmasına ramen, enzimatik hidrolizin bazı dezavantajları da vardır. Ksilan yapısındaki farklı eker grupları, asetil grupları ve dallanmalar enzimatik hidrolize karı direnç göstermekte ve üretilen ürünün DPsini kontrol etmek çok zordur (Sun ve ark., 2002). Enzimatik hidrolizde üretilen Klerin DPsi, kullanılan enzime balıdır. Buna karılık asit ile hidroliz reaksiyonunda kullanılan asidin cinsinden ve ksilan yapısından baımsız olarak, ksiloz üniteleri arasındaki glikozidik baları rastgele hidroliz edilmektedir. Alternatif olarak, ksilan enzimle hidrolize edildii gibi asitle de hidrolize edilebilir (Erdogan, 2007). Asit hidrolizde HCl, H 2 S 4 gibi asitler kullanılır; ancak uygulamalarda daha çok sülfürik asit tercih edilir. Fazla asidi nötürletirmek amacıyla kullanılan CaC 3 ile H 2 S 4 birletiinde suda çözünmeyen CaS 4 tuzu oluur ve bu tuzun filtrasyonla uzaklatırılması daha kolay olmaktadır. Asit hidrolizi ile polimerleme derecesi 2-15 arasında olan ksilooligosakkaritler elde edilebilir, ancak önemli bir miktarda monosakkarit ve buna baımlı olarak birçok mikroorganizma için toksik etkili olan furfural gibi maddeler üretilebilir (Dominguez ve ark., 1996; Erdoan ve Akpınar, 2008). Literatürde, Kimura ve Tajima (1998), Sun ve ark., (2002) ve Akpınar ve ark., (2009) lignoselülozik atıklardaki (pamuk sapı gibi) ksilandan asit hidrolizi ile ksilooligosakkarit üretmilerdir.

30 Ksilanazlar Ksilanı hidrolize eden enzimlere ksilanolitik enzimler denir. Ksilan, dallanmı heteropolisakkarittir. Homoksilanlar sadece ksiloz birimlerinden oluur, yan zincirleri yoktur ve doada yaygın deildir (Wong ve ark., 1988; Ebringerova ve Heinze, 2000; Beg ve ark., 2001). Kompleks yapısından dolayı ksilanın tamamen hidrolizi için farklı enzimler gerekmektedir. Endoksilanazlar (-1,4), -ksilozidaz, -L-arabinofüranozidaz, -glikoronozidaz, asetil ksilan esteraz ve fenolik asit esterazlar (ferulik asit ve p- kumarik asit) ksilanın ksiloza hidrolizasyonu için gerekli ksilanolitik enzimlerdir. ekil 2.9 da bu enzimlerin etki mekanizmaları gösterilmitir. Endoksilanaz enzimi (-1,4- endoksilanazların, 1,4--D-ksilanksilanohidrolaz, EC ) ksilanın ana iskeletini rastgele hidrolize eder. ksilozidaz (1,4--D-ksilozidaz, 1,4--D-ksilan ksilohidrolaz EC ) kısa zincirli oligosakkaritleri hidrolize eder. Asetil ksilan esterazlar, ksilan molekülünün asetil gruplarını uzaklatırırken, -L-arabinofüranozidazlar (EC ) ksilanda bulunan -L-arabinofüranozil ucunu hidrolize ederler. -D-glikoronozidazlar (EC ) ksiloz ve D-glikoronik asit veya 4--metileter arasındaki -1,2-glikozidik balarını hidrolize eder. Feruloyil esterazlar (EC ), ferulik asit ile ksiloz arasındaki ester baını hidrolize eder (Saha, 2003; Collins ve ark., 2005). Ksilanazlar, genellikle glikoprotein yapısında, 6-80 kda arası molekül aırlıında, optimum ph ı 4,5-6,5 ve optimum sıcaklıı 40-60C olan enzimlerdir. Farklı kaynaklardaki ksilanazların sıcaklık, ph gibi optimum özellikleri deimektedir. Wong ve ark. (1988), ksilanazları fizikokimyasal özelliklerine göre 2 gruba ayırmıtır. Düük molekül aırlıklı (< 30 kda) ve nötral pi da ksilanazlar ile yüksek molekül aırlıklı (> 30 kda) ve asidik pi da ksilanazlar (Butt ve ark., 2008). Ayrıca ksilanazlar, sıcaklık ve ph tercihlerine göre de termostabil, ekstremofilik, termofil, psikrofil, alkalifil ve asidofil eklinde de sınıflandırılır (Collins ve ark., 2005). Ksilanazların ticari üretiminde genellikle Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Thermomyces lanuginosus, Aureobasidium pullulans, Bacillus subtilis ve Streptomyces lividans mikroorganizmalar kullanılır (Beg ve ark., 2001). Endüstride kullanılan

31 26 ksilanazlar genellikle küf veya bakteri kaynaklı, mezofilik (40-60C), nötral veya hafif asidiktirler (Collins ve ark., 2005). H 3 C H CH R H H H Endoksilanaz H β-ksilanaz H H Asetil ksilan esteraz Ac H α-glukoronozidaz H H H H R Ac: Asetil R: H (p-kumarik asit) R: CH3 (ferulik asit) α-arabinofuranozidaz H C CH CH H R Ferulik asit esteraz p-kumarik asit esteraz ekil 2.9. Ksilanazların ksilan iskeletindeki rolleri (Erdogan ve Akpinar, 2008). Ksilanazlar, ilk balarda pulp ve kaıt endüstrisinde kullanım alanı bulmutur. Bu alanda ksilanazlar, beyazlatma ajanı olarak kullanılmılardır. Bunun yanında kanatlı hayvanlarda gıda katkısı olarak (Bedford ve Classen, 1992), buday unundan yapılmı hamurun yorulmasını ve fırıncılık ürünlerinin kalitesini iyiletirmede (Maat ve ark., 1992), kahve, bitkisel ya ve niasta özütlenmesinde (Wong ve Saddler, 1992), tarımsal silaj ve yemlik tahılların besinsel özelliklerini iyiletirmede (Kuhad ve Singh, 1993), meyve suyunun berraklatırılmasında selülaz ve pektinazla birlikte (Biely, 1985), keten, haha, hint keneviri, çin keneviri gibi bitkisel lif kaynaklarının zamklarını gidermede (Kapoor ve ark., 2001; Puchart ve ark., 1999; Sharma, 1987) kullanılmaktadırlar. Kaıt endüstrisinde klor yerine aartma amacı ile ksilanaz kullanımı kaıt hamurundan lignin ayrılmasını kolaylatırmıtır. Klor ve klorlu bileiklerin çevreye verdikleri zarar böylece önlenmitir. Hayvan beslenmesinde küf kaynaklı Trichoderma ve Aspergillus türleri kullanılmaktadır. Yemlere eklenen ksilanaz hayvanların yemi daha kolay sindirmesini salamaktadır. Fırıncılık ürünlerinde ksilanazların kullanımı suda çözünmeyen hemiselülozu çözünür hale geçirir, hamurun su tutma gücünü artırır, ekmein somun

32 27 hacmini artırarak ekmein tazeliini uzun süre muhafaza etmesini salar (Kulkarni ve ark., 1999; Beg ve ark., 2001) Endoksilanazlar Endoksilanazlar veya endo-1,4--d-ksilan ksilanohidrolazlar (EC ), -Dksilopiranoz birimleri arasındaki -1,4 iç balarını hidrolizleyerek ksilan iskeletini rastgele parçalarlar ve düük molekül aırlıında ksilan parçaları ile ksilooligosakkaritler olutururlar (Beg ve ark., 2001; Courtin ve ark.,, 2006; Verwimp ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). Bugün 300 den fazla endoksilanaz belirlenmitir. Bunlar küf, bakteri, böcek, salyangoz, kabuklular, alg ve bitkilerde bulunurlar. Endoksilanazlar bitkilerden buday, arpa ve çavdar gibi tahıllarda bulunmaktadır. Budayda bulunan endoksilanazlar, endosperm hücre duvarını (çounlukla arabinoksilan ve -glikan içeren) parçalarlar, niasta ve protein eriilebilirliini iyiletirirler. Endüstriyel olarak endoksilazlar mikrobiyal kaynaklardan üretilmekte ve endüstriyel proseslerde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Genetik bilgiye ve yapısal analize göre endoksilanazlar aminoasit dizili ve yapılarına göre glikozid hidrolazların (GH) 5, 7, 8, 10, 11, 16, 26, 43 ve 62 aileleri altında sınıflandırılmaktadırlar. Bununla birlikte endoksilanazların büyük bir bölümü GHF 10 ve 11 sınıfına aittir. GH 11 ailesi, ksilan iskeletinin substitüye olmamı bölgesini hidroliz ederken GH 10 ailesi, ksilan iskeletinin 4--metil-D-glikoronat, asetat ve -Larabinofüranosil substitüyelerini hidrolizler. Bakteri ve küf endoksilanazları, GH 10 ve 11 ailesi içinde sınıflandırılırken bitki endoksilanazları daha çok GH 10 ailesi içinde yer alırlar (Beg ve ark., 2001; Courtin ve ark., 2006; Verwimp ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). Endoksilanazlar, dier ksilanolitik enzimlerle sinerjik biçimde çalıarak kompleks yapıdaki ksilanın tamamını hidrolize ederler. Endoksilanazlar, moleküler kütle, izoelektrik nokta, optimal sıcaklık ve ph stabilitesi gibi fiziko-kimyasal özellikleri bakımından farklılık gösterir. GH 10 endoksilanazlar genellikle yüksek molekül aırlıı (> ) ve düük pi (3,6-4,5) ile karakterize

33 28 edilirler (nitelendirilirler). GH 11 endoksilanazlar genellikle düük molekül aırlıında ( ) alkali (pi 8-9) ve asidik (pi 4-5) endoksilanazlar içinde gruplandırılır. (Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). Dekker ve Richards (1976) a göre küf endoksilanazlarının optimum ph sı 3,5-5,5 iken bunlar genellikle geni ph aralıklarında (3,0-10,0) oldukça kararlıdırlar. Bakteriyel endoksilanazlar, genellikle optimum ph ya (~6,0) sahiptirler; fakat ph stabiliteleri daha azdır (5,0-7,3) (Courtin ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). GH 10 ve GH 11 aileleri ayrıntılı incelenmesine ramen, son zamanlarda kefedilen GH 5, 7, 8 ve 43 ailelerinin özelliklerine ait aratırmalar çok sınırlıdır. Trichoderma reesei den elde edilen GH 7 ailesine ait enzim, spesifik olmayan endo--1,4 glikanaz olarak sınıflandırılmıtır (Kleywegt ve ark., 1997). Paenibacillus polymyxa dan elde edilen ve GH 43 ait ksilanaz ve -Larabinofüranozidaz aktivitesine sahip olduu bulunmutur (Gosalbes ve ark., 1991). E. chrysanthemi den elde edilen ve GH 5 ailesine ait ksilanazın 4--metil-Dglikoronoksilan veya onun asetillemi formunu hidrolize ettii ve dier tip ksilanları hidroliz etmedii bulunmutur (Vrsanska ve ark., 2007). GH 11 ailesinden elde edilen ksilanazlar, GH 10 ksilanazlardan düük katalitik aktiviteye sahiptirler ve bunların hidrolizasyonu ile açıa çıkan ürünler GH 10 enzimleri ile hidrolize edilebilir. GH 10 ksilanazları son ürün olarak ksiloz açıa çıkarabilirken; GH 11 ksilanazların açıa çıkardıı son ürünler ksilobiyoz ve ksilotriozdur. Ksilanolitik aktivitelerine ek olarak GH 10 ksilanazların ilginç bir özellii de glikoz türevi (sellobiyoz gibi) substratları da hidolize edebilmeleridir. GH 10 ksilanazların aksine, GH 11 enzimleri uzun zincirli oligosakkaritleri daha iyi hidrolize ederler. Ksilanazların substrat spesifiklikleri dorudan elde edilen ürünlere yansımaktadır. Ksilanazların aktif bölgelerinde her bir ksiloz yerleebilecei alt bölgeler vardır. Bu alt bölgelerin sayısı hidrolizasyon sonucu oluacak ürünün polimerizasyon derecesini dorudan etkilemektedir. Kinetik ve yapısal aratırmalar GH 11 ailesine ait ksilanazların -3 ve + 3 olmak üzere toplam altı alt bölgesi bulunduunu göstermitir. GH 10 ailesine ait enziminin aktif bölgelerinin büyüklüü ise deikendir. GH ailesi arasında sadece GH 10 ve GH 11 ksilanazları arabinoksilanı hidrolize ederler. GH 11 ksilanazları arabinoksilan iskeletinin substitüye olmamı bölgelerini hidroliz ederken GH 10 daha çok substitüye olmu bölgeleri hidroliz etmektedir (Berrin ve Juge, 2008).

34 29 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Analiz için ayçiçek, buday, pamuk ve tütün sapları Tokat ve çevresinden temin edilerek öncelikle kurutulmu daha sonra da boyutları 0,2-1 cm ye küçültülmütür. Trichoderma longibrachiatum dan elde edilen endo-ksilanaz Danisco (Finlandiya) firması ve aluminyum silika jel 60 ince tabaka plakaları Sigma (Sigma Chemical Company, M, USA) firmasından temin edilmitir. Ksilooligosakkarit standartları; ksiloz (X1), ksilobiyoz (X2), ksilotriyoz (X3), ksilotetroz (X4), ksilopentoz (X5), ksiloheksoz (X6) ve ksiloheptoz (X7) ise Akpınar ve ark. (2009) nın metodu baz alınarak 0,25 M H 2 S 4 ile hidrolize edilen tütün sapları ksilanından (%4 w/v) elde edilmitir. Dier kullanılan bütün kimyasallar Sigma (Sigma Chemical Company, M, USA) ve Merc (KGaA, Germany) firmalarından temin edilmitir Yöntem Atıkların Karakterizasyonu Nem Sabit tartıma getirilen petri kutuları içerisine 2 g kadar her bir örnekten tartılmıtır (M 1 ). Örnekler 105 C de etüvde sabit tartıma (M 2 ) gelene kadar kurutulmutur. Her bir örnek (AS, BS, PS ve TS) için analiz 3 paralelli yapılmıtır. % Nem = [ (M 1 -M 2 ) / m] x 100 M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen kurutma kabının aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen kurutma kabının aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g)

35 Kül Sabit tartıma gelen porselen krozelere (a) kurutulmu 1 g kadar her bir örnekten konularak kül fırınında 600 o C de yakılmıtır. Yakma ilemine örneklerde siyah leke kalmayana dek devam edilmitir. Desikatörde soutulan örnekler tartılmıtır (b). Her bir örnek (AS, BS, PS ve TS) için analiz 3 paralelli yapılmıtır. Kül miktarı (K.M. de %)= 100 (b-a) M a: Yakma kabı darası (g) b: Kül + yakma kabı (g) M: Örnek miktarı (g) Lignin AS, BS, PS ve TS örneklerinden 0,3 g (M1) kadar test tüplerine konularak, üzerlerine 4,5 ml %72 lik H 2 S 4 eklenmi ve 30 o C deki çalkalanan su banyosu içinde 1 saat bekletilmitir. Daha sonra her bir örnee 84 ml saf su eklenenerek asit içerii %3 e seyreltilmitir. Örnekler 2 saat kaynatılarak, sabit tartıma getirilmi ve porlu süzgeçten (M2) süzülmütür. Analiz 3 paralelli yapılmıtır. % Lignin = [ (M 1 -M 2 ) / m] x 100 M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen porlu süzgecin aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen porlu süzgecin aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g)

36 Selüloz AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2,5 g kadar bir erlen içine tartılmıtır. Her birine 80 er ml sıcak saf su eklenerek 70 o C deki su banyosu içine yerletirilmitir. Her bir örnee önce 0,5 ml asetik asit sonra 1 ml sodyum klorit eklenerek, su banyosunda 1 saat çalkalanması salanmıtır. Tekrar aynı sıra ile aynı miktarda aynı maddeler eklenerek 1 er saat çalkalanmıtır. Bu ekilde toplam 7 kez bu çözeltiler eklenerek su banyosunda 1 gece bırakılmıtır. lk eklemeden 24 saat sonra örnekler darası alınmı filtre kaıdından süzülerek, filtre kaıdı ile birlikte 105 o C de kurutulmutur. Kuruyan her bir örnekten (lignini uzaklamı holoselüloz) 2 er gram (m) alınarak 25 ml %17,5 luk NaH ile muamele edilip, darası alınmı porlu kroze ile filtre edilerek hemiselüloz uzaklatırılmıtır. Kalan katı kısım 100 ml %8,3 lük NaH ve distile suyla yıkanmı, yıkanan örnee 15 ml %10 luk asetik asit ilave edilerek tekrar distile suyla yıkama ilemi gerçekletirilmitir. Daha sonra örnekler 105ºC de 3 saat sabit aırlıa gelene kadar kurutma ilemine devam edilmitir. % Selüloz = [ (M 1 -M 2 ) / m] x 100 M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen porlu süzgecin aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen porlu süzgecin aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g) Ksilan Yukarıda %17,5 NaH muamelesinden elde edilen filtrat hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karıımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra ksilan filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC de kurutulmutur (ASTM, 1993).

37 Çözünürlükler Souk suda çözünürlük AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar bir beher içine tartılmıtır. Her birine 300 ml saf su eklenmitir. Magnetik karıtırıcıda 48 saat karıtırılarak, karıım darası alınmı filtre kaıdından süzülmütür. Filtre kaıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC de kurutulmutur. M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g) % Çözünürlük= [ (M 1 -M 2 ) / m] x Sıcak suda çözünürlük AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar bir erlen içine tartılmıtır. Her birine 100 ml saf su eklenmitir. 3 saat geri soutucuda kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre kaıdından süzülmütür. Filtre kaıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC de kurutulmutur. M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g) % Çözünürlük= [ (M 1 -M 2 ) / m] x Alkol-benzen çözünürlük AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar tartılarak erlene transfer edilmitir. Her birine 50 ml %95 etil alkol ile 100 ml benzen eklenerek 6 saat geri soutucuda

38 33 kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre kaıdından süzülmütür. Filtre kaıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC de kurutulmutur. M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g) % Çözünürlük= [ (M 1 -M 2 ) / m] x Diklorometanda çözünürlük AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar tartılarak erlene transfer edilmitir. Her birine 150 ml %98 diklorometan eklenerek 6 saat geri soutucuda kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre kaıdından süzülmütür. Filtre kaıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC de kurutulmutur. M 1 = Alınan örnek aırlıı+sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) M 2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre kaıdının aırlıı (g) m = Alınan örnein aırlıı (g) % Çözünürlük= [ (M 1 -M 2 ) / m] x Atık Ksilanın Karakterizasyonu Üronik asit Atıkların ve bunlardan elde edilen ksilanın üronik asit içerii m-hidroksidifenil metodu ile D-glikoronik asit standardı kullanarak belirlenmitir (Melton and Smith, 2001). AS, BS, PS, TS ile ASK, BSK, PSK ve TSK örneklerinden 0,005 g kadar bir tüp içine tartılarak üzerlerine 2 ml konsantre sülfürik asit eklenmi ve buz içine yerletirilerek 20 dk kartırılmıtır. Toplam hacim 10 ml olana kadar distile su ile seyreltilmitir ve örnekler 10 dakika 2000xg de santrifüj edilerek sıvı kısımdan 400 µl alınmı ve 40 µl

39 34 4 M sulfamik asit/potasyum sulfamat çözeltisi (ph 1,6) ile karıtırılmıtır. Üzerine sülfürik asit içinde hazırlanmı 2,4 ml 75 mm sodyum tetraborat eklenmi ve 100ºC su banyosu içinde 20 dakika kaynatılmıtır. Örnekler oda sıcaklıına kadar soutulduktan sonra 80 µl m-hidroksidifenol çözeltisi eklenmitir. Kontrol de m-hidroksidifenol çözeltisi yerine 80 µl %0,5 lik NaH eklenerek yapılmıtır. Örnekler 10 dakika oda sıcaklıında inkübe edildikten sonra oluan pembe renk spektrofotometrede (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201) 525 nm de okunmutur. Bu analizde kullanılan çözeltilerin hazırlanıı Ek 1 de verilmitir. ndirgen eker miktarı DNS metodu ile (Miller, 1959) ksiloz standartı kullanılarak hesaplanmıtır (Ek 3) eker kompozisyonu Atıklardan özütlenmi ksilan örneklerinin (ASK, BSK, PSK ve TSK) her birinden 0,3 g kadar tartılmıtır. Her birine 3 ml %72 lik sülfürik asit eklenerek 30ºC deki su banyosunda 2 saat çalkalanması salanmıtır. Her bir örnee 77,55 ml saf su eklenerek asit içerii %4 e düürülmütür. Bu ekilde her bir örnek 100ºC de kaynayan suda 4 saat kaynatılmıtır. Soutulan örneklerin ph ları 5 ile 6 arasına CaC 3 ile ayarlanarak 5000 rpm de 10 dk santrifüjlenmitir. Nötral monosakkaritler sülfürik asitle hidrolizinden sonra Aminex HPX 87H (Biorad) kolonda HPLC ile belirlenmitir (Pellerin ve ark., 1991). Hidrolizasyon esnasında oluan Klerin miktarı refraktometrik dedektöre (model 200) ve kolon fırınına (model 200) sahip Perkin Elmer HPLC sisteminde analiz edilmitir. Örnekler enjeksiyondan önce 0,20 µm boyutlu filtrelerden geçirilmitir. Hareketli faz olarak 5 mm H 2 S 4 su kullanılmıtır. Örnekler 45ºC de ve 0,4 ml/dk akı hızı ile 45 dakika kolondan elute edilmitir.

40 Ksilanın Büyük Ölçekte Özütlenmesi Zilliox ve Debeire (1998) metoduna göre ksilan özütlenmitir. AS, BS, PS ve TS örneklerinden 20 er g kadar tartılmı ve her bir örnee 1 litre saf su eklenerek 60 o C de 16 saatte örnekler yumuatılmıtır. Tel süzgeçten süzüldükten sonra üstteki katı atık bir erlene alınmı ve 170 ml %1 NaBH 4 ve %24 KH içeren çözelti her bir örnee eklenmitir. 35 o C deki su banyosunda 3-4 saat bekletilen örnekler bir tülbentten süzüldükten sonra alta geçen süzüntü santrifüj tüplerine alınmı 25 o C de 4000 rpm devirde 10 dk santrifüjlenmitir. Sıvı kısım alınarak Whatman 1 filtre kaıdından süzülmütür. Elde edilen sıvı kısım, hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karıımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC de kurutulmutur Ksilanların Enzimle Hidrolizasyonu Bradford metodu ile enzimin protein miktarını belirleme 500 µl örnek ile 5 ml 0,5 mg/ml Bradford çözeltisi karıtırılarak 10 dk oda sıcaklıında bekletildikten sonra spektrofotometrede Bovin Serum Albumin (BSA) standartına karılık 595 nm de absorbansına bakılmıtır. BSA ya göre hazırlanan grafie göre hesaplamalar yapılarak enzimin protein miktarı belirlenmitir. Bu analizde kullanılan çözeltilerin hazırlanıı Ek 2 de verilmitir Ksilanaz aktivitesi Ksilanaz aktivitesini belirlemek amacıyla farklı dilusyonlarda hazırlanan enzim çözeltisi (0,1 ml) ticari bir ksilan olan hu aacı ksilanı (%1 konsantrasyonda 1 ml) ile ph 4,6 da 50 o C de 30 dk inkübe edilmi ve oluan indirgen eker miktarı DNS yöntemi ile

41 36 belirlenmitir. Bir ünite (U) enzim aktivitesi 1 dakikada 1 µmol ksiloz edeeri üreten enzim miktarı olarak tanımlanmıtır (Bailey ve ark., 1992) Enzimatik hidrolizasyon ncelenen atıklardan elde edilen ksilanların hidrolizinde Trichoderma longibrachiatum ksilanazının 1ml si (4 U/mL enzim konsantrasyonunda) ile 10 ml ksilan ( %2 substrat konsantrasyonunda, ph 4,6 da 50 mm sitrat tamponla hazırlanmı) 50C de inkübe edilmitir. Reaksiyon süresi sonunda örnekler 5 dk kaynatılarak enzim inaktive edilmitir. Hidrolizasyon reaksiyonunun sonucu DNS metodu ile indirgen eker ölçülerek bulunmutur. Reaksiyon ürünleri TLC ile aaıda belirtildii ekilde analiz edilmitir. K üretmek için reaksiyon süresi (0 ile 48 saat aralıında), sıcaklık (30C, 40C, 50C, 60C, 70C), ph (3,6; 4,6; 5,6), substrat (%1 ile %5 aralıında) ve enzim konsantrasyonu (1, 2, 4, 6, 16, 20 U/mL) optimize edilmitir ndirgen eker ndirgen eker DNS metodu ile ksiloz standartı kullanılarak belirlenmitir (Miller, 1959). Enzimatik hidrolizasyon sonunda elde edilen örneklerden 50 µl alınarak 950 µl distile su ile karıtırılmıtır. Bu karıımın üzerine 1,5 ml DNS ilave edilerek vorteks karıtırıcı ile örnekler homojen hale getirilmitir. 100 C de 5 dakika kaynatma ileminden sonra örnekler oda sıcaklıına soutulmu ve oluan renk spektrofotometrede 560 nm de okunmutur TLC Ksiloz standartı ve örnekler TLC plakalarına uygulandıktan sonra plakalar etil asetat:asetik asit:saf su karıımı (2:2:1) içinde yürütülmütür (Ek 4). TLC plakaları etil

42 37 alkol:h 2 S 4 (18:2) sprey çözeltisi ile spreylenerek etüvde 105C de dk bekletilmitir statiksel Analiz Analiz sonuçları ortalama ve standart sapma ile beraber verilmitir. Verilerin analizinde istatiksel SPSS bilgisayar paket programı (SPSS, Inc., II., USA) kullanılmıtır. Analiz verileri arasındaki farklılık (p<0.05) Duncan çoklu karılatırma testine göre hesaplanmıtır.

43 4. BULGULAR ve TARTIMA 4.1. Atıkların Karakterizasyonu Tarımsal atıkların kimyasal kompozisyonları; yetitikleri yere, mevsime, hasat ekline, analiz metotlarına göre deimektedir. Çizelge 4.1 de farklı lignoselülozik maddelerden çalımada kullanılan ayçiçek sapı (AS), buday sapı (BS), pamuk sapı (PS) ve tütün sapı (TS) örnek saplarının kimyasal kompozisyonları verilmitir. Sonuçlar arasındaki farklılıklar nem, kül, selüloz, lignin, suda ve dier çözücülerde çözünürlük bakımından istatistiki yönden önemli bulunmutur; ancak seçilen bu örneklerde hemiselüloz (ksilan) kompozisyonu bakımından önemli bir fark bulunmamıtır. Kül miktarı, incelenen örneklerdeki inorganik anyon ve katyonları yani mineral madde miktarını göstermektedir. Çalımamızda kül yüzdeleri AS, BS, PS ve TS örneklerinde sırası ile %3,12, %5,46, %7,31 ve %6,88 olarak hesaplanmıtır ve aradaki farklılıın istatistiksel açıdan önemli olduu bulunmutur. Buna göre kül içerii en yüksek PS nda (%7,31) en düük ise AS nda (%3,12) hesaplanmıtır (Çizelge 4.1). Genelde, sert odunsu bitkilerin kül miktarı yumuak odunsu bitkilerin kül miktarından daha fazladır. Literatürde kül oranları AS nda %5 oranlarında (Sharma ve ark., 2002), BS nda %5-10 (Anonim, 2007b; Mengelolu ve Alma, 2002; Youngquist ve ark., 1996; Rowell ve ark., 2000),PS nda %2-6 (Clayton, 1969; Youngquist ve ark., 1996; Ate, 1990; Akpınar ve ark., 2007; Mengelolu ve Alma, 2002; Silverstein 2004), TS nda %5-11 (Erdoan, 2007; Tank ve ark., 1985; Pehlivan, 2000) arasında bulunmutur. Aaçların yapılarında %40-50 oranında bulunan selüloz, tarımsal atıklarda %25-40 civarındadır (Ate, 1990). Selüloz içerii atık saplarının türüne, iklim koullarına ve yetitirilme ortamına göre deiiklikler göstermektedir (Kahraman, 1998). AS %41,7, BS %39,5, PS %32,96 ve TS %44,27 oranında selüloza sahip olduu bulunmutur (Çizelge 4.1).

44 39 Çizelge 4.1. Atıkların (AS, BS, PS ve TS) kimyasal kompozisyonu. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmitir. çerik (%) Bileenler AS BS PS TS Nem 5,65±0,30 c 4,74±0,10 d 7,09±0,19 a 5,95±0,09 b Kül 3,12±0,36 d 5,46±0,13 c 7,31±0,17 a 6,88±0,92 b Selüloz 41,66±2,61 ab 39,50±2,70 b 32,96±0,65 c 44,27±2,93 a Ksilan 18,87±3,98 a 20,62±0,78 a 21,34±0,36 a 21,82±1,24 a Lignin 26,12±0,35 b 19,75±0,67 d 28,76±0,37 a 22,68±0,97 c Souk su çözünürlüü 4,59±0,50 c 7,30±0.17 b 8,98±0,15 a 7,79±0,70 b Sıcak su çözünürlüü 7,09±0,59 c 9,15±0,67 b 12,24±0,28 a 10,05±0,47 b Diklorometan çözünürlüü 1,55±0,09 c 3,74±0,04 b 3,64±0,13 b 5,93±0,32 a Alkol-benzen çözünürlüü 1,71±0,20 c 4,21±0,15 b 5,36±0,28 a 5,65±0,18 a abcd Farklı harfler Duncan çoklu karılatırma testine göre örnekler arasındaki farklılıı gösterir. Ayrı harfle iaretlenmi ortalamalar, istatistiki olarak birbirinden farklıdır (P<0,05). Literatürde selüloz oranları AS nda %39-41 (Marechal ve Rigal, 1999; Sharma ve ark., 2002), BS nda %38-46 (Youngquist ve ark., 1996; Anonim, 2007b), PS nda %35-50 (Clayton 1969; Akpınar ve ark., 2007; Mengelolu ve Alma, 2002; Ate, 1990), TS nda %33-46 (Tank ve ark., 1985; Erdoan, 2007) arasında bulunmutur. Ksilan içerii bakımından AS, BS, PS ve TS incelendiinde sırası ile %18,87, %20,63, %21,34 ve %21,82 oranında ksilana sahip olduu gözlenmi (Çizelge 4.1) ve farklılıklarında önemsiz olduu bulunmutur. Literatürde hemiselüloz oranları AS nda %32-34 (Sharma ve ark., 2002; Marechal ve Rigal, 1999), BS nda %26-30 (Anonim, 2007b; Mengelolu ve Alma, 2002), PS nda %19-26 (Akpınar ve ark., 2007; Mengelolu ve Alma, 2002; Ate, 1990), TS nda %17-22 (Erdoan, 2007, Akpınar ve ark., 2008) arasında bulunmutur.

45 40 Lignin yönünden AS, BS, PS ve TS sırası ile %26,12, %19,75, %28,76 ve %22,68 oranında lignin içerdii ve aradaki farklılıın istatistiksel açıdan önemli olduu bulunmutur (Çizelge 4.1). Literatürdeki lignin oranları AS nda %17-18 (Sharma ve ark., 2002; Marechal verigal, 1999), BS nda %15-20 (Anonim, 2007b; Han ve Rowell, 1997; Mengelolu ve Alma, 2002), PS nda %20-27 (Clayton, 1969; Mengelolu ve Alma, 2002; Akpınar ve ark., 2007; Ate, 1990), TS nda %17-19 (Tank ve ark., 1985; Erdoan, 2007) arasında bulunmutur. Genellikle sert odunsularda selüloz ve hemiselüloz oranının yumuak odunsulardakinden yüksek, lignin oranının ise daha düük olduu bildirilmitir (Mazlan, 1998). Yumuak odunsularda selüloz %42, hemiselüloz %27 ve lignin %28 oranında iken sert odunsularda selüloz %45, hemiselüloz %30 ve lignin %20 oranındadır. Souk su, lignoselülozik materyallerden tanenleri, gamları, renk maddeleri ile ekerleri sıcak su ise yine aynı maddeler ile niastalı maddeleri yapıdan uzaklatırmıtır. Alkolbenzen karıımı yası maddeleri, mumları ve reçineleri diklorometan ise yine mum, ya, reçine benzeri maddeleri yapıdan uzaklatırmıtır. Sıcak suda çözünürlük ile alkolbenzen çözünürlük deerleri zayıf alifatik ve aromatik bileenlerin varlıının bir göstergesidir. Özütlenen bu maddeler, düük molekül aırlıında ve nötral çözücülerde çözünen organik maddelerdir. Aromatiklerin kombinasyonundan olumu bileenler, yalar vakslar, ya asitleri ve alkoller, flavanoidler, tanenler, terpenler ve çeitli ekerler özütlenebilen maddeleri olutururlar. Bunlar tarımsal atıkların toplam aırlıının %15-30 unu oluturmaktadırlar ve bitki türüne, corafi bölge ve mevsime göre bunların içerikleri deimektedir (Mazlan, 1998). Souk suda çözünürlük oranları AS nda %4,59, BS nda %7,3, PS nda %8,98, TS nda %7,79; sıcak suda çözünürlük oranları AS nda %7,09, BS nda %9,15, PS nda %12,24, TS nda %10,05; alkol-benzen karıımında çözünürlük oranları AS nda %1,71, BS nda %4,21, PS nda %5,36, TS nda %5,65; diklorometanda çözünürlük oranları ise AS nda %1,55, BS nda %3,74, PS nda %3,64, TS nda %5,93 bulunmutur. Özüt maddeler

46 41 bakımından sert odunsular daha zengindir. Sert odunsularda %5 oranında özüt varken yumuak odunsularda %2 oranındadır (Mazlan, 1998) Atık Ksilanın Karakterizasyonu Ksilan, monokotil bitkilerde (hububat ve tahıl) arabinoz, asetil grupları ve glikoronik asit yan zincirleri içerirken dikotil bitkilerde (sert odunsular) ksilan, sadece kısmen asetillemi 4--metilglikoronoksilan zincirleri halinde bulunur (Nabarlatz, 2007). Çiçekli bitkilerde (glikorono-)arabinoksilanlar ve glikoronoksilanlar olarak 2 gruba ayrılır. Monokotların (hububat ve tahıl) hücre duvarında bulunan ksilan -D-1,4- baı ile balı D-ksilopiranozil birimlerinin düz zincir halindedir ve genelikle 2-- ve/veya 3-- pozisyonlarında -L-arabinofüranosil ile -D-glikopiranozil üronik asit veya onun 2-- pozisyonunda 4--metil türevlerini içerir (Kabel, 2002). Alkali özütleme ilemleri ile AS, BS, PS ve TS den sırası ile elde edilen ASK (ayçiçei sapları ksilanı), BSK (buday sapları ksilanı), PSK (pamuk sapları ksilanı) ve TSK (tütün sapları ksilanı) kompozisyonları Çizelge 4.2 de verilmitir. Çizelgeden de görüldüü üzere elde edilen ksilanların pentoz ve heksoz ekerler ile üronik asitten olumu heterojen bir yapıya sahip olduu görülmektedir. Ksilanın kompozisyonu bitkiden bitkiye deimektedir. ncelenen atıkların ksilanlarında ksiloz oranları %85 ile %95 arasında deimektedir. Kimyasal yapılarına balı olarak PSK nda glikozun, BSK nda ise arabinozun yüksek oranda olduu görülmektedir. Ksilan, kısmen asetillemi olmasına ramen alkali özütleme ilemi süresince asetil grupları uzaklatırıldıından asetil gruplar belirlenememitir. Üronik asit oranları da tarımsal atık kaynaına göre deimektedir. Ksilanların üronik asit oranları ASK da %10,16; BSK da %6,58; PSK da %9,75 ve TSK da %11,30 olduu tespit edilmitir (Çizelge 4.3). Tarımsal atık örneklerinden AS nın %6,20; BS nın %3,19; PS nın %7,47 ve TS nın ise %8,51 üronik asit içerdii belirlenmitir. Test edilen örneklerin atık ve ksilan üronik asit içeriklerinde farklılıkların önemsiz olduu bulunmutur.

47 42 Sonuçlar ASK, PSK ve TSK nın glikoronoksilan yapısında, BSK nın ise daha heterojen bir yapıya sahip arabinoksilan yapısında olduunu göstermitir. Özellikle ASK, PSK ve TSK yapılarının sert odunsu bitkilerin ksilanına, BSK nın ise yumuak odun ksilanına (arabinoksilan) benzer olduu saptanmıtır (Akpınar ve ark., 2008). Çizelge 4.2. Atık ksilanlarının (ASK, BSK, PSK ve TSK) nötral eker ve üronik asit kompozisyonları. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmitir. çerik (%) Bileenler ASK BSK PSK TSK Ksiloz 95,72±3,72 a 85,17±0,10 b 85,12±7,28 b 93,45±0,99 a Glikoz 4,27±3,72 b 3,36±0,07 b 14,87±7,28 a 6,54±0,99 b Arabinoz 0 b 11,47±0,17 a 0 b 0 b Üronik asit 10,16±0,18 b 6,58±0,18 d 9,75±0,21 c 11,30±0,26 a Glikoz/Ksiloz (mol/mol) 0,04 0,03 0,17 0,06 Arabinoz/Ksiloz (mol/mol) 0 0, abcd Farklı harfler Duncan çoklu karılatırma testine göre örnekler arasındaki farklılıı gösterir. Ayrı harfle iaretlenmi ortalamalar, istatistiki olarak birbirinden farklıdır (P<0,05). Çizelge 4.3. AS, BS, PS ve TS nın atık ve ksilan üronik asit oranları. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmitir. Üronik Asit çerii (%) Örnek Atık Ksilan AS 6,20±0,59 10,16±0,18 BS 3,19±0,53 6,58±0,18 PS 7,47±0,23 9,75±0,21 TS 8,51±0,26 11,30±0,26

48 Ksilanın Özütlenmesi Ksilan, hücre duvarından alkali özütleme kullanılarak izole edilmektedir. Bu yöntem ester balarının hidrolizini ve ksilanın deasetilasyonunu içermektedir. Hemiselüloz, farklı oranlarda ve farklı alkaliler ile bulunduu kaynaktan özütlenebilir. Bu amaç için kullanılan alkaliler; %5 ve %24 (w/v) KH (0,9 M ve 4,3 M) veya %4 ve %10 (w/v) NaH (1 M ve 2,5 M) dır. Hemiselülozun özütlenmesinde oksijensiz ortamlar tercih edilmektedir. rtamda oksijen bulunması durumunda NaBH 4 gibi kuvvetli indirgeyici ajanlar ilave edilmektedir. Yapıda çok fazla lignin varsa hemiselülozun lignin uzaklatırıldıktan sonra özütlenmesi daha dorudur (Sorenson ve ark., 1999). Çizelge 4.4 de kuru aırlık baına atıklardaki ksilan (%) oranları verilmitir. Tütün sapı ksilan oranı en yüksek oranda (%23,20), ayçiçei sapı ksilan oranı ise en düük (%20) bulunmutur. ranlar birbirine yakındır ve ortalama %20-24 dür. Çizelge 4.4. Kuru aırlık baına atıklardaki ksilan oranları. çerik (%) Bileenler AS BS PS TS Ksilan 20 21,64 22,96 23, Ksilanın Enzimle Hidrolizasyonu Enzimin Ksilanaz Aktivitesi Enzimatik hidrolizde Trichoderma longibrachiatum dan elde edilen ticari ksilanaz enzimi kullanılmıtır. Kullandıımız enzimin protein içerii ve spesifik aktivitesi Çizelge 4.5 te verilmitir.

49 44 Çizelge 4.5. Enzimin protein miktarı ve ksilanaz aktivitesi. Toplam Protein Miktarı (g/ml) Ksilanaz Aktivitesi (U/g) 0, ekil 4.1 de ticari bir ksilan olan Birchwood ksilanı (BWK) ile farklı konsantrasyonlarda hazırlanmı enzimle ph 4,6 da 50C de 30 dk hidrolizasyon sonucu oluan indirgen eker miktarları verilmitir. Elde edilen sonuçlardan enzim konsantrasyonu arttıkça oluan indirgen eker miktarının da artmı olduu görülmütür. Enzim konsantrasyondaki artı 6 U/mL üzerine çıktıında indirgen eker miktarında önemli bir deime gözlenmemitir. Uygun enzim konsantrasyonunu belirlerken prosesin ekonomik analizine balı olarak oluan K oranına ve enzimin fiyatına bakılarak çalımada 4 U/mL enzim konsantrasyonu tercih edilmitir. ndirgen eker Miktarı (mm) Enzim Konsantrasyonu (mg/ml) ekil 4.1. %1 Birchwood ksilanından ksilanaz ile K üretiminde enzim konsantrasyonunun etkisi. Her bir nokta veri yapılan 4 tekrarın ortalamasını belirtmektedir ve standart sapmalar hata çubukları eklinde gösterilmitir (ph 4,6 da 50 C de 30 dk hidrolizasyon).

50 ph Deeri ve Hidrolizasyon ekil 4.2 de %2 substrat konsantrasyonunda hazırlanan ASK, BSK, PSK ve TSKdan, farklı ph deerlerinde oluan indirgen eker miktarları verilmitir. ekil incelendiinde ph 3,6 da ASK, BSK, PSK ve TSK dan oluan indirgen eker miktarı sırası ile 3,96, 5,48, 4,00 ve 3,8 mm; ph 4,6 da 8,52, 11,91, 8,94 ve 7,87 mm ve ph 5,6 da 3,89, 6,15, 3,94 ve 5,55 mm olduu tespit edilmitir. T. longibrachiatum ksilanazı bütün ksilanlarda (ASK, BSK, PSK ve TSK) en iyi aktivitesini ph 4,6 da gösterdii ve bu ph deerinde enzimin en çok BSK dan, en az TSK dan indirgen eker oluturduu gözlenmitir. ndirgen eker Miktarı (mm) ASK BSK PSK TSK 3,6 4,6 5,6 ph ekil 4.2. %2 substrat konsantrasyonlarında hazırlanan ASK, BSK, PSK ve TSK dan ksilanaz ile K üretiminde ph ın etkisi. Her bir blok veri yapılan 4 tekrarın ortalamasını belirtmektedir ve standart sapmalar hata çubukları eklinde gösterilmitir (4 U/mL ksilanaz ile 50C de 30 dk hidrolizasyon).