RIDASCREEN Verotoxin. Makale no: C 2201

Transkript

1 RIDASCREEN Verotoxin Makale no: C 2201 R-Biopharm AG, Landwehrstr. 54, D Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) / Fax: +49 (0) Χ

2 1. Kullanım amacı In vitro diyagnostik kullanım için. RIDASCREEN Verotoxin bir ELISA testi olup gaitada ve zenginleştirilmiş kültürlerde Escherichia kolini Verotoxins 1ve 2 (Shiga-like toxins I ve II) kalitatif tespiti için kullanılır. 2. Testin özeti ve açıklaması Escherichia koli tip enterobakter (E. coli) insane bağırsaklarında ve çoğu çiftlik hayvanında bulunur. Suda ve gıdalarda fekal kontaminasyonu gösterir.bunlar gram negatif, anaerobik çubuk bakteri olup, peritrikal kamçılıdırlar. E. koli O antijenine (LPS nin dış membranı) ve H antijene (kamçılı antijen)bağlı olarak farklı serovarlara ayrılır. E. koli fakültatif patojen olarak değerlendirlmelidir.çünkü, çeşitli patojenlik faktörler plasmid kodlu ya da transfer edilmiştir. E. coli iki sitotoksin üreten, Verotoksin 1 ve yılından beri bilinir.bu verotoksinlerin genleri (VT) propajın alanında kromozomun da yerleşiktir. E. coli tekini veya iki geni birden içermesi bakımından ayrımlanır.çünkü verotoksinlerin, Shigella dizanterinin toksini olan Shigatoksine benzerliği görülür, bunlarda Shiga-like Toxins I ve II (SLT I and II)olarak anılır.ekolinin oluşturduğu verotoksinler (VTEC) ciddi isale sebep olur. Enterohaemorrhagic E. koli (EHEC) ilk defa 1982 yılında tanımlandı, Serovar O157:H7 ait olarak. EHEC in farklı O serovarları tanımlandı. İlave olarak önemli patojeniti faktörler, EHEC tipin karakteristiği plamid kodlu ve intimin adhezindir. eae A geni diğer virüssel faktörlerle kromozom üzerinde patojeniti ada üzerindedir. (PAI). EHEC tarafondan olan kastalıkların klinik semptomu, orta şiddetli isal,ciddi gastroenterit, kolit, olan enfeksiyonların %10-20 sinde görülür.%5-10 enfeksiyon ise, bebeklerde, küçük çocuklarda, yaşlılarda, bağışıklık sistemi düşük kişilerde, Hemolitik üremi sendromu (HUS) ya da trombotik, trombositopenik pupura (TTP) olarak hayatı tehtit eden komplikasyonlardır. HUS ve TTP olan bebekler arasındaki ölüm oranı %10-15 dir. Akut böbrek yetmezliği geçici dialize ihtiyaç duyar, tamamen böbreğin kaybında dialize ihtiyaç duyabilir.klinik resmin şiddeti hastanın predipozisyonuna bağlıdır, ve aynı zamanda da EHEC fenotipe bağlıdır.bunun anlamı hastalığın seyrinin patojenik faktörlere bağlı olduğudur.faktörleri bugün hala bilinmeyen rolleri vardır.inkübasyon periyodu 1-3 gün olup enfektif doza bağlıdır.8 günde sürebilir.çünkü EHEC in yüksek çevresel direnci ve yüksek asit toleransı, enfekte dozu yaklaşık olarak 100 organizmadır.enfeksiyon kaynakları keçiler, koçunlar,sığırlar, özellikle çiğ et,et ve et ürünleri yeteri kadar pişirilmemiş ya da pastörize olmamış çiğ, onaylanmamış süt.enfeksiyon zinciri, insandan insanadır örneğin; toplu yaşam alanlarında anaokullarında, yaşlı insanların evleri ya da hastaneler, hayvanlarla direk kontak olan kişiler.hastaların çevresinde klinik olarak asimtomatik taşıyıcılar bulundu.ehec enfeksiyonunun teşhisinde ilk metotlar yetersiz bulundu. RIDASCREEN Verotoxin

3 Yaklaşık olarak E. Kolinin %1 i EHEC gruba dahil değildir ve enterohemosiline sebep olur. enterohaemolytic koli bakterinin tespiti kanlı agarda EHEC için önemli bir faktör değildir.ama EHEC bateriler vardır HUS hastalarından ayrılır ve bunlar enterohaemolysin olarak açıklanmaz. Almanya da O157tipi HUS durumlarının %70-80 ninden sorumludur. Gerçekte diğer serovarlar saf gastroenterit vakalarında prodominanttır. Bu sebepten, Serovar O157 deteminasyonu yeterli değildir.teşhis prosedürü bugün mtsb içinde zenginleştirilmiş patojenler bir gece bekletilir (Mitomycin C katkısı ile, 50 ng/ml) ve sonra ayrım yapılır.verotoksin determinasyonu aynı zamanda gaita süspansiyonundan kültür çalışması ile en güvenilir bir şekilde de çalışılmalı. Bu test immunolojik olrak ELISA kullanılarak sitopatik etkiler ile sınırlayarak verocel kültür olarak çalışılır.veroceldeki sitotoksisiti, ELISA tekniği kolay metottur ve laboratuvarda uygulanabilir.her iki metotta da ön zenginleştirme tekniği kullanılır. Çünkü, toksin seviyesi gaitada çok düşük olabilir.hus ve TTP hastalarıyla eliminasyon durabilir.yanlış sonuçlar gaitanın zenginleştirme yapılmadan çalışılmasından kaynaklanabilir.bu yaklaşımın hassasiyeti az olduğu için, negatif sonuçlar provizyonel belirti yer alabilir.bu durumda, zenginleştirme yapıp çalışmak zorunlu olur.sadece semptomatik iyileştirme HUS ya da TTP ile tavsiye edilir.bu genellikle isal ve plazmaferezi içerir.böbrek yetmezliğinde, heoma ya da transperitonal de dializ yapılır. 3. Test prensibi RIDASCREEN Verotoxin test, sandvç metota spesifik antikorlar kullanır. Verotoksin 1 ve 2 ye karşı olan antikorlar kuyucukların yüzeyine uygulanır. Gaitadan hazırlanan numune süspansiyonu ve kontroller kuyucuklara pipetlenir oda sıcaklığında (20 25 C) inkübasyona bırakılır. Yıkama adımından sonra, verotoksin karşı olan peroksidazla konjuge edilmiş antikorlar eklenir ve oda ısısında (20 25 C) inkübasyona bırakılır. Verotoksin antijenlerinin mevcudiyetinde sandviç kompleks sabitlenmiş antikorlar, Verotoksin antijenleri ve konjuge edilmiş antikorlar içerir.enzimle işaretli bağlanmamış antikorlar yıkama esnasında uzaklaştırılır.substrat eklendikten sonra, bağlı enzim daha önce renksiz olan solüsyonu rengini maviye dönüştürür eğer numune pozitif ise.stop reaktifi eklenmesiyle de mavi renk sarıya dönüşür.oluşan rengin şiddeti numunedeki Campylobacter antijenleri ile doğru orantılıdır. RIDASCREEN Verotoxin

4 4. Sağlanan Reaktifler Pakette 96 teste yetecek kadar reaktif bulunur. Pleyt 96 test. Mikrokuyucuklu pleyt, 12 mikrokuyucuklu strip (kırılabilir);monoklonal antikorlar (fare) Verotoksin 1ve 2 ye karşı Diluent ml Numune dilüsyon bufer, protein buffer NaCl solüsyonu; % 0.05 Proklin 300 içerir; kullanıma hazırdır; yeşil renkli Yıkama 100 ml Yıkama buffer, fosfat buffer NaCl solüsyonu (10-kat konsantre); % 0.1 Thimerosal içerir. Kontrol ml Inaktive edilmiş Verotoksinler; kullanıma hazır;% 0.1 Kathon içerir Konjugat 10 ml Stabilize edilmiş protein solüsyonu içinde, Verotoksin I ve II ye karşı konjuge edilmiş peroksidazlı antikorlar, %0.05 Proclin 300 içerir; kullanıma hazırdır, yeşil renkli Substrat 10 ml Ure peroksit/tmb; kullanıma hazır Stop 6 ml Stop reaktifi, 1 N sülfürik asit kullanıma hazırdır. 5. Saklama gereklilikleri Tüm reaktifler 2 8 C de saklanabilir ve etiketin üzerinde basılı tarih kadar kullanılabilir. Dilüe edilen yıkama solüsyonu 2 8 C de saklanır. Maksimum 4 hafta kullanılabilir.mikrobiyal kontaminasyona mutlaka önlenmelidir. Miadı geçtikten sonra kalite garantisi geçerli değildir. Alüminyum çanta kilidinden açılmalı, kilit yırtılmamalı. Kullanılmayan kuyucular çantanın içine geri konulmalıdır ve 2 8 C de inkübe edilmelidir. Renksiz substrat, bozulmasını engellemek ya da okside olarak mavi renge dönüşmesinin önüne geçmek için, direk olarak gün ışığından korunarak saklanmalıdır. Açılan substrat mavi renge dönerse kullanılmamalıdır. RIDASCREEN Verotoxin

5 6. Ek olarak gerekli reaktifler ve ekipmanlar 6.1. Reaktifler - Distile su ya da deiyonize su 6.2. Aksesuarlar - Test tüpleri - Yıkama ünitesi ya da çok kanallı pipet (300 µl) - Pleyt okuyucu (450 nm ve 600 nm referans filtre (gerekirse)) - Santrifüj(en az 5000 rpm) - Karıştırıcı, uygun mikropleyt - Vorteks mikser - Alarm saati - Mezür (1000 ml) - Mikropipet µl ve 1 ml hacim için - Filtre kağıdı (laboratuar havlusu) - %0.5 hipoklorit içeren solüsyon 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir. Mutlaka eğitimli bir personel tarafından kullanılmalıdır.medikal laboratuvar çalışanları için olan rehber takip edilmeli ve oradaki direktiflere tamamen uyulmalıdır. Kitte bulunan pozitif kontroller inaktive edilmiş Verotoksin içerir. Buna rağmen kontroller ve numuneler mutlaka enfekte materyal gibi, ulusal güvenlik kurallarına göre muamele görmelidir. Numuneler ya da reaktifler ağız ile pipetlememeli ve yaralı deriyle, mukoz membran ile teması önlemelidir. Numuneler, eldiven giyilerek çalışılmalı ve test bittiği zaman eller yıkanmalıdır. Numuneler veya reaktifler ile çalışırken sigara içmeyiniz, yemek yiyip içmeyiniz. Pozitif kontrol, numune dilüsyon buffer ve konjugat buffer koruyucu olarak % 0.05 Proclin 300 içerir.bu maddeler deri ve mukoz membran ile temas ettirilmemelidir. RIDASCREEN Verotoxin

6 Yıkama bufer koruyucu olarak % 0.1 Thimerosal içerir. Deri ve mukoz membran bu madde ile temas etmemelidir. Ure peroksidaz yanmaya sebep olur. Dikkatli kullanın. Stop reaktifi 1 N sülfirik asit içerir.deri ve elbiseniz ile temastan kaçının.deriniz temas etmiş ise bol su ile durulayınız. Tüm reaktiflere ve materyallere, enfeksiyon kapma riski olan numuneler gibi davranılmalı ve uygun bir dezenfektan veya otoklav ile 121 C de en az 1 saat dezenfekte edilmelidir. DİKKAT: Zehirli gazların oluşumunu önlemek için,stop reaktifi içeren her atık sıvı hipoklorit solüsyonu eklemeden önce nötralize edilmelidir. 8. Numune toplama ve saklama Gaita numuneleri test başlamadan önce 2 8 C de bekletilmelidir.eğer 3 günden fazla saklamak gerekiyorsa, numuneler 20 C de saklanmalıdır. Bu durumda da numuneler test edilmeden önce oda ısısında tamamen çözülmelidir. Tekrar tekrar çözüp dondurmaktan kaçınılmalıdır. Gaita numunesi ve rektal swap taşıma konteynır ile toplanmalıdır, bu transport medianın içinde koruyucular, hayvan serumu, metal iyonları, oksitleme ajanı ya da deterjan içerir bunlarda RIDASCREEN Verotoxin testine olumsuz etki yapabilir. Eğer rektal swap kullanıldıysa, test için, yeteri kadar gaita (yaklaşık 100 mg) alındığından emin olunuz. 9. Test prosedürü 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve Mikropleyt Pleyt kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmeli (20 25 C) Kuyucuklar oda sıcaklığına gelene kadar alüminyum çantadan çıkarılmamalıdır.reaktifler kullanılmadan önce karıştırılmalıdır.kullanılmayan kuyucuklar ve reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır.kullanılan kuyucuklar tekrar kullanılmamalıdır.zarar görmüş paketteki malzemeler kullanılmamalıdır. Çapraz reaksiyonu önlemek için numunelerin kit komponentleri ile temasından sakınılmalıdır.test direk olarak gün ışığına maruz kalmamalıdır. Kuyucuğun üzerini kapatıp buharlaşma kayıplarını engellemenizi tavsiye ederiz. RIDASCREEN Verotoxin

7 9.2. Yıkama buferı hazırlama 1 hacim yıkama konsantre bufer ile Yıkama 9 hacim distile suyu karıştırın. Yıkama bufer içinde olan herhangi bir kristalleşme varsa, kullanmadan önce 37 C de su banyosunda çözülerek kullanılmalıdır Numune hazırlama İlk sonucu çabukça elde etmek için, numuneden toksin tespiti direk olarak uygulanabilir. Çünkü numunede toksin miktarı çok az olabilir ve bundan dolayı çıkacak negative sonuç EHEC negatif olrak değerlendirilmemelidir. Genelde, hassasiyeti artımak için zenginleştirme uygulanan numunelere toksin determinasyonu uygulanmalıdır. Almanya da, bir gece Mitomycin C katkılı (50 ng/ml) mtsb içinde karıştırcı içinde 37 C de çalıkalanır.diğer zenginleştiriciler r enrichment BRILA ya da GN broth negatif bir etki yapmaz. (matriks etkisi) RIDASCREEN Verotoksin EIA; zenginleştirmeyi karşılamaz Taze numunenin ya da dondurulmuş numunenin araştırması Gaita numunesi Verotoksin Numune dilüenti ile 1 : 5 (v/v) dilüe edin.bunun için tek kullanımlık pipet kullanın.(makale no: Z 0001) 1 ml sıvı gaita 4 ml buffer ile karıştırılır ve etiketlenmiş test tüpüne konur.katı numuneler için, ekstraksiyon için tek kullanımlık inokulasyon loop ilgili hacimde kullanın. Homojen hale gelen gaita numuneleri pipetle çekip bırakılarak ya da mikser ile karıştırılır.kısa bir sure için bekletilir (10 dakika, berrak sediment) 100 µl süspansiyon süpernatantı direk olarak teste uygulanır. Not: Düşük hassasiyetten dolayı, zenginleştirme yapmadan testler tarama testi gibi değerlendirilmelidir.negatif sonuç anlamsızdır. Bu durumda numune zenginleştirilip test tekrar edilmelidir Zenginleştirilen kültürden test etme Tarif edilen prosedür RKI (Robert Koch Institute) ve BfR (German Institute for Risk Evaluation). Riayet eder. RIDA Anreicherungsbouillon (Article no: Z 1000) daki direktiflere uyun. (RIDA Anreicherungsbouillon) supernatant zenginleştirme direk olarak dilue etmeden santrifüjden sonra uygulanabilir. Not:Sıcaklığın broth ve negatif kontrolde eşitlendiğinden emin olun. (her ikiside testing başında,oda sıcaklığında (20 25 C) olmalıdır). Yükselen broth sıcaklığı yanlış pozitif OD değerlerine sebep olur. RIDASCREEN Verotoxin

8 İlk olarak, 100 µl sıvı gaita ya da ona eş değer ( mg) katı gaita 4 ml Mitomycinli C (e.g. RIDA Anreicherungsbouillon, Article no: Z 1000) mtsb içine konur ve karıştırıcı (yaklaşık olarak rpm) üzerinde uygun miktarda oksijen varlığında, 37 C de saat inkübe edilir. Yatay karıştırıcı veya rotary mikser uygundur.inkübasyondan sonra, 3000 rpm de 15 dk için santrifüj edilir.elisa testi için 100 µl temiz süpernatanttan kullanın. Sediment ve orjinal numune konfirmasyon için saklanmalıdır. Saklamak için ideal metot : sedimenti swapa absorbe edin (Amies, Stuart or Cary Blair) ve 2 8 C saklanır İlk İnkübasyon Yeteri kadar kuyucuk çalışma çerçevesine yerleştirildikten sonra 2 damla (100 µl) pozitif kontrol Kontrol +, numune dilüsyon buferı Diluent 2 (= negatif kontrol) ve numune süspansiyonu kuyucuklara konur.oda sıcaklığında (20 25 C) 60 dk inkübe edilir Yıkama Yıkamada tamamen direktiflere uymak doğru sonuç elde etmek için çok önemlidir. Kuyucuklarda inkübe edilen madde mutlaka dezenfeksiyon için hipoklorit içeren atık kabına atılmalıdır. Bundan sonra, kalan damlaları için emici bir kağıt üzerinde vurarak alınız.bundan sonra her seferinde 300 µl olmak üzere, yıkama bufer ile 5 defa yıkayınız.her yıkamadan sonra her yıkamadan sonra, emici kağıda vurarak kalan damlalar emdirilir. ELISA yıkayıcı kullanıyorsanız, cihazın mikropleyt tipine uygun olduğu kontrol edin.daha da ötesi partiküle sahip olan numune süspansiyonu pipetlenmiş ise ilk yıkama manuel olarak yapılmalıdır, yoksa yıkayıcının uçlarını tıkayabilir. Aynı zamanda yıkama işleminde tüm sıvının emildiğinden emin olunuz.her yıkamadan sonra kalan damlaları absorbe edecek bir kağıda veya havluya emdiriniz.optimum yıkama sonucunu elde etmek için kuyucuk başına en az 600 μl yıkama buffer kullanılması önerilir.yıkama sayısı daha iyi sonuç elde etmek için 5 den fazla yapılabilir İkinci İnkübasyon 2 damla (100 µl) enzim konjugat Konjugat kuyucuklara pipetle ve oda ısısında (20 25 C) 30 dakika inkübe et. RIDASCREEN Verotoxin

9 9.7. Yıkama Yıkama Bölüm 9.5i uygulayınız. Direktiflere tam olrak uyunuz Üçüncü inkübasyon 2 damla (100 µl) substrat Substrat her kuyucuğa ekleyiniz.daha sonra oda sıcaklığında (20 25 C) karanlıkta 15dk için bekletin. 1 damla (50 µl) stop reaktifini Stop her kuyucuğa ekleyin. Dikatle karıştırdıktan sonra (hafifçe pleytin kenarına vurarak)ana filtre 450 nm ve referans filtre 600 nm (opsiyonel) kullanarak ölçünüz. Mikro pleyt olmadan havaya karşı sıfırlayınız. Not: Yüksek pozitif numuneler,substratı siyah sediment olarak çöktürebilir. 10. Kalite Kontrol reaktifin miadı Kalite kontrol amacı için, negatif ve pozitif numune çalışılır; testin doğru çalıştığından ve reaktiflerin stabilitesinden emin olunur.negatif kontrol (O.D.) 450 nm de < 0.2 ise ve pozitif kontrol > 0.8 ise doğru çalışılmıştır. Eğer negatif kontrol monokromatik çalışma için >0.2 yıkamanın yetersiz olduğunu ifade eder.eğer bulunan değerler beklenenlerden farklı ise ve substratta bulanıklık varsa ya da maviye dönüşmüş ise reaktifin eskidiğini gösterebilir. Şart koşulan değerlerle sonuçlar çakışmazsa, test tekrar edilmeden önce aşağıdaki noktalar kontrol edilmelidir: Kullanılan reaktiflerin miadı Kullanılan ekipmanların fonksiyonları(örn:kalibrasyon) Test prosedürünü kontrol edin Kit kontaminasyonuna yönelik akma veya herhangi bir gözle görülen bir bozulma substrat maviye dönmüş olmamalıdır. Bunlardan emin olduktan sonra, yeni kaset ile testi tekrar ettiğinizde, eğer kontrol bandı görünür değilse, lütfen üretici ya da R-Biopharm distirübütör ile kontak kurunuz. 11. Değerlendirme ve yorumlama 11.1 cut-off hesaplama Test edilen materyale bağlı olarak (süpernatantdan veya zenginleştirilmiş numuneden) farklı cut off kullanılır. RIDASCREEN Verotoxin

10 Zenginleştirilen kültürden Cut off oluşturmak için, negatif kontrol OD değerine 0.1 eklenir. cut-off = negatif kontrol OD Taze Numune ya da derin dondurucuda dondurulmuş numuneden olan çalışma (zenginleştirme olmadan) Cut off oluşturmak için, negatif kontrol OD değerine 0.2 eklenir. cut-off = negatif kontrol OD Test sonucu Cut off değerinden % 10 da yüksek O.D. ye sahip numuneler pozitif olarak değerlendirilir. Eğer sonuç Cut of değerinin % ± 10 arasında ise şüpheli olarak değerlendirilir.eğer testin tekrarı da gri zonda çıkarsa numune negatif olarak değerlendirilmelidir. Cut off değerinin %10 altında çıkan değerler ise negatif olarak değerlendirilir. 12. Metot Limitleri RIDASCREEN Verotoksin test E. kolinin ürettiği verotoksin I ve II taoksinleri gaitada veya zengileştirilmiş numunede tespit eder. Test çalışmasında oluşan rengin şiddeti, ciddi klinik semptomların oluşması ilişkisi kullanılamaz. Sonuçlar klinik tablo ile birlikte değerlendirilmelidir.pozitif toksin sonuçlarında organizmayı tanımlamada en güvenilir metot EHEC tespitidir. Pozitif sonuçlar, diğer bulaşıcı patojenlerin olmadığı anlamına gelmez. Negatif sonuçlar E. coli enfeksiyonu olmadığını göstermez. Bu enfeksiyon aralıklı olarak salgılanan patojenler ya da az miktardaki numune olan antijenleri miktarı ile alakalı olabilir. Eğer hasta anemik ve verotoksin üreten E. coli şüphesi var ise, bir başka gaita numunesi alınarak test tekrar edilmelidir. Bazı EHEC strainler az miktarda verotoksin üretir. Verotoksin miktarı gaita numunesinde sıklıkla az miktarda olur, direk toksin determinasyonu metodu hassas değildir.pozitif sonuçlar, EHEC enfeksiyonunu gösterir. Negatif sonuç ise enfeksiyon olmadığı anlamına gelmez. RIDASCREEN Verotoxin

11 Şüpheli sonuçlara sebep gaitada virüslerin homojen dağılımında olmamasından kaynaklanabilir. Eğer bu olursa, aynı numuneden yada yeni bir numuneden ikinci bir süspansiyon hazırlanıp test edilmelidir. Pozitif toksin sonucu sonunda, E. Coli nin ayrımına gidilir. Patojeni tanımlama ve karekterini belirleme toksin tanımlama ile klinik semptomların değerlendirlmesi ile birlikte olur.ehec enfeksiyonu mevcut bile olsa, toksin determinasyonu zenginleştirilmiş kültürden negatif olarak dönebilir.zenginleştirme optimumdan az olabilir.buna ilave olrak, toksin içeriği çok az olabilir, E. Koli olmasına rağmen negatif sonuç alınır. Buna sebep Fiziksel E. Koli florasında EHEC in az olmasıdır. (bazı durumlarda EHEC E. coli), ve toksin üretimi ve eliminasyonu kesin büyütme koşullarında durur.sonuç olarak,toksin determinasyonu gaitadan düşük pozitif ama zenginleştirilmiş kültürden negatif olur. RIDASCREEN Verotoxin ELISA çok hassas bir testdir., şüpheli veya düşük pozitif sonuçları spesifik olmayan matriks etkisinden olur, numune zenginleştirme olmadan çalışılırsa. Direk determinasyonda yıkama zorunludur. Sendrom sonrası gelişme örneğin HUS ya da TTP, organizmaların tanımlanmasını imkansız hale getirebilir. Bu durumda Verotoxin ELISA negatif sonuç verecektir. Mümkün olduğu kadar enterik fazda test yapmak önemlidir. Bütün diğer hususlarda, EHEC diyagnostik planının uygulanması (Lit. 15) national reference centre of the Robert Kochenstitüsü tarafından tavsiye edilir. 13. Performans nitelikleri Test kalitesi Klinik çalışmada, RIDASCREEN Verotoxin test zenginleştirmeden sonra 223 numuneye uygulandı; bunların 221 tanesine aynı zamanda zenginleştirmeden çalışıldı.bu çalışmada, veroceller üzerinde sitotoksisiti testi referans metot olarak kullanıldı. Aynı zamanda RIDASCREEN Verotoxin ELISA Paul Ehrlich enstitüsü tarafından onaylanmış başka bir ELISA testi ile kıyaslandı.sonuçlar Tablo 1 de özetlenmiştir.süpernatant 1/5 oranında sitotoksisiti testi için dilüe edildi. ELISA testleri üretici direktiflerine gore çalışıldı. RIDASCREEN Verotoxin

12 Table 1: RIDASCREEN Verotoxin EIA zenginleştirilen küşltürden süpernatant RIDASCREEN EIA Diğer EIA (Zenginleştirmeden sonra) (Zenginleştirmeden sonra) sitotoksisiti test* (Zenginleştirmeden sonra) * Sitotoksisiti testinde pozitif olmayan numuneleri VTEC ile ayırım yapıldı. Bu numuneler pozitif olarak sayılıp aşağıdaki bilgiler elde edildi. RIDASCREEN EIA Diğer EIA Hassasiyet: 83.3 % Hassasiyet: 76.6 % Özgüllük: 98.4 % Özgüllük: 98.4 % Gaita numunesi zenginleştirilmeden yapılan EIA sonuçları Tablo 2 de özetlendi. Zenginleştirilen numunelere yapılan sitotoksisiti testi referans Kabul edildi. Sitotoksisiti için TSB medianın içinde ve RIDASCREEN EIA için gaitalar 1 : 5 dilüe edildi. ELISA testleri üretici direktiflerine göre çalışıldı. Tablo2: RIDASCREEN Verotoksin EIA zenginleştirmeden RIDASCREEN EIA Diğer EIA (zenginleştirmeden) (zenginleştirmeden) sitotoksisiti test* (after enrichment) * Sitotoksisiti testinde pozitif olmayan numuneleri VTEC ile ayırım yapıldı. Bu numuneler pozitif olarak sayılıp aşağıdaki bilgiler elde edildi. RIDASCREEN EIA Diğer EIA Hassasiyet: 35.7 % Hassasiyet : 42.8 % Özgüllük: 98.4 % Özgüllük : 99.5 % RIDASCREEN Verotoxin

13 Zenginleştirmeden yapılan testlerde düşük hassasiyet ve gözlemlendi.zenginleştirme yapmadan çalışmak hassas değildir ve çalışılmamalıdır devamlı konfirmasyon gerektirir Analitik hassasiyet RIDASCREEN Verotoxin testinin analitik hassasiyeti diğer Verotoksin EIAs testleri ile ispatlandı.bu nedenle, VT 1 ya da VT 2 kültür seri dilüsyon hazırlanıp çalışıldı.sonuçlar Tablo 3 de listelendi. Verotoksin için referans bir standart olmadığı için hazırlanan protein konsantrasyonu bilgisi verilmedi. Tablo 3: RIDASCREEN Verotoxin EIA nın analitik hassasiyeti Dilüsyon VT 1 VT 2 RIDASCREEN Diğer EIA RIDASCREEN Diğer EIA 1 : : : : : : : RIDASCREEN EIA Diğer EIA Pos. kontrol: Neg. kontrol: Şüphelil: Çapraz Reaksiyon İlintili organizmalar bir gece 37 C zenginleştirici mediada bekletildi ve 10 6 organizma/ml içeren kültür test edildi.(tablo 5). Klinik çalışma boyunca, aşağıdaki organizmalar ayrımı yapıldı ve RIDASCREEN Verotoxin test ile reaksiyon vermedi(tablo 4). Tablo 4: Patojenik mikroorganizmalar ile çapraz reaksiyon (hasta numunelerinden) Mikro-organizma Campylobacter jejuni Candida albicans Clostridium difficile Cryptosporidium Giardia lamblia Proteus RIDASCREEN Verotoxin

14 Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Staph. aureus Yersinia enterocolitica Adenovirus Rotavirus Tablo 5: Patojenik mikroorganizmalar ile çapraz reaksiyon (kültürden) Mikro-organizma OD 450nm - OD 620nm Acinetob. lwoffii DSM Aeromonas hydrop. anaerogenes DSM Aeromonas hydrop. hydrophila DSM Campylobacter coli Campylobacter fetus Campylobacter jejuni Citrob. freundii* Citrob. freundii DSM Enterob. cloacae DSM Enterococcus faecalis DSM Enterococcus faecium ATCC E. coli* E. coli* E. hermanii DSM Lactococcus lactis DSM Listeria innocua* Morganella morganii Proteus mirabilis DSM Proteus mirabilis DSM Proteus vulgaris DSM Providencia stuartii DSM Pseudom. aerug. DSM Pseudom. fluorescens DSM Pseudom. fluorescens DSM Salmonella agona* Salmonella braenderup* Salmonella infantis* Salmonella Ohio* RIDASCREEN Verotoxin

15 Salmonella typhimurium* Serratia proteamaculans DSM Shigella flexneri DSM Shigella sonnei DSM Staph. aureus DSM Staph. aureus* Strep. agalactiae* Strep. dysgalactiae* Strep. uberis* E. coli 026:H8 VT Pozitif kontrol E. coli VT 1+2 (0157:H7) Negatif kontrol (mtsb) Pozitif kontrol (test kit) Cut-off * izole olmuş Presizyon Intra-test Verotoksin 1 ve 2 preparatları (VT 1 ve VT 2) kullanılarak 4 farklı konsantrasyonda 24 ölçüm yapıldı.ortalama değer,standart deviasyon,cv verildi. Intra-test Verotoksin 1 ve 2 preparatları (VT 1 ve VT 2) 4 farklı konsantrasyonda 11kez bağımsız şekilde çalışıldı.(3 test-kit lotu, 5 teknisyen ile 7 günde). Ortalama değer,standart deviasyon,cv verildi (11 test/numune). Sonuçlar Tablo 6dadır. Tablo 6: RIDASCREEN Verotoxin EIA Intra-test VT 1 Ortalama OD Standart deviasyon CV (%) Intra-test VT 2 Ortalama OD Standart deviasyon CV (%) Inter-assay VT 1 Ortalama OD Standart deviasyon negatif Düşük pozitif pozitif Güçlü pozitif RIDASCREEN Verotoxin

16 CV (%) Inter-test VT 2 Ortalama OD Standart deviasyon CV (%) RIDASCREEN Verotoxin

17 Referanslar 1. Beutin, L. et al.: Zur Epidemiologie von Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) in der Bundesrepublik Deutschland im Jahr Bundesgesundhbl. 10, (1994) 2. Beutin, L.: Infektionen mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundhbl. 11, (1996) 3. Bockemühl, J. et al.: Zur aktuellen Bedeutung der enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in Deutschland ( ). Bundesgesundhbl. 8, (1996) 4. Bockemühl, J. et al.: Infektionen des Menschen durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) in Deutschland, Bundesgesundhbl. 6, (1997) 5. Bülte, M.: Enterohämorrhagische E. coli-stämme (EHEC) - Aktuell in der Bundesrepublik Deutschland? 1. Pathogenitätspotential von EHEC-Stämmen - Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. (Literaturübersicht) Fleisch-wirtschaft 75, (1995) 6. Bülte, M. et al.: Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) - aktuelle Lebensmittelinfektionserreger auch in der Bundesrepublik Deutschland? 2. Nachweis von VTEC- Stämmen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs Fleischwirtschaft 76, (1996) 7. Donohue-Rolfe, A. et al.: Purification of Shiga Toxin and Shiga-Like Toxins I and II by Recptor Analog Affinity Chromatography with Immobilized P1 Glycoprotein and Production of Cross-Reactive Monoclonal Antibodies. Infection and Immunity, Dec., (1989) 8. Karch, H. et al.: Clonal Structure and Pathogenicity of Shiga-Like Toxin-Producing, Sorbitol- Fermenting Escherichia coli 0157:H -. Journal of Clinical Microbiology 5, (1993) 9. Kuntze, U. et al.: Nachweis von verotoxinbildenden E. coli-stämmen in Roh-milch und Rohmilchkäse. Archiv f. Lebensmittelhygiene 47, (1996) 10. Ritchie, M. et al.: Comparison of a Direct Fecal Shiga-Like Toxin Assay and Sorbitol- McConkey Agar Culture for Laboratory Diagnosis of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. J. of Clin. Microbiol., Feb., (1992) 11. Strockbine, N. A. et al.: Characterization of Monoclonal Antibodies against Shiga-Like Toxin from Escherichia coli. Infection and Immunity, Dec., (1985) 12. Takeda, Y. et al.: Vero Toxins (Shiga-Like Toxins) Produced by Enterohemorrhagic Escherichia coli (Verocytotoxin-Producing E. coli). Microbiol. Immunol., 37 (8), (1993) 13. Walterspiel, J. N. et al.: Effect of Subinhibitory Concentrations of Antibiotics on Extracellular Shiga-like Toxin I. Infection 20, No. 1, (1992) 14. Gerritzen, A. et al.: Flüssige Vorkultur von Stuhlproben verbessert den EHEC- Toxinnachweis mit ELISA und Zytotoxizitätstest. J. Lab. Med. 22 (2), (1998) 15. Fruth, A. et al.: Zur Verbesserung der gegenwärtigen bakteriologischen Diagnostik von enterohemorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundheitsbl.- Gesundheitsforsch.-Gesundheitsschutz 43, (2000) RIDASCREEN Verotoxin