RIDASCREEN Verotoxin. Makale no: C2201

Transkript

1 RIDASCREEN Verotoxin Makale no: C2201 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Almanya Telefon: +49 (0) / Fax: Faks: +49 (0)

2 1. Kullanım amacı İn vitro diagnostik kullanım içindir. RIDASCREEN Verotoxin testi dışkı örnekleri ve zenginleşme kültürleri içinde Escherichia coli Verotoxins 1 ve 2 (Shiga-like toksin I ve II) kalitatif tespiti için enzim immunoassaydir. 2. Özet ve testin açıklaması Escherichia coli tip enterobacteriaceae (E. coli) insanlar ve birçok çiftlik hayvanı bağırsaklarının sağlıklı florasında bulunur. Bu nedenle onlar ayrıca sularda ve gıdada fekal kontaminasyonun göstergesi olarak düşünülür. Bunlar gram negatifdir, peritrichal kamçılama ile hareket eden fakültatif anaerobik çubuk bakteriler. E. coli O antijenleri (dış membranın LPS) ve H antijenleri (flagellar antijenler) dayalı farklı serovarlara bölünebilir. E. coli sıklıkla plazmidkodlu veya fajlar tarafından aktarılan değişik patojenite faktörlerden dolayı fakültatif patojenler olarak düşünülmelidir. İki sitotoksin üretme kapasitesine sahip E. coli, Verotoxin 1 ve 2, 1977 yılından bu yana bilinmektedir. Bu verotoksinlerin genleri (VT) bu profaj alanı içinde kromozom üstünde bulunur. Her ikisini veya yalnızca iki genden birini içeren E. coli izole edilmiştir. Verotoksinlerin Shigella dysenteriae Shiga toksinine benzerliğinden dolayı Shiga-like Toksinleri I ve II (SLT I ve II) olarakta adlandırılırlar. E. coli (VTEC) üreten bu verotoksinin bazısı diğer patojenik faktörleri oluşturarak ciddi hemorajik ishalleri neden olabilir. Bu enterohemorajik E. coli (EHEC) "prototipi" ilk kez 1982 de belirlendi Serovar O157:H7 ait olarak. O zamandan beri, ancak değişik farklı O serovarların EHEC tanımlanmıştır. EHEC tipinin karakteristiği olan önemli ek patojenite faktörler plazmid-kodlu enterohaemolysin ve intimin adhezindir, geni (eae A) diğer virulans faktörlerinin genleriyle birlikte kromozom üstünde patojenik adada (PAI) bulunur. EHEC kaynaklı klinik belirtiler hafif ishaller ve şiddetli gastroenteritlerden enfeksiyon durumlarının yaklaşık 10-20% sinde oluşan hemorajik kolite kadarki aralıktadır. Enfeksiyonların 5-10% u ile, özellikle bebekler ve küçük çocuklarda ve zayıflamış bağışıklık sistemine sahip yaşlı hastalar veya hastalarda bu hemolitik üremik sendromu (HUS) veya hayatı tehdit eden post-enfeksiyöz komplikasyon olarak thrombotik trombositopenik purpura (TTP) yol açabilir. HUS ve TTP ile mortalite bebekler arasında özellikle yüksektir (yaklaşık 10-15%). Diyaliz için geçici ihtiyacı olan akut böbrek bozukluğu veya diyaliz için sürekli ihtiyaç haliyle sonuçlanan böbrek fonksiyonunun geri dönüşümsüz kaybı oluşabilir. Klinik tablonun yoğunluğu hastanın yatkınlığına bağlıdır ancak ayrıca ilgili EHEC fenotipede bağlıdır; bu hastalığın ilerleyişinin ayrıca patojenik faktörlerin ifade edildiği farklı şekillere bağlı olduğu anlamına gelir. Bugün hala bilinmeyen faktörler ayrıca rol oynar. İnkübasyon periyodu enfektif doza bağlı olarak yaklaşık 1-3 gündür. Ancak 8 günde sürebilir. Yüksek çevresel direnci ve nispeten yüksek asit toleransı nedeniyle, EHEC için enfektif doz yaklaşık 100 organizmadadır. Enfeksiyon kaynakları, sığır, koyun veya keçi, özellikle çiğ et, RIDASCREEN Verotoxin

3 veya yeterince ısıtılmış et veya et ürünleri ve pastörize olmayan çiğ veya onaylı olmayan sütten kontamine gıdalardır. İnsandan insana enfektif zincirler, özellikle anaokulları gibi ortak tesislerde, yaşlılar için evler veya hastanelerde, hayvanlarla direkt temaslarda da önemlidir. Klinik olarak asemptomatik taşıyıcılar hastanın çevresinde de bulunmuştur. EHEC enfeksiyonunu teşhis eden ilk yöntemlerden bazıları tatmin edici olmadı. EHEC grubuna ait olmayan E. coli nin sadece yaklaşık olarak 1%i enterohaemolysin oluşturabildiği için kan agar üzerindeki enterohaemolytic colibacteria tespiti EHEC için kesinlikle önemli bir gösterge değildir. Ancak ayrıca HUS hastalarından izole edilmiş EHEC vardır ve enterohaemolysin göstermez. Ayrıca başlangıçta bulunan tip O157 nin Almanya'da HUS durumlarının sadece 70 80% ninden sorumlu olduğu bulunmuştur. Aslında diğer serovarlar saf gastroenteritlerin durumunda ağır basar. Bu sebepten dolayı, sadece Serovar O157 tespiti yeterli değildir. Bugün önerilen tanı prosedürü mtsb ortamında bir gece boyunca patojeni önceden zenginleştirmek (Mitomycin C katkısıyla, 50 ng/ml) ve sonra onu izole etmektir. Ayrıca en güvenilir patojenik faktörü olarak kültürün süpernatantından verotoksin belirlemek için denenmelidir. Bu, ELISA kullanılarak immunolojik olarak veya verohücre kültüründe sitopatik etkiyi belirleyerek yapılabilir. Verohücrelerdeki sitotoksisite testinin aksine, ELISA tekniği, RIDASCREEN Vero- toxin EIA içinde belirtildiği gibi, herhangi laboratuvarda kullanılabilen basit bir yöntemdir. Organizmanın önceden zenginleştirilmesi eliminasyon seviyesi ve toksin içeriği dışkıda çok düşük olabildiğinden iki yöntemde de gereklidir. Özellikle HUS ve TTP hastalarıyla, eliminasyon tamamen sona durdurulabilir. Bireysel temelde hızlı bir sonuç elde etmek için, toksini direkt olarak önceden zenginleştirme olmaksızın dışkıdan tespit etmeyi denemek mümkündür. Ancak bu yaklaşımın duyarlılık eksikliği nedeniyle, negatif bir sonuç sadece geçici gösterge olarak alınabilir. Bu durumda, zenginleştirme sonrası sonuç için beklemek zorunludur. Sadece bir semptomatik tedavi HUS veya TTP ile önerilebilir. Bu genellikle zoraki diürez ve plasmaphaeresis içerir. Toplam böbrek yetmezliği durumunda, haemo- veya transperitoneal diyalizi yapılır. Antibakteriyel bir kemoterapi bakteri eliminasyonunu uzattığından genellikle belirtilmez ve hatta toksin üretimini uyarabilir. 3. Test prensibi RIDASCREEN Verotoxin testinde, spesifik antikorlar sandviç-tip metotta kullanılır. Verotoxin 1 ve 2 karşı spesifik antikorlar mikrokuyu plakta kuyunun yüzeyine uygulanır. Test edilecek örneğin süspansiyonu ve kontoller inkübasyon için ortam sıcaklığında (20 25 C) mikrokuyu plaktaki kuyuya pipetlenir. Verotoksinlere karşı bir yıkama aşamasından sonra peroksidazkonjuge spesifik antikorlar eklenir ve oda sıcaklığında (20 25 C) plak inkübe edilir. Verotoksin varlığında immobilize antikorlardan, verotoksinler ve konjuge antikorlardan oluşan bir sandviç kompleks meydana gelir. Bağlanmayan enzim-etiketli antikorlar bir sonraki yıkama aşamasından esnasında uzaklaştırılır. RIDASCREEN Verotoxin

4 Substrat eklendikten sonra test pozitifse bağlanan enzim mikrokuyu plağın kuyularındaki önceden renksiz olan solüsyonun rengini maviye dönüştürür. Durdurma reaktifi eklenmesiyle renk maviden sarıya değişir. Ekstinksiyon örnekte bulunan toksin miktarıyla orantılıdır. 4. Sağlanan reaktifler Paket içindeki reaktifler 96 tespit için yeterlidir. Plate 96 det. Microwell plate, 12 microwell strips (which can be divided) in strip holder; coated with monoclonal antibodies (mouse) against Verotoxins 1 and 2 Diluent ml Sample-dilution buffer, protein-buffered NaCl solution; ready for use; green coloured Wash 100 ml Wash buffer, phosphate-buffered NaCl solution (10-fold concentrate); contains 0.1 % Thimerosal Control ml Inactivated Verotoxins; ready for use; Conjugate 10 ml Peroxidase-conjugated monoclonal antibody against Verotoxins 1 and 2 in stabilised protein solution; ready for use; green coloured Substrate 10 ml Urea peroxide/tmb; ready for use Stop 6 ml Stop reagent, 1 N sulphuric acid; ready for use 5. Saklama talimatları Tüm reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır ve etikette basılı tarihe kadar kullanılabilir. Sağlanan seyreltilmiş yıkama buffer 2 8 C de saklanır, maksimum 4 hafta kullanılabilir. Mikrobiyel kontaminasyon önlenmelidir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. Alüminyum çanta kilit parçalanmayacak şekilde makasla açılmalıdır. Gerekmeyen herhangi mikrokuyu strip hemen alüminyum çantaya konulmalı ve 2 8 C de saklanmaldır. Renksiz substratın ayrışması veya oto-oksidasyon nedeniyle maviye dönmesinden korunması için direkt ışıktan korunmalıdır. Substrat maviye dönmüşse kullanılmamalıdır. 6. Gerekli ek reaktifler ve gerekli ekipman 6.1. Reaktifler - Distile veya deiyonize su RIDASCREEN Verotoxin

5 6.2. Aksesuarlar - RIDA Anreicherungsbouillon (Makale no: Z1000) - Tek kullanımlık pipetler (Makale no: Z0001) - Vorteks karıştırıcı (isteğe bağlı, Kısım 9.3. bakın) l ve 1 ml hacim için mikropipet - Ölçüm silindiri (1000 ml) - Durdurma saati - Mikrotitrasyon pipetler veya çok kanallı pipetler için yıkama birimi (300 µl) - Mikrokuyu plaklar için fotometre (450 nm ve referans filtre 600 nm gerektiğinde) - Filtre kağıdı (laboratuvar havluları) % hipoklorit solüsyonu içeren atık kabı 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. Medikal laboratuvarlardaki iş kılavuzu gözlenmelidir. Testi yapmak için talimatlar sıkıca izlenmelidir. Kit içindeki pozitif kontroller inaktif verotoxin içerir. Buna rağmen onlar ve hasta örnekleri olası bulaşıcı gibi işlenmeli ve ulusal güvenlik düzenlemelerine uyumlu olarak kullanılmalıdır. Örnekler veya reaktifler ağızla pipetlenmemeli ve yaralı cilt veya mukoza membranlarıyla temas etmemelidir. Örnekleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve testin tamamlanmasından sonra ellerinizi yıkayın. Örnekler veya test reaktiflerinin kullanıldığı alanlarda sigara içmeyin veya birşey yiyip içmeyin. Pozitif kontrol, örnek dilüsyon buffer ve konjugat koruyucu olarak 0.05 % Proclin 300 içerir. Bu madde cilt veya mukoza membranıyla temas etmemelidir. Yıkama buffer koruyucu olarak 0.1% Thimerosal içerir. Bu madde cilt ve mukoza membranlarıyla temas etmemelidir. Üre peroksit yanıklara neden olabilir. Dikkatli kullanın. Durdurma reaktifi 1N sülfürik asit içerir. Cilt veya giysilerle temasını önleyin. Eğer cilt durdurma reaktifiyle kontamine olduysa suyla durulayın. Olası bulaşıcı örneklerle temas eden tüm reaktifler ve materyaller uygun dezenfektanlarla işlenmeli veya en az 1 saat 121 Cde otoklavlanmalıdır. DİKKAT: Zehirli gazların oluşumunu önlemek için durdurma reaktifi içeren herhangi sıvı atık hipoklorit solüsyonuna eklenmeden önce nötralize edilmelidir. RIDASCREEN Verotoxin

6 8. Numune toplama ve saklama Shigatoxin için test edilecek dışkı örnekleri taze kullanılmaz, bunlar zenginleştirme brotu içinde kullanılmadan önce aşağıdaki gibi saklanabilir: oda sıcaklığı veya 2 8 C de 24 saate kadar 2 8 C de 72 saate kadar Örneklerin dondurulması EHEC bakterisine zarar vereceğinden ve çoğalma yeteneklerini azaltacağından veya hatta zenginleşme kültüründe hiçbir şekilde çoğalmalarına izin vermeyeceğinden önerilmez. Dışkı örnekleri herhangi katkı maddesi olmadan temiz kaplarda toplanmalıdır ve testte başlamadan önce 2 8 C de saklanmalıdır. Kullanılan rektal swablar, testi yapmak için yeterli dışkı materyalinin (yaklaşık 100 mg) toplandığından emin olun. Kontakt izleme esnasında dışkı örnekleri asemptomatik taşıyıcıları belirlemek için klinik olarak göze çarpmayan kişilerden alınmalıdır. 9. Test prosedürü 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve mikrokuyu plak kullanımdan önce oda sıcaklığına(20-25 C) getirilmelidir. Mikrokuyu stripler oda sıcaklığına erişene kadar alüminyum çantadan çıkartılmamalıdır. Bu reaktifler kullanımdan hemen önce iyice karıştırılmalıdır. Kullanımdan sonra mikrokuyu stripler (kapalı çantalarda) ve reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır. Birkez kullanıldığında mikrokuyu stripler tekrar kullanılmamalıdır. Bu reakifler ve mikrokuyu stripler paketleme zarar görmüşse veya şişelerde sızıntı varsa kullanılmamalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için örneklerin kit bileşenleriyle direkt teması önlenmelidir. Bu test direkt güneş ışığında yapılmamalıdır. Buharlaşma kayıplarını önlemek için mikrokuyu plağın kaplanmasını veya üzerine film yerleştirilmesini öneririz Yıkama buffer hazırlama 1 kısım yıkama buffer konsantreyi Wash 9 kısım distile suyla karıştırın. Konsantre içinde bulunan herhangi kristal 37 C de su banyosunda ısıtılarak önceden çözülmüş olmalıdır Örnekleri hazırlama İlk sonucu hızlı şekilde elde etmek için bir toksin tespiti dışkı örneğinden direkt olarak yapılabilir. Dışkıdaki toksin içeriğinin çok az olma ihtimali olduğundan negatif sonuç negatif EHEC bulgusu olarak aynı olarak düşünülemez. Genelde duyarlılığı arttırmak için bir toksin tespiti zenginleşme kültüründen bir örnek üstünde yapılmalıdır hatta dışkı için bulgular negatif olduğunda. Almanya'da şu anda 37 C de çalkalayıcı üstünde gece boyunca Mitomycin C katkısıyla (50 ng/ml) mtsb ortamında zenginleştirme yapılması önerilir. BRILA veya GN brotu gibi diğer zenginleştirme ortamları RIDASCREEN Verotoxin EIA içinde herhangi negatif etki üretmedi (matriks etkileri); RIDASCREEN Verotoxin

7 ancak onlar profesyonel birlikler tarafından önerilen zenginleştirme ortamına uymamaktadır Taze veya derin dondurumuş dışkı örneklerinin araştırılması Verotoxin örnek dilüsyon buffer ile dışkı örneğini seyreltin 1 : 5 (v/v). Bunu yapmak için 1 ml likit dışkıyı ekstrakte etmek için tek kullanımlık pipet kullanın (Makale no: Z0001) ve etiketli bir test tüpünde 4 ml buffer ile karıştırın. Katı dışkılarla ilgili hacmi ekstrakte etmek için tek kullanımlık aşılama döngüsü kullanın. Tek kullanımlık bir pipetten emme veya ejeksiyon ile veya alternatif olarak vorteks karıştırıcıda karıştırarak dışkı süspansiyonunu homojenize edin. Kısa bir süre beklemeye bıraktıktan sonra (10 dakika, net sedimantasyon) test içinde direkt olarak 100 µl süspansiyon supernatantı kullanın. Not: Düşük duyarlılıktan dolayı, zenginleştirilmemiş dışkı örnekleri kullanılarak tespit sadece anamnestik nedenlerden dolayı aciliyet uğruna hızlı bir ön tarama testi olarak kabul edilebilir. Negatif bir sonuç anlamlı değildir. Bu durumda zenginleşmiş örnek üstünde bir testten sonuç için beklenmesi gerekir Zenginleşmiş kültürden örnekleri test etme Burada tanımlanan prosedür RKI (Robert Koch Institute) ve BfR (German Institute for Risk Evaluation) önerileriyle uyumludur. Lütfen ayrıca RIDA Anreicherungsbouillon (Makale no: Z1000) için test talimatını izleyin. Zenginleşmiş kültür supernatantı (RIDA Anreicherungsbouillon) kısaca santrifüjleme sonra daha seyreltmeden testte direkt kullanılabilir. Not: Brot ve negatif kontrol arasında sıcaklığın eşitlendiğinden emin olun (her ikiside testin başlangıcında oda sıcaklığına (20 25 C) ayarlanmalıdır). Artan brot sıcaklıkları yanlış pozitif OD değerlerine yol açabilir. İlk olarak transfer 100 µl sıvı dışkıyı veya eşdeğer miktarda ( mg) katı dışkı örneğini Mitomycin C ile 4 ml mtsb içine aktarın (ör. RIDA Anreicherungsbouillon, Makale no: Z1000) ve maksimum saat için 37 C de yeterli miktarda oksijenle çalkalayacı üstünde inkübe edin (yaklaşık rpm). Yatay çalkalayıcı ve döner karıştırıcı çalkalayıcı olarak kullanım için uygundur. İnkübasyon sonrası, yaklaşık 15 dk 3000 rpm de tüm örneği santrifüj edin. ELISA testinde 100 µl net supernatant kullanın. Çökelti ve orjinal dışkı örnekleri sonraki onay için tutulmalıdır. Örnekleri saklamanın ideal metodu swab ile çökeltiyi emmek içindir, uygun taşıma ortamına aktarın (Amies, Stuart veya Cary Blair) ve gönderene kadar 2 8 C de saklayın İlk inkübasyon RIDASCREEN Verotoxin

8 Çerçeve içinde yeterli sayıda kuyuyu seçtikten sonra, 2 damla (100 µl) pozitif kontrol Control +, örnek-diluüsyon buffer Diluent 2 (= negatif kontrol) veya dışkı süspansiyonunu kuyulara pipetleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edin. İnoküle edilmemiş zenginleştirme brotu Diluent 2 yerine negatif kontrol olarak kullanılabilir Yıkama Doğru sonuçlar elde etmek için dikkatli yıkama önemlidir ve bu nedenle talimatlara sıkı şekilde uyarak yapılmalıdır. Kuyularda inkübe edilen madde dezenfeksiyon için hipoklorit içeren atık kabına boşaltılmalıdır. Bundan sonra kalan nemi uzaklaştırmak için emici kağıt üstünde plağa vurun. Sonra her defasında 300 µl yıkama buffer kullanarak plağı 5 kez yıkayın. Emici kağıdın hala kuru ve kullanılmamış kısmında her yıkamadan sonra kuyulara vurarak onların tamamen boşaltıldığından emin olun. Otomatik yıkayıcı kullanırken makinenin kullanılan mikrokuyu plağın tipine doğru şekilde ayarlanmış olduğundan emin olun. Ayrıca tüm sıvının emildiğinden emin olun. Son kez yıkandıktan sonra kalan nemi uzaklaştırmak için temiz emici kağıt veya laboratuvar havluları üstünde plağa iyice vurun. En iyi yıkama sonuçları elde etmek için, kuyu ve yıkama aşaması başına en az 600 µl yıkama buffer ile overflow modda yıkama yapılması önerilir. Yıkama aşamalarının sayısı 5'ten fazla artırılabilir ve bu bazen daha iyi yıkama sonuçları verebilir İkinci inkübasyon Kuyulara 2 damla (100 µl) enzim konjugat Conjugate ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edin Yıkama Yıkama Kısım 9.5 bakın. Talimatlara sıkıca uyarak yapın Üçüncü inkübasyon Her kuyuya 2 damla (100 µl) substrat Substrate ekleyin. Sonra karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) plağı inkübe edin. Bundan sonra her kuyuya 1 damla (50 µl) durdurma reaktifi Stop ekleyerek reaksiyonu durdurun. Dikkatlice karıştırdıktan sonra (plağın kenarına hafifçe vurarak) referans dalgaboyu kullanarak 600 nm (isteğe bağlı) 450 nm de ekstinksiyon ölçün. Sonra havaya karşı sıfırı kalibre edin, ör. mikrokuyu plak olmadan. Not : Yüksek pozitif hasta örnekleri siyah çökelti halinde substratın çökelmesine yol açabilir. RIDASCREEN Verotoxin

9 10. Kalite kontrol reaktif süresi bitiminin belirtileri Kalite kontrol amaçları için, pozitif ve negatif kontroller testin doğru şekilde yapıldığından ve reaktiflerin stabil olduğundan emin olmak için her test yapıldığında kullanılmalıdır. Negatif kontrol için ekstinksiyon (O.D.) 450 nm de 0.2 den azsa ve pozitif kontrol için ölçülen değer 450 nm de 0.8 den büyükse test doğru yapılmıştır. Değer negatif kontrol için 0.2 den fazlaysa bu yetersiz yıkama olduğunu gösterebilir. Değerler olması gerekenden farklıysa veya substrat bulanık veya kuyulara eklenmeden önce maviye dönmüşse bu reaktiflerin süresinin dolmuş olduğunu gösterebilir. Öngörülen değerler karşılanmazsa aşağıdaki noktalar testi tekrarlanmadan önce kontrol edilmelidir: Kullanılan reaktiflerin son kullanma tarihleri Kullanılan ekipmanın işlevselliği (ör. kalibrasyon) Doğru test prosedürü Kontaminasyon veya sızıntılar için kit bileşenlerinin görsel kontrolü maviye dönen substrat solüsyonu kullanılmamalıdır. Test tekrarlandıktan sonra şartlar hala yerine gelmediyse lütfen üretici veya yerel R-Biopharm distribütörünüzle temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorumlama Cut-off hesaplama Farklı bir sınır değeri test edilen örnek materyaline bağlı olarak test değerlendirilirken kullanılmalıdır (zenginleşme kültürlerinden supernatant veya zenginleşme olmaksızın dışkı örneği) Zenginleşme kültüründen örnekleri test etme Cut-off belirlemek için, 0.1 ekstinksiyon birimleri negatif kontrol için ölçülen ekstinksiyona eklenir. Cut-off = Negatif kontrol için ekstinksiyon Taze veya derin dondurulmuş dışkı örneklerinin araştırılması (zenginleşme olmaksızın) Cut-off belirlemek için, 0.2 ekstinksiyon birimleri negatif kontrol için ölçülen ekstinksiyona eklenir. Cut-off = Negatif kontrol için ekstinksiyon Test sonucu Örnekler ekstinksiyonları hesaplanan cut- off %10 dan fazla üstündeyse pozitif düşünülür. Ekstinksiyonları cut-off± 10 % içindeyse örnekler şüpheli düşünülür ve tekrarlanmalıdır. Taze dışkı örneğiyle test tekrarlanıyorsa tekrar gri aralıkta bir değer verir, örnek negatif düşünülmelidir. RIDASCREEN Verotoxin

10 10% dan fazla hesaplanan cut-off altındaki ekstinksiyonlara sahip örnekler negatif düşünülmelidir. 12. Metod sınırlamaları RIDASCREEN Verotoxin testi dışkı örneklerinde veya zenginleşme kültürlerinden verotoxin üreten E.coli den Verotoxins 1 ve 2 belirler. Bu test belirlenen ekstinksiyon ve ciddi klinik belirtilerin oluşumu arasında bir ilişki kurmak için kullanılamaz. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik tabloyla birlikte yorumlanmalıdır. Aynı zamanda organizmayı tanımlarken pozitif toksin bulgusu EHEC belirleyen en güvenilir yöntem olarak kabul edilir. Pozitif sonuç başka bulaşıcı patojen varlığını ekarte etmez. Negatif sonuç illede verotoxin üreten E.coli ye sahip enfeksiyon olmadığı anlamına gelmez. Bu patojenin aralıklı atılımı veya örnekteki antijenlerin miktarının çok az olmasından kaynaklanabilir. Hasta anemikse veya verotoxin üreten E. coli sahip enfeksiyon şüphesi varsa başka dışkı örneği test edilmelidir. Bazı EHEC zincirleri sadece az miktarda verotoxin üretir. Dışkı örneğindeki verotoxin miktarı genelde az olduğundan dışkıdan direkt toksin tespiti kendi başına yeterince duyarlı bir yöntem değildir. Dışkıdan pozitif toksin bulgusu olası EHEC enfeksiyonunun hızlı göstergesini verir. Ancak negatif bir sonuçla EHEC enfeksiyonu ekarte edilemez. Şüpheli sonuç dışkı örneğindeki bakteri dağılımının homojen olmamasından kaynaklanabilir. Eğer bu olursa aynı örnekten ikinci bir süspansiyon test edilmeli veya test için ikinci dışkı örneği toplanmalıdır. Pozitif bir toksin bulgusu her zaman her durumda E. coli izolasyonuyla takip edilmelidir. Sadece patojenin belirlenmesi ve karakterize edilmesiyle tespit edilen toksin ve klinik belirtiler arasında bir bağlantı yapılabilir. EHEC enfeksiyonu olsa bile toksin tespiti zenginleşme kültüründen negatif olarak meydana gelebilir. Zenginleşme kültür koşullarına bağlı olarak idealden daha az olabilir. Buna ek olarak E. coli başarılı şekilde kültürlenmiş olmasına rağmen kültür ortamındaki toksin içeriği çok az olabilir, test negatif sonuç verir. Bunun nedeni fizyolojik E. coli florada EHEC oranının düşük olmasından olabilir (bazı durumlarda, için E. coli sadece bir EHEC), ve ayrıca belli büyüme koşulları altında toksin üretimi ve eliminasyonunun durmuş olması olabilir. Bu nedenle dışkıdan direkt olarak toksin tespitinin pozitif olması olasılığı vardır (zayıf) ama kültürden tespit negatifdir. RIDASCREEN Verotoxin ELISA ayarlaması nedeniyle son derece duyarlıdır, şüpheli veya zayıf pozitif sonuç zenginleşme olmadan bir dışkı test edilirken spesifik olmayan matriks etkilerindende kaynaklanabilir. Bu nedenle yıkama aşamasının dışkı üstünde direkt tespit için iyice yapıldığından emin olunması zorunludur. HUS veya TTP gibi post- RIDASCREEN Verotoxin

11 bulaşıcı sendromların gelişimiyle patojenlerin miktarı organizmayı izole etmeyi mümkün kılarak zaten dışkıya düşmüş olabilir. Bu durumda Verotoxin ELISA negatif sonuç verir. Bu nedenle enteritik aşama esnasında mümkün olduğu kadar erken dışkı örneklerinin test edilmesi önemlidir. Diğer tüm yönlerden Robert-Koch Enstitüsü ulusal referans merkezi tarafından önerilen EHEC tanılama programına (Lit. 15) bakarız. 13. Performans özellikleri Test kalitesi Klinik bir çalışmada RIDASCREEN Verotoxin testi zenginleşme sonrası toplam 223 dışkı örneğinde test edildi; bu örneklerin 221 tanesi zenginleşme olmadan dışkının seyreltilmiş süspansiyonu olarak test içinde direkt olarak kullanıldı. Bu çalışmada verohücrelerinde sitotoksisite testi referans metod olarak kullanıldı. Aynı zamanda RIDASCREEN Verotoxin ELISA piyasada mevcut ve Paul Ehrlich enstitüsü tarafından onaylı başka verotoxin enzim immunoassay ile kıyaslandı. Zenginleşme kültürlerinden supernatantlar üstündeki testlerden sonuçlar Tablo 1 de özetlenmektedir. Bu supernatantlar sitotoksisite testi için 1 : 5 seyreltildi. İki enzim immunoassay ilgili üreticinin talimatlarına uygun şekilde yapıldı. Tablo 1: Zenginleşme kültürlerinden supernatantlar ile RIDASCREEN Verotoxin EIA sonuçları Sitotoksisite testi* (zenginleşme sonrası) RIDASCREEN EIA (zenginleşme sonrası) Diğer EIA (zenginleşme sonrası) * Sitotoksisite testinde pozitif sonuç vermeyen bir örnekten VTEC izole edilmesi mümkün olmuştur; bu örnek duyarlılık ve özgüllük hesaplanırken pozitif olarak sayıldı RIDASCREEN EIA Diğer EIA Duyarlılık: 83.3 % Duyarlılık: 76.6 % Özgüllük: 98.4 % Özgüllük: 98.4 % EIA içinde zenginleşme olmadan dışkı örnekleri üstündeki testlerden sonuçlar Tablo 2 de özetlenmektedir. Zenginleşme kültürlerinden bu sitotoksisite testi standart metod olarak kullanıldı. Dışkı örnekleri sitotoksisite testi için TSB ortamında ve RIDASCREEN EIA içinde 1 : 5 seyreltildi. Enzim immunoassay üreticinin talimatlarına uygun şekilde yapıldı. Tablo 2: Zenginleşme olmadan dışkı örnekleri ile RIDASCREEN Verotoxin EIA sonuçları RIDASCREEN Verotoxin

12 Sitotoksisite testi * (zenginleşme sonrası) RIDASCREEN EIA (zenginleşme olmadan dışkıdan) Diğer EIA (zenginleşme olmadan dışkıdan) * Sitotoksisite testinde pozitif sonuç vermeyen bir örnekten VTEC izole edilmesi mümkün olmuştur; bu örnek duyarlılık ve özgüllük hesaplanırken pozitif olarak sayıldı RIDASCREEN EIA Diğer EIA Duyarlılık: 35.7 % 42.8 % Özgüllük: 98.4 % 99.5 % Sitotoksisite testinde zenginleşme olmadan dışkı örnekleri test edilirken benzer şekilde düşük duyarlılık gözlendi (gösterilmemiş sonuçlar). Ancak bu sonuçlardan sonuca varılması mümkün olmuştur, dışkı örneklerindeki verotoxin direkt tespiti organizmanın önceden zenginleşmesi olmadan rutin olarak kullanılacak yeterince duyarlı bir metod değildir ve her zaman zenginleşme kültüründen tespit ile onay gerektirecektir Analitik duyarlılık RIDASCREEN Verotoxin testinin analitik duyarlılığı diğer bazı onaylı Verotoxin EIA ile kıyaslandı. Bunun için, tanımlanmış zincirlerin kısmen temizlenmiş kültür supernatantları dilüsyonlarının bir serisi, VT 1 veya VT 2 üreten, testler ve ölçülen ekstinksiyonlar için ilgili dilüsyon bufferları kullanılarak hazırlandı. Sonuçlar Tablo 3 de listelenmektedir. Verotoksinler için referans standartlar olmadığından, hazırlıkların protein konsantrasyonundaki bilgi verilmemiştir. Tablo 3: RIDASCREEN Verotoxin EIA analitik duyarlılığı Dilüsyon VT 1 VT 2 RIDASCREEN Diğer EIA RIDASCREEN Diğer EIA 1 : : : : : : : RIDASCREEN Verotoxin

13 RIDASCREEN EIA Diğer EIA Poz. kontrol: Neg. kontrol: Şüpheli: Çapraz reaktivite İlgili organizmalar 37 C de zenginleşme ortamında bir gece boyunca inkübe edildi ve 10 6 organizma/ml den fazla içeren kültürler ELISA içindeki reaksiyonları için test talimatlarına uygun olarak test edildi (Tablo 5). Klinik çalışma esnasında, aşağıdaki organizmalar RIDASCREEN Verotoxin testinde reaksiyon göstermeyen örneklerden izole edildi (Tablo 4). Tablo 4: Patojenik mikroorganizmalarla çapraz reaktivite (hasta dışkılarından) Mikro-organizma Campylobacter jejuni Candida albicans Clostridium difficile Cryptosporidium Giardia lamblia Proteus Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Staph. aureus Yersinia enterocolitica Adenovirus Rotavirus Tablo 5: Patojenik mikroorganizmalarla çapraz reaktivite (kültürlerden) Mikroorganizma OD 450nm - OD 620nm Acinetob. lwoffii DSM Aeromonas hydrop. anaerogenes DSM Aeromonas hydrop. hydrophila DSM Campylobacter coli Campylobacter fetus Campylobacter jejuni RIDASCREEN Verotoxin

14 Citrob. freundii* Citrob. freundii DSM Enterob. cloacae DSM Enterococcus faecalis DSM Enterococcus faecium ATCC E. coli* E. coli* E. hermanii DSM Lactococcus lactis DSM Listeria innocua* Morganella morganii Proteus mirabilis DSM Proteus mirabilis DSM Proteus vulgaris DSM Providencia stuartii DSM Pseudom. aerug. DSM Pseudom. fluorescens DSM Pseudom. fluorescens DSM Salmonella agona* Salmonella braenderup* Salmonella infantis* Salmonella Ohio* Salmonella typhimurium* Serratia proteamaculans DSM Shigella flexneri DSM Shigella sonnei DSM Staph. aureus DSM Staph. aureus* Strep. agalactiae* Strep. dysgalactiae* Strep. uberis* E. coli 026:H8 VT Positive control E. coli VT 1+2 (0157:H7) Negative control (mtsb) Positive control (test kit) Cut-off * İzolatlar RIDASCREEN Verotoxin

15 13.3. Kesinlik İntra-test tekrarlanabilirliği her durumda 24 ölçümle 4 farklı konsantrasyonda Verotoxin 1 ve 2 hazırlıkları (VT 1 ve VT 2) kullanılarak belirlendi. Ortalama değer, standart sapma ve varyasyon katsayısı verilir. İnter-test tekrarlanabilirliği her durumda 11 bağımsız yürütülen ölçümle 4 farklı konsantrasyonda Verotoxin 1 ve 2 hazırlıkları (VT 1 ve VT 2) kullanılarak belirlendi (3 test-kit lotu, 7 farklı günde 5 teknisyen). Ortalama değer, standart sapma ve varyasyon katsayısı verilir (örnek başına 11 tespit). Sonuçlar Tablo 6 da listelenmektedir. Tablo 6: RIDASCREEN Verotoxin EIA tekrarlanabilirliği Intra-test VT 1 Ortalama ekstinksiyon Standart sapma Varyasyon katsayısı (%) Intra-test VT 2 Ortalama ekstinksiyon Standart sapma Varyasyon katsayısı (%) Inter-test VT 1 Ortalama ekstinksiyon Standart sapma Varyasyon katsayısı (%) negatif zayıf pozitif güçlü pozitif pozitif Inter-test VT 2 Ortalama ekstinksiyon Standart sapma Varyasyon katsayısı (%) RIDASCREEN Verotoxin

16 Referanslar 1. Beutin, L. et al.: Zur Epidemiologie von Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) in der Bundesrepublik Deutschland im Jahr Bundesgesundhbl. 10, (1994) 2. Beutin, L.: Infektionen mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundhbl. 11, (1996) 3. Bockemühl, J. et al.: Zur aktuellen Bedeutung der enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) in Deutschland ( ). Bundesgesundhbl. 8, (1996) 4. Bockemühl, J. et al.: Infektionen des Menschen durch enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) in Deutschland, Bundesgesundhbl. 6, (1997) 5. Bülte, M.: Enterohämorrhagische E. coli-stämme (EHEC) - Aktuell in der Bundesrepublik Deutschland? 1. Pathogenitätspotential von EHEC-Stämmen - Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. (Literaturübersicht) Fleisch-wirtschaft 75, (1995) 6. Bülte, M. et al.: Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) - aktuelle Lebensmittelinfektionserreger auch in der Bundesrepublik Deutschland? 2. Nachweis von VTEC- Stämmen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs Fleischwirtschaft 76, (1996) 7. Donohue-Rolfe, A. et al.: Purification of Shiga Toxin and Shiga-Like Toxins I and II by Recptor Analog Affinity Chromatography with Immobilized P1 Glycoprotein and Production of Cross-Reactive Monoclonal Antibodies. Infection and Immunity, Dec., (1989) 8. Karch, H. et al.: Clonal Structure and Pathogenicity of Shiga-Like Toxin-Producing, Sorbitol- Fermenting Escherichia coli 0157:H -. Journal of Clinical Microbiology 5, (1993) 9. Kuntze, U. et al.: Nachweis von verotoxinbildenden E. coli-stämmen in Roh-milch und Rohmilchkäse. Archiv f. Lebensmittelhygiene 47, (1996) 10. Ritchie, M. et al.: Comparison of a Direct Fecal Shiga-Like Toxin Assay and Sorbitol- McConkey Agar Culture for Laboratory Diagnosis of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. J. of Clin. Microbiol., Feb., (1992) 11. Strockbine, N. A. et al.: Characterization of Monoclonal Antibodies against Shiga-Like Toxin from Escherichia coli. Infection and Immunity, Dec., (1985) 12. Takeda, Y. et al.: Vero Toxins (Shiga-Like Toxins) Produced by Enterohemorrhagic Escherichia coli (Verocytotoxin-Producing E. coli). Microbiol. Immunol., 37 (8), (1993) 13. Walterspiel, J. N. et al.: Effect of Subinhibitory Concentrations of Antibiotics on Extracellular Shiga-like Toxin I. Infection 20, No. 1, (1992) 14. Gerritzen, A. et al.: Flüssige Vorkultur von Stuhlproben verbessert den EHEC- Toxinnachweis mit ELISA und Zytotoxizitätstest. J. Lab. Med. 22 (2), (1998) 15. Fruth, A. et al.: Zur Verbesserung der gegenwärtigen bakteriologischen Diagnostik von enterohemorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Bundesgesundheitsbl.- Gesundheitsforsch.-Gesundheitsschutz 43, (2000) RIDASCREEN Verotoxin