RNA biosentezi (transkripsiyon)

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "RNA biosentezi (transkripsiyon)"

Transkript

1 RNA biosentezi (transkripsiyon) Doç. Dr. Nurten Özsoy Kalıp DNA DNA Gen 1 Transkripsiyon Gen 2 Translasyon Kodon Amino asid Gen 3

2 Transkripsiyon Genetik bilginin DNA den RNA e geçmesi dir. Bu biokimyasal reaksiyonun enzimi RNA polimerazdır. Genetik bilgi DNA veya onun bir polinukleotid zincirinin tamamlayıcısı olan RNA daki nukleotidlerin purin ve pirimidin bazlarının diziliş sırası ile proteinlerdeki amino asidlerin diziliş sırası arasındaki bağıntıdır.

3 RNA polimerazın özellikleri 1. DNA ya bağımlı RNA polimeraz kalıp halata 3' 5' yönünde bağlanır ve genin kalıp halatının tamamlayıcısı olan ribonukleotidlerin 5' 3' yönünde polimerleşmelerinden sorumludur. (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PP i RNA Bir nukleotid ile uzamış RNA 2. Sentez için Mg 2+ ve 4 tane NTP a gereksinim vardır-atp, GTP, CTP, UTP 3. Sentez için öncül moleküle (primer) gereksinim yoktur. DNA kalıbı yeterlidir. 4. RNA polimerazın hata düzeltici 3' 5' ekzonukleaz aktivitesi yoktur (tek bir hücrede çok sayıda RNA kopyasının yapılması nedeniyle, hatalı RNA moleküllerinin hücreye etkisi DNA daki hatadan daha az olur).

4 (α 2 β'βωσ) Çekirdek enzim Holoenzim çekirdek altbirim İlk fosfodiester bağı oluştuktan sonra σ altbiriminin uzaklaşmasıyla zincir uzama süreci başlar E. coli RNA polimerazı Çekirdek enzimin dört altbirimi vardır: α, β, β' ve ω. Bu alt birimler α 2 ββ'ω şeklinde birleşir. α-altbiriminin RNA polimeraz proteininin katlanmasında, β nın ise transkripsiyonda bir katalizör olarak görev alır. β ve β' birimleri ribonukleotidlerin polimerizasyonunda görev almaktadır. α-alt birimleri regülatör proteinlerele bağlantı kurabilen kısımlardır. Çekirdek halindeki RNA polimeraza sigma (σ) denilen bir alt biriminin enzime bağlanması ile enzim holoenzim halini alır.

5 Herhangi bir hücrede yer alan genlerin her zaman için aktif olmaları söz konusu olmaz. DNA üzerinde bulunan genlerin aktivasyonu, sitoplazmik sinyaller sonucu RNA polimeraz ın transkripsiyonu yapılacak gen veya genlerin hemen önündeki belli bir baz bölgesi (upstream) olan promotör gene bağlanması ile gerçekleşir. σ altbirimi, enzimin bağlanacağı genin promotörünü tanıyarak DNA ile özgün bağlanmasını sağlar.

6 Farklı genleri tanıyan farklı σ altbirimleri mevcuttur E. coli RNA polimerazın altbirimleri Alt birim Gen Sayı Ağırlık (kd) En sık rastlanan σ birimi molekül ağırlığı 70 kd olan σ 70 dir.

7 Bakteri RNA polimerazı, tüberküloz tedavisinde kullanılan rifamisinin β altbirimine bağlanması ile fosfodiester bağının oluşumunu engelleyerek inhibe olur. Rifamisin Fenoksazon halkası Aktinomisin D Aktinomisin D ise transkripsiyonun uzama safhasında inhibisyon yapar.

8 DNA ya bağımlı RNA polimeraz promotör dizilerini tanıyana kadar DNA molekülünü 10 3 /bç/s lik bir hız ile tarar ve bu dizilere bağlanır. Promotörler transkripsiyon başlama bölgesinde kendilerini tekrarlayan konsensus dizileri (tüm organizmalarda aynı veya benzer olan bu diziler evrim boyunca çok korunmuştur). 5'-TATAAT-3' dizisi- transkripsiyon başlangıç nukleotitden (+1) 10 baz çifti kadar önce -10 bölgede bulunur (Pribnow kutusu). DNA sarmalının RNA polimeraz tarafından çözülmeye başladığı nokta. 5'-TTGACA-3' dizisi- transkripsiyon başlangıç nukleotitden (+1) 35 baz çifti kadar önce -35 bölgede bulunur. RNA polimerazın tanıyıp bağlandığı bölge. Kalıp DNA -35 bölge Prokaryotik promotör Pribnow kutusu Transkripsiyon başlama bölgesi

9 Beadle-Tatum un tek gen-tek enzim hipotezi, tek gen-tek protein ve daha doğrusu tek gen-tek polipeptid olarak genişletilmiştir. Bazı genler trna ve rrna kodladıkları göz önünde bulundurarak, bir gen, yapısal ya da katalitik işlevli bir polipeptid veya bir RNA gibi, genin son ürününün primer dizisini kodlayan tüm DNA dır.

10 Fonksiyonlarına göre 2 tip gen vardır 1. Yapısal genler belirli proteinleri sentezlerler 2. Denetleyici genler yapısal genleri uyarır veya frenlerler. a) operatörgenler-yapısal genlere direktetkilidirler b) düzenleyici (regülatör)genler: yapısal genlere, operatörgenler yolu ile etkilidirler Bir ya da birkaç yapısal gen kendi operatör genleriyle beraber genetik bir birimi olan operonu meydana getirirler. Operatör genden gelen sinyale göre (trafik ışıklarına benzer bir şekilde) operondaki yapısal genler çalışır. Aktivatörün bağlanma yeri Promotör Represör bağlanma yeri (operatör) operon Düzenleyici diziler represör<->operatör aktivatör <->artırıcı (enhencer) Birlikte yazılan genler

11 Bir operon sistemindeki operatör ve düzenleyici (regülatör) gen arasındaki el ele çalışmalarla yapısal genlerin ifadeleri ya gelişir ya da kesilebilir. Bunun sonucunda, ya normal ya da patolojik bir fonksiyon düzeni belirebilir. Hücrede bazı özel proteinler vardır ki bunlara düzenleyici veya regülatör proteinler adı verilir. Her bir regülatör protein bir veya birden fazla genin düzenlenmesinde etkileyici rol oynar. Bu proteinler normal gen regülasyonunda iki şekilde faaliyet göstermektedir: Gen ifadesini arttırırlar - pozitif regülatör (aktivatör) Gen ifadesini azaltırlar - negatif regülatör (represör; baskılayıcı) Gen ifadesinin düzenlenmesinin 2 tipi vardır: 1. Negatif düzenleme Transkripsiyonu durduran baskılayıcı bir protein yoluyla düzenleme. Negatif regülatörvarlığında genetik bilginin ifadesi azalır. 2. Pozitif düzenleme pozitif regülatörvarlığında genetik bilginin ifadesi artar.

12 RNA polimerazla transkripsiyonun başlaması en az üç tip protein düzenler: 1. Spesifik transkripsiyon faktörleri 2. Baskılayıcılar (represörler): bağlanma yeri: operatör (negatif düzenleme) 3. Aktivatörler: bağlanma yeri: artırıcılar (transkripsiyon hızını arttırırlar) (pozitif düzenleme)

13 Baskılayıcılar (represörler): DNA üzerinde operatöre (prokaryotik hücrelerde genellikle promotörün yanında bulunur) bağlanır. Baskılayıcının DNA ya bağlanması, efektör denilen, küçük molekül ya da protein olan moleküler bir sinyalle düzenlenir. Efektör baskılayıcı moleküle bağlanır ve yapısal bir değişime neden olur. Baskılayıcı ile sinyal molekülü arasındaki etkileşim, transkripsiyonu azaltır ya da artırır Efektör maddeler represör üzerinde iki şekilde etki gösterir: -İndüktör (anti-inhibitör): eğer ortamda bir indüktör madde varsa, bu madde DNA operonu üzerindeki represörü uzaklaştırır ve böylece sentez olayı yeniden başlamış olur. Efektör, geni engelleyen represörün aktivitesini ona bağlanarak yok ediyorsa, yani baskılanmayı ortadan kaldırıyorsa, bu operona uyarılabilen (indüklenebilen) operon denir. - Co-represör: represör co-represör ile aktif hale gelip DNA yı bloke eder. Bu tür operona ise baskılanabilen operon denir.

14 Negatif düzenleme (represör transkripsiyonu inhibe eder) Operatör Represör moleküler sinyalin yokluğunda operatöre bağlanır Pozitif düzenleme (aktivatör transkripsiyonu uyarır) RNA polimeraz Moleküler sinyal (indüktör) represör ün dissosiasyonuna neden olur ve transkripsiyon uyarılır Sinyal molekülü Promotör Represör moleküler sinyalin (co-represör) varlığında operatöre bağlanır Aktivatör moleküler sinyalin yokluğunda DNA ya bağlanır ve transkripsiyon ilerler. Sinyal eklendiği zaman aktivatör dissosiye olur ve sinayal ile birleşerek transkripsiyon inhibe olur. Sinyal ayrıldığında represör dissosiye olur ve transkripsiyon oluşur. Aktivatör sinyalin varlığında DNA ya bağlanır. Sinyal uzaklaştırılınca dissosiye olur ve transkripsiyon inhibe olur.

15 Aktivatörler DNA ya bağlanırlar ve promotörde RNA polimerazın aktivitesini güçlendirirler. (Aktivatör bağlanma bölgeleri, çoğunlukla RNA polimerazın zayıf bağlandığı ya da tek başına hiçbir zaman bağlanmadığı, promotörlere yakın bulunur. Bazı ökaryotik aktivatörler, promotörden çok uzaktaki artırıcılar (enhancer) denilen bölgelere bağlanır). - Bazı aktivatörler, bir sinyal molekülünün bağlanmasıyla tetiklenen aktivatörün disosiasyonu sağlanıncaya kadar transkripsiyonu güçlendirmek için DNA ya bağlanır. - Diğer olgularda ise aktivatör sadece, bir sinyal molekülüyle etkileştikten sonra DNA ya bağlanır.

16 Operonun özellikleri Operon modeli, François Jacob ve Jacques Monod adındaki Fransız araştırmacıların E.coli deki laktoz operonu (lac operon) üzerinde yaptıkları çalışmalar (1961) sonucu ortaya çıkmış ve bu çalışma 1985 yılında kendilerine Nobel ödülünü kazandırmıştır. Laktozu galaktoz ve glukoza hidroliz eden β-galaktozidaz enziminin yapısal geni (lacz), galaktozun hücre içine geçişinden sorumlu olan permeaz (lacy) ve transasetilaz (laca) genlerle birlikte kümelenmiştir ve birlikte lac mrna yı oluştururlar. β-galaktozidaz: laktozu parçalayarak 6 karbonlu glukoz ve galaktoza ayırır Galaktozit permeaz: laktozun bakteri hücre duvarından geçişini sağlar Tiyogalaktozit transasetilaz: Asetil CoA dan asetil grubunu tiyogalaktozidin C-6 hidroksil grubuna transferini gerçekleştirir.

17 Uyarılabilen (indüklenebilen) operon: Laktoz operonu I geni, Lac represörünü kodlar P: Lac genlerinin promotörü Pı: I geninin promotörü O 1 : Lac operonun asıl operatörüdür O 2 ve O 3 : psödooperatörler denilen ikincil operatör bölgeleridir Dış İç Laktoz Laktoz Galaktozit permeaz E.Coli karbon kaynağı olarak glukoz ve laktozu kullanır. Sadece glukoz varlığında, bakteriyel büyüme fazının başlangıcından itibaren hücre glukoz tükenene kadar laktoz katabolizması için gerekli olan enzimleri indüklemez (laktoz yokluğunda, lac operon genleri baskılanır). Bunun mekanizması şöyledir: Bu enzimlere gereksinme olmadığını gösteren bir protein sentezlenir ve operonun düzenleyici bölgesinde bulunan i ye bağlanarak onu etkileştirir ve bir i-mrna (represör mrna) biyosentezlenir, bu ise translasyonla represör proteinini oluşturur. Represör proteini o (operatör) bölgesine bağlanır ve böylece RNA polimerazın p (promotör) bölgesine ulaşmasını engeller (yapısal genlerin transkripsiyonları engellenir). Laktoz eklendiğinde, laktoz metabolizması sırasında oluşan allolaktoz represöre bağlanır, represör genden uzaklaştırılır ve RNA polimeraz promotöre yerleşip laktozun yıkımında görevi olan üç enzimin mrna sının transkripsiyonuna başlar. Laktoz β-galaktozidaz Allolaktoz Galaktoz Glukoz

18 Regülatör gen Lac i Negatif düzenleme (+Glukoz; -Laktoz) Glukoz ve laktoz seviyeleri, lac baskılayıcı protein ile CAP üzerindeki etkileri sayesinde lac operonunda transkripsiyonun (yazılımın) başlangıcını etkileyebilir. Promotör Operatör lac Z β-galaktozidaz lac Y lac permeaz lac A transasetilaz Transkripsiyon Transkripsiyon lac mrna 5' 3' 5' lac mrna 3' Translasyon Translasyon lac represör β-galaktozidaz lac permeaz transasetilaz Lac represör - allolaktoz allolaktoz molekülleri Laktoz eklenmesi allolaktoz derişimini arttırır. Allolaktoz baskılayıcı proteine bağlanarak DNA dan ayrılmasını sağlar.

19 Pozitif düzenleme (+ Laktoz; -Glukoz) Katabolik süreçler genellikle, organizmanın tercih ettiği yakıtın yokluğunda alternatif yakıt moleküllerini kullanan enzimlerin sentezini sağlayan aktivatörlerle çalışır. Bu aktivatörler tercih edilen yakıt molekülllerinin varlığında genetik aktiviteyi baskılar. Buna katabolit baskılaması denir. Laktoz operonu hücrede glukoz miktarını ayarlayan ve Katabolit Aktivatör Protein (CAP) veya camp Reseptör Proteini (CRP) denilen bir aktivatörle çalışır. Prokaryot solunumunda tercih edilen yakıt glukoz olduğu için, glukozun yüksek konsantrasyonları laktoz operonunu durdurur. Bu koşullarda kullanılabilecek bol miktarda yakıt olduğundan laktozun yıkımına gerek kalmamaktadır Yüksek glukoz (düşük camp) Düşük glukoz (yüksek camp) camp Bağlanmış lac represör Laktoz Laktoz Laktoz represör Glukoz düzeyleri azaldığında ise camp, CAP ın allosterik bölgesine bağlanarak proteinde konformasyonel değişikliklere yol açar. Böylece aktiflenen CAP, operonda promotöre komşu bölgeye bağlanarak RNA polimerazın promotöre bağlanmasına yardımcı olur. Laktoz represör Gen kapalı RNA polimeraz Transkripsiyon, Gen açık promotör konumunun yakın bir bölgesinde DNA ya bağlanmış CAP-cAMP kompleksinin bulunması durumunda meydana gelir. CAPcAMP pozitif bir düzenleyicidir.

20 Baskılanabilen operon-triptofan operonu Apo-represör = aktif olmayan represör Transkripsiyon devam eder Apo-represör + Triptofan (Co-represör) Aktif represör + operatör İnaktif promotör Transkripsiyondevam etmez Bir represör, coreseptör ile aktif hale gelip DNA yı bloke eder. E.coli hücresi kendisine gerekli olan amino asitleri sentezleyen tüm enzimleri yapısında bulundurur. Amino asidlerden herhangi birinin ortama hazır olarak verilmesi durumunda bu amino asidin sentezi için gerekli enzim sisteminin yapımı da durur. Bu olaya represyon adı verilir. Örneğin ortamda konsantrasyonu artan triptofan (trp operonu tarafından sentezlenen enzimin ürünü) kendisine özgü olan trp represörüne bağlanabilmekte ve onu aktif hale getirip DNA ya bağlanmasını sağlar. Böylece triptofan sentezinde görev alan 5 enzimin sentezi durdurulmuş olur. Bu durumda bir efektör olan tiptofan bir co-represör dür. E.coli beslenme ortamına bol miktarda triptofan verildiğinde, hücrede triptofan sentezleyecek enzim oluşmaz.

21 Transkripsiyon 4 basamakta gerçekleşir: 1. Kalıba bağlanma: RNA polimeraz DNA ya bağlanır ve bir promotörü lokalize eder. 2. Zincir başlangıcı. RNA polimeraz ilk NTP ikinci bir ribonukleozit trifosfat ile eşleşmesini katalize eder. 3. Zincir uzaması: Sentezlenen RNA molekülünün 3' ucuna arka arkaya NTP ı baz eşleşmeleri ile yerlerine yerleşir ve difosfat ayrılarak fosfodiester bağlar oluşur. RNA, 5' 3' yönünde DNA kalıbına ters yönde paralel olarak sentezlenir. DNA G C T A RNA C G A U 4. Zincir sonlanması: DNA molekülünün kalıp halatındaki bazı diziler sonlanma sinyalleri olarak görev görürler.

22 mrna zincirinin ilk 8-10 nukleotid sentezinden sonra σ faktörü enzimden ayrılmaktadır RNA polimerazın promotöre bağlanması Başlama

23 Sentezin başlaması RNA polimerazın transkripsiyona başlamasında 1. İlk basamak holoenzimin DNA daki promotöre zayıf olarak bağlanmasıdır. Böylece kapalı bir kompleks oluşur. 2. İkinci basamakta DNA sarmalında 10 baz çiftine yakın bir bölgenin açılması ile polimeraz kalıba daha sıkı bağlanarak açık kompleks oluşur. 3. Pribnow kutusu A-T ce zengin olduğu için heliksin açılmasını kolaylaştırır. 4. Açılan DNA ya ilk nukleotid trifosfat bağlanınca RNA polimeraz transkripsiyonu başlatır. 5. İlk fosfodiester bağı oluştuktan sonra σ altbiriminin uzaklaşmasıyla enzim, zincir uzama süresine geçer. Bu dönemde başka RNA polimerazlar da promotöre bağlanabildiği için gen birçok kez transkript edilebilir. RNA polimeraz promotör

24 DNA molekülü boyunca RNA polimeraz ilerledikçe, kalıp halatın nukleotidlerine uygun baz eşleşmesine olanak sağlamak için DNA sarmalın çözülmesi gereklidir. DNA sarmalın çözülme derecesi transkripsiyon boyunca sabittir ve her bir polimeraz molekülü başına 17 baz çifti kadardır. DNA sarmalın bir taraftan çözülmesini (negatif superhelezonlar oluşturarak), diğer taraftan bükülmesi ve helezonlaşmasını (pozitif superhelezonlar oluşturarak) kataliz eden enzim topoizomerazdır. Herhangi bir noktadaki DNA/RNA hibridi 7-10 baz çifti uzunluğundadır. DNA çift sarmalın bükülmesi Kalıp halat RNA polimeraz Kodlayıcı halat (Bu zincirin baz sırası, genden yazılan RNA zincirinin aynısıdır, sadece T yerine U geçmiştir). DNA çift sarmalın çözülmesi mrna DNA/RNA hibrit heliksi Uzama yönü RNA polimerazın hareket yönü E.coli nin RNA polimeraz enzimi bir aktivatör olan Mg +2 varlığında 37 o C de saniyede yaklaşık 40 nukleotid sentezlemektedir

25 Zincir uzaması RNA nukleotidleri Yeni sentezlenen RNA Kalıp DNA

26 Sentezlenecek olan protein RNA polimeraz genin promotör bölgesine bağlanır Proteini kodlayan gen Tamamlayıcı DNA halatı dezoksiribonukleotidler Sentez edilen mrna ribonukleotidler

27 Proteini kodlayan gen Kopyalanacak gen RNA polimeraz mrna kodon Sentez edilen mrna ribozomlara taşınır Genin tamamlayıcısı olan mrna

28 Transkripsiyonun sonlanması DNA molekülünün kalıp halatındaki bazı diziler sonlanma sinyalleri olarak görev görürler. Buraya Rho sonlanma faktörü bağlanır. RNA polimeraz

29 Transkripsiyon, Rho ya bağımlı ve Rho dan bağımsız iki farklı yolla bitebilir. Rho dan bağımsız olan bitişte iki önemli özellik görülür 1. RNA transkripitinin bitiş noktasından nukleotid önce, transkriptin kendi üzerine katlanıp bazlar arasında bağ yaparak saç firketesi şeklini aldığı G- C ce zengin bir bölge 2. Kalıpta bulunan kısa bir adenilat zinciridir. Gerek saç firkete şeklindeki yapı, gerekse RNA daki U zinciri ile kalıp DNA daki A zincirinin bağ yaparak oluşturdukları A=U bölgesi, RNA-DNA ilişkisini zayıflatarak ve RNA polimeraz ve transkript arasındaki ilişkiyi bozarak transkriptin ayrılmasını kolaylaştırır.

30

31 Rho-bağımlı sonlanma Rho hekzamerik bir proteindir RNA nın bazlık kısmını etrafına sarar Rho ATPaz aktivitesine sahiptir ve DNA/RNA hibridini ayırır Nispeten nadir olarak görülür

32 Ökaryot transkripsiyonu Kromatinin transkripsiyon için açık hale gelmesi Transkripsiyon faktörlerinin (TF) promotör bölgede DNA ya bağlanması ile genin aktiflenmesi Artırıcıların aktivatörlere bağlanarak transkripsiyonu uyarması

33 Genin 5' ucu 5' tercüme edilmeyen bölge (5' UTR) Transkript edilen kısım Primer transkript 3' tercüme edilmeyen bölge (3' UTR) Genin 3' ucu Akış yukarı düzenleyici diziler promotör mrna kopyasının işlenen 3' ucu CAAT kutusu Artırıcılar Enhancers Susturucular Silencers Insulators TATA kutusu Transkripsiyonun başlama yeri Protein sentezinin başlama kodonu Protein sentezinin bitiş kodonu (UGA, UAA, UAG) 3' ucunun poliadenillenmes i sinyal dizisi Transkripsiyonun bitiş yeri

34 Ökaryotlarda Transkripsiyonun başlaması- RNA polimerazlar RNA polimeraz formları Sentezlediği ürün Bulunduğu yer RNA polimeraz I rrna (18S, 5.8S ve 28S rrna) Çekirdekçik RNA polimeraz II mrna, snrna Nükleoplazma RNA polimeraz III 5S rrna, trna Nükleoplazma Ökaryot nükleer RNA polimerazları Amanita phalloides denilen zehirli mantarda bulunan α-amanitin tarafından inhibe edilebilir.

35 RNA polimeraz II nukleusta ökaryotik mrna nın sentezinden sorumludur. Tek bir promotör diziyi tanıyan prokaryot RNA polimerazın aksine, ökaryot RNA polimeraz II enzimi transkripsiyona birçok konsensus dizisini tanıyarak başlar. Bu dizilerin en iyi bilineni ve en iyi korunmuş olanı TATA kutusudur. Bazı transkripsiyon faktörlerinin kendilerine özgün bölgelere, birbirlerine ve Polimeraz II ye bağlanmaları ile transkripsiyon uyarılır. TATA-bağlayıcı proteinin (TBP) TATA kutusuna bağlanması ile süreç başlar. DNA transkripsiyon faktörleri Ökaryot promotör TATA-bağlayıcı protein

36 RNA polimeraz II, TATA kutusu bölgesinde kodlayıcı halatına bağlanır ve transkripsiyonu 25 nukleotid akış aşağı (3' yönünde) konumda başlatır. TBP (sıklıkla TFIIA ile birlikte), TFIIB ve RNA polimeraz II, TFIIE, TFIIF ve TFH nın sırayla biraraya gelişi kapalı bir kompleks oluşturur. TBP, sıklıkla TFIID olarak adlandırılan büyük kompleksin bir parçası olarak bağlanır. DNA TFIIH nın helikaz aktivitesiyle çözünür ve açık bir kompleks oluşur. Büyük RNA polimeraz II altbirimini karboksil ucu (CTD) TFIIH tarafından fosforillenir ve transkripsiyon (yazım) başlar.

37 Transkripsiyon sonrası değişiklikler Sitoplazma DNA RNA Transkripsiyon RNA nın işlenmesi RNA polimeraz II bir RNA fabrikası gibidir, bir yandan DNA dan RNA sentezlenirken, diğer yandan da yaptığı RNA yı işler mrna G AAAAAA G AAAAAA Çekirdek Eksport

38 Ökaryot hücresi Transkripsyon Translasyon Prokaryotlarda hücre çekirdeği yoktur. mrna ayrıca sentezlendikten sonra herhangi bir işlemden geçmeden doğrudan sitoplazmaya gider. Prokaryot hücresi Transkripsyon RNA nın işlenmesi Translasyon Oysa ökaryotik hücrede mrna sentezi çekirdekte gerçekleşir ve öncül-mrna bir seri işlemden geçtikten sonra çekirdeği olgun mrna şeklinde terk ederek sitoplazmaya geçer ve ribozoma ulaşır. Burada polipeptid sentezi gerçekleşir.

39 İntronların uzaklaştırılması Prokaryot genleri sürekli genlerdir, ökaryot genleri ise sürekli değildir. DNA nın primer kopyalarında, olgun mrna yı oluşturmak üzere uzun kotlayıcı dizileri bağlayan ve uzaklaştırılmaları gereken DNA nın kotlayıcı olmayan dizileri bulunur. Bunlara intronlar denilir. DNA nın kotlayıcı bölgeler ise eksonlardır. İntronların prekürsör mrna dan uzaklaştırılmaları ve eksonların bir arada bağlanmalarına RNA splaysing denilir. Gen Transkripsiyonun başlaması İntron 1 İntron 2 Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 Transkripsiyon İntron 1 İntron 2 Primer kopya Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 splicing Olgun mrna Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3

40 mrna nın işlenmesi - Ökaryotlarda sentezlenen RNA ların olgun ve fonksiyonel hale gelmesi. 5' - başlığın eklenmesi poli(a) zincirinin eklenmesi Transkripsiyonla sentezlenen RNA molekülüne primer transkript denir. İntronlar çıkartılır Örtülü yapı ve poli(a) kuyruğu ilave edilir 5' 3' Olgun mrna Poli(A) kuyruğu başlık

41 Tüm intronlar GU dizisi ile başlayıp AG dizisi ile biter. Bunlara sırası ile verici ve alıcı intron-ekzon bağlantıları denir. Dallanma 5' kesim yeri noktası 3' kesim yeri Piriminden zengin bölge İntron dizilerinin uzaklaştırılması RNA üzerindeki üç yer ile ilişkilidir: 5' kesim yeri 3' kesim yeri kesip çıkartılan kementin tabanını oluşturan intron dizisindeki dallanma noktası.

42 İntron sınıfları Dörtsınıf intron vardır. Grup I. rrna, mrna ve trna ları kodlayan bazı nükleer, mitokondri ve kloroplast genlerinde yer alır. Bir guanin nukleozit kofaktörüne gereksinim vardır. Fakat kofaktör bir enerji kaynağı olarak kullanılmaz. Guanozinin 3'-OH grubu intronun 5' ucuyla normal 3',5'-fosfodiester bağı kurar. Daha sonra, eksonun 3'-OH ucu nukleofil olarak davranır ve tepkimeyi tamamlar. Sonuç, intronun tam olarak kesilip, çıkartılması ve eksonların bağlanmasıdır. Grup II intronların kesilmesinde intronun içinde bulunan bir adenilatın 2'-OH grubu intronun ucu ile birleşip kement şeklini alarak ekzondan ayrılır. Fungi, alga ve bitkilerin mitokondri veya kloroplast mrna larında bulunur. Bu iki grup intronun kesilmesinde herhangi bir enzim görev almadığı için her iki grup da kendinden kesicidir. Kendilerini kesip-birleştiren intronlar Grup I Grup II splisozom Grup III

43 Katalitik intronlar - RNA enzimleri (Ribozimler) En iyi tanımlanmış olan ribozimler, kendi kesip yeniden birleştiren grup I intronlar. Bu ribozimlerin aktivitelerinin büyük bir kısmını çapraz esterleştirme ve fosfodiester bağının hidrolizi gibi iki temel tepkime oluşturur.

44 = Kesilip-birleştirme (Splaising) Splisozom dinamik bir makinedir Grup III intronlar: nükleer mrna ların primer transkriptlerinde bulunur. Kesilme işlemi ikinci grup intronlara bezemekle birlikte ufak nükleer ribonükleoproteinler (snrnp) denilen RNA-protein komplekslerinin yardımı ile gerçekleşir. Ökaryotik çekirdeğinde kesim işlemlerinde beş adet snrna (U1, U2, U4, U5, U6) görev alır. Bu moleküllerin her biri snrnp leri (küçük çekirdek ribonukleotidleri) oluşturmak üzere en az yedi protein altbirimi ile birleşir. Bu snrnp ler splisozomların nüvesini oluşturur. Grup IV intronlar: bazı trna larda bulunur. Bu intronları bir endonukleaz ATP hidroliz ederek ve intronun iki ucundaki fosfodiester bağlarını keserek uzaklaştırır ve ekzonu birleştirir.

45 5 Exon 1 RNA transcript (pre-mrna) Intron Exon 2 Protein snrna Diğer Other proteinler proteins Kesilip-birleştirme (splaising), snrnp ve diğer proteinlerin oluşturduğu splisozomlar tarafından katalizlenir. 5 snrnpler Spliceosome Splisozom Spliceosome components Splisozom bileşenleri mrna 5 Exon 1 Exon 2 İntronun kesilmesi

46 Splisozomlar öncül mrna molekülündeki kesim işaretlerini tanır, intronun iki ucunu bir araya getirir ve tepkimenin enzimatik etkinliğini sağlar. Pre mrna ya bağlı splisozom Splisozom Birleşmiş ekzonlar Kesim 1, intronun bir ucunun korunmuş adenine tutunmasını sağlar ve kovboy kementi biçiminde bir yapı oluşur (lariat) Kesim 2 kementi serbest bırakır ve iki ekzon ucunu birleştirir Kimyasal olarak 1 ve 2 evreleri transesterifikasyon reaksiyonlarıdır.

47 Transesterleşme diye bilinen ardışık iki fosfor aktarım tepkimesi aradaki intronu kement halinde kesip uzaklaştırırken iki eksonu birbirine bağlar. Fosfat bağ sayısı aynı kaldığından, bu tepkimeler, prensipte nukleozit trifosfat hidrolizi olmadan oluşur. Birinci çapraz esterleşme Ekzon 1 in 3' oksijeni Dallanma noktası A nın 2' oksijeni İntronun 3' oksijeni

48 Ekzon 1 in 3' oksijeni Dallanma noktası A nın 2' oksijeni İntronun 3' oksijeni İkinci çapraz esterleşme Kesip birleştirilmiş eksonlar Lariat intron

49 Splisozom intron üzerindeki kesim sinyallerini tanır ve intronun iki ucunu birbirine yakınlaştırır. Önce dallanma noktasındaki adenin (A) buraya özgü bir protein tarafından tanınır (BBP-branch point binding protein) ve bunu yardımcı bir protein olan U2AFnin bağlanması izler. Sonraki evrede U2snRNP BBP ve U2AF yi bağlandığı yerden uzaklaştırır ve dallanma noktasındaki adeninle bağ oluşturur. U1 snrnp ise bu arada 5' kesim bölgeye bağlanır ve bunu U4/U6*U5 snrnp lerin komplekse katılması izler. Bu üçlü komplekste U4 ve U6 birbirine sıkıca U5 ise daha gevşek bağlıdır. Sonra bazı RNA- RNA yeniden düzenlenmeleri gerçekleşir ve U4/U6 arasındaki bağ kırılır ve U4 splisozom kompelksinden salınır. Serbest kalan U6 5' kesim bölgeye bağlanan U1 i yerinden koparır. Daha sonra gerçekleşen yeniden düzenlenmeler ve farklı proteinlerin işe karışmasıyla kesim-birleştirme reaksiyonu tamamalanır ve lariat formunda intron uzaklaşır, iki ekzon birbirine bağlanır.

50 Başlık ekleme Transkripsiyonun süreci ile kenetlenir. RNA polimeraz II tarafından DNA transkripsiyonunda oluşan RNA henüz 20 amino aside ulaşmışken 5' uç bölgesinde metillenir. Transkripsiyon başlama yeri RNA polimeraz II nin uzamaya geçişinde anahtar aşama RNA polimeraz II nin CTD veya C uç alanı olarak adlandırılan kuyruğunun yoğun bir şekilde fosforillenmesidir. CTD, başlık ve poliadenilat kuyruk ekleyicilerini sırasıyla transkripte yönlendirir. Başlık İnsan RNA polimeraz II molekülünün CTD bölgesinde 52 tekrar vardır ve bu bölgenin tam olarak fosforillenmesi sonucunda polimeraza 104 tane negatif yüklü fosfat grubueklenmiş olur Başlık ekleme enzimleri Bu özel uçlar, RNA molekülü protein sentezi için çekirdekten atılmadan önce mrna nın her iki ucunun tam (ve mesajın bozulmamış) olduğunun hücre tarafından onaylanmasını sağlar.

51 RNA polimeraz II RNA molekülünün ilk 25 nukleotidini sentezler sentezlemez, yeni yapılan RNA molekülünün 5' ucuna değiştirilmiş bir guanin nukleotidinden oluşan bir kep ekleyerek bu ucu değiştirir. Bu kepleme işlemi RNA polimerazın fosforillenmiş kuyruğuna bağlı olan ardışık 3 enzim tarafından gerçekleşir( fosfataz, guanil transferaz ve metil transferaz). 5- metil kep yapısı ökaryotik mrna ların 5' ucunu simgeler. Bu işaret, RNA polimeraz II nin diğer RNA tiplerinden ayırt edilmesinde yardımcı olur. 7-Metilguanilat 5' başlık, mrna nın 5' ucuna GTP molekülünün trifosfatıyla bağlanmasıyla oluşur. Transkripsiyon kompleksi DNA üzerinde trifosfat bağı ilerledikçe başlık ekleyici enzim kompleksi mrna nın 5' ucuna bir guanilatı 5' 5' trifosfat bağı yaparak bağlar. Bağlanan guaninin yedinci azotu ve kep e komşu birinci ve ikinci Kep e komşu birinci nukleotid nukleotidlerin 2'-OH grupları metillenir. Metil vericisi S-adenozilmetiyonindir. Başlık mrna nın ribozom tarafından tanınmasını Kep e komşu ikinci nukleotid sağladığı gibi, molekülü ribonukleaz etkisinden korur.

52 3' ucunun poliadenillenmesi Ökaryotlarda mrna nın çekirdekten sitoplazmaya taşınması genelde mrna nın 3' ucundaki stop noktasından sonra yer alan adenilat biriminden oluşan bir poli (A) kuyruğu tarafından gerçekleşmektedir. Poliadeninlerin mrna ya bağlanmasının en önemli özelliği mrna nın sitoplazmik enzimlerden etkilenmemesi yani sitoplazmada stabil kalmasıdır. Poli(A) kuyruğunun eklenmesi çok aşamalı bir işlemdir. RNA, büyük bir enzim kompleksinin bir bileşeni olan endonukleaz tarafından AAUAAA sinyal dizisinin 3' ucunda 10 ile 30 nukleotidlik kısmındaki bir noktadan kırılır. Kesilme sonrası, kesilme noktasının 3' ucuna poliadenilat polimeraz enzimi adenilattan oluşan poli(a) dizisini ekler. RNA polimeraz bu işlemden sonra transkripsiyonu sonlandırır. Kalıp DNA Endonükleaz Poliadenilat polimeraz RNA polimeraz Enzim kompleksi