ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ DERSİ LABORATUVAR FÖYÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ ÇEVRE MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ DERSİ LABORATUVAR FÖYÜ Ders Sorumlusu Prof. Dr. Şükrü DURSUN Yardımcı Araştırma Görevlisi Arş. Gör. Zeynep Cansu AYTURAN

2 İÇİNDEKİLER Safya No I. Deney No Sıvı Besi Yeri Hazırlanması ve Ekim Katı Besi Yeri Hazırlanması ve Ekim Mikroskop Tanıtımı II. Deney No Mikroorganizma Boyama Metotları Direkt Sayma Metodu (Thoma Lamı Yöntemi) III. Deney No Kültürel Sayma Metodu (Çoklu Tüp Yöntemi) Kültürel Sayma Metodu (Plaka Yöntemi) IV. Deney No Saf Kültür Elde Edilmesi Seyreltme Metodu Sıvı + Katı Besiyeri V. Deney No Koliform Tayini için Besiyeri Hazırlanması Koliform Tayini (Tahmin Deneyi + Doğrulama Deneyi)

3 ÇEVRE MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ Öğretim Yılı MİKROBİYOLOJİ LABORATUARI DENEY BİLGİLERİ DENEY NO DENEYİN ADI SORUMLU ASİSTAN Tarih Sıvı besi yeri hazırlanması ve Ekim 1 Katı besi yeri hazırlanması ve Arş. Gör. Zeynep Cansu Ekim Ayturan Mikroskop tanıtımı Mikroorganizma boyama metotları Direkt sayma metodu (Thoma Lamı) Kültürel sayma metodu (Çoklu Tüp Yöntemi) Kültürel sayma metodu (Plaka Metodu) Saf kültür elde edilmesi Seyreltme metodu Sıvı+ Katı besiyeri Koliform tayini için besiyeri hazırlanması, Koliform tayini (Tahmin deneyi + Doğrulama deneyi) Arş. Gör. Zeynep Cansu Ayturan Arş. Gör. Zeynep Cansu Ayturan Arş. Gör. Zeynep Cansu Ayturan Arş. Gör. Zeynep Cansu Ayturan 07 KASIM KASIM KASIM ARALIK ARALIK 2017 Deney No Ders Saati Grup Numarası 10:20 11:05 Grup :15 12:00 Grup 2 10:20 11:05 Grup :15 12:00 Grup 1 10:20 11:05 Grup :15 12:00 Grup 2 10:20 11:05 Grup :15 12:00 Grup :20 11:05 Grup 1 11:15 12:00 Grup 2 *Her Grup kendi saatinde deneye girmek zorundadır. Yoklama listeleri ona göre alınacaktır. Her deneyden önce bütün sınıf toplu halde Quiz sınavına girecek, başarısız olan o deneyden başarısız sayılacaktır. 1. Öğrencilerin kendi gruplarında deney gününde deneyleri takip etmesi gerekmektedir. 2. Deneye gerekli laboratuar malzemeleri ile gelinmesi gerekmektedir. (Önlüksüz gelen öğrenci deneye alınmayacaktır.) 3. Deneyin başlangıç saatinden önce öğrencilerin ilgili laboratuarının önünde hazır olması gerekmektedir. 4. Deney başladıktan sonra içeriye öğrenci alınmayacaktır.

4 MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARINDA ÇALIŞIRKEN DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN HUSUSLAR Mikrobiyoloji laboratuvarına devam edecek öğrencilerin aşağıdaki hususlara titizlikle uyması gerekmektedir. Sağlığınız açısından bu hususlara uyulması mecburi olup hiçbir mesuliyet kabul edilmeyecektir. Bu yüzden laboratuvardaki uyarılara kesinlikle uymanız gerekmektedir. Belli başlı hususlar şunlardır: 1- Mikrobiyoloji laboratuvarına devam edecek öğrenciler laboratuvara gelirken temiz, beyaz bir önlük getireceklerdir. Önlüksüz gelen öğrenciler laboratuvara kesinlikle alınmayacaktır. 2- Laboratuvarda çalışmaya başlamadan önce ve çalışma bittikten sonra elleriniz sabunla iyice yıkayınız. Daha sonra da uygun bir dezenfektan ile dezenfekte ediniz. 3- Çalışmaya başlamadan önce çalışma sahanızı uygun bir dezenfektan (mesela %70 lik etil alkol) ile iyice siliniz. Gerekirse yıkayınız. 4- Laboratuvarda hiçbir şey yiyip içmeyiniz. 5- Bakteri kültürlerinin ağzını devamlı olarak kapalı tutunuz. 6- Elinizle bakteri veya diğer mikroorganizma kültürlerine dokunmayınız. 7- Bakteri süspansiyonlarını hiçbir zaman ağzınızla çekmeyiniz. Bunun için mekanik ayarlı pipetleri kullanınız. 8- Öze, iğne gibi malzemeleri kullanmadan önce ve kullandıktan sonra bunları bek alevinde iyice yakınız. 9- Mikroorganizmalarla temas eden her türlü malzemenin sterilize edilmesi gerekmektedir. 10- Her öğrencinin kırılabilecek malzemelere gerekli dikkati göstermesi önemle tavsiye edilir. Zira, kırıldığı takdirde yenisini almak mecburiyetindedir. 11- Bakteri kültürü herhangi bir sebeple dökülecek olursa, hemen laboratuvar sorumlularına haber veriniz. (A1ko1 dökülerek yakılması gerekir) 12- Laboratuvar çalışması bittikten sonra, herkes çalıştığı masayı temizlemek mecburiyetindendir. 13- EN ÖNEMLİSİ, HER ÖĞRENCİ LABORATUVARA GELMEDEN ÖNCE YAPILACAK DENEYİ İYİCE OKUYUP GELMELİDİR.

5 DENEY NO 1 Sıvı Besi Yeri Hazırlanması ve Ekim Katı Besi Yeri Hazırlanması ve Ekim Mikroskop Tanıtımı Amaç: Mikroorganizmaların üretilmesi amacıyla kullanılan, organik veya inorganik kimyasal maddeler yardımıyla oluşturulan ortamların hazırlanışını ve mikroskop kullanımını öğrenmek. TEORİK BİLGİ Herhangi bir canlı hücre canlılığını yani metabolik olaylarını devam ettirebilmek için çevreden bazı besin maddelerini alması gerekir. Canlıların besin maddelerini alış ve bu maddelerden faydalanma tarzları dikkate alındığında iki büyük grup görülür. İhtiyaç duyulan besin maddelerini gerek sıvı gerekse katı formda olsun özel bir organ veya organel yardımıyla alıp enzimatik olarak kullanabilir şekle çeviren canlıların beslenme şekline HOLOZİK beslenme denir. Buna örnek olarak, protozoalardan insanlara kadar olan bütün canlıları gösterebiliriz. Buna karşılık bakteri, mantar ve riketsiyalar katı besin maddelerini özelleşmiş organ veya organelleri ile içeri alıp sindirme özelliklerine sahip değillerdir. Bu tip canlılar, besin maddelerini enzimatik olarak parçalarlar ve bundan sonra hücre içerisine alırlar. Bu tip beslenme şekline HOLİFİTİK beslenme denir. Mikroorganizmaların üretilmesi için kullanılan çeşitli organik veya inorganik kimyasal maddelerden oluşmuş ortamlara besiyeri denir. Geliştirilmek istenen mikroorganizmaya ve çalışma amacına göre çeşitli besiyerleri mevcuttur. Bu besiyeri tiplerine girmeden önce, besiyerlerinin bileşimine giren organik ve inorganik kimyasal maddeleri kısaca açıklamakta fayda var. Besiyerlerinin Bileşimine Giren Kimyasal Maddeler: 1. AGAR: Agarın besiyerlerinin bileşiminde kullanılması 1883 yıllarına rastlar. Koch 'un asistanlarından birisinin karısı olan Frau Hess, Hollandalı bazı arkadaşlarının marmelatları katılaştırmak için deniz alglerinden elde edilen ve agar olan bu maddenin besiyerilerinin katılaştırılmasında kullanılabileceğini ve o güne kadar katılaştırma ajanı olarak kullanılan jelatinin yerini tutabileceğini ileri sürmüştür. Yine bu tarihlerde Koch 'un diğer bir asistanı olan Richard Petri, bakteri kolonilerinin tek tek geliştirilerek saflaştırılabilmesi için gerekli olan katı besiyeri yüzeylerinin elde edilmesi için petri kutularını geliştirmiştir. Bu buluşlardan sonra birçok bakteri saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Agar, yapı itibariyle d-galaktopiranoz birimlerinden oluşmuş bir polisakkarittir. Bu maddenin redüksiyonu sonucu Galaktoz birimleri meydana gelir. Özellikle Uzakdoğu orijinli deniz alglerinden elde edilir. Bu maksat için Gelidium, Eucheuma, Pterocladia algleri kullanılır. Toz veya lif halinde olabilen agar, algin kurutularak yüksek sıcaklıktaki suda ekstraktının hazırlanması, daha sonra ise sırasıyla asitlerle ve amonyaklı su ile muamele edilmesiyle hazırlanır. Agar polisakkarit yapısında olmasına rağmen mikroorganizmalar tarafından besin kaynağı olarak kullanılamazlar. Bu özellik, muhtemelen agarda bulunan değişik bağ yapısından kaynaklanmaktadır. Yapılan bazı araştırmalarda agar tipi polisakkaritleri ve oligosakkaritleri parçalayan B-Agaraz I ve II enzimleri Psedomonas atlantica dan izole edilmiştir. 1

6 Agar molekül yapısı sebebiyle kendisinin katı suyu tutma özelliğine sahiptir o C de katılaşır, o C de erir. Genellikle %0.5-3 lükmiktarları besiyerlerini katılaştırmak için yeterlidir. Agar, katı besiyerleri için %1-3, yarı katı besiyerleri için % , yarı sıvı besiyerleri için % oranlarında kullanılır. Özel olarak hazırlanmış ağarlar hariç tutulursa, ağarın besiyerini katılaştırmadan başka bir fonksiyonu yoktur. 2. JELATİN: Jelatin de ilk defa l883 yılında Koch tarafından besiyerlerini katılaştırmak amacıyla kullanılmıştır. Yapı olarak bir protein türevidir o C de katılaşır, 37 o C de erir. Jelatin mikrobiyolojide iki amaç için kullanılmaktadır: Besiyerlerini katılaştırmak için ve mikroorganizmaların proteolitik aktivitelerinin tayini için. Katılaştırmak için genellikle %10-20 lik oranlar yeterlidir. Jelatin, agarla besiyerlerinin katılaştırılması yönünden karşılaştırıldığında gerek düşük sıcaklıklarda erimesi gerekse bazı mikroorganizmalar tarafından eritilmesi sebebiyle tercih edilmez. 3. PEPTON: Mikrobiyolojide en fazla kullanılan maddelerden biridir. Mikroorganizmalar tarafından karbon ve azot kaynağı olarak kullanılır. Bilhassa kan pıhtısı, yağsız et, kalp kası, soya fasulyesinden hazırlanır. Peptonlar, yukarıda sayılan maddelerin asidik olarak veya enzimatik olarak parçalanması sonucu elde edilirler. Enzimatik hidroliz için bilhassa pepsin, tripsin, ve papain gibi enzimler kullanılır. Pepton içerisinde amino asit, dipeptid, tripeptid, polipeptid, magnezyum ve potasyum tuzları ile riboflavin ve nikotinik asit gibi üreme faktörleri bulunur. Bu maddelerin oranlarının değişmesiyle değişik karakterlerde peptonlar hazırlanır. 4. BEEF EKSTRAKT (ET EKSTRAKTI): Yağsız etten hazırlanır ve bileşimi tam olarak bilinmez İçerisine etin bileşimindeki birçok madde bulunur. Taze et iyice kıyıldıktan sonra suda kısa süre kaynatılarak etteki besinlerin süspansiyona geçmesi sağlanır. Daha sonra da suyu uçurularak kullanılabilir hale getirilir. Bileşiminde, mineral maddelere ilaveten üreme faktörleri (Nikotik asit, Pantotenik asit, Piridoksin, Kolin, Riboflavin), çeşitli amino asitler, pürin, glutation ve etin bileşimindeki diğer maddeler bulunur. 5. YEAST EKSTRAKT (MAYA EKSTRAKTI): Ekmek veya bira mayasının otolizi veya asidik hidrolizi ile elde edilir. Bileşiminde B-Grubu vitaminler, karbonhidratlar bulunur. 6. SERUM: Sıvı ve katı besiyerlerinde amaca göre değişik oranlarda olmak üzere zenginleştirmek amacıyla katılır. Bileşiminde, organik ve inorganik maddelerle birlikte üreme faktörleri bulunur. 7. MİNERAL MADDELER: Bu amaç için çeşitli tuzlar kullanılır. Örnek olarak Na +, K +, Mg ++, Mn ++, Fe ++/+++ gibi elementlerin türleri verilebilir. İnorganik mineral maddeler bilhassa ozmotik yoğunluğu temin etmek ve içerideki metabolik olaylar için kullanılır. 8. KARBON KAYNAKLARI: Enerji kaynağı ve birçok diğer organik maddelerin sentezinde iskelet teşkil etmesi sebebiyle bilhassa karbonhidratlar kullanılır. Mikroorganizmaların teşhisinde ve tiplendirilmesinde de kullanılır. 9. KAN: Bazı mikroorganizmaların kan üzerine etkilerini araştırabilmek için besiyerlerine kan ilave edilir. Bu tip mikroorganizmalar, kan hücrelerinden olan eritrositleri hemolize ederler. 10. SU: Besiyerinin bileşimine giren esas maddedir. Su gerek besin maddelerinin çözünmesi gerekse metabolik olayların yürütülebilmesi için gerekli olan en önemli maddedir. 2

7 11. BOYA MADDELERİ: Boya maddeleri, gelişme inhibitörü veya belirli metabolik olayların göstergesi olarak besiyerlerinde ilave edilir. En önemlisi de mikroorganizmaların boyanmasında kullanılır. 12. ANTİBİYOTİKLER: Özellikle selektif besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılır. Antibiyotiklerin etki mekanizmalarının farklılığından faydalanılarak istenen mikroorganizmaların gelişmesi belli ölçülerde sağlanabilir. Antibiyotikler bundan başka terapide önemli bir yer tutan antibiyogram testlerinin yapılmasında da kullanılır. 13. AMİNO ASİTLER: Proteinlerin yapısına girdikleri için mikroorganizmaların hücre faaliyetlerinde önemli rolleri vardır. Ayrıca, bazı genetik çalışmalarda, bakterilerin amino asit mutantlarının seçiminde de kullanılır. Besiyerleri: Mikroorganizmaların kültürü için kullanılan besiyerlerinin kompozisyonları mikroorganizma gruplarına göre ve çalışma amacına göre oldukça farklılıklar gösterir. Mikroorganizmaların gelişebilmesi için, besiyerlerinin yeterli derecede neme, uygun bir ph a, uygun bir oksidayon-redüksiyon potansiyeline ve özel besinlere sahip olması gerekmektedir. Bu sebeple funguslar, bakterilerin kültürü için hazırlamış besiyerlerinde optimal olarak kültüre alınmazlar. Yanı şekilde, bakterilerde funguslar için hazırlanmış besi yerinde kültüre alınmazlar. Birkaç tür hariç, bütün mikroorganizmalar üniversal kültür besiyerleri üzerinde gelişebilirler, bu tip besiyerlerine NONSPESİFİK=SPESİFİK OLMAYAN besiyeri denir. Buna karşılık, bazı besiyerlerinde belirli bir tür veya grup mikroorganizma yetişebilir, bu tip besiyerlerine de SELEKTİF=SEÇİCİ besiyeri denir. Besiyerleri sıvı veya katı olabilirler. Sıvı besiyerine katılaştırıcı bir ajan (agar veya jelatin) eklenerek katı besiyeri elde edilebilir. Katı besiyerleri üzerinde tek tek bakteri kolonileri teşekkül ettiği için, herhangi bir yerdeki bakteri sayısını tayin etmek ancak besiyerleri ile mümkün olabilmektedir. Ayrıca saf kültürün hazırlanması için de katı besiyerlerine ihtiyaç vardır. Genel olarak bakteriler en iyi şekilde ph ı arasında olan, pepton ve beef ekstratı ihtiva eden besiyerlerinde gelişirler. Buna karşılık, maya ve küflerin ph istekleri 2-6 arasındadır ve şekerli besiyerlerini tercih ederler. Besleyenleri kullanma amaçlarına göre çeşitli şekillerde sınıflandırılmışlardır. Genel olarak besiyerleri canlı ve cansız veya katı ve sıvı olarak ayrılmaktadır. Virüs veya riketsiya gibi mikroorganizmalarla birkaç bakteri türü gelişip üreyebilmeleri için mutlaka canlı besiyerlerine ihtiyaç duyarlar. Birçok mikroorganizma ise cansız olan sentetik besiyerlerinde rahatlıkla üreyebilirler. Besiyerlerini canlı ve cansız olarak inceleyecek olursak; A- Canlı Besiyerleri: Canlı ve çoğalan hücrelerden oluşan besiyerleridir. Deney hayvanları ve doku kültürleri canlı besi yerlerine örnek olarak verilebilir. A1- Deney Hayvanları: Mikroorganizmaların üretilmesinde çeşitli deney hayvanları kullanılır. Bunlardan maymun, kobay, fare, sıçan, tavşan ve kümes hayvanları sayılabilir. Bu hayvanların seçimi, çalışılan, mikroorganizmanın tipine ve amaca göre değişmekte olup, bazı mikroorganizmalar için belirli yaştaki hayvanlara ihtiyaç duyulmaktadır. Canlı besiyerleri içerisinde döletli yumurta en fazla kullanılan besiyeridir. Kabakulak (Paramyxovirus) ve uçuk virüslerinin (Herpesvirus) üretilmesinde en çok kullanılan döletli yumurta besiyeridir. A2- Doku Kültürleri: Doku kültürleri, tüp, şişe veya petri kutusu gibi cam malzemeler içerisinde yapılmaktadır. Kültürü yapılmak istenen dokunun belli bir bölgesinden bir miktar hücre alınır ve belirli besin çözeltileri içerisinde geliştirilir. Doku kültürü yapıldıktan sonra 3

8 üretilmek istenen mikroorganizmadan buraya ekim yapılır. Doku kültürleri, virüslerın ve riketsiyaların üretilmesinde fazla kullanılır. Ayrıca cüzzama neden olan Mycobacterium ve frengi=sifiliz yapan Treponema pallidium gibi bakterilerin geliştirilebilmesi için doku kültürleri gibi canlı besi yerleri kullanılmaktadır. B- Cansız Besiyerleri: Laboratuvarda hazırlanırlar. Sıvı ve katı olmak üzere ikiye ayrılırlar. Cansız besiyerleri kimyasal özelliklerine göre şu şekilde sınıflandırılabilir: Bl- Kimyasal Yapıları Bilinen Besiyerleri: Kimyasal kompozisyonları ve içerisindeki maddelerin miktarları bilinen besiyerleridir. Bilhassa, mikroorganizmalardaki metabolik yolların anlaşılması veya metabolizma ürünlerinin araştırılması amacıyla hazırlanırlar. B2- Genel Üretim Besiyerleri: Laboratuvarda en fazla kullanılan besiyerleridir ve ikiye ayrılırlar. Temel ve basit besiyerleri mikroorganizmaları üretmek için kullanılırlar. Pepton + NaCl (peptonlu su), Beef Ekstrakt + Pepton + NaC1 (buyyon) gibi maddelerin suda eritilmesiyle hazırlanırlar. Buyyona %1-1.5 oranında agarın eklenmesiyle elde edilen besiyerine jeloz adı verilir. Bir diğer genel besiyeri zenginleştirilme besiyeri olarak adlandırılır. Temel besiyerlerine kan, serum, glikoz ve yumurta gibi besin maddelerinin eklenmesiyle elde edilir. İstenen mikroorganizmaları zenginleştirmek için kullanılırlar. B3- Özel Besiyerleri: Belirli mikroorganizmaların üremesinin temin edilerek diğerlerinin gelişmesinin engellenmesi, sadece bir tür veya grup mikroorganizmanın üretilmesi için kullanılan, içlerinde belirli ayraçlar bulunan ve bu şekilde metabolik olayların varlığının anlaşılmasında kullanılan besiyerleridir. Bunlardan bazıları şunlardır; a) Spesifik Besiyerleri: Bir tür mikroorganizmayı geliştirmek için hazırlanan besiyerleridir. Buna örnek olarak Mycobacteriumlar ın izolasyonu ve geliştirilmesi için kullanılan Lowenstein-Jensen besiyerini verebiliriz. b) Selektif Besiyerleri: Bazı mikroorganizmaların gelişmesini temin eden, diğerlerininkini ise inhibe eden besiyerleridir. Bu tip besi yerlerine antibiyotikler, boya maddeleri ve bazı tuzlar ilâve edilerek seçicilik sağlanır. c) Ayırıcı Besiyerleri: Bileşiminde ayraçları bulunduran besiyerleridir. Bakterilerdeki metabolik farklılıklar dolayısıyla tür farklılığından dolayı ayracın renginde meydana gelen farklılıklar gösterge olarak kullanılır. Örneğin, Laktoza etkili ve etkisiz bağırsak bakterilerinin ayrılmasında Endo veya EMB besiyerleri kullanılır. d) Ayraç Besiyerleri: Mikroorganizmaların metabolizmalarının incelenmesinde kullanılırlar ve amaca göre seçilmiş ayraçları ihtiva ederler. Bunlar arasından, Brom Thymol Blue, Metil Red ve Phenol Red sayılabilir. Şekerlerin fermantasyonu sonucunda asit oluşup oluşmadığı bu besiyerleri ile anlaşılır. KULLANILAN MALZEMELER VE CİHAZLAR - Petri Kutuları - Tüpler - Etüv - Otoklav - Erlenmayer - Pipetler - Beher 4

9 - Pamuk - Tüp - Alüminyum Folyo - ph Metre - Katı Besiyeri (Plate Count Agar, Eosin Methylene Blue Agar) - Sıvı Besiyeri (Nutrient Broth) DENEYİN YAPILIŞI Katı besiyerleri yatık veya dik olarak tüpte ve petrilerde, sıvı besiyerleri ise tüpte ve erlenlerde hazırlanabilir. Besiyerleri genellikle toz halinde kurutulmuş olup ne kadar hacım için ne kadar tartılacağı, üzerinde yazılıdır. Ayrıca, besiyerinin bileşimine giren maddeler miktarlarıyla birlikte belirtilmiştir. Petri kutularına besiyeri hazırlarken şu sırayı takip etmek gerekir; - İstenen hacim için gerekli olan besiyeri veya besiyeri bileşiminde bulunan maddelerden tartılır. - Temiz bir erlenmayer içerisinde yavaş yavaş damıtık su ilave edilerek çözülür, son hacime damıtık su ile tamamlanır. - Besiyerinin ph'ı kontrol edilir ve gerekirse ph'ı ayarlanır. - Erlenmayerin ağzı alüminyum kâğıt ile veya pamuk ile kapatılır. Pamukla kapatılmış ise pamuğun üzeri tekrar alüminyum kağıtla kapama yapılır. - Otoklava konarak 121 o C de 15 dakika sterilize edilir. - Otoklavın basıncı sıfıra düştükten sonra kapağı açılır. - Daha önceden Etüv de 175 o C de 1 saat bekletilerek sterilize edilmiş olan petri kutularına, erlenmayer içerisindeki besiyeri konur. Bunun için erlenmayerin ağzındaki pamuk veya alüminyum kâğıt önce çıkarılır, erlenin ağzı alevden geçirilerek sterilize edilir ve petri kutusunun kapağı yarım açılarak tabanı kapalayacak şekilde besiyeri dökülür. Besiyerinin dökülmesi işlemi mümkün olduğunca kısa sürede tamamlanmalıdır. Bunun nedeni laboratuvar ortamında bulunan spor formundaki mikroorganizmaların besiyerini kontamine etme ihtimalidir. Ayrıca dökme işlemi sırasında erlen nin ağzı arada bir yakılmalıdır. - İçlerinde besiyeri bulunan petri kutuları oda sıcaklığında bırakılır, içerisindeki agardan dolayı besiyeri 43 o C nin altına düştüğü anda katılaşır. Petri kutuları ters çevrilir ve ekim yapılmayacaksa buz dolabına ters bir şekilde yerleştirilerek muhafaza edilir. Tüplere dik veya yatık katı ve sıvı besiyeri hazırlanırken aşağıdaki sıra takip edilir; - İstenen hacim için gerekli olan besiyeri veya besiyeri bileşiminde bulunan maddelerden tartılır. Gerekli hacimde erlenmayer içerisinde çözülür. - Besiyerinin ph'ı kontrol edilir ve gerekirse ph'ı ayarlanır. - Katı besiyerinin içerisindeki ağarın eritilebilmesi için, erlenmayer basınç düğmesi kapatılmış otoklavda 5-10 dakika bekletilir. - Katı besiyeri eritildikten sonra sıvı besiyeri ise direkt olarak temiz tüplere 7-8 ml taksim edilir. Katı besiyeri için bu işlemi kısa sürede yapmak gerekir, çünkü besiyeri içinde bulunan agar bir süre sonra katılaşmaya başlayacaktır. - Besiyeri dağıtıldıktan sonra tüplerin ağzı pamukla kapatılır ve tüpler topluca beher içine konarak ağızları alüminyum folyo ile kapatılır. 5

10 - Tüpler daha sonra otoklava konarak 121 o C de 15 dakika sterilize edilir. - Otoklavadan çıkarılan, içerisinde steril katı besiyeri bulunan tüpler kullanım amacına göre dik ve yatık vaziyette bırakılır. Bu şekilde besiyerlerinin katılaşması sağlanır. Ekim yapılmayacak tüpler buzdolabında muhafaza edilir. - Sıvı besiyeri hazırlama işlemi aynı şekilde yapılır. Sadece besiyerinin içinde agar olmadığı için tüp içerisinde bulunan steril besiyeri sıvı haldedir. Deney sırasında katı besiyeri hazırlanırken tüpte yatık olarak standart Plate Count Agar, petride ise Eosin Methylene Blue Agar kullanılacaktır. Sıvı besiyeri hazırlanırken ise Nutrient Broth kullanılacaktır. Bileşimleri aşağıda verildiği gibidir. Standart Plate Count Agar - Tryptone : 5 gr - Glukoz : 1 gr - Yeast Ektrakt : 2.5 gr - Agar : 15 gr - Damıtık Su : 1000 ml - ph : 7 Eosin Methylene Blue Agar - Pepton : 10 gr - K2HPO4 : 2 gr - Laktoz : 10 gr - Sakkoroz : 5 gr - Eosin Y : 0.4 gr - Methlene Blue : gr - Agar : 15 gr - Damıtık Su : 1000 ml - ph : 6.8 Nutrient Broth - Beef Ektrakt : 3 gr - Peptone : 5 gr - Damıtık Su : 1000 ml Besiyerlerine Ekim 1- Sıvı Besiyerine Ekim Sağ elle tutulan özenin teli kor haline gelinceye kadar yakıldıktan soma soğutulur ve bakteri kütlesi veya numune özenin halkası ile alınır. İçerisinde steril sıvı besiyeri bulunan tüp veya erlenmayer sol elle tutularak ağzındaki pamuk, sağ elin küçük parmağı ve avuç içerisine sıkıştırılarak çıkarılır. Tüp veya erlenmayerin ağız kısmı alevden geçirilerek sterilize edilir ve öze tüp veya erlemayerin içerisine sokulur. Öze halkasında bulunan bakteri kütlesi veya numune, sıvı besiyeriinin hemen üst kısmında, tüpün kenarında iyice ezilerek besiyerine karışması sağlanır. Ekim işleri esnasında tüp veya erlenmayerin birçok kontaminasyona engel olmak bakımından yatık vaziyette tutulması gerekir. Ekim (İnokülasyon işlemi) bittikten sonra; önce erlenmayer sonra tüpün ağız kısmı yakılır ve pamuğu kapatılır. Daha sonra öze teli, alevin üst kısmından yavaş yavaş dik vaziyette 6

11 aşağıya indirilerek yakılır. Ekimi yapılmış olan sıvı besyeri daha sonra inkübatörde inkübe edilir. 2- Katı Besiyerine Ekim Katı besiyerlerine ekim tüplere ve petlilere olmak üzere ikiye ayrılır. Petrilere ekimde, içerisinde steril besiyeri bulunan petri kutusu sol tarafa konur. Öze yakılıp soğutulduktan sonra, bakteri kütlesi öze halkası ile alınır. Sol avuç içerisine alınan petri kutusunun kapağı sol elin parmakları vasıtasıyla hafifçe açılır. Açık kısmı bize bakacak şekilde tutulur ve öze halkasındaki bakteri kütlesi çeşitli şekillerde besiyerinin yüzeyine yırtmadan ekim yapılır. Ekimden sonra petrinin kapağı kapatılır ve ters vaziyette inkübatöre konur. Öze tekrar yakılır. Ekim şekillerine göre bakteri kolonileri değişik şekillerde gelişebilirler (Şekil 1). Şekil 1. Bakteri kütlesinin ekim şekilleri ve inkübasyondan sonraki bakteri kolonilerinin görünümü Petri kutularındaki besiyerlerine, L şeklinde kıvrılmış bagetlerlede ekim yapılır. Ekim yapılırken bazen de ne baget ne de öze kullanılır. Sterilize edildikten sonra o C lik su banyosuna konarak sıvı halde kalması temin edilen tüplerdeki besiyeri içerisine, steril şartlarda ekimi yapılmak istenen numune veya bakteri süspansiyonundan belirli bir miktar konur. Tüp karıştırıcıda iyice karıştırıldıktan sonra steril petri kutusu içerisine dökülür. Bu şekilde besiyerinin her yerine bakteri hücreleri yavılmış olur. Petri kutuları daha sonra inkübatöre konur ve inkübasyondan sonra bazı dilüsyonlardan yapılan ekimlerde tek tek bakteri kolonilerinin geliştiği görülür. Tüplere ekimde tüplerdeki katı besiyeri yatık veya dik vaziyette olabilir. Dik katı besiyerleri daha çok bakterilerin jelatini parçalayıp parçalamadıklarını, hareketli olup olmadıklarını anlamak için hazırlanır ve sterilize edilmiş tüpteki agarlı besiyerinin yatırılmadan dik vaziyette katılaşmasıyla elde edilir. Bu besiyerine ekim için, ucu sivri özeler (ok uçlu iğneler) kullanılır. Öze yakıldıktan sonra, ekimi yapılmak istenen mikroorganizmadan bir miktar telin ucu ile alınır. Sol elle tüp tutulur ve ağzındaki pamuk sağ elin küçük parmağı ve avucu arasına sıkıştırılarak çıkarılır. Tüpün ağız kısmı alevden geçirilir. Öze teli, besi yerinin 7

12 tam ortasından tüpün dibe yakın kısmına kadar sokulur. Bu şekilde, delik boyunca mikroorganizmalar inoküle edilmiş olur. Öze tüpten çıkarılır, tüpün ağzı tekrar alevden geçirilir ve pamuğu konur. Daha sonra öze yakılır. İnoküle edilen tüp inkübutöre konur. Tüplerdeki yatık besiyerlerine ekim de özelerle yapılır. Öze teli yakılır ve soğutulur. Sol elle, içinde besiyeri bulunan tüp alınır ve pamuğu daha önce anlatıldığı şekilde çıkarılarak tüpün ağız kısmı alevden geçirilir. Öze halkası ile alınan bakteri besiyerinin yüzeyinde dik zikzaklar çizdirilerek (aşağıdan yukarıya doğru) ekilir. Tüpün ağzı tekrar alevden geçirilerek pamuklanır ve öze yakılır. İnokülasyonu yapılan tüp inkübatöre konur. MİKROSKOP TANITIMI Mikroorganizmaları çoğunlukla gözle görmek mümkün değildir. Görülebilmeleri için büyültülmeleri ve gözle görülür hale getirilmeleri gereklidir. Bu nedenle mikroskop, mikrobiyoloji laboratuvarının vazgeçilmez bir aletidir. Mikrobiyoloji laboratuvarında uygulama yapan her öğrencinin, mikroskobun esaslarını ve özellikle kullanılmasını bilmesi lazımdır. Alet pahalı olduğundan ve mercek kısımları çeşitli etkenlerle kolayca işe yaramaz hale geleceğinden bunun kullanılmasında dikkat ve itina gösterilmelidir. Mikroskobun muhtelif tipleri olup, uygulama laboratuvarında kullanılanlar adi ışık mikroskobudur. Bunlar mekanik ve optik olmak üzere başlıca iki kısımdan oluşmaktadır. Üst tarafta dikey pozisyonda ve her iki ucuna merceklerin yerleştirildiği ANA TÜP ve bazı mikroskoplarda da ana tüp içinde ayrıca ayarlanabilen çekme tüp bulunmaktadır. Bu gibi mikroskopların kullanılmalarından önce çekme tüpün yan tarafındaki 160 sayısının görülecek şekilde yukarı kaldırılması gerekmektedir. Bununla beraber birçok mikroskoplarda tüp sabit olduğundan bunun ayarlanmasına lüzum yoktur. Ana tüpün alt tarafında, üzerine preparatın konduğu TABLA bulunmaktadır. Bazı mikroskoplarda tabla sabit olduğu halde bazılarında muayenesi yapılacak objenin yatay pozisyonda hareketini sağlayan mekanik kısım bulunmaktadır. Bu gibi tablalara MEKANİK TABLA adı verilmektedir. Ana tüple tablayı kol birleştirmektedir. Kol bazı mikroskoplarda düz olduğu halde bazılarında bükeydir ve mikroskobun kaldırılması veya taşınmasında hizmet görür. Doğrudan doğruya kolun ve tablanın alt tarafında at nalı şeklinde ayak ile desteklenen direk şeklinde bir sütun bulunmaktadır. Kol ve sütunun birbirine EĞİLMEYERİ (eklem) adı verilen bir mekanizmayla bağlı bulunmaktadır. 8

13 Şekil 2. Işık Mikroskobu Kısımları Ana tüpün üst ucuna yerleştirilen mercek sistemine denmekte ve 10X işareti bulunan görüntüyü 10 defa büyüttüğünü ifade etmektedir. Okülerin zarar görmemesi için ince yumuşak kâğıt ile temizlenmesi lazımdır. Mikroskop kullanılmadan önce ana tüpten çıkartılarak silinmesi adet haline getirilmelidir. Ana tüpün alt ucunda yuvarlak şekilde DÖNDÜRME MEKANİZMASI ve bunun alt tarafında ise OBJEKIİF adı verilen mercek sistemi bağlanmış bulunmaktadır. Objektifler muhtelif uzunlukta olup burun kısmının döndürülmesi suretiyle bunlardan herhangi biri ana 'tüpün merkezinden inen hat üzerine getirilebilir. Objektif oküler gibi ince yumuşak kâğıt ile temizlenmelidir. Mikroskopta bulunan üç objektiften en kısası az büyütme güçlü objektif olup üzerinde 10X işareti bulunmaktadır. Bundan daha uzun olanına Yüksek Büyütme Güçlü Objektif adı verilmekte ve üzerinde 43X işareti bulunmaktadır. En uzun olan objektife ise İmmersiyon Objektifi denilmekte ve üzerinde 97X veya 100X işareti bulunmaktadır. İmmersiyon objektifindeki merceğin alt tarafı o kadar küçüktür ki yeteri kadar ışık mercekten içeri geçemez. Bunu sağlamak üzere immersiyon objektifinin kırılma indisi, camın indisinin aynı olan sedir yağına batırılarak kullanılması gerekmektedir. Bu sebepten immersiyon objektifi kullanılacağı zaman preparat üzerine bir damla sedir yağı damlatılır ve objektif bu yağa batırılarak gözlem yapılır. Mikroskop kolunun her iki yanında birer adet kaba ayar vidası ve bunların altında da yine birer adet ve fakat diğerinden daha küçük ince Ayar Vidası bulunmakta ve ayar bu vida vasıtasıyla yapılmaktadır. Tablanın alt tarafında Kondansör ve İris Diyaframı bulunmakta ve Objektife gelen ışık bu diyafram ile kontrol edilmektedir. Kondansörün solunda ve onu tablaya bağlayan 9

14 mekanizmaya Tabla Altı Kolu adı verilmektedir. Bunun alt ucunda kondansörü kaldıran veya indiren ayar vidası bulunmaktadır ki buna Hızlı Vida denilmektedir. Ayakta tabla arasında yuvarlak şekilde bir Ayna bulunmaktadır. Bu ayna birbirine dikey iki eksenden birisi üzerinde çevrilebilir ve ışınları preparasyon üzerine yansıtır. Aynanın bir yüzü düz bir yüzü ise iç bükeydir. Bunlardan başka preparatın tabla üzerinde sıkıca tutulmasını KISKAÇ sağlar. İmmersiyon objektifi ile çalışırken dikkat edilmesi gereken en önemli nokta, obje önce küçük büyütmede bulunmalı, daha sonra immersiyon objektifine geçilmelidir (100X). Bu büyütmede sadece mikro vida ile görüntü aranır. Adi ışık mikroskobunda, boyanmış ve dolayısıyla ölmüş bakteriler incelenirken, karanlık alan mikroskobunda bakteriler boyanmadan incelenirler. Bu şekilde bakterilerin hareketli olup olmadıkları ve kirpik durumları rahatlıkla görülebilir. Karanlık alan mikroskobundaki kondasör ışık mikroskobundaki kondansörden farklıdır. Bu şekilde objeler üzerine eğik ışınlar gönderilir ve bakteriler karanlık bir sahada parlak olarak görülürler. Elektron Mikroskobu hariç tutulacak olursa, mikrobiyoloji laboratuvarlarında adi ışık mikroskobu, faz-kontrast mikroskobu, flüoresan mikroskobu, karanlık alan mikroskobu çok fazla kullanılır. Bakteriler genellikle 1000X büyütmede incelenirler. Bu büyütme ise immersiyon objektifi ile elde edilir. İmmersiyon objektifi ile çalışırken incelenecek olan preparatın üzerine bir damla immersiyon veya sedir yağı damlatılır. İmmersiyon objektifinin delik çapı oldukça küçüktür. Bu sebeple, kondansörden gelen ışınların çok azı bu açıklıktan geçebilir. Işınların büyük bir kısmı yanlara doğru kırılarak kaybolur. İşte bu yüzden preparatın üzerine sedir veya immersiyon yağı konur ve ışınların yanlara doğru kırılarak kaybolması sağlanır Flüoresan mikroskobunda, ışık kaynağı normal ışık olmayıp ultraviyole ışındır. Buda, yüksek basınçlı cıva basınçlı lambalar kullanılarak elde edilir. Bakteriler normal olarak bu ışınlar altında flüoresans ışın saçmazlar. Ancak bu bakteriler Auramin, Korifosfin O, Tioflavin S, Berberin Sülfat, Fuksin, Morin ve Primulin gibi flüoresans renk veren boyalarla muamele edildikten sonra flüoresan mikroskobunda bakılacak olurlarsa karanlık bir sahada flüoresans renk veren parlak cisimler şeklinde görülürler. Faz-Kontrast mikroskobunda ise, adi ışık mikroskobundan farklı olarak kondansör ve objektifte olmak üzere iki adet difraksiyon (ışınların kırılması) levhası bulunur. Bu levhalar, gelen ışığın dalga boyunda l/4'lük bir değişikliğe sebep olurlar ve ışınlar l/4'lük bir gecikmeyle gelirler. Bu şekilde faz-kontrast mikroskoplarında, ışık kaynağından doğrudan doğruya gelen ışınlar ve cisimlerden kırılarak gelen ışınlar olmak üzere iki tip ışın vardır. Faz-kontrast mikroskobunda bakteriler canlı olarak incelendiği için, bakteri hareketlerini, bölünmesini, çeşitli yapı elemanlarını, inklüzyonları incelemek mümkündür. 10

15 DENEY NO 2 Mikroorganizma Boyama Metotları Direkt Sayma Metodu (Thoma Lamı Yöntemi) Amaç: Mikroorganizmaların boyanarak daha kolay ayırt edilmelerini sağlamak ve koloni sayısının Thoma Lamı yöntemi ile belirlenmesi. TEORİK BİLGİ Mikroorganizmalar, mesela bakteriler boyanmadan mikroskopta muayene edildiklerinde yarı saydam olduklarından ötürü iyi görülemezler. Bunların iyi görünmeleri morfoloji ve sitolojileri hakkında bilgi edinmek ancak boyanmaları ile mümkün olmaktadır. Bu bakımdan biyolojik boyalarla mikroorganizmaların boyanmaları bakteriyolojide çok önemlidir. Mikroorganizmaların boyanmaları için önce bunların preparatlarının yapılması gereklidir. Bunun için de çok temiz bir lamın ortasına bir damla destile su konur ve katı besiyerindeki kültürden aşı iğnesi ucu ile alınan bir miktar bakteri, su damlasının kenarında iyice ezildikten sonra su ile karıştırılarak homojen hale getirilir. Bundan sonra lamın üzerine ince bir tabaka halinde yayılır. Şayet bir de sıvı besiyeri kültürü varsa bu takdirde bir lam üzerine bir damla Pastör pipeti ile konduktan sonra lam üzerine yayılır ve havada kurutulur., Bundan sonra bakterinin lam üzerine tespit edilmesi gerekmektedir ki bu FİKSASYON adı verilmektedir. Bu da genel olarak alt yüzünü (bakteri tabakasının bulunduğu yüz üstte kalacak şekilde) hafif olarak alevden geçirmek suretiyle yapılır. Ancak özel maksatlarda, meselâ kanın tespitinde alev yerine alkol kullanılmaktadır. Tespit işlemi, mikroorganizmaların özellikle boyama sıvasında preparat yıkanırken onların akıp gitmemelerini sağlamaktadır. Tespit veya fiksasyon islerinden sonra boyama yapılmaktadır. Bunun içinde boya çözeltilerinin daha önceden hazırlanmaları lazımdır. Mikroorganizmaların boyanmasında genel olarak iki metot kullanılmaktadır. Bu metotlar; 1- Basit boyama metodu, 2- Diferansiyel boyama metodudur, Basit boyama metodunda tek bir boya, diferansiyel boyama metodunda ise birden fazla boya uygulanmaktadır. KULLANILAN MALZEMELER VE CİHAZLAR - Mikroskop - Lam - Lamel - Öze - Tüp - Pipetler - Metilen Mavisi - Fuksin - Thoma Lamı - Filtre Kâğıdı 11

16 Kullanılan Boya Çözeltilerinin Hazırlanışları: Basit Boyama için Löflerin metilen Mavisi Boyası: Etil Alkoldeki doymuş metilen mavisinden 30 ml + % 1 lik KOH den 1 ml damıtık su şeklinde hazırlanır. Gram Boyama İçin 1- Kristal Viole Stoğu Kristal Viole 10 gr % 95' lik Etil Alkol 100ml 2- Oksalat Stoğu Amonyum Oksalat 1 gr Damıtık Su 100 ml Oksalat solüsyonu damıtık su ile 1:4 oranında seyreltilir ve daha sonra eşit hacimde Kristal Viole stoğu ile karıştırılır. Şayet kristal viole stoğu konsantre gelecek olursa, oksalatla karıştırmadan önce 1/5 oranında veya 1/10 oranında seyreltilir. 3- Gramın iyot Solüsyonu İyot 1 gram Potasyum İyodür 2 gram Bu maddeler 5 ml damıtık su içerisinde tamamen çözülür ve bunun üzerine 140 ml damıtık su ve %5 lik sulu sodyum karbonattan 60 ml ilave edilir. İyice karıştırıldıktan sonra kullanılır. 4- Sulu Bazik Fuksin Stoğu Bazik Fuksin 3 gram 95 lik Etil Alkol 100 ml Hazırlanan bu stoktan 10 ml alınır ve 100 ml damıtık su ile seyreltilir. DENEYİN YAPILIŞI 1- Basit Boyama: Basit boyama, şu şekilde yapılmaktadır: Lam üzerine yayılarak havada kurutulduktan sonra alevden geçirilerek tespit edilen mikroorganizma preparatının üzerine bir boya çözeltisi, mesela Löffler in metilen mavisi, dökülerek bir dakika beklenir. Bu sürenin sonunda preparat su ile hafifçe yıkanır ve filtre kâğıdı arasında kurutularak mikroskopla muayeneye hazır duruma getirilir. Boyama sırasında, boya çözeltisinin lamın üzerini iyice örtmemesi ve preparat üzerinde çöküntü yapmaması için de boya çözeltisinin hazırlanırken süzülmesi unutulmamalıdır. Metilen mavisi ile ve basit boyara ile boyanan hücreler mavi, Malaşit yeşil ile boyananlar yeşil ve Safranın ile boyananlar ise kırmızı görülmektedir. Basit boyamada boyama müddeti değiştiği gibi kullanılan boyaya göre de mikroorganizmaların rengi farklı olmaktadır. Negatif boyamada ise çok kez çini mürekkepten faydalanılır. Bunun içinde bir damla çini mürekkebi lamın uç tarafına konur bir öze dokusu mikroorganizma süspansiyonu ile karıştırıldıktan sonra bir lamel yardımı ile lam üzerine yayılır, preparat hava da kurutulur ve mikroskopta muayene edilir. Çini mürekkep hücreye nüfus etmediğinden muayenede hücreler boyanmamış halde fakat zemin siyah gözükür. Negatif boyamada cini mürekkep yerine NİGROSİN de kullanılabilir. 12

17 2- Diferansiyel Boyama: Diferansiyel boyama metodunda birden fazla boya maddesi kullanılmaktadır Bakterileri ayırmak veya hücrenin kısımlarını ayırmak için kullanılır. Bu boyamaya örnek gram boyama verilebilir. Gram boyama şu şekilde yapılır; - İncelenmesi istenen materyalden steril şartlarda alınır ve temiz bir lamın üzerine homojen şekilde, ince bir film halinde yayılır, havada kurutulur ve alevden geçirilerek sabitlenir. - Preparatın üzerine kristal viyole boyası dökülerek saniye beklenir. - Boya dökülür, iyot solüsyonu ile 1-2 dakika muamele edilir. - Su ile yıkanır ve Alkol-aseton (1:1) karışımı ile dekolorize edilir. Bu işleme, renksiz dekolorize çözeltisi akıncaya kadar (2 saniye-l dakika) devam edilir. - Sulu bazik fuksin ile saniye boyanır. - Su ile yıkanır, havada kurutulur ve İmmersiyon objektifi ile incelenir. Mikroskopta incelenirken mor-menekşe renkte görünen bakteriler Gram (+) pembe renkte görünen bakteriler ise Gram (-) olarak değerlendirilir. Bu boyamada, ikinci olarak kullanılan sulu bazik fuksin "Karşıt Boya" adını alır. Sporların etrafında kalın bir duvar bulunduğu için boyamaları vejetatif hücrelere nazaran oldukça güçtür. Birçok spor boyama metodu mevcuttur. Malaşit Yeşili ile yapılan boyama işlemi sırasıyla şöyledir; - Temiz bir lâm üzerine, sporlanmış kültürden yayma yapılır, havada kurutulur ve alevden geçirilerek fikse edilir. - Temiz bir kurutma kağıdından küçük bir parça kesilerek lâmın, bakteri fikse edilmiş yüzeyine kapatılır. Kurutma kağıdının üzerine %1-2 lik malaşit yeşili (suda hazırlanmış) solüsyonundan damlatılır. Bakteri sürülü yüzey yukarıda kalacak şekilde, lâm çok hafif bek alevinde ısıtılır. Bu arada kurutma kağıdının kurumamasına dikkat edilir. Gerekirse, malaşit yeşilinden ara sıra damlatılır ve ısıtma işlemine 3-5 dakika devam edilir. - Su ile yıkanır. - Üzerine sulu bazik fuksin çözeltisi dökülür ve saniye beklenir. - Tekrar su ile yıkanır. - Kurutulur ve immersiyon objektifinde incelenir. Mikroskopta, bakteriler füksinle boyandığı için pembe renkte, sporlar ise malaşit yeşili ile boyandığı için yeşil renkte görünürler. Direkt Sayma Metodu (Thoma Lamı Yöntemi) Kültür süspansiyonu iyice çalkalandıktan sonra bir pipetle 1 ml olarak steril bir tüpe konur. Üzerine 9 ml 1/10 oranında seyreltilmiş H2SO4 veya asetik asit ilave edilerek iyice çalkalanır. Steril bir pipetle bu sayıma hazırlanmış kültürden bir damla alarak Thoma lamının sayım yapılacak kısmı üzerine konur ve lamelle kapatılır. Thoma lamı mikroskop tablasına yerleştirilir. En az büyüten objektifle sayım yapılır. Bunun için Thoma lamı (Şekil 2) üzerinde görülen her biri kendi içinde 25 küçük kareye hölünmüş olan 16 büyük karenin çapraz olarak 8 adedinde mikroorganizmaları en az 5 defa sayarak ortalamaları alınır. Sonra 16 karede bulunan miktarı hesaplanır. Bulunan sayı ile ve sonuçta 1/10 olan seyreltme faktörü ile çarpılarak 1 ml deki mikro organizma sayısı bulunur. 13

18 Şekil 3. Thoma Lamı Örnek Hesaplama: Bir büyük karede bulunan 25 adet küçük karenin her birinin ebatları Kenar: 1/20 mm Derinlik: 1/10 olduğuna göre, hacmi = mm3 dür. Bir büyük kare içinde 25 adet küçük kare bulunduğuna göre 16 büyük karede: 16 x 25 = 400 küçük kare bulunur. 16 büyük karenin hacmi ise 1/4000 x 400 = 1/10 mm 3 = 0.1 mm 3 dür. 16 karede 25 mikroorganizma sayıldığı kabul edilirse 0.1 mm 3 hacim içinde 25 mikroorganizma vardır. 0.1 mm3 de 25 mikroorganizma varsa, 1 mm 3 de 250 mikroorganizma ve 1 cm 3 de ise 250 x 1000 mikroorganizma olacaktır. Bu rakam seyreltme faktörü olan 10 ile çarpılacak olursa esas süspansiyonun 1 ml 'sindeki mikroorganizma sayısı bulunmuş olur. Buna göre formül: a*10000*seyreltme Faktörü dür. Burada a: 0.1 mm 3 deki mikroorganizma sayısını gösterir. 14

19 DENEY NO 3 Kültürel Sayma Metodu (Çoklu Tüp Yöntemi) Kültürel Sayma Metodu (Seyreltme Plaka Yöntemi) Amaç: Bir süspansiyondaki mikroorganizma sayısının Kültürel Sayma Metotları ile belirlenmesi. TEORİK BİLGİ Herhangi bir süspansiyondaki total mikroorganizma sayısı esas itibariyle kültürel ve mikroskobik olmak üzere iki metotla sayılmaktadır. Ancak bu metotların uygulanması için numunelerin usulüne göre hazırlanmaları gerekmektedir. Mesela; kuru meyvelerdeki mikroorganizmaların kültürel metotla sayımında mikroorganizmaların seyreltme çözeltilerine geçmesi veya toprağın su ile muamele edildikten sonra mikroorganizmaların süspansiyonda sayılması gerektiği gibi, süt ve şıra gibi sıvı gıda maddelerinde, mikroorganizma yüklerine bağlı olmak üzere, ya doğrudan veya seyrelterek savım yapılmaktadır. Kültürel sayımda eldeki süspansiyondan dilüsyonlar yapıldıktan sonra besiyerlerine ekim yapılmakta ve belli bir inkübasyon süresinden sonra mikroorganizma kolonileri sayılmaktadır. Seyretmeler fizyolojik tuz çözeltisi (%0,85 tuz çözeltisi), Peptonlu su veya Ringer çözeltisi ile yapılmaktadır. Özellikle ozmotik basınca dayanıklı olmayan maya ve bakteri gibi organizmalarda bu husus önemlidir. İnkübasyon müddet ve derecesi mikroorganizmaların cinsine göre değişmektedir. Bazılarını (Termofil) 55 o C, bazılarını (Mezofil) 37 o C de inkübasyona tabi tutmak gerekir. Bazı mikroorganizmalar, mesela; E.coli bakterileri saat içerisinde üredikleri halde bazı mikroorganizmalarda bu süre uzamakta veya kısalmaktadır. Direkt mikroskobik metotta da yine numunenin sayıma uygun şekilde hazırlanması lâzımdır. Örneğin sütte yağın giderilmesi gereklidir. Gerek kültürel gerekse direkt mikroskobik metodun kendine göre üstün ve sakıncalı tarafları bulunmaktadır. Mesela kültürel sayımda canlı mikroorganizma kolonileri sayıldığı halde direkt mikroskobik sayımda hem canlı hem de cansız olanlar sayılmakta ve bu nedenle de ikinci metotta sayım birinciye nazaran daha yüksek bulunmaktadır. Ayrıca kültürel metotta mikroorganizmaların sayılmaları için geçen zaman (inkübasyon müddeti) uzun, buna karşılık direkt metotta bu süre çok çok kısadır. Bunlardan başka kültürel metotta mikroorganizma sayısı kullanılan besi yerine inkübasyon müddet ve derecesine de bağlı bulunmaktadır. Bu nedenle de sayımın daima standart şartlarda yapılması gereklidir. Direkt mikroskobik metotta ise böyle bir sakınca yoktur. Bununla beraber kültürel sayım standart metotlara göre yapıldığından yukarıdaki sakınca büyük ölçüde ortadan kalkmış bulunmaktadır. Her ne kadar direkt mikroskobik sayım kültürel metoda nazaran daha ucuz ise de numunenin çok az olması bazı hallerde esas numuneyi temsil etmediği gibi, mikroorganizma sayısı düşük olan numunelerde bu metodun kullanılması elverişli değildir. Bunlara ilâveten mikroskop alanında mikroorganizma sayılarının değişiklik göstermeleri nedeniyle bu metotta aynı sonuçların elde edilmesi beklenemez. Bu sebeplerden ötürü açıklanan metotlardan birisi diğerine tercih edilerek veya bazen her ikisi bir arada kullanılmaktadır. KULLANILAN MALZEMELER VE CİHAZLAR - Petri Kutuları - Tüpler 15

20 - Pipetler - Etüv - Koloni sayıcı - Besiyeri (sıvı ve katı) DENEYİN YAPILIŞI 1- Seyreltme Plaka Metodu: Numune önce homojen hale getirmek üzere iyice karıştırılır. 5 adet dilüsyon tüpü üzerine 1,2, 3,4 ve 5 rakamları cam kalemiyle yazılır ve bu tüplere 9 ar ml seyreltme çözeltisi konur. Mikroorganizma süspansiyonundan steril pipet ile 1 ml alınarak 1 No lu tüpe aseptik şartlarda boşaltılır. Tüp avuç içinde çevrilerek iyice karışması sağlanır. Böylece 1 nolu tüpte 1/10 oranında bir seyrelt me yapılmış olmaktadır. 1 nolu tüpten yine bir pipetle 1 ml alınarak 2 nolu tüpe aseptik şartlarda aktarılır. Böylece 2 nolu tüpte 1/100 oranında bir seyreltme yapılmış olur. Böyle devam edilerek 1/1000, 1/10000 ve 1/ oranında seyreltmeler elde edilir. Boş petri kutuları üzerine cam kalemi ile seyreltme oranları yazılır ve bu oranlara eşdeğer olan seyreltilerden birer ml boş petri kutularına aseptik şartlar altında aktarılır. Daha önce hazırlanıp eritilmiş ve 45 o C de tutulan agarlı besiyerleri alınarak her petri kutusuna birer tanesi boşaltılır, dairesel hareketle süspansiyonla besiyerinin iyice karışması sağlanır ve katılaşması beklenir. Besiyerleri katılaştıktan sonra maya ve küfler 27 o C de, bakteriler (Mezofil) o C'de inkübatörde saat tutulur ve bu müddetin bitiminde sayım yapılır (şayet sayım gecikirse kültürler soğukta muhafaza edilir). Şekil 4. Dilüsyon Hazırlanması Sayım koloni bulunan petri kutularında yapılır. Bunun için; - Petri kutusu koloni sayıcısına yerleştirilir. - Sayacın lambası açılıp numaratör sıfırlanır. - Koloni sayıcısının ekranında çapraz olarak işaretlenmiş olan karelere raslayan koloniler cam kalemiyle işaretlenir ve her işaretlenen koloni için numaratör düğmesine basılır. - Çapraz olarak işaretlenmiş olan karelerin kapladığı alan hesaplanır. 16

21 - Petri kutusunun alanı bulunup çapraz karelerin kapladığı alanın kaç misli olduğu bulunur. Bulunan rakam çapraz karelerdeki koloni adeti ile çarpılarak ortalama koloni sayısı bulunur. - Bulunan koloni sayısı seyreltme oranıyla çarpılarak 1 ml süspansiyondaki canlı organizma sayısı hesaplanır. Örnek Hesaplama: Petri kutusu taban çapı = 9 cm olsa Petri kutusunun alanı = π*r 2 = 3,1416 x (4,5) 2 = 64 cm 2 Sayacın tablasındaki karelerin her birinin alanı = 1 cm 2 Olduğuna göre kutuda 64 tane kare bulunur. Ancak Petri kutusunun 9 cm lik çapı içine çapraz olarak kaç tane kare girdiğini bulmak için bir küçük karenin köşegenini hesaplamak gerekir. Çünkü bunların köşegenleri uç uca gelerek çapı teşkil eder. Küçük karenin kenarları 1 cm olduğuna göre köşegenin uzunluğu 2 yani cm dir. 9 cm lik bir köşegen içindeki kare sayısı = 9/ = 6.4 dür. Tabloda küçük karelerden meydana gelmiş iki adet çapraz olarak işaretlenmiş kare grubu olduğuna göre toplam olarak bu gurupta 6,4 x 2 = 12.8 adet küçük kare mevcuttur. Bir küçük karenin alanı 1 cm olduğundan 12,8 küçük kare petri kutusunun toplam alanının 12,8 cm 2 sini teşkil eder. Bu da esas alanın 64 cm 2 nin 1/5 idir. Öyleyse çapraz karelerde sayılan koloni adeti 5 ile çarpıldığında petri kutusundaki ortalama koloni sayısı bulunmuş olur. 2- Çoklu Tüp Sayım Metodu: Çoklu tüp sayımı (veya En Muhtemel Sayı), verilen bir sıvı örnekteki canlı organizmaların sayısı hakkında bir fikir edinmemizi sağlar. Örnek katı ise süspansiyon hazırlandıktan sonra 10 katlı seyreltileri hazırlanır. Şekil 5. Çoklu Tüp Sayım Uygulaması 17

22 Her seyreltmeden tüplerdeki uygun besiyerine 1 er ml ekim yapılır. İnkülasyondan sonra en yüksek seyreltme (=örneğin en düşük konsantrasyonu) kaydedilir. 1/100 lük seyreltmede gelişme olduğunu ancak 1/1000 seyreltmede büyüme olmadığını gözlediğimizi farz edelim. Buna göre orijinal numunenin her ml sinde arası canlı hücre bulunmaktadır. Bu yaklaşık değerde hata oranını düşürmek için her bir seyreltmede birçok tüp inoküle edilir. Böylece orijinal numunedeki canlı organizmaların yaklaşık sayıları en muhtemel sayı tablolarından bulunduktan sonra %95 güvenirlik hesabı yapılır. Bu metot özellikle çok az sayıda mikroorganizma ihtiva eden maddelerin incelenmesinde başarılı olarak kullanılmaktadır. Ayrıca seçici ve teşhis edici ortamlar kullanılarak mikroorganizmaların özel grupları belirlenebilmektedir. Tablo 1. En Muhtemel Sayı Tablosu 18

23 DENEY NO 4 Saf Kültür Elde Edilmesi Seyreltme Metodu Sıvı + Katı Besiyeri Amaç: Tek koloninin gelişmesiyle oluşmuş saf kültürün elde edilmesi ve seyreltme yöntemini uygulamayı öğrenmek. TEORİK BİLGİ Mikrobiyoloji de saf kültür, tek tür bir mikroorganizmadan oluşan kültüre verilen isimdir. Saf kültürler genellikle farklı tür mikroorganizmalar içeren bir besiyerinden tek tür bir mikroorganizma kolonisinin alınarak steril başka bir besiyerine aktarılması sonucunda elde edilir. Saf kültürü elde etmek için kullanılan birçok yöntem vardır. Bunlar çizgi plaka yöntemi, dökme plaka yöntemi, yayma plaka yöntemi ve seri seyreltme yöntemi olarak dört ana başlık altında incelenir. Yöntemlerin temeli seyreltme işlemine dayanmaktadır. Saf kültür elde edilebilmesi için canlı organizmalar içeren sıvı örnek seyreltilerek veya koloni halinde ortaya çıkmış bir organizma türü seçilerek işlem yapılabilmektedir. Çizgi plaka yöntemi saf bakteri kültürlerini izole etmek için yaygın olarak kullanılır. Az miktarda karışık kültür, aşılama iğnesinin ucuna yerleştirilir ve agar ortamının yüzeyinde çizilir. Ardışık çizgiler inokülümu yeterince inceltir ve mikro organizmalar birbirlerinden ayrılır. Şekil 6 de farklı tür ardışık çizgiler verilmektedir. Yeniden inokülasyon olmaksızın aynı iğne ile ikinci bir plakayı çizmek genellikle tavsiye edilir. Bu plakalar, kolonilerin büyümesine izin vermek için inkübe edilir. Bu yöntemin temel prensibi, çizgiler vasıtasıyla bakteri hücrelerini agar yüzeyinde biriktirerek petri plakasının yüzeyi boyunca bir seyreltme gradyanı oluşturulmasıdır. Bu seyreltme gradyanı nedeniyle, az sayıda bakteri hücresinin bulunduğu ortamda birleşik büyüme gerçekleşmez. Genellikle, her koloni tek bir mikrobiyal hücrenin soyudur, böylece saf kültürden bir klonu temsil eder. Bu izole edilmiş koloniler steril inokülasyon iğnesi kullanılarak ayrı ayrı toplanır ve saflığı sağlamak için taze ortam üzerine yeniden çizilir. Şekil 6. Ardışık Çizgi Şekilleri Dökme plaka metodu (Şekil 7), eritilmiş agar ortamı ile karıştırılmış seyreltik numunelerin katmanlaştırılmasını içerir. Ana prensip, inokülümu sıvılaştırılmış agar içeren ardışık tüplerde seyreltmek suretiyle bakteri hücrelerinin ortam içinde eksiksiz bir şekilde dağılmasına izin vermektir. Burada, bakteri karışık kültürü sıvı halde C (agar 42 C altında katılaşır) sıcaklıkta muhafaza edilmiş eritilmiş agar içeren tüpler doğrudan seyreltilir. Bakteriler ve eritilmiş ortam iyice karıştırılır. Her tüpün içeriği ayrı petri plakalarına dökülür, katılaşmasına izin verilir ve sonra inkübe edilir. Bakteri kolonileri geliştiğinde, izole edilmiş kolonilerin hem 19

24 agar ortamı (yer altı kolonileri) hem de ortam üzerinde (yüzey kolonileri) geliştiği görülür. Bu izole edilmiş koloniler daha sonra aşılama halkası ile toplanır ve saflığı sağlamak için başka bir Petri plakasına çizilir. Şekil 7. Dökme Plaka Metodu Yayma plaka metodunda (Şekil 8), karışık kültür veya mikroorganizmalar eritilmiş agar ortamında seyreltilmemiştir (dökme plakası yönteminin aksine); steril sıvı, genellikle su veya fizyolojik tuz içeren bir dizi tüp içinde oldukça seyreltilir. Her tüpten bir damla seyreltilmiş sıvı bir agar plakasının merkezine yerleştirilir ve sterilize edilmiş eğik cam çubuk vasıtasıyla yüzeye eşit şekilde yayılır ve ortam inkübe edilir. Koloniler agar üstünde geliştiğinde, pazı petrilerde çok iyi izole edilmiş kolonilerin oluştuğu tespit edilir. Bu koloniler agar üzerine yayılan seyreltilmiş sıvı damlası içindeki bireysel mikroorganizmaların ayrılması sonucunda oluşur. Şekil 8. Yayma Plaka Metodu 20

25 Saf kültür eldesi sıklıkla katı ortam üzerinde başarılı bir şekilde uygulanmasına rağmen, sadece sıvı ortamda yetişen mikroorganizmaların saf kültürlerini elde etmek için seri seyreltme yöntemi kullanılmaktadır. Karışık bir kültürde baskın olan bir mikroorganizma, bir dizi seyreltme ile saf halde izole edilebilir. İnokülüm, steril bir sıvı besiyeri seri seyreltmeye tabi tutulur ve çok sayıda tüp steril sıvı besiyerinde her ardı sıra seyreltmenin alikotları ile aşılanır. Bu seyreltmenin amacı, bir dizi karışık kültür içeren süspansiyonla bir dizi tübün inoküle edilmesidir, böylece seyreltilerek yalnızca bir tek mikrop büyümesini gösteren bazı tüpler bulunur. Kolaylık sağlamak için, mikroorganizma içeren, yani 100 mikroorganizma / ml lik sıvı ortamı içeren 10 ml sıvı ortam içeren bir kültürümüz olduğunu varsayalım. Eğer bu ortamdan 1 ml çıkarırsak ve 9 ml taze steril sıvı ortam ile karıştırırsak, 10 ml veya 10 mikroorganizma / ml'de 100 mikroorganizmaya sahip oluruz. Bu süspansiyonun 1 ml' ini başka bir 9 ml 'ye eklersek. Taze steril sıvı ortamın her bir ml'sinde artık tek bir mikroorganizma bulunacaktır. Eğer bu tüp herhangi bir mikrobiyal büyüme gösteriyorsa, bu büyümenin ortamda tek bir mikroorganizmanın ortaya çıkmasından kaynaklandığı ve bu mikroorganizmanın saf kültürünü temsil ettiği var sayılır. KULLANILAN MALZEMELER VE CİHAZLAR - Petri Kutuları - Tüpler - Pipetler - Öze - Etüv - Otoklav DENEYİN YAPILIŞI 1- Çizgi Plaka Yöntemi Karışık kültürün bulunduğu numuneden, yakılarak sterilize edilmiş öze yardımıyla bir miktar alınarak petri kutusundaki katı besiyeri üzerine Şekil 9 da gösterildiği gibi ekim yapılır. Petri kutusu 35 o C de inkübasyona bırakılır saat sonra besiyeri üzerinde ayrı olarak gelişmiş kolonilerin oluştuğu gözlemlenir. Petrideki besiyerinde tek olarak gelişmiş olan bakteri kolonisi öze ile alınır ve steril ekim şartlarına uygun olarak tüpteki yatık besiyerinin yüzeyine sürülerek ekilir. Daha sonra da inkübe edilir. Bu şekilde tek koloninin gelişmesiyle oluşan saf kültür elde edilmiş olur. Daha da gerisine gidilecek olursa, bu kültürün bir bakteri hücresinden oluştuğu görülür. 21

26 Şekil 9. Çizgi Plaka Yöntemi Ekim 2- Seri Seyreltme Yöntemi İlk olarak 10 ml sinde yaklaşık 1000 mikroorganizma bulunan sıvı besiyeri alınır. Temiz bir pipet yardımıyla bu besiyerinden 1 ml alınarak içerisinde 9 ml steril sıvı besiyeri bulana başka bir tüpe aktarılır ve karıştırılır. Artık bu yeni besiyerinin 10 ml sinde 100 mikroorganizma olduğu varsayılır. Ardından bu yeni oluşturduğumuz besiyerinden 1ml daha alınır ve aynı işlem tekrarlanır. Bu seyreltmelere yeni besiyerinin 10 ml sinde 1 mikroorganizma olduğu varsayılana kadar devam edilir. Son seyreltmeden sonra besiyeri inkübe edilir ve saat sonra üreme gözlemlenir. Bu şekilde tek tür bir mikoorganizma içeren saf kültür elde edilmiş olur. Şekil 10 da seri seyreltme yöntemi verilmiştir. Şekil 10. Seri Seyreltme Yöntemi 22