RIDA QUICK Verotoxin / O157 Combi

Transkript

1 RIDA QUICK Verotoxin / O157 Combi Article no: N 2202 R-Biopharm AG, Landwehrstr. 54, D Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) / Fax: +49 (0)

2 1. Kullanım amacı Laboratuvar içi kullanım içindir. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi Testi mtsb broth ta zenginleştirilmiş gaitada verotoksinlerin (syn. shigatoksinler) ve/veya E.coli serovar O157 nin kalitatif belirlenmesi için immünokromatografik hızlı testtir. 2. Özet ve testin açıklaması Shigatoxinler (Stx) enterohaemorraghic Escherichia coli (EHEC) nin çok önemli zehirlilik unsurudur. Diyareye ve hayatı tehdit edici çocukluk çağında akut böbrek yetmezliğinin temel nedeni olan haemolytic uraemic syndrome (HUS) a neden olurlar. Serogroup O157, tüm EHEC enfeksiyonlarının yaklaşık olarak % ına karışmaktadır. Bu patojenin hızlı saptanması uygun tedavinin kararlaştırılması için zorunludur. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi Testi mtsb broth ta bir gün zenginleştirilmiş gaitanın süpernatantındaki shigatoxinler ve Serogroup O157 yi eşzamanlı olarak saptar. 3. Testin prensibi Hızlı test tek adımlı immünokromatografik yana doğru akış testidir, herbir parazite karşı yönelen spesifik antikorların kendileri kırmızı (shigatoxin-spesifik) veya yeşil (O157-spesifik) lateks partiküllere bağlanır. İki patojene karşı spesifik diğer antikorlar membrana sıkıca bağlanır. Gaita örneği patojen sayısını arttırmak ve shigatoxin oluşumu için yaklaşık olarak saat 37 C de broth (mtsb + Mitomycin C) de zenginleştirilip incelenir. Broth un santrifüjlenmesinden sonra süpernatantın bir kısmı test-spesifik örnek tamponu ile 1:2 dilüe edilir ve dilüe edilen karışım testte kullanılır. Test stribi dilüe örneğe daldırıldığında, renkli lateks partiküllere bağlı spesifik antikorlar örnekteki antijenlere kendiliğinden bağlanır ve akış yoluyla belirli bir biçimde membranda spesifik toplama şeritlerine bağlanır. Yeşil ve/veya kırmızı şerit örnekte bulunan antijene bağlı olarak ortaya çıkar. Aynı zamanda mavi kontrol şeriti testin geçerliliğini doğrulamak için daima ortaya çıkmalıdır. 4. Temin edilen reaktifler 25 belirleme için yeterli reaktif pakettedir. Strip 25 bel. 25 test stribi içeren tüp Diluent 18 ml Ekstraksiyon tamponu, kullanıma hazır; % 0.1 sodyum azit içerir. Pipet 25 adet Torba 25 tek kullanımlık pipet içerir. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

3 5. Saklama talimatları Paket 2-30 C de saklanabilir ve yazılan son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Son kullanma tarihinden sonra, kalite garantisi geçerli değildir. Test striplerinin tüpü kurutma maddesi içermektedir ve stripleri nemden korumak için açık bırakılmamalıdır. Test stribi çıkarıldığında her seferinde tekrar dikkatlice kapatılmalıdır. 6. Gerekli materyal (temin edilmemiştir) - Gaita süspansiyonu için test tüpleri - Süpernatant süspansiyonu için tüpler (opsiyonel: kaplanmamış mikrotitre çukurları) - Vorteks (opsiyonel) - Mikropipet (200 μl μl) - % 0.5 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren atık kabı - Zenginleştirici broth (mtsb + Mitomycin C ; e.g. RIDA Anreicherungsbouillon :Z 1003) - Santrifüj 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece laboratuvar içi teşhiste kullanım içindir. Test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmelidir. Tıbbi laboratuvarlarda çalışma yönergesi takip edilmeli ve testin uygulama talimatlarına kesinlikle bağlı kalınmalıdır. Örnek dilüsyon tamponu koruyucu olarak sodyum azit içermektedir. Bu maddelerin deri veya mukoz membran ile temasına izin verilmemelidir. Örnekler veya reaktifler ağız ile pipetlenmemelidir ve yaralı deri veya mukoz membranlar ile teması önlenmelidir. Örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler kullanın ve test tamamlandığında ellerinizi yıkayın. Örneklerin kullanıldığı alanlarda sigara kullanmayın, birşey yiyip içmeyin. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

4 Bulaşıcı olabilecek örnekler ile temas eden tüm reaktif ve malzemeler uygun dezenfektan (örneğin sodyum hipoklorit) ile örneklerin kendileri gibi aynı yöntemle tamamen işlemden geçirilmelidir veya en az bir saat 121 C de otoklavda tutulmalıdır. 8. Örnek toplama ve saklama Eğer gaita örnekleri shigatoxin veya E.coli O157 için test edilecekse taze olarak kullanılmaz, kullanımdan önce aşağıdaki şekilde zenginleştirme broth'unda saklanmalıdır: - 24 saate kadar oda sıcaklığında 72 saate kadar 2-8 C de Örneklerin dondurulması tavsiye edilmez çünkü bu EHEC bakterilerine hasar verir ve zenginleştirme kültüründe çoğalma yeteneklerini azaltır veya durdurabilir. Gaita örnekleri herhangi bir katkı maddesi içermeyen temiz kaplarda toplanmalıdır ve teste başlamadan önce 2-8 C de saklanmalıdır. Eğer rektal çubuk kullanılması gerekiyorsa, testi uygulamak için yeterli gaita materyali (yaklaşık olarak 100 mg) toplandığından emin olun. Portör izlenmesi sırasında, asemptomatik taşıyıcıların tanımlanması için klinik olarak göze çarpmayan portörlerden gaita örneği alınmalıdır. 9. Testin prosedürü 9.1. Genel bilgi Örnekler, ekstraksiyon tamponu ve test stripleri kullanımdan önce oda sıcaklığında (20-25 C) bırakılmalıdır. Test striplerinin tüpü oda sıcaklığına erişene kadar açılmamalıdır ve gerekli test stripleri alındıktan sonra tekrar kapatılmalıdır. Kullanılan test stribi tekrar kullanılmamalıdır. Test direk güneş ışığında gerçekleştirilmemelidir Örneklerin hazırlanması Önce 100 μl sıvı gaita veya eşdeğer miktarda ( mg) katı gaita örneğini 4 ml Mitomycin C (e.g. RIDA Anreicherungsbouillon, Article no:z 1003) içeren mtsb ye aktarın ve çalkalayıcıda (yaklaşık olarak rpm) yeterli oksijeni sağlayarak 37 C de 18 saat maksimum 24 saat inkübe edin. Yatay çalkalayıcı ve dönüşlü karıştırıcının ikiside çalkalayıcı olarak kullanmak için uygundur. İnkübasyondan sonra tüm örneği 3000 rpm (yaklaşık olarak 1500 G) de yaklaşık 15 dakika santrifüjleyin. Berrak süpernatantı spesifik ekstraksiyon tamponu ile 1:2 dilüe edin ve dilüe edilen karışımı temiz test tübüne veya kaplanmamış mikrotitre çukuruna aktarın. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

5 9.3. Örneğin test edilmesi Tüpten test stribi alın ve hazırlanan örneğe daldırın. Test stribi ok ile gösterilen çizgiden daha fazla daldırılmamalıdır. Test sonucu 15 dakika sonra okunabilir. 10. Kalite kontrol reaktif süresinin dolduğunun belirtileri Eğer test stribi bozulmamış ve renk değişimi yoksa veya hazırlanan örnek süspansiyonuna daldırmadan önce üstündeki çizgiler görülebiliyorsa test değerlendirilmelidir. Ayrıca, test inkübasyonundan sonra en azından mavi kontrol çizgisi görülmelidir. Eğer görülmezse, test tekrarlanmadan önce aşağıdakiler kontrol edilmelidir: - Test striplerinin ve kullanılan ekstraksiyon tamponunun son kullanma tarihi - Doğru test prosedürü - Ekstraksiyon tamponunun kontaminasyonu Eğer yeni test stribi ile test tekrarlandıktan sonra kontrol çizgisi hala görünmüyorsa, lütfen imalatçı veya yerel R-Biopharm dağıtıcınız ile temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorum Örnek absorbsiyon bölgesinde izleyen sırada maksimum üç çizgi görülmelidir: bir yeşil, bir kırmızı ve bir mavi (kontrol) çizgisi. Eğer mavi kontrol çizgisi eksikse, test geçersizdir ve değerlendirilemez! Aşağıdaki yorumlar mümkündür: - O157 pozitif : yeşil ve mavi çizgi görünür. - Shigatoxin pozitif: kırmızı ve mavi çizgi görünür. - O157 ve shigatoxin pozitif : yeşil, kırmızı ve mavi çizgi görünür. - Negatif: sadece mavi çizgi görünür. - Geçersiz: görünür çizgi yok veya üstte tanımlanandan başka bir birleşim veya çizgi renginde diğer değişiklikler. Benzer şekilde, 15 dakika sonra veya daha sonrasında ortaya çıkan çizgi rengindeki değişikliklerin herhangi bir tanı değeri yoktur ve değerlendirme için kullanılamaz. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

6 12. Metoda dair sınırlamalar RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi testi zenginleştirilmiş gaita örneklerinde O157 / veya Shigatoxinlerin antijenlerini saptar. Test spesifik görünür çizginin yoğunluğu ve klinik semptomların meydana gelmesi veya şiddeti arasında bir ilişki türetmek için kullanılamaz. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik düşünceyle birleştirilerek yorumlanmalıdır. Pozitif sonuç başka bir bulaşıcı patojen varlığında bertaraf edilemez. Negatif sonuç olası EHEC enfeksiyonu veya shigatoxinlerin varlığında bertaraf edilemez. Bu olabilir çünkü örnekteki antijenlerin miktarı çok az. Eğer hasta anemili veya patojenle enfekte olduğundan şüphe ediliyorsa, dört hafta sonra başka bir gaita örneği test edilmelidir. 13. Performans karakteristikleri Test niteliği Testin geçerliliği HUS için Münster Üniversitesi hijyen estitüsünde kontrol laboratuvarında toplam 159 örnekte gerçekleştirilmiştir. 38 farklı serotipin geniş spektrumunu temsil eden 51 EHEC referans türünü içermektedir. Hayvanlar için patojenik olan alttip Stx 2g ye kadar insanlar için patojenik olan diğer tüm shigotoxin tipleri temsil edilmiştir. 96 gaita örneği ve bu örneklerden 8 izolat ve de hayvanlardan 4 izolat incelenmiştir. Enstitüde Stx- ve O157-spesifik PCR metodlarının sonuçları karşılaştırılmıştır. Verocell ler ile sitotoksisite testi doğrulamak için Stx ürünleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Tablo 1 de listelenmiştir. Tablo 1: Stx kodlu genlerin ve de Serotype O157 için spesifik sfpa genlerinin belirlenmesi için RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi hızlı testin spesifik PCR metodlarıyla karşılaştırılması. RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

7 Duyarlılık: 85.0 % 90.9 % Spesifiklik: 98.7 % 98.5 % poz. tahmin değeri: 98.6 % 90.9 % neg. tahmin değeri: 86.7 % 98.5 % Doğruluk: Analitik duyarlılık Her iki toksin RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi Test kullanılarak her iki shigatoxin i belirleme limitini saptamak için seri dilüsyon yapılmıştır. Sonuçlar Tablo 2 de gösterilmiştir. Tablo 2: Stx 1 ve Stx 2 için belirleme limiti Stx 1 pure RIDAQuick Stx 2 pure RIDAQuick ng/ml Stx / O157 ng/ml Stx / O *Belirleme limiti * (+) * (+) Spesifiklik RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi Test diğer E-coli serotipleri veya yüzeyinde O157 antijeni olan Grup N salmonella hariç diğer enterobakterler ile herhangi bir çapraz reaktivite göstermemiştir. Bu yüzey antijeni bazen Citrobacter türlerinin birkaçında bulunmaktadır şöyle ki eğer yalnız O157 şeritinde reaksiyon olursa kültür oluşturulduktan sonra belirlemenin yapılması uygundur. Diğer taraftan shigatoxin üretme yeteneğini yitirmiş O157 izolatları çok nadirdir (bakteriyofaj kaybı). RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

8 Kaynakça 1. Beutin, L. et al.: Zur Epidemiologie von Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) in der Bundesrepublik Deutschland im Jahr Bundesgesundhbl. 10, (1994) 2. Beutin,L. et al. : Comparative evaluation of the RIDASCREEN Verotoxin enzyme immunoassay for detection of shigatoxin producing strains of Escherichia coli (STEC) from food and other sources. J. of Appl. Microbiol. 102, (2007) 3. Beutin, L.: Infektionen mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundhbl. 11, (1996) 4. Bockemühl, J. et al.: Zur aktuellen Bedeutung der enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in Deutschland ( ). Bundesgesundhbl. 8, (1996) 5. Bockemühl, J. et al.: Infektionen des Menschen durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) in Deutschland, Bundesgesundhbl. 6, (1997) 6. Bülte, M.: Enterohämorrhagische E. coli-stämme (EHEC) - Aktuell in der Bundesrepublik Deutschland? 1. Pathogenitätspotential von EHEC-Stämmen - Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. (Literaturübersicht) Fleisch-wirtschaft 75, (1995) 7. Bülte, M. et al.: Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) - aktuelle Lebensmittelinfektionserreger auch in der Bundesrepublik Deutschland? 2. Nachweis von VTEC- Stämmen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs Fleischwirtschaft 76, (1996) 8. Donohue-Rolfe, A. et al.: Purification of Shiga Toxin and Shiga-Like Toxins I and II by Recptor Analog Affinity Chromatography with Immobilized P1 Glycoprotein and Production of Cross-Reactive Monoclonal Antibodies. Infection and Immunity, Dec., (1989) 9. Karch, H. et al.: Clonal Structure and Pathogenicity of Shiga-Like Toxin-Producing, Sorbitol- Fermenting Escherichia coli 0157:H -. Journal of Clinical Microbiology 5, (1993) 10. Kuntze, U. et al.: Nachweis von verotoxinbildenden E. coli-stämmen in Roh-milch und Rohmilchkäse. Archiv f. Lebensmittelhygiene 47, (1996) 11. Ritchie, M. et al.: Comparison of a Direct Fecal Shiga-Like Toxin Assay and Sorbitol- McConkey Agar Culture for Laboratory Diagnosis of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. J. of Clin. Microbiol., Feb., (1992) 12. Strockbine, N. A. et al.: Characterization of Monoclonal Antibodies against Shiga-Like Toxin from Escherichia coli. Infection and Immunity, Dec., (1985) 13. Takeda, Y. et al.: Vero Toxins (Shiga-Like Toxins) Produced by Enterohemorrhagic Escherichia coli (Verocytotoxin-Producing E. coli). Microbiol. Immunol., 37 (8), (1993) RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi

9 14. Walterspiel, J. N. et al.: Effect of Subinhibitory Concentrations of Antibiotics on Extracellular Shiga-like Toxin I. Infection 20, No. 1, (1992) 15. Gerritzen, A. et al.: Flüssige Vorkultur von Stuhlproben verbessert den EHEC- Toxinnachweis mit ELISA und Zytotoxizitätstest. J. Lab. Med. 22 (2), (1998) 16. Fruth, A. et al.: Zur Verbesserung der gegenwärtigen bakteriologischen Diagnostik von enterohemorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundheitsbl.- Gesundheits- Gesundheitsforsch.-Gesundheitsschutz 43, (2000) RIDA Quick Verotoxin / O157 Combi