ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Dicle DÖNMEZ GIDALARDA BOZULMA ETKENİ OLAN BAZI FUNGUSLARIN Debaryomyces hansenii ile BİYOKONTROLÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 21

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDALARDA BOZULMA ETKENİ OLAN BAZI FUNGUSLARIN Debaryomyces hansenii ile BİYOKONTROLÜ Dicle DÖNMEZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez.../.../. Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir..... Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Prof. Dr. Nuray GÜZELER Doç. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF29YL6 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 6 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDALARDA BOZULMA ETKENİ OLAN BAZI FUNGUSLARIN Debaryomyces hansenii ile BİYOKONTROLÜ Dicle DÖNMEZ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Yıl: 21, Sayfa: 77 Jüri : Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Prof. Dr. Nuray GÜZELER Doç. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ Yapılan bu çalışmada, üç farklı Debaryomyces hansenii suşunun (D. hansenii Dh1, D. hansenii Dh2 ve D. hansenii Dh3), gıdalarda bozulma yapan küf (Penicillium nalgiovense K2, Aspergillus parasiticus K7, Penicillium chrysogenum K, Penicillium chrysogenum K9, Aspergillus flavus K12, Geotrichum klebahnii K13) ve mayalar (Rhodotorula glutinis M1, Candida rugosa M16, Rhodotorula mucilaginosa 2 M71, Issatchenkia orientalis M73) üzerine antifungal etkileri, farklı gelişme ortamlarında (sıcaklık, ph, tuz) agar difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. Sonuç olarak, her üç Debaryomyces hansenii suşunun, araştırmada kullanılan küfler üzerine antifungal etkisi belirlenirken, mayalar üzerine antifungal etkisi bulunamamıştır. D. hansenii suşlarına karşı en duyarlı küf, Penicillium nalgiovense K2, en dirençli küf ise, Aspergillus flavus K12 olarak belirlenmiştir. Kullanılan D. hansenii suşlarından en güçlü antifungal etkiyi D. hansenii Dh2, en zayıf antifungal etkiyi ise D. hansenii Dh3 göstermiştir. D. hansenii suşlarının antifungal etkinliği üzerine ph nın etkisinin önemsiz olduğu, sıcaklık ve NaCl konsantrasyonunun ise önemli olduğu belirlenmiştir. D. hansenii suşlarının küfler üzerine antifungal etkisi, sıcaklık ve NaCl konsantrasyonu arttıkça artış göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Biyokontrol, Debaryomyces hansenii, antifungal etki, küf I

4 ABSTRACT M.Sc. THESIS SOME OF FOOD SPOILAGE FUNGI BIOCONTROL WITH Debaryomyces hansenii Dicle DÖNMEZ CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY Supervisor : Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Year : 21, Page: 77 Jury : Prof.Dr. Zerrin ERGİNKAYA Prof.Dr. Nuray GÜZELER Assoc. Prof. Dr. Hatice K. GÜVENMEZ In this study, antifungal effects on the moulds (Penicillium nalgiovense K2, Aspergillus parasiticus K7, Penicillium chrysogenum K, Penicillium chrysogenum K9, Aspergillus flavus K12, Geotrichum klebahnii K13) and yeasts (Rhodotorula glutinis M1, Candida rugosa M16, Rhodotorula mucilaginosa 2 M71, Issatchenkia orientalis M73) which some spoilage the foods, of three different strain of D. hansenii (D. hansenii Dh1, D. hansenii Dh2 ve D. hansenii Dh3), was investigated in different growth conditions (temperature, ph, NaCl) with agar difüzion method. Consequently, the all of D. hansenii strains which were used in this study, showed antifungal effects on the moulds, however no antifungal effects were determined on the yeasts. The most sensetive mould to D. hansenii was determined P. nalgiovense K2 and the most resistant mould to D. hansenii was detected as A. flavus K12. From the D. hansenii strains, the most strongest antifungal effect was obtained from the D. hansenii Dh2, the weakest antifungal effect was obtained from the D. hansenii Dh3. ph was determined as unimportant on the antifungal efficieny of D. hansenii strains, however temperature and NaCl were important on the antifungal efficieny of D. hansenii strains. It was observed that antifungal effect of D. hansenii strains was increased in case of increasing temperature and NaCl conditions. Key Words: Biocontrol, Debaryomyces hansenii, antifungal effect, mould II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tezimin başlangıcından bitimine kadar her aşamada değerli görüşlerini aldığım, her konuda bana destek olan, yapıcı ve yönlendirici fikirleri ile bana yol gösteren danışman hocam sayın Prof.Dr. Zerrin ERGİNKAYA ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tezimin geliştirilmesinde, tüm samimiyetiyle değerli bilgi ve görüşlerini paylaşan, bilgi birikiminin paylaşarak artacağınnın, güzel bir örneğini sunan, jüri üyelerim sayın Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ e ve Prof.Dr. Nuray GÜZELER e tüm içtenliğimle teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam sırasında sık sık bilgi alışverişinde bulunduğum, her konuda dertleştiğim, yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, güler yüzüyle bana sürekli pozitif enerji veren, arkadaşım Ar.Gör. Emel Ünal a, tezimin istatistik analizlerinde bana yardımcı olan, sonuçların değerlendirilmesinde sık sık görüşlerini aldığım, yorucu çalışma temposuna rağmen sorularımı cevapsız bırakmayan, arkadaşım Öğr.Gör. Selin Kalkan a, mikrobiyoloji laboratuvarı çalışma arkadaşlarım, yüksek lisans öğrencileri Hatice ULUDAĞ a, Alin BAYRAM a ve Tuba KAYA ya teşekkürü borç bilirim. Yüksek lisans öğrenimim boyunca her zaman yanımda olan, gerektiğinde kendi işlerinden fedakarlık edip yardımıma koşan, hayatımdaki anlamını ve önemini kelimelere sığdıramayacağım çok değerli dostum, uzman Biyolog Kübra GÜN e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans sürem boyunca her zaman yanımda olan, her konuda bana destek olan, beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan, değerli dostlarım Ar.Gör. Özhan ŞİMŞEK e, doktora öğrencileri Tolga İZGÜ ye ve Ali COŞKUN a, Ar.Gör. Nurşen YILDIRIM a, yüksek lisans öğrencileri Melda BONCUK a ve Fatma ASLAN a teşekkürlerimi sunarım. Bugünlere gelmemde sonsuz destekleri olan, hayatım boyunca aldığım her kararda pozitif eleştiri ve yorumlarıyla yanımda olduklarını bildiğim, bana duydukları güveni her zaman hissettiğim, annem Süheyla DÖNMEZ e, babam Mithat DÖNMEZ e, abim Ulaş DÖNMEZ e, ablam Sinem ERSUZ a, eniştem Hasan ERSUZ a çok sevdiğim yeğenlerin Elif ERSUZ a ve Ekin ERSUZ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ...X 1. GİRİŞ Genel Bilgiler Debaryomyces hansenii Penicillium spp Aspergillus spp Geotrichium spp Rhodotorula spp Candida spp Issatchenkia spp ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Debaryomyces hansenii ve Diğer Bazı Mayaların Biyokontrol Özellikleri Üzerine Yapılan Bazı Çalışmalar MATERYAL VE METOT Materyal Mikroorganizmalar Besiyerleri Çözeltiler ve Kimyasallar Alet ve Ekipmanlar Metot Debaryomyces hansenii nin Gelişim Kinetiğinin Belirlenmesi Optik Yoğunluk ile Canlı Hücre Sayısı Arasındaki İlişkinin Belirlenmesi..21 IV

7 Farklı Ortam Koşullarının Antifungal Etkiye Duyarlı Küflerin Gelişimi Üzerie Etkisi Küf Kültürlerinin Hazırlanması Küf Sporunun Elde Edilmesi D. hansenii ve Diğer Mayaların Hazırlanması Farklı Gelişim Ortamlarında Antifungal Etkinin Belirlenmesi Agar Kuyu Difüzyon Yöntemi İstatistiksel Analiz 26. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Farklı Ortam Koşullarının Antifungal Etkiye Duyarlı Küflerin Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarının Penicillium chrysogenum K9 un Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarının Penicillium chrysogenum K in Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarının Penicillium nalgiovense K2 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarının Aspergillus parasiticus K7 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarının Aspergillus flavus K12 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı Ortam Koşullarında Debaryomyces hansenii nin Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin P. chrysogenum K9 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin P. chrysogenum K Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin P. nalgiovense K2 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin A. parasiticus K7 Üzerine Antifungal Etkisi...9 V

8 .2.. Debaryomyces hansenii nin A. flavus K12 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin Geotrichum klebahnii K13 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin Rhodotorula glutinis M1 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin Candida rugosa M16 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin Rhodotorula mucilaginosa 2 M71 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin Issatchenkia orientalis M73 Üzerine Antifungal Etkisi.6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER..63 KAYNAKLAR... 6 ÖZGEÇMİŞ VI

9 VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Küf ve Maya Kültürleri 19 Çizelge 3.2. Deneme Planı.2 Çizelge 3.3. Zon Çaplarının Değerlendirilme Aralıkları...2 Çizelge.1. Farklı Ortam Koşullarının P. chrysogenum K9 un Gelişimi Üzerine Etkisi..2 Çizelge.2. Farklı Ortam Koşullarının P. chrysogenum K in Gelişimi Üzerine Etkisi..29 Çizelge.3. Farklı Ortam Koşullarının P. nalgiovense K2 nin Gelişimi Üzerine Etkisi..31 Çizelge.. Farklı Ortam Koşullarının A. parasiticus K7 nin Gelişimi Üzerine Etkisi..33 Çizelge.. Farklı Ortam Koşullarının A. flavus K12 nin Gelişimi Üzerine Etkisi..3 Çizelge.6. D.hansenii Suşlarının Farklı Ortam Koşullarında P. chrysogenum K9 Üzerine Antifungal Etkisi.36 Çizelge.7. D.hansenii Suşlarının Farklı Ortam Koşullarında P. chrysogenum K Üzerine Antifungal Etkisi.1 Çizelge.. D.hansenii Suşlarının Farklı Ortam Koşullarında P. nalgiovense K2 Üzerine Antifungal Etkisi.. Çizelge.9. D.hansenii Suşlarının Farklı Ortam Koşullarında A. parasiticus K7 Üzerine Antifungal Etkisi...9 Çizelge.1. D.hansenii Suşlarının Farklı Ortam Koşullarında A. flavus K12 Üzerine Antifungal Etkisi...3 VIII

11 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Debaryomyces hansenii Dh1 e ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D. 7 nm)..22 Şekil 3.2. Debaryomyces hansenii Dh2 ye ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D. 7 nm)..22 Şekil 3.3. Debaryomyces hansenii Dh3 e ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D. 7 nm)..23 Şekil.1. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K9 un gelişimi üzerine etkisi...2 Şekil.2. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K in gelişimi üzerine etkisi...3 Şekil.3. Farklı ortam koşullarının P. nalgiovense K2 nin gelişimi üzerine etkisi...31 Şekil.. Farklı ortam koşullarının A. parasiticus K7 nin gelişimi üzerine etkisi...33 Şekil.. Farklı ortam koşullarının A. flavus K12 nin gelişimi üzerine etkisi...3 Şekil.6. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi...3 Şekil.7. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi...3 Şekil.. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi...39 Şekil.9. ph., % NaCl, 2 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi... Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi...2 Şekil.11. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi 3 X

13 Şekil.12. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi...3 Şekil.13. ph., % NaCl, 2 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi... Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi Şekil.1. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi..7 Şekil.16. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi...7 Şekil.17. ph., % NaCl, 2 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi... Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi... Şekil.19. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi..1 Şekil.2. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi...1 Şekil.21. ph., % NaCl, 2 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi...2 Şekil.22. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi... Şekil.23. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi Şekil.2. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi... Şekil.2. ph., % NaCl, 2 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi...6 Şekil.26. ph., % NaCl, 1 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in Geotrichum klebahnii K13 üzerine antifungal etkisi 7 XI

14 Şekil.27. ph., % NaCl, 1 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in Rhodotorula glutinis M1 üzerine antifungal etkisi... Şekil.2. ph., % NaCl, 1 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in Candida rugosa16 üzerine antifungal etkisi 9 Şekil.29 ph., % NaCl, 1 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in Rhodotorula mucilaginosa 2 M71üzerine antifungal etkisi.. 6 Şekil.3. ph., % NaCl, 1 o C koşullarında D. hansenii Dh1 in Issatchenkia orientalis M73 üzerine antifungal etkisi..61 XII

15 XIII

16 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ 1. GİRİŞ Günümüzde gıdaların korunmasında, çeşitli kimyasallar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koruyucular, gıdaların bozulma sürecini yavaşlatarak, gıdaların daha uzun süre saklanmasını sağlamaktadırlar. Örneğin, benzoik asit; fırın mamulleri, dondurulmuş mandıra ürünleri, peynir, sakız, çeşni gibi gıdalarda, sodyum benzoat; süt ve et ürünleri, çeşni, fırın mamulleri ve şekerlemelerde, sülfür dioksit; kurutulmuş meyveler, meyve suyu, sirke ve patates ürünlerinde, nitrat ve nitrit; et ve et ürünlerinde, koruyucu olarak kullanılmaktadır (Ova, 21). Antimikrobiyal etkili gıda katkı maddelerinin insan sağlığı açısından risk oluşturabileceği uzun yıllardan beri tartışılmaktadır. Ancak, bu maddeler gıdaların raf ömrünü uzattığından, özellikle de hazır gıdalarda, gıda kaynaklı patojen mikroorganizmaların inhibisyonu amacıyla kullanılmaktadır. Buna karşın, son yıllardaki doğal ve katkısız ürünlere karşı tüketici eğilimindeki artış, resmi otorite ve üreticileri, birçok üründe gıda güvenliğini sağlamak ve raf ömrünü uzatmak amacıyla, farklı yöntem arayışına yönlendirmiştir (Marino ve ark, 21; Holley ve ark, 2). Gıdaların biyolojik dayandırmalarında, mikroorganizmalar arası antagonistik ilişkilerden oldukça sık yararlanılmaktadır. Son yıllarda, antimikrobiyal özelliğe sahip mikroorganizmalar ve metabolitlerinin, çeşitli gıdalarda kullanılmasına bağlı olarak, ürünün stabilitesi ve raf ömrünü uzatma çalışmaları ayrı bir önem kazanmıştır (Norman, 19). Birçok gıdada, mikroorganizmaların gelişmesini ve baskın hale geçmesini belli ölçülerde de olsa engelleyebilen, antimikrobiyal aktiviteye sahip, bazı doğal maddeler (inhibitörler) bulunmaktadır. Bazı mikroorganizmalar, ürettikleri metobilitlerlerle, ya dolaylı olarak (ortam ph sını, yüzey gerilimi ve ozmotik basıncı değiştirerek), ya da doğrudan (bazı toksik maddeler veya antimikrobiyal maddeler; bakteriyosin, antibiyotik vs. üreterek) ortamda bulunan diğer mikroorganizmaların gelişimini durdurabilir veya onları öldürebilirler. Örneğin; mikroorganizmalar tarafından üretilen bazı organik asitler, ortam ph sını düşürerek, aside duyarlı mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal etki gösterirler (Ünlütürk, 1999). 1

17 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ İşlenmiş ürünlerin yanı sıra, tarım sektöründe de hasat öncesi ve sonrası ürünlerin raf ömrünü uzatmak için kimyasallar kullanılmaktadır. Örneğin; halen limonda patojenlerin neden olduğu kayıpları önlemek amacıyla, hasat öncesi ve sonrasında market kayıplarına yol açan, Penicillium spp. nin neden olduğu yeşil ve mavi küf enfeksiyonu (Droby ve ark, 199), Colletotrichum gloeosporioides in neden olduğu hastalık (Whiteside ve ark, 19; Davies ve Albrigo, 199) ve Geotrichum candidum un neden olduğu küf çürümesini önlemek amacıyla bazı kimyasal işlemler uygulanmaktadır (Howard, 1936; Whiteside ve ark, 19; Chalutz ve Wilson, 199). Hasat öncesinde ve sonrasında meyvelere uygulanan kimyasal maddeler, meyvelerdeki kalıntı nedeniyle, meyvelerin tüketimi sonucu insan sağlığı açısından risk taşımaktadır (Norman, 19). Örneğin; yapılan bir çalışmada, hasattan sonra soğanlarda Aspergillus niger in neden olduğu çürümelere karşı, fungisit ve gamma ışınlarının birlikte uygulanması, meydana gelen çürümeleri %79 oranında azaltmış, ancak soğanın dış kabukları üzerinde yüksek konsantrasyonlarda fungisit kalıntılarının birikmesine neden olduğu rapor edilmiştir (Sinha ve ark, 199). Ayrıca, hasat sonrası depolama süresince meydana gelen çürümeleri önlemek için kullanılan, fungisitlere dirençli suşların ortaya çıkması ile fungisitlerin etkinliği azalabilmektedir (Biondi, 1979; Janisiewicz, 197; Wilson ve Wisniewski, 199; Benli, 23). Hasat sonrası hastalıkların kontrolünde, kimyasal fungusitlere oranla daha ekonomik ve güvenli olmaları bakımından alternatif olan mikrobiyal antagonistler, hasat öncesi ve sonrasında uygulanabilmektedir. Ancak, hasat sonrası uygulamalarda, daha çok etkili olmaktadırlar (Wilson ve ark, 1991). Hasat sonrası hastalıkların kontrolünde, mikrobiyal antagonistlerin kullanımıyla ilgili iki temel yaklaşım vardır. Birincisi, üründe doğal olarak var olması, ikincisi ise, antimikrobiyal olarak ürünlere inoküle edilmesidir (Sharma ve ark, 29). Mikrobiyal antagonistlerde aranan en önemli özellikler ise, bulundukları ortamlarda, patojenlerden daha hızlı ve daha kısa sürede kolonize olmaları ve değişen çevre koşullarına daha çabuk uyum sağlamalarıdır (Droby ve ark, 1992). Mikrobiyal antagonistler, yüksek konsatrasyonlarda kullanıldığında patojenlere karşı daha çok etkili olmaktadırlar (Sharma ve ark, 29). Mikrobiyal antagonistlerin diğer önemli bir özelliği ise, glukonaz, kitinaz ve proteinaz gibi litik enzimlerle, patojenlerin hücre 2

18 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ duvarlarını parçalamalarıdır (Lorito ve ark, 1993; Castoria ve ark, 1997, Jijakli ve Lepoivre, 199; Kapat ve ark, 199; Mortuza ve Ilag, 1999; Castoria ve ark, 21; Chernin ve Chet, 22; Sharma ve ark, 29) yılları arasında, bazı meyve patojenleri üzerine, antagonistik etki gösteren mayaların olduğu rapor edilmiş ve bu antagonist etkiyi de turunçgillerde Debaromyces hansenii nin, elma ve benzeri meyvelerde ise Cryptococcus a ait bazı türlerin gerçekleştirdiği bildirilmiştir. Debaryomyces hansenii, meyvelerde mavi ve yeşil küf çürümelerine karşı etkili olmaktadır (Chalutz ve Wilson, 199). Biyolojik kontrol, meyvelerde hasat sonrası hastalıklarda kimyasal kontrole alternatif olabilmektedir. Mayaların, özellikle hasat sonrası uygun şekilde kullanıldığı taktirde, fungal patojenlerin etki alanını yüksek derecede azalttığı rapor edilmiştir (Dal Bello ve ark, 2). Hasat sonrası kontrolde, mikrobiyolojik ajanların kullanımı, çevre için güvenli ve daha ucuz oluşları açısından önem kazanmaktadır (Kubo ve Nakanishi, 1979; Dixit ve ark., 199; Wilson ve ark, 1997; Conway ve ark, 1999; El- Ghaouth ve ark, 2; Korsten ve ark, 2; Janisiewicz ve Korsten, 2). D. hansenii nin antagonistik aktivitesiyle ilgili bilgilerin yetersiz olmasına karşın, yapılan çalışmalarda D. hansenii' nin Clostridium tyrobutyricum ve Clostridium butyricum gibi peynirlerde istenmeyen mikroorganizmaların spor oluşumunu inhibe ettiği ve bu ürünlerde diğer patojenlere karşı antimikrobiyal maddeler ürettiği bulunmuştur (Fatichenti, ve ark, 193; Deiana ve ark, 19). Ayrıca, meyvelerdeki küflere, özellikle de Penicillium a karşı inhibitör etkisinin olduğu rapor edilmiştir (Droby ve ark, 199; Wilson ve Wisniewski, 199; Fleet, 23; Liu ve Tsao, 2). D. hansenii, Trichosporon cutaneum ve Candida zeylanoides tarafından üretilen öldürücü (killer) toksinlere karşı dirençlidir. Debaryomyces in toksin üretme özelliği ve diğer mayalar tarafından üretilen toksinlere karşı dirençli olması, özellikle medikal uygulamaları için önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu toksin aktivitesi, sadece ortamda NaCl veya KCl gibi tuzların bulunması durumunda gözlenmiştir (Breuer ve Harms, 26). D. hansenii nin, ya sentezledikleri toksinler ile hücre döngüsünün G1 fazına etki ederek, ya da aynı ortamda bulunan patojenlere karşı besinler için yer ve rekabet 3

19 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ ortamı yaratarak, antimikrobiyal etki gösterdiği düşünülmektedir (Chalutz ve ark, 199; Golubev, 199). Hemen hemen tüm gıda ürünlerinde gelişebilme yetenekleri olan maya ve küfler, lipaz ve proteaz gibi çeşitli enzim aktiviteleri yoluyla gıdaların bozulmasına neden olmaktadırlar. Gıda güvenliği açısından küflerin en önemli özelliği toksijenik ikincil metabolitler olan mikotoksin üretme yetenekleridir (Holley ve Patel, 2). Örneğin; Aspergillus lar; meyve, sebze, ekmek gibi birçok üründe hem gıda güvenliği hem de kalite kriteri açısından sorun yaratan küfler arasındadır. Ayrıca bu cinsin bazı türleri aflatoksin üretmektedir. Geotrichum lar; turunçgil, şeftali gibi meyvelerde çürümeye ve süt kremasında ekşimeye neden olan mayalar arasındadır. Penicillium lar ise; meyvelerde yumuşak çürümeye neden olmakta ve bazı türleri mikotoksin üretmektedir. Rhodotorula cinsine ait bazı mayalar ise; tereyağı, balık ve sığır kıymasında bozulma yapmaktadırlar. Candida cinsi mayalar; tereyağ ve margarinlerin yanı sıra, şarap ve bira gibi içeceklerde bozulmalara neden olmaktadır (Ayhan, 2). Maya ve küfler genellikle psikrotrofik ve mezofilik mikroorganizmalardır. Bu özellikleri nedeniyle buzdolabında muhafaza edilen gıdalarda gelişerek bozulmalara neden olabilmektedirler (Temiz, 1999). Antagonistik özelliğinden yararlanılan mikroorganizmalar, genelde bulundukları ortamlarda rekabet ortamında olmaları nedeni ile, ancak, düşük besin konsantrasyonu, geniş sıcaklık ve ph aralığı gibi çevre koşullarına adapte olma özelliklerine sahip olduğu taktirde başarılı olabilmektedir (Janisiewicz ve ark, 2; Nunes ve ark, 21). Antagonist özelliğinden yararlanılan mikroorganizmaların başında mayalar gelmektedir. Mayalar, meyve ve diğer gıdalarda biyokontrol ajanı olarak kullanılmalarına olanak sağlayan bazı özelliklere sahiptirler. Bunlar; 1- Basit besin ortamlarına gereksinim duymaları, 2- Ucuz besin ortamlarında fermantasyon yapabilmeleri, 3- Geniş çevre koşullarında hayatta kalabilme yetenekleri ve - Antrotoksijenik bileşikler üretmemeleridir (Wilson ve Wisniewski, 199; Bleve ve ark, 26). Ortamın ph sı, bazı mikroorganizmalarda morfolojik değişikliklere neden olabilmektedir. Örneğin; Penicillium chrysogenum un ph 6. nın üzerinde sürekli

20 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ kültür sisteminde daha kısa hifler oluşturduğu belirlenmiştir. Diğer taraftan, ortam ph sı, ortamdaki bazı iyonların çözünürlüğünü dolayısıyla mikroorganizmların bu iyonlardan yararlanmasını etkileyebilmektedir. Ortam ph sı, yalnızca gelişmeyi değil, aynı zamanda mikroorganizmaların canlılıklarını sürdürme özelliklerini de etkilemektedir. Mikroorganizmaların canlılıklarını sürdürebildikleri ph değerleri, özellikle gıdaların depolanması, kurutulması ve ısıl işlem uygulamalarında daha önemli olmaktadır (Temiz, 1999). Yapılan bazı çalışmalar, mikroorganizmaların gelişmesinde ph, tuz konsantrasyonu ve sıcaklığın sinerjik etkilerinin olduğunu göstermiştir. Örneğin.2 M NaCl varlığının, ortamda NaCl bulunmamasına veya.2 M sodyum sitrat varlığına kıyasla, Alcaligenes faecalis in, daha geniş bir ph aralığında gelişebilmesine neden olduğu belirlenmiştir. Aynı şekilde gelişme sıcaklığı da, mikroorganizmaların gelişme ph sını etkileyebilmektedir. Bu etkileşimlere bağlı olarak da, mikroorganizmaların antagonistik özelliklerinde de farklılık gözlenmektedir (Temiz, 1999). Bu araştırmada, Debaryomyces hansenii nin in-vitro olarak, farklı NaCl konsantrasyonlarında, ph ve sıcaklıklarda, gıdalarda bozulma etkeni olan bazı maya ve küfler üzerine antifungal etkisi araştırılarak, elde edilen bulguların, gıdalarda kullanım olanaklarının belirlenmesi amaçlanmıştır Genel Bilgiler Bu bölümde, araştırmada kullanılan fungusların genel özelliklerinin yanı sıra, gıdalardaki önemi ile ilgili genel bilgilere yer verilmiştir Debaryomyces hansenii Debaryomyces ler, multilateral tomurcuklanma yapan ve askospor oluşturan mayalardır. Askosporlar, küresel, ovoidal veya mercek biçimindedir. Genellikle, her askusta bir veya iki spor bulunmaktadır, ama bazı türlerde bu sayı dörde çıkmaktadır (Kurtzman ve Fell, 199; Çorbacı, 2). Bazı türleri, yalancı misel oluşturma

21 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ özelliğine sahiptir. Debaryomyces hansenii, süt ve süt ürünlerinde en yaygın bulunan maya cinslerinden biri olup, önceleri D. subglobosus ve Torulaspora hansenii olarak bilinmekteydi. D. hansenii, %2 NaCl de ve.6 gibi düşük su aktivitesinde gelişebilme özelliğine sahip olması nedeniyle, tuzlu ürünlerde yaygın olarak bulunur (Praphailong ve Fleet, 1997). Ayrıca ph gibi geniş bir ph aralığında gelişebilme yeteneğinde olup, genellikle de patojen değildirler (Ayhan, 2). D. hansenii ye, peynir, et, şarap, bira, meyve, toprak, yüksek şeker ve deniz suyu gibi düşük su aktivisine sahip gıdalarda ve ortamlarda rastlanmaktadır. D. hansenii nin doğada yaygın bulunmasının nedenlerinin başında; tuz toleransı, proteolitik ve lipolitik enzim kapasitesi, süt, yağ ve proteinlerini metabolize etmesi, düşük sıcaklık ve su aktivitesinde gelişebilmesi gelmektedir (Wyder ve Puhan, 1999). Debaryomyces ler ozmotoleranstırlar ve bu özelliklerinden dolayı, tarım ve gıda sektöründe üretim maliyetini azaltmak ve kullanılan ortamlara yarı steril özellik kazandırmak amacı ile biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmaktadır (Onishi, 1963). D. hansenii, çeşitli toksinleri tolere etme veya üretme yeteneğine sahiptir. Toksin sentezi biyoteknolojik araştırmalar için ilgi çekici bir konu olup, ilk olarak 1993'te Gunge ve çalışma arkadaşları, D. hansenii nin toksin üreten maya türü olduğunu rapor etmişlerdir. Bu toksin aktivitesi, sadece ortamda NaCl veya KCl gibi tuzlar hazır bulunduğunda gözlenmiştir (Breuer ve Harms, 26). D. hansenii nin, 37 C de, diğer bazı maya türlerine karşı öldürücü toksin aktivitesi, yapılan bazı çalışmalarla belirlenmiştir. Bu özelliği nedeniyle, maya öldürücü toksinleri, medikal uygulamalarda insan vücut sıcaklığında aktivite göstermektedir ve patojen mayalara karşı terapotik ajan olarak kullanılmaktadır (Buzzini ve Martini, 21). D. hansenii nin nitratı kullanamayıp, nitriti kullanabildiği bilinmektedir (Nakase ve ark, 199). D. hansenii nin optimum 2-2 C de geliştiği, -1 C lerde ve hatta C de bile canlı kaldığı rapor edilmiştir. Van Den Tempel ve Jacobsen (2), yaptıkları çalışmada, sıcaklık ve su aktivitesinin D. hansenii nin gelişimi üzerine etkisini incelemişler ve 1 C de,.99 gibi yüksek su aktivitesinde, ph.-6. da gelişebildiğini bulmuşlardır. 6

22 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ Konu ile ilgili yapılan bazı çalışmalarda ise, D. hansenii nin laktat, sitrat, laktoz ve galaktozu kullanabildiklerinden dolayı, üründe aroma oluşumuna olumlu katkıda bulunduğu ve peynir ürünlerinde starter kültür olarak kullanılmasının uygun olacağı rapor edilmiştir (Welthagen ve ark, 199; Laubscher ve ark, 1999). D. hansenii, bütün peynir çeşitlerinde bulunan genel bir türdür. Tuza tolerans göstermesinin yanı sıra, süt proteinleri ve yağı metabolize etme özellikleri vardır. Proteolitik ve lipolitik enzimleri üretebilmekte, düşük su aktivitesi ve düşük sıcaklıklarda gelişebilmektedirler (Breuer ve Harms, 26). Ayrıca, peynir salamurasında, hücre içi ve hücre dışı antimikrobiyal metabolitler üreterek, Clostridium butyricum ve Clostridium tyrobutyricium gibi istenmeyen mikroorganizma büyümelerinin inhibisyonunu sağlamaktadır (Fatichenti ve ark, 193). İlave olarak, D. hansenii nin metabolik aktivitesinin peynirdeki mikro çevreyi modifiye ettiği ve bu sayede peynir için yararlı olabilecek bazı mikroorganizmaların peynirde gelişme kaydedebildiği ve ayrıca istenmeyen karbohidrat fermentasyonlarına karşı peyniri koruduğu da bulunmuştur (Van Den Tempel ve Jakobsen, 2). D. hansenii, özellikle Brick, Limburger, Port Salut, Taleggio, Tilsitter, Trappist ve Danish Danbo peynir çeşitleri gibi, yüzey olgunlaşmış peynirlerin üretiminde önemli bir mayadır. Peynirlerin yüzey tabakası, mayalar ve bakterileri kapsayan bir mikrobiyal popülasyondan meydana gelmektedir. Bu tip peynirlerde maya, laktatın degredasyonunu sağlayarak, olgunlaşmayı başlatmaktadır ve bu şekilde peynir yüzeyinde ph artışı gözlenmekte ve peynir aromasına katkı sağlayan bakteriyel popülasyonların büyümesi sağlanmış olmaktadır (Leclercq-Perlat ve ark, 1999; Petersen ve ark, 21). Dura ve ark. (2), Debaryomyces in amonyak ve birkaç uçucu bileşikleri üretebileceğini, kurutulmuş tuzlu sucukların serbest amino asit içeriğini ve starter kültür olarak ürünlerin lezzet profillerini değiştirebileceğini göstermişlerdir. Ayrıca, Flores ve ark. (2), Debaryomyces türlerinin kuru fermente sucukların olgunlaşması sırasında, lipid oksidasyon ürün üretimini inhibe ederek, uçucu bileşiklerin üretimi üzerinde etkili olduğunu ve etil ester üretimine destek sağladığını göstermişlerdir. Bu iki olgu ise, tipik sucuk aromasının gelişimini sağlamaktadır. 7

23 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ Penicillium spp. Gıdalarda çok yaygın bulunan funguslardan biri olan Penicillium ların, oluşturdukları miseller septalıdır. Konidioforları, bazen tek, bazen de dallanmış haldedir. Uç taraflarında fırça görünümünde konidi taşıyıcıları yer alır. Konidileri yuvarlak olup, maviden mavi-yeşile kadar değişen tonlarda koloni oluştururlar (Ayhan, 2). Sıcak iklimlerde, tahılların depolanmasında en önemli bozulma etkeni fungus Penicillium dur. Penicillium un tahıllarda bozulma yapması ise, sıcaklık ve su aktivitesine bağlı olarak değişmektedir (Magan ve Lacey, 19; Boysen ve ark, 2). Penicillium lar, unlu gıdalar ve meyveler üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Aspergillus lar gibi, yüksek miktarda yağ ve protein içeren et ve et ürünleri, süt ve süt ürünleri, fındık, tahıl gibi pek çok gıdada gelişerek bozulmalara neden olurlar (Frisvad ve ark, 1992; Kure ve ark, 2). Endüstriyel küflerden, üzerinde en çok çalışılan Penicillium türleridir. Bu cinse ait birçok tür, gıdaların bozulmasında önemli rol oynarken, bazı türleri peynir ve antibiyotik gibi çeşitli ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır. Ayrıca bazı Penicillium türleri de mikotoksin üretmesi nedeniyle, gıda güvenliği açısından önem taşımaktadır (Ünlütürk ve ark, 1999) Aspergillus spp. Pek çok gıda üzerinde sarı, yeşil, turuncu veya siyah koloniler oluşturan Aspergillus lar, tek hücreli yuvarlak konidilere sahip olup, miselleri septalıdır. Erik, incir gibi meyvelerin yanı sıra, turunçgillerde siyah çürümelerin etmenidirler. Bu cinsin A. flavus ve A. parasiticus başta olmak üzere, bazı türleri aflatoksin üretirken, bazılarından, endüstriyel proteaz enzimi veya sitrik asit üretiminde yararlanılmaktadır (Ayhan, 2). Aspergillus cinsi küflere, hububat ve ürünleri, meyve, sebze ve ürünleri, kuru gıdalar, yüksek miktarlarda yağ ve protein içeren fındık, yağlı tohum, et ve et ürünleri ve peynir gibi diğer pek çok gıda üzerinde yaygın olarak rastlanmaktadır (Magan ve Lacey, 19; Frisvad ve ark, 1992; Ayhan, 2; Bullerman, 23; Kure

24 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ ve ark, 2; Akın ve Akın, 21). A. Niger, yemeklik soğanda siyah çürüklük hastalığına neden olmaktadır (Sumner, 199) Geotrichum spp. Meyve, sebze, süt ürünleri gibi birçok gıdada bulunan Geotrichum cinsine ait küflerin en önemli özelliği, miselyumun hemen tamamının artrosporlara (artrokonidium) bölünmesidir. Beyaz, sarı ve portakal kırmızısı miseller oluştururlar. Miseller, gelişmenin ilk evresinde keçe görünümünde sıkı bir yapı gösterirken, inkübasyon süresi uzadıkça, yumuşak kremsi yapı alır. Turşularda bozulmalara neden olurlar (Ünlütürk ve ark, 1999; Akın ve Akın, 21). Yapılan bir çalışmada, starter kültür olarak kullanılan Geotrichum candidum un peynirlerde koruyucu kültür olarakta kullanılabileceği gösterilmiştir (Naz ve ark, 21). G. candidum un, yarı-sert peynirlerin olgunlaşması ve bu peynirlerde aroma ve tat oluşumuna katkı sağladığı bilinmesine karşın, yüksek CO 2 içeren çevre koşullarında gelişebilmesinden dolayı, Jarlsberg peyniri gibi yüksek CO 2 miktarı içeren peynirlerde bozulma yapma ve taze cottage, quark peynirleri, tereyağı ve kremalarda aroma bozucu kontaminant olma gibi olumsuz etkileri de söz konusudur (Chapman ve Sharpe, 199; Varnam ve Sutherland, 199; Haasum ve Nielsen, 199; Kure ve ark, 21; Boutrou ve Guéguen, 2; Hudecova ve ark, 29). Geotrichum lar özellikle limon, domates, havuç ve diğer meyve ve sebzelerde çürümelere neden olmaktadır (Pitt ve Hocking, 29). Ayrıca 2 C gibi düşük sıcaklıklarda gelişme yeteneğinden dolayı, hasat sonrası patojen olarak önemlidirler (Moline, 19; Oladiran ve Iwu, 1993; Skavia, 2; Tournas, 2; Thornton ve ark, 21) Rhodotorula spp. Çok yüksek oranda yağ içermeleri nedeniyle, Rhodotorula spp. gıdalarda bulunan en önemli maya türlerindendir. Rhodotorula lar spor oluşturmazlar, ender 9

25 1. GİRİŞ Dicle DÖNMEZ olarak yalancı misel oluşturdukları saptanmıştır. Çoğalmaları, çok yönlü tomurcuklanmayla (multilateral) olur. Kültür ortamlarında ve gıdalar üzerinde pembe, kırmızı, turuncu ve somon rengi pigment oluştururlar. Genelde, mezofilik olup, psikrofil türleri de vardır. Taze kanatlı etleri, balık, karides ve sığır kıymasında bozulma etkeni olmalarının yanı sıra, tereyağının yüzeyinde kolaylıkla gelişirler (Ayhan, 2). Ayrıca, Rhodotorula cinsi mayalar şarapları kontamine ederek, ürünün aromasını olumsuz etkilemektedirler (Loureiro ve Malfeito-Ferreira, 23) Candida spp. Gıdalarda yaygın olarak bulunan maya cinslerinden biri olan Candida spp., multipolar tomurcuklanma ile çoğalırlar ve bu mayalar yuvarlak, ovoid hücre şekline sahiptirler. Bazı türleri tereyağ ve margarinlerde, şarap ve bira gibi içeceklerde bozulmalara neden olur (Ünlütürk ve ark, 1999; Akın ve Akın, 21). Bazı türleri ise, peynirlerde ve ayranlarda gelişerek bozulmalara neden olmaktadır (Jacques ve Casaregola, 2). Candida cinsi mayalar, şaraplarda bozulma yapan mikroorganizmalar arasındadır (Loureiro ve Malfeito-Ferreira, 23). Cheddar peynirlerinde bozulmaya sebep olan en önemli maya cinsidir (Hocking ve Faedo, 1992). Ayrıca, Candida cinsi mayalar, dondurulmuş gıdalarda gelişerek bozulmalara neden olmaktadır (Tyrer, 199; Tyrer ve ark, 2). Düşük su aktivitesi ve düşük ph koşullarında gelişebilmelerinden dolayı sebze, meyve suyu gibi içeceklerde bozulmalara neden olmaktadırlar (Tyrer ve ark, 2) Issatchenkia spp. Özellikle, düşük ph içeriğine sahip gıdalarda bulunan Issatchenkia cinsine ait türler, çok yönlü tomurcuklanmayla çoğalırlar ve yalancı misel oluşturabilirler. Önceleri Pichia cinsi içinde yer alan bazı türleri, bu cins içine aktarılmıştır. Ayrıca, Candida krusei, Issatchenkia orientalis olarak değiştirilmiştir. Gıdalarda yaygın olarak bulunurlar (Ayhan, 2). Peynirlerde bozulma yapmaktadırlar (Jacques ve Casaregola, 2). 1

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu bölümde, Debaryomyces hansenii ve diğer bazı mayaların, gıdalarda bozulma yapan bazı mikroorganizmalar üzerine, biyokontrol aktivitesi ile ilgili bilgilere yer verilmiştir D. hansenii ve Diğer Bazı Mayaların Biyokontrol Özellikleri Üzerine Yapılan Bazı Çalışmalar Fatichenti ve ark (193), D. hansenii türüne ait 31 suşun, Clostridium tyrobutyricum ve Cl. butyricum üzerine inhibitör etkisini araştırmışlar ve D. hansenii nin, bu mikroorganizmaların gelişimini inhibe ettiğini belirlemişlerdir. Bu etkinin, sadece besin rekabetinden değil, bunun yanında, D. hansenii nin hücreiçi ve hücredışı antimikrobiyal metabolitler üretmesinden kaynaklandığını göstermişlerdir. Bu inhibitör etkinin, suşlara göre değiştiğini ve aerobik koşullarda veya az oksijenli ortamlarda olduğunu belirlemişlerdir. Chalutz ve ark (19), D. hansenii nin, birçok turunçgil çeşidinde, Penicillium digitatum ve P. italicum kaynaklı çürümelerin ve altıntop, limon ve portakallarda ise Geotrichum candidum un neden olduğu bozulmaların engellenmesinde etkili olduğunu belirlemişlerdir. Droby ve ark (199), D. hansenii ve Aueobasidium pulluoms mayalarının altıntop muhafaza süresini uzattığını bulmuşlardır. Chalutz ve ark (199), limonların yüzeyinden izole ettikleri D. hansenii suşlarını turunçgil, elma ve üzümlerin, derim sonu hastalıklarının kontrolünde kullanarak, başarılı sonuçlar elde etmişlerdir. Wilson ve Chalutz (199), D. hansenii, Aueobasidium pulluoms mayalarının yanı sıra Pseudomonas cepacia ve P. sgringae bakterilerinin, limon ve altıntoplarda çürüme etkeni olan, Penicillium digitatum ve P. italicum üzerine antimikrobiyal etkileri olduğunu belirlemişlerdir. Chalutz ve ark (199), limonların yüzeyinden izole ettikleri, D. hansenii mayasının inhibisyon etkisini, limonlarda çürüme etkeni olan Penicillium digitatum, 11

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ P. italicum ve Geotrichum candidum küflerine karşı test etmişlerdir. D. hansenii nin, en fazla inhibisyon etksini, P. digitatum üzerine gösterdiğini belirtmişlerdir. D. hansenii nin, P. digitatum ile aynı zamanda veya daha önce inoküle edildiğinde inhibisyon etkisi gösterdiğini ve D. hansenii nin, P. digitatum dan sonra uygulandığında inhibisyon etkisinin azaldığını belirlemişlerdir. Wisnievwski ve ark (1991), elmalarda çürüme etkeni olan Botrytis cinerea üzerine, P. guilliermondii ve D. hansenii mayalarının, inhibitör etkilerini araştırmışlar ve sonuçta, D. hansenii nin inhibitör etkisinin daha çok olduğunu bulmuşlardır. D. hansenii nin, elmalarda, B. cinerea hiflerine sıkıca tutunup, bu bölgelerde çukurluklar oluşturarak, B. cinerea hiflerinin oluşumlarını engellediklerini gözlemlemişlerdir. Paster ve ark (1993), Pichia guiliermondii nin, tahıl mikroflorasının gelişimini inhibe etme yeteneğini, doğal kontamine soya fasulyesi ve yapay olarak Aspergillus flavus ile inoküle edilen soya fasulyelerinde test etmişlerdir. A. flavus ve P. guiliermondii steril soya fasulyesine inoküle edildiğinde, 16 günlük depolama sırasında, fungal yayılımda önemli derecede azalma olduğunu belirlemişlerdir. Petersson ve Schnurer (199), yaptıkları çalışmada, Pichia anomala nın, çeşitli küflere karşı antifungal etkisini araştırmışlardır. Aspergillus fumigatus ve Eurotium amstelodam en duyarlı türler olarak bulunurken, Penicillium italicum ve Penicillium digitatum un en dirençli türler olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, P. anomala nın, en kuvvetli antagonistik aktiviteyi, 1 ve 1 6 kob/g konsantrasyonda, Penicillium roqueforti üzerine göstermiştir. P. guilliermondii ve S. cerevisiae mayalarının antifungal etkileri ise, oldukça düşük bulunmuştur. El-Neshawy ve Wilson (1997), yaptıkları bir çalışmada ise, elmalarda, Botryis cinerea ve Penicillium expansum un neden olduğu çürümelerin kontrolünde, Candida oleophila antagonistik mayası ile nisinin etkisini değerlendirmişlerdir. Elmalarda açılan kuyucuklara patojen, antagonist ve nisinin çeşitli kombinasyonları ilave edilmiştir. Antagonist süspansiyona %. nisin ilave edildiğinde, 23 C de 7 gün inkübayondan sonra, kuyucuklarda %.7 B. cinerea ve P. expansum sporu bulunurken, sadece antagonist ile patojenler inoküle edildiğinde %33. oranında B. 12

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ cinerea ve P. expansum sporu gelişmiştir. Nisin, C. oleophila mayasının, B. cinerea ve P. expansum küflerine karşı antagonistik etkisini artırmıştır. Calistru ve ark (1997), Trichoderma viride ve T. harzianum mayalarının, Fusarium moniliforme ve Aspergillus flavus üzerine inhibitör etki gösterdiklerini ve bu inhibisyonun, gelişme ortamındaki karbon veya nitrojen kaynaklarının varlığına bağlı olarak değiştiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, Trichoderma spp. nin bazı mikotoksin üreten fungusların biyokontrolü için kullanılabileceğini rapor etmişlerdir. Vinas ve ark (199), elma, şeftali ve elma yapraklarından izole edilen epifitik mikroorganizmaların antagonistik aktivitelerini, elmalarda Penicillium expansum, Botrytis cinerea ve Rhizopus nigricans a karşı test etmişlerdir. Toplamda 933 bakteri ve mayanın antagonistik aktivitesi test edilmiştir. Her üç küfe karşı, en iyi antagonistik aktiviteyi, Candida sake CPA-1 mayasının gösterdiği bulunmuştur. Bu maya, elmalarda açılan kuyucuklara inoküle edildiğinde, ilk 2 saatte ve 2 C de hakim duruma geçmektedir. Mortuza ve Ilag (1999), farklı Trichoderma izolatının, Lasiodiplodia theobromae üzerine antagonistik etkisini test etmişlerdir. Mikroskobik incelemeler sonucu T. harzianum ve T. viride nin hifleri çevresinde L. theobromae nın şişmiş, deforme olmuş hücrelerini gözlemişlerdir. T. viride nin, muz çevresine inoküle edildiği taktirde, %29.7 den 6.6 ya kadar çürümeyi azalttığını belirlemişlerdir. Göçer (1999), Washington navel portakalı ve mineola tangelo meyvelerinin muhafazası sırasında meydana gelen Penicillium çürüklerine karşı kullanılan, kimyasal maddelerin kullanım miktarını azaltmak, için Candida oleophila mayası kullanmıştır. Araştırmada, tek başına maya kullanımının Penicillium kaynaklı çürümeyi önleyemediği, fakat thiabendazole + maya kullanımının etkili olduğu belirlenmiştir. Zahavi ve ark (2), sofralık ve şaraplık üzümlerden izole ettikleri mikroorganizmalardan Candida gulliermondi A2 ve Acremonium cephalosporium B11 in antagonistik aktivitesini üzümlerde Botrytis cinerea, Aspergillus niger ve Rhizopus stolonifer in neden olduğu bozulmaların kontrolü için değerlendirmişlerdir. B. cinerea, A. niger ve R. stolonifer in neden olduğu bozulmaları ayrı ayrı incelemişler ve sonuçta, A2 nin, Botrytis cinerea nın gelişimini %, A. niger in 13

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ gelişimini %1 ve R. stolonifer in gelişimini %22 oranında, B11 in ise, B. cinerea nın gelişimini %16, A. niger in gelişimini %2 ve R. stolonifer in gelişimini %6 oranında azalttığını belirlemişlerdir. Fan ve Tian (2), antagonist özellikte olan Cryptococcus albidus (1 x 1 kob/ml) mayasının, fuji elmalarda, hasat sonrası patojenler olan Botrytis cinerea ve Penicillium expansum üzerine biyokontrol kapasitesini 23 C ve 1 C lerde araştırmışlardır. Sonuçta 23 C ve 1 C lerde C. albidus mayasının elmalarda B. cinerea ve P. expansum un neden olduğu bozulmaları inhibe ettiğini belirlemişlerdir. Payne ve Bruce (21), Pinus sylvestris odunlarının yüzeyinde gelişen maya ve küflerin gelişimini engellemek için, biyolojik kontrol ajanı olan D. hansenii yi kullanmışlardır. Araştırmada, ay boyunca odun yüzeyinde, -2 C de ve %93-1 nem oranında maya ve küf gelişimi kontrol edilmiş ve %1 nemde, 1 C de maksimum inhibitör etki gözlenmiştir. Vero ve ark (22), Cryptococcus laurentii ve Candida ciferrii mayalarının, Penicillium expansum un neden olduğu mavi küf bozulmalarına karşı antifungal etkilerini araştırmışlardır. Her iki maya, 2 C de P. expansum un gelişimini, % oranında azaltmıştır. C. ciferrii, C. laurentii ye göre, daha düşük konsantrasyonlarda, daha fazla inhibitör etki göstermiştir. Araştırmada, her iki mayanın antifungal aktivitesi, ancak karışık kültürleri kullanıldığında veya ortama NaCl ya da deoksiglukoz gibi maddeler eklendiğinde görüldüğü belirtilmiştir. Lima ve ark (22), Rhodotorula glutinis LS11, Cryptococcus laurentii LS2 ve Aureobasidium pullulans LS3 mayalarını, elmaların yüzeyine inoküle etmişler, her üç mayanın 3 C ve 2 C lerde, Botrytis cinerea ve Penicillium expansum a karşı antifungal etkilerini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda, LS2 ve LS3 izolatları en fazla antifungal etkiyi bozulmaları önleyerek göstermişlerdir. LS11 izolatı ise, sadece elmaların 3 C deki depolamasında etkili olmuştur. Masih ve Paul (22), üzümlerin yüzeyinden izole ettikleri Pichia membranifaciens in, üzüm şaraplarında bozulma yapan Botrytis cinerea üzerine antagonistik etki gösterdiğini bulmuşlardır. Bu antagonizmin, Pichia membranifaciens tarafından salgılanan β-1,3-glukanaz enziminden kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. 1

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ Benli ve Çakmakçı (23), elmalarda hasat sonrası hastalıklara neden olan Botrytis cinerea ve Penicillium expansum üzerine mayaların antifungal etkisini belirlemek amacıyla, yaprak, çiçek ve meyve yüzeylerinden izole edilen 123 maya izolatını kullanmışlardır. Çalışmada, maya izolatlarının in-vitro koşullarda antibiyozis denemelerini yapmışlar ve üç farklı etki saptamışlardır. Birincisi, inhibisyon zonu oluşumu, ikincisi kırmızı pigment oluşumu ve üçüncüsü ise çöküntü oluşumudur. Birinci ve ikinci etkiyi, her iki patojene karşı bulurken, üçüncü etki şekli olan çöküntü oluşumunu, sadece B. cinerea lara karşı bulmuşlardır. Qin ve ark (2), Trichosporon pullulans, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula glutinis ve Pichia membranefaciens mayalarının antifungal etkilerini, 2 C de kirazlarda hasat sonrası patojenlere (Alternaria alternata, Penicillium expansum, Botrytis cinerea ve Rhizopus stolonifer) karşı test etmişlerdir. 2 C de A. alternata, P. expansum, B. cinerea ve R. stolonifer kontrolünde en iyi antifunfal etkiyi T. pullulans ın gösterdiğini bildirmişlerdir. Mercier ve Jimenez (2), Muscodor albus un, hasat sonrası taze meyvelerde hastalığa neden olan diğer funguslara karşı biyokontrol etkinliğini araştırmışlardır. İn vitro testler, M. albus un depolama patojenleri olarak bilinen, Botrytis, Colletotrichum, Geotrichum, Monilinia, Penicillium ve Rhizopus cinslerine ait türler üzerinde inhibisyon etkisinin olduğunu göstermiştir. Yao ve ark (2), Cryptococcus laurentii ve Trichosporon pullulans gibi antagonistik mayaların süspansiyonuna, %2 oranında sodyum bikarbonat ilave edildiğinde, PDB (Patato Dekstrose Broth) besiyerinde, Penicillium expansum ve Alternaria alternata nın spor oluşumunu önemli derecede azalttığını bildirmişlerdir. C. laurentii ve T. pullulans ın, sodyum bikarbonat ile kombine halde kullanımı, P. expansum ve A. alternata üzerine, tek başına antagonistik maya kullanımından daha etkili olduğu bulunmuştur. C. laurentii nin, sodyum bikarbonat ile kombine kullanıldığında en fazla inhibisyon etkiyi A. alternata üzerine gösterdiği rapor edilmiştir. Lahlali ve ark (2), Candida oleophila ve Pichia anomala mayalarının, turunçgillerde hasat sonrası hastalıklara karşı antagonistik aktivitesinin, patojen inokülasyonundan önceki inkübasyon peryoduna bağlı olduğunu belirtmişlerdir. 1

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ Çalışmada, C. oleophila ve P. anomala mayalarının, limonlarda P. digitatum ve P. italicum çürümelerini %7 azalttığı, yine klementin çeşidi limonlarda, Geotrichum candidum un neden olduğu çürümeleri % azalttığı bulunmuştur. Zheng ve ark (2), yaptıkları çalışmada, Rhodotorula glutinis in, portakallarda yeşil küf hastalığına neden olan Penicillium digitatum üzerine biyokontrol aktivitesini test etmişlerdir. R. glutinis, yüksek konsantrasyonlarda daha iyi biyokontrol etki göstermiştir. Ayrıca R. glutinis düşük sıcaklıklarda ( C) P. digitatum üzerine etkili olmaktadır. Tian ve ark (2), Cryptococcus laurentii ve Rhodotorula glutinis in silikon ile kombine olarak biyokontrol aktivitesini, keçiboynuzu meyvesinde çürüme yapan, Alternaria alternata ve Penicillium expansum küflerine karşı, 2 ve C lerde araştırmışlardır. C. laurentii ve R. glutinis in, A. alternata ve P. expansum küflerine karşı en iyi antagonistik aktiviteyi 2 C de, %2 silikon ile kombinasyonunun gösterdiğini bildirmişlerdir. Irina ve ark (26), Metschnikowia pulcherrima mayasının, kayısı ve şeftali meyvelerinde, hasat öncesi ve sonrası çürümelere neden olan patojenlerden fungusit dirençli Monilinia spp. küfüne karşı antifungal etkisini araştırmışlardır. M. pulcherrima, kayısı ve şeftali meyvelerinin üstüne 2 x 1 6 kob/ml ve 6 x 1 6 kob/ml konsantrasyonlarda püskürtülmüştür. M. pulcherrima nın, hasat sonrası C deki depolama süresince, meyve çürümelerini tamamen önlediği gözlenmiştir. Bleve ve ark (26), üzümlerdeki epifitik floradan izole ettikleri mayaların antagonistik aktivitesini, üzümlerde okratoksin A birikimine neden olan Aspergillus carbonarius ve A. niger e karşı test etmişlerdir. Elde edilen mayalardan, Issatchenkia orientalis e ait iki izolat, Metschnikowia pulcherrima, Kluyveromyces thermotolerans, Issatchenkia terricola ve Candida incommunis in okratoksijenik küflere karşı inhibisyon yeteneklerini değerlendirmişlerdir. Sonuçta, Kluyveromyces thermotolerans dışındaki mayaların, A. carbonarius ve A. niger e karşı inhibisyon etkisi gösterdiğini ve en iyi antagonistik aktiviteyi I. orientalis e ait iki izolatın gösterdiğini tespit etmişlerdir. Mekbib (27), meyve çürümelerinin kontrolünde kullanılan kimyasal pestisitlere alternatif olarak, portakal ağaçlarının yaprak yüzeyinden ve dallarından 16

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ izole ettikleri, Cryptococcus laurentii (MeJtw1-2 ve TiL-3) ve Candida sake (TiL-2) mayalarını kullanmışlardır. Sonuç olarak, turunçgillerde, Geotrichum candidum ve Colletotrichum gloeosporioides in neden olduğu çürüme ve hastalıklara karşı, %7-9 oranında kontrol sağlamışlardır. Aynı araştırmada, aynı mayaların, Penicillium digitatum un neden olduğu yeşil küf çürümelerine karşı etkisini de test etmişlerdir. Her üç mayanın da, P. digitatum un spor oluşumunu inhibe ettiğini bildirmişlerdir (P<.). Sempere ve Santamarina (27), yaptıkları bir çalışmada, Trichoderma harzianum un farklı ortam koşulları altında (su aktivitesi ve sıcaklık) Alternaria alternata ya karşı olası biyokontrol aktivitesini araştırmışlar ve sonuç olarak; biyokontrol mekanizmasının, besin ve ortam için rekabet, mikoparasitizm ve antibiyosis gibi farklı mekanizmalar tarafından yönetildiğini belirlemişlerdir. Ayrıca, su aktivitesi ve sıcaklığın, fungal gelişim oranını etkilediği, aynı çalışmada vurgulanmıştır. Zhang ve ark (27), Cryptococcus laurentii nin, şeftalide hasat sonrası Botrytis cinerea, Penicillium expansum ve Rhizopus stolonifer in neden olduğu, sırasıyla gri küf, mavi küf ve Rhizopus çürümesine karşı azaltıcı aktivitesini değerlendirmişlerdir. Çalışma sonunda, C. laurentii nin 1 x 1 9 kob/ml konsantrasyonu ve 2 C de gün inkübasyon koşulunda, gri küf çürümesini tamamen inhibe ettiğini, B. cinerea nın 1 x 1 spor/ml konsantrasyonu üzerine de etkili olduğu belirlenmiştir. Dal Bello ve ark (2), solanaceous bitkisinin yüzeyinden izole edilen mayaların, domateslerde hasat sonrası, B. cinerea nın neden olduğu çürümeleri, azaltıcı aktivitesi olduğunu belirlemişlerdir. Rhodotorula rubra ve Candida pelliculosa türlerine ait 1 suşun, bu patojene karşı in-vitro koşullarda kuvvetli antagonist etki gösterdiğini saptamışlardır. Hernandez ve ark (2), yaptıkları çalışmada, sofralık yeşil zeytinlerde Candida, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia ve Saccharomyces cinslerine ait 1 maya suşunun, farklı koşullarda inhibitör etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada, farklı ph (3.-.) ve NaCl konsantrasyonu ( %, ve 1) denenmiştir. İnhibitör etki, en yüksek ph. ve en düşük ph. te bulunmuştur. % ve % NaCl 17

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dicle DÖNMEZ konsantrasyonunda inhibitör etki artarken, %1 NaCl konsantrasyonda azalma gözlenmiştir. Liu ve Tsao (2), D. hansenii nin yoğurt ve peynir küflerine karşı inhibitör etkisini ph. ve sıcaklık 2 C ve 3 C lerde araştırmışlardır. Araştırmada, D. hansenii nin, süt ürünlerinde bozulmalara neden olan Aspergillus sp., Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Cladosporium sp., Eurotium chevalieri, Penicillium candidum ve Penicillium roqueforti küfleri üzerine antifungal etki gösterdiğini belirlemişlerdir. Ancak, söz konusu antifungal etkinin, küflerin konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiğini ve küf konsantrasyonu azaldıkça, D. hansenii nin inhibitör etkisinin arttığını saptamışlardır. 1

34 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Mikroorganizmalar Araştırmada kullanılan D. hansenii suşları, antifungal aktiviteye duyarlılığı araştırılan küfler, mayalar ve temin edildiği yerlerle ilgili bilgiler Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge Araştırmada Kullanılan Küf ve Maya Kültürleri. Mikroorganizma Suş No Kaynak D.hansenii Dh1 Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya D.hansenii Dh2 Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya D.hansenii Dh3 SWİNG LAF 3-Chr. Hansen Penicillum nalgiovense K2 Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya Aspergillus parasiticus K7 TÜBİTAK Kültür Kolleksiyonları Penicillum chrysogenum K Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya Penicillum chrysogenum K9 Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya Aspergillus flavus K12 Çukurova Üniversitesi/Türkiye Geotrichum klebahnii K13 Çukurova Üniversitesi/Türkiye Rhodotorula glutinis M1 Hohenheim Üniversitesi Stuttgart/Almanya Candida rugosa M16 Çukurova Üniversitesi/Türkiye Rhodotorula mucilaginosa 2 M71 Çukurova Üniversitesi/Türkiye Issatchenkia orientalis M73 Çukurova Üniversitesi/Türkiye Besiyerleri D. hansenii ve diğer maya suşlarının gelişiminde ve antifungal etkinin belirlenmesinde aşağıda bileşimi verilen YEPD (Yeast Extract Pepton Dextrose) agar ve broth besiyeri kullanılmıştır. 19

35 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ Bileşimi g/l Yeast Extract (Merck) 2 Meat Pepton (Merck) 1 Dextrose (Merck) 1 Agar agar (Merck) 1 Küflerin gelişimi için ise, PDA (Potato Dextrose Agar) (Merck) hazır besiyeri kullanılmıştır. Kullanılan her iki besiyeri de 121 C de 1 dakika otoklavda sterilize edilmiştir Çözeltiler ve Kimyasallar Seyreltme sıvısı: NaCl (Merck). g/l Pepton (Merck) 1. g/l Yukarıdaki maddeler 1 litre destile suda çözündükten sonra 121 C de 1 dakika otoklavda sterilize edilmiştir. Tamponlanmış Fosfat Solüsyonu: NaCl (Merck) g/l K 2 HPO (Merck) 1.21 g/l KH 2 PO (Merck).3 g/l Yukarıdaki maddeler 1 litre destile suda çözündükten sonra %. oranında Tween ile tamponlanmıştır Alet ve Ekipmanlar Araştırmanın değişik aşamalarında, su banyosu (P-Selecta Unitronic), ph metre (P-Selecta ph 21), inkübatör (Aqua Lytic Termostatic Cabinet ve MMM Group Incucell 111), santrifüj cihazı (Heraeus Sepatech Labofuge 2) ve spektrofotometre (PerkinElmer Lambda 2 UV/VS Spectrofotometer) kullanılmıştır. 2

36 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ 3.2. Metot Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda yürütülen bu çalışmada, Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun (Dh1, Dh2 ve Dh3) Penicillium, Aspergillus, Geotricum gibi küflerin yanı sıra, Candida, Rhodotorula, ve Issatchenkia mayalarına ait türler üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkileri agar kuyu difüzyon metodu kullanılarak araştırılmıştır. Tüm denemeler 2 tekrarlı yapılmıştır Debaryomyces hansenii Suşlarının Gelişim Kinetiğinin Belirlenmesi Optik yoğunluk ile Canlı Hücre Sayısı Arasındaki İlişkinin Belirlenmesi Debaryomyces hansenii suşlarının (Dh1, Dh2 ve Dh3), 2 ml sıvı YEPD besiyerine ayrı ayrı ekimleri yapılarak, ekim anından itibaren saatlik inkübasyon süresince her 1 saatte bir örnek alındıktan sonra O.D. 7 nm dalga boyunda, hücre yoğunluğu ölçülmüş ve aynı anda YEPD agar besiyerine ekimleri gerçekleştirilerek, hücre sayıları belirlenmiştir. Daha sonraki çalışmalarda ise, Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3 te verilen grafiklerden yararlanılarak, sadece optik yoğunluk ölçülmek suretiyle, D. hansenii hücre sayıları belirlenmiştir. 21

37 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ 1,E+1 D.hansenii Dh1 maya sayısı (kob/ml) 1,E+9 1,E+ 1,E+7 1,E+6 1,E+ 1,E+,166.saat,973 1.saat 1, 2.saat 2, saat,9.saat 7,992.saat absorbans ve zaman Şekil 3.1. Debaryomyces hansenii Dh1 e ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D 7 nm) D. hansenii Dh2 1,E+1 maya sayısı (kob/ml) 1,E+9 1,E+ 1,E+7 1,E+6 1,E+ 1,E+,217.saat,97 1.saat 1, saat 2, saat 6,7332.saat 7,999.saat absorbans ve zaman Şekil 3.2. Debaryomyces hansenii Dh2 ye ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D 7 nm) 22

38 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ maya sayısı (kob/ml) 1,E+1 1,E+9 1,E+ 1,E+7 1,E+6 1,E+ 1,E+,23.saat,29 1.saat D. hansenii Dh3, saat,71 3.saat absorbans ve zaman,962.saat 3,26.saat Şekil 3.3. Debaryomyces hansenii Dh3 e ait hücrelerin optik yoğunluk değerleri ile hücre sayısı arasındaki ilişki (O.D 7 nm) Farklı Ortam Koşullarının Antifungal Etkiye Duyarlı Küflerin Gelişimi Üzerine Etkisi Farklı ortam koşullarının (ph, NaCl, sıcaklık) antifungal etkiye duyarlı küflerin gelişimi üzerine etkisini belirlemek amacıyla, küflerin YEPD agar besiyerine ekimi yapılmış ve aerob koşullarda 7 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda küflerin koloni çapları mm cinsinden ölçülmüştür. Antifungal etkiye duyarlılığı araştırılan küflerin farklı ortam koşullarında gelişimiyle ilgili deneme planı Çizelge 3.3 te verilmiştir (Baumgart, 1993) Küf Kültürlerinin Hazırlanması Antifungal etkiye duyarlılığı incelenecek ve C de stok kültürde saklanan küf suşları, yatık Potato Dextrose Agara, steril öze yardımıyla ekilerek 2 C de 7 gün inkübe edilmiştir. 23

39 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ Küf Sporunun Elde Edilmesi 2 C de 7 gün inkübe edilen ve misel oluşturuncaya kadar yatık PDA da geliştirilen küf suşlarının sporlarını ayırmak için, aseptik koşullarda ml steril %. Tween içeren tamponlanmış fosfat solüsyonu, yatık agara ilave edilerek steril öze yardımıyla yavaşça miseller gevşetilmiştir. Daha sonra, steril tülbent bezi, steril cam huni içine yerleştirilerek, süspansiyon süzülmüş ve böylece miseller üstte kalarak ayrılmıştır. Altta kalan küf sporlarının konsantrasyonu, 1 spor/ml ye ayarlanarak, duyarlılık testlerinde kullanılmıştır (Dal Bello ve ark, 2) D. Hansenii ve Diğer Maya Kültürlerinin Hazırlanması D. hansenii suşları, ml YEPD broth besiyerinde 2 C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra gelişen hücreler, devirde, 1 dakika santrifuj edilmiştir ve süpernatant kısmı dökülmüştür. Daha sonra, hücre çökeltisi, steril destile su ile iki defa yıkanmıştır. D. hansenii suşlarının hücre konsantrasyonu, 1 kob/ml ye ayarlanarak, antifungal etkiyi belirlemede kullanılmıştır (Zhang, 27). D. hansenii suşlarına karşı duyarlılığı araştırılan mayalar ise, yatık PDA besiyerine ekimi yapılarak, 2 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda, gelişen mayaların üzerine, ml steril %. Tween içeren tamponlanmış fosfat solüsyonu eklenip, mayaların geliştiği yatık agar steril öze yardımıyla yıkanmıştır. Süzme işlemi yapılmadan 1 7 kob/ml ye ayarlanan hücre konsantrasyonu, duyarlılık testinde kullanılmıştır Farklı Gelişim Ortamlarında Antifungal Etkinin Belirlenmesi D. hansenii mayasının gıdalarda bozulma etkeni olan bazı funguslar üzerine, farklı ortam koşullarındaki antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir. D. hansenii mayasının, gıdalarda bozulma etkeni olan bazı funguslar 2

40 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ üzerine antifungal etkisini, farklı gelişim ortamlarında belirlemek amacıyla kurulan deneme planı Çizelge 3.2 te verilmiştir. Çizelge 3.2. Deneme Planı Maya Kültürleri ph % NaCl Sıcaklık C Debaryomyces hansenii Dh1.,. ve.,, 1 ve 2 Debaryomyces hansenii Dh2.,. ve.,, 1 ve 2 Debaryomyces hansenii Dh3.,. ve.,, 1 ve Agar Kuyu Difüzyon Yöntemi Agar kuyu difüzyon yöntemi ile Debaryomyces hansenii suşlarının antifungal etkilerinin belirlenmesi için yapılan bu çalışmada, antifungal etkiye duyarlılığı araştırılan maya ve küf süspansiyonlarından, 1 er ml farklı tuz ve ph koşullarında hazırlanan YEPD agar besiyerine dökme ekim yöntemiyle ekimi yapılmış ve katılaşan besiyerinde mm çapında 2 kuyucuk açılmıştır. Kuyucuklardan birine, önceden konsantrasyonu belirlenen Debaryomyces hansenii süspansiyonlarından.3 ml ilave edilmiştir, diğer kuyucuğa ise.3 ml steril YEPD sıvı besiyeri eklenmiş ve kontrol olarak değerlendirilmiştir. 1 ve 2 C de 7 gün inkübasyona bırakılmış ve süre sonunda zon oluşumu değerlendirilmiştir (Magaldi ve ark, 2). Oluşan zon çaplarının değerlendirilmesi Çizelge 3.3 e göre gerçekleştirilmiştir. Çizelge 3.3. Zon Çaplarının Değerlendirilme Aralıkları (Rodriguez ve ark., 2) Zon çapı (mm) İnhibisyon Aktivitesi Görülmedi - <1 (+) 1-1 (++) 1-19 (+++) >2 (++++) (-)Dirençli ; (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas 2

41 3. MATERYAL VE METOT Dicle DÖNMEZ İstatistiksel Analiz Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun (Dh1, Dh2 ve Dh3), gıdalarda bozulma etkeni olan küfler (Penicillium nalgiovense K2, Aspergillus parasiticus K7, Penicillium chrysogenum K, Penicillium chrysogenum K9, Aspergillus flavus K12, Geotrichum klebahnii K13) ve mayalar (Rhodotorula glutinis M1, Candida rugosa M16, Rhodotorula mucilaginosa 2 M71, Issatchenkia orientalis M73) üzerine, farklı ortam koşullarında (sıcaklık, ph, tuz) antifungal etkisinin belirlenmesinde SPSS 9. paket programı kullanılmıştır. 26

42 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Yapılan bu çalışmada, 3 farklı Debaryomyces hansenii maya suşunun (Dh1, Dh2 ve Dh3), gıdalarda bozulma yapan bazı küfler (Penicillium chrysogenum K9, Penicillium chrysogenum K, Penicillium nalgiovense K2, Aspergillus parasiticus K7, Aspergillus flavus K12, Geotrichum klebahnii K13) ve bazı mayalar (Rhodotorula glutinis M1, Candida rugosa M16, Rhodotorula mucilaginosa 2 M71, Issatchenkia orientalis M73) üzerine antifungal etkileri, farklı ortam koşullarında (sıcaklık, ph, NaCl) agar difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir..1. Farklı Ortam Koşullarının Antifungal Etkiye Duyarlı Küflerin Gelişimi Üzerine Etkisi Antifungal etkiye duyarlılığı belirlenen küflerin (P. chrysogenum K9, P. chrysogenum K, P. nalgiovense K2, A. parasiticus K7 ve A. flavus K12), farklı ortam koşullarında (sıcaklık, ph ve NaCl) gelişim özellikleri belirlenmiştir Farklı Ortam Koşullarının Penicillium chrysogenum K9 un Gelişimi Üzerine Etkisi Penicillium chrysogenum K9 un gelişimi üzerine, farklı NaCl (tuz) konsantrasyonlarının (%, % ve %), farklı ph nın (.,. ve.) ve farklı sıcaklıkların (1 C ve 2 C) etkisi belirlenmiş ve bu uygulamalar sonucunda elde edilen kolonilerin çapları mm cinsinden ölçülerek değerlendirilmiştir (Çizelge.1, Şekil.1). 27

43 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Çizelge.1. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K9 un gelişimi üzerine etkisi P. chrysogenum K9* ph NaCl % 1 C 2 C *koloni çapı mm Penicillium chrysogenum K9 koloni çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.1. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K9 un gelişimi üzerine etkisi P. chrysogenum K9 un koloni gelişimi, en fazla 3 mm koloni çapıyla ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında, en az ise 6 mm koloni çapı ile ph., 1 C, % NaCl ortam koşullarında gözlenmiştir. 2

44 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ P. chrysogenum K9 un gelişimi üzerine, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarının etkisini incelemek amacıyla yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, tek başına NaCl ve sıcaklığın P. chrysogenum K9 un gelişimi üzerine önemli olduğu bulunurken, tek başına ph nın etkisinin önemsiz olduğu bulunmuştur. Sonuçlar incelendiğinde, P. chrysogenum K9 un en iyi % NaCl ve 2 C de geliştiği görülmüştür (p<.) Farklı Ortam Koşullarının Penicillium chrysogenum K in Gelişimi Üzerine Etkisi Penicillium chrysogenum K in koloni gelişimi üzerine, farklı tuz konsantrasyonlarının (%, % ve %), farklı ph nın (.,. ve.) ve farklı sıcaklıkların (1 C ve 2 C) etkisi belirlenmiş ve bu uygulamalar sonucunda elde edilen kolonilerin çapları mm cinsinden ölçülerek değerlendirilmiştir (Çizelge.2, Şekil.2). Çizelge.2. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K in gelişimi üzerine etkisi P. chrysogenum K* ph NaCl % 1 C 2 C *koloni çapı mm

45 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ P. chrysogenum K koloni çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.2. Farklı ortam koşullarının P. chrysogenum K in gelişimi üzerine etkisi P. chrysogenum K in koloni gelişimi, en fazla 7 mm zon çapıyla ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında, en az ise mm koloni çapıyla ph., 1 C, % NaCl ortam koşullarında gözlenmiştir. P. chrysogenum K in gelişimi üzerine, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarının etkisini incelemek amacıyla yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, tek başına NaCl ve sıcaklığın P. chrysogenum K in gelişimi üzerine önemli olduğu bulunurken, tek başına ph nın etkisinin önemsiz olduğu bulunmuştur. Sonuçlar incelendiğinde, P. chrysogenum K in en iyi tuzsuz ortamda ve 2 C de geliştiği görülmüştür (p<.) Farklı Ortam Koşullarının Penicillium nalgiovense K2 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Penicillium nalgiovense K2 nin koloni gelişimi üzerine, farklı tuz konsantrasyonlarının (%, % ve %), farklı ph nın (.,. ve.) ve farklı sıcaklıkların (1 C ve 2 C) etkisi belirlenmiş ve bu uygulamalar sonucunda elde 3

46 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ edilen kolonilerin çapları mm cinsinden ölçülerek değerlendirilmiştir (Çizelge.3, Şekil.3). Çizelge.3. Farklı ortam koşullarının P. nalgiovense K2 nin gelişimi üzerine etkisi P. nalgiovense K2* ph NaCl % 1 C 2 C *koloni çapı mm P. nalgiovense K2 koloni çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.3. Farklı ortam koşullarının P. nalgiovense K2 nin gelişimi üzerine etkisi 31

47 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ P. nalgiovense K2 nin koloni gelişimi, en fazla 6 mm koloni çapıyla ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında, en az ise 12 mm koloni çapıyla ph., 1 C, % NaCl ve ph., 1 C, % NaCl ortam koşullarında gözlenmiştir. P. nalgiovense K2 nin gelişimi üzerine, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarının etkisini incelemek amacıyla yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, tek başına NaCl ve sıcaklığın P. nalgiovense K2 nin gelişimi üzerine önemli olduğu bulunurken, tek başına ph nın etkisinin önemsiz olduğu bulunmuştur. Sonuçlar incelendiğinde, P. nalgiovense K2 nin en iyi tuzsuz ortamda ve 2 C de geliştiği görülmüştür (p<.). Penicillium un gelişimi üzerine sıcaklık ve NaCl konsantrasyonunun birlikte etkisini belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada, ortama 1 M NaCl ilave edildiğinde, Penicillium 33 C de iyi gelişirken, ortama M NaCl ilave edildiğinde 3 C de iyi geliştiği gözlenmiştir. Gelişme ortamında NaCl konsantrasyonu arttıkça, Penicillium un sıcaklığa toleransı azalmaktadır (Cuppers ve ark, 1997)..1.. Farklı Ortam Koşullarının Aspergillus parasiticus K7 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Aspergillus parasiticus K7 nin koloni gelişimi üzerine, farklı tuz konsantrasyonlarının (%, % ve %), farklı ph nın (.,. ve.) ve farklı sıcaklıkların (1 C ve 2 C) etkisi belirlenmiş ve bu uygulamalar sonucunda elde edilen kolonilerin çapları mm cinsinden ölçülerek değerlendirilmiştir (Çizelge., Şekil.). 32

48 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Çizelge.. Farklı ortam koşullarının A. parasiticus K7 nin gelişimi üzerine etkisi A. Parasiticus K7* ph NaCl % 1 C 2 C *koloni çapı mm A. parasiticus K7 koloni çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.. Farklı ortam koşullarının Aspergillus parasiticus K7 nin gelişimi üzerine etkisi A. parasiticus K7 nin koloni gelişimi, en fazla 2 mm koloni çapıyla ph., 2 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında, en az ise 6 mm koloni çapıyla ph., 1 C, % NaCl ortam koşullarında gözlenmiştir. 33

49 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ A. parasiticus K7 nin gelişimi üzerine, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarının etkisini incelemek amacıyla yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, tek başına NaCl ve sıcaklığın A. parasiticus K7 nin gelişimi üzerine önemli olduğu bulunurken, tek başına ph nın etkisinin önemsiz olduğu bulunmuştur. Sonuçlar incelendiğinde, A. parasiticus K7 nin en iyi % NaCl ve 2 C de geliştiği görülmüştür (p<.)..1.. Farklı Ortam Koşullarının Aspergillus flavus K12 nin Gelişimi Üzerine Etkisi Aspergillus flavus K12 nin koloni gelişimi üzerine, farklı tuz konsantrasyonlarının (%, % ve %), farklı ph nın (.,. ve.) ve farklı sıcaklıkların (1 C ve 2 C) etkisi belirlenmiş ve bu uygulamalar sonucunda elde edilen kolonilerin çapları mm cinsinden ölçülerek değerlendirilmiştir (Çizelge., Şekil.). Çizelge.. Farklı ortam koşullarının A. flavus K12 nin gelişimi üzerine etkisi A. flavus K12* ph NaCl % 1 C 2 C *koloni çapı mm

50 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ A. flavus K12 koloni çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.. Farklı ortam koşullarının Aspergillus flavus K12 nin gelişimi üzerine etkisi A. flavus K12 nin koloni gelişimi, en fazla 7 mm koloni çapıyla ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında, en az ise 11 mm koloni çapıyla ph., 1 C, % NaCl ortam koşullarında gözlenmiştir. A. flavus K12 nin gelişimi üzerine, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarının etkisini incelemek amacıyla yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, tek başına NaCl ve sıcaklığın A. flavus K12 nin gelişimi üzerine önemli olduğu bulunurken, tek başına ph nın etkisinin önemsiz olduğu bulunmuştur. Sonuçlar incelendiğinde, A. parasiticus K7 nin en iyi % NaCl ve 2 C de geliştiği görülmüştür (p<.). Aspergillus un gelişimi üzerine sıcaklık ve NaCl konsantrasyonunun birlikte etkisini belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada, ortama 1 M NaCl ilave edildiğinde, Aspergillus 3 C de iyi gelişirken, ortama 6 M NaCl ilave edildiğinde 31 C de iyi geliştiği gözlenmiştir. Gelişme ortamında NaCl konsantrasyonu arttıkça, Aspergillus un sıcaklığa toleransı azalmaktadır (Cuppers ve ark, 1997). 3

51 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ.2. Farklı Ortam Koşullarında Debaryomyces hansenii nin Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun; %, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve 1 C ve 2 C de Penicillium chrysogenum K9, P. chrysogenum K, Penicillium nalgiovense K2, Aspergillus parasiticus K7, A. flavus K12, Geotrichum klebahnii K13, Rhodotorula glutinis M1, Candida rugosa M16, Rhodotorula mucilaginosa M71, Issatchenkia orientalis M73 üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir Debaryomyces hansenii nin Penicillium chrysogenum K9 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, %, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve 1 C ve 2 C de P. chrysogenum K9 (1 spor/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir (Çizelge.6). Çizelge.6. D. hansenii suşlarının farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi K9 (P. chrysogenum) Dh1 Dh2 Dh3 ph % NaCl 1 C 2 C 1 C 2 C 1 C 2 C. dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli +++ dirençli dirençli dirençli dirençli ++ dirençli dirençli (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas 36

52 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde, P. chrysogenum K9 un tuzsuz ortamda D. hansenii suşlarının oluşturduğu antifungal etkiye karşı dirençli olduğu, ancak NaCl konsantrasyonu arttıkça bu antifungal etkiye dirençliliğin azaldığı görülmüştür. D. hansenii suşlarının, P. chrysogenum K9 üzerine oluşturdukları antifungal etki ph azaldıkça ve sıcaklık arttıkça artış göstermiştir. D. hansenii Dh1, P. chrysogenum K9 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii Dh2, P. chrysogenum K9 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 1 C, % NaCl, ph., 2 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii Dh3, P. chrysogenum K9 üzerine en fazla antifungal etkiyi ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii suşlarının, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisini belirlenmesi için yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, her üç D. hansenii suşunun da, P. chrysogenum K9 üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkisinin olduğu belirlenmiştir. Oluşan zon çapları üzerinde, tek başına NaCl konsantrasyonu ve ph nın her üç D. hansenii suşu için önemli olduğu bulunurken (P<.), tek başına sıcaklığın D. hansenii Dh1 ve D. hansenii Dh3 ün, oluşturduğu zon çapı üzerine önemli, D. hansenii Dh2 nin oluşturduğu zon çapı üzerine önemsiz olduğu görülmüştür (şekil.6, şekil.7,şekil., şekil.9). 37

53 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 zon çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.6. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi. 2 zon çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.7. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi. 3

54 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 1 zon çapı (mm) 1 1 C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi Araştırmada, D. hansenii nin üç suşunun da, P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etki gösterdiği belirlenmiştir. Chalutz ve ark (19), Wilson ve Chalutz (199), yaptıkları benzer çalışmalarda, D. hansenii mayasının, özellikle turunçgillerde depolama sırasında çürümelere neden olan Penicillium digitatum ve P. italicum üzerine antifungal etkisinin olduğunu bildirmişlerdir. 39

55 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Şekil.9. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in P. chrysogenum K9 üzerine antifungal etkisi Debaryomyces hansenii nin Penicillium chrysogenum K Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, %, % ve % NaCl, ph.,. ve., 1 C ve 2 C de P. chrysogenum K (1 spor/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir (Çizelge.7).

56 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Çizelge.7. D. hansenii suşlarının farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi. K (P. chrysogenum) Dh1 Dh2 Dh3 ph % NaCl 1 C 2 C 1 C 2 C 1 C 2 C. dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli +++ dirençli +++ dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli +++ dirençli ++ dirençli ++ dirençli (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas Elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde, P. chrysogenum K in tuzsuz ortamda D. hansenii suşlarının oluşturduğu antifungal etkiye karşı dirençli olduğu, ancak NaCl konsantrasyonu arttıkça bu antifungal etkiye dirençliliğin azaldığı görülmüştür. D. hansenii suşlarının, P. chrysogenum K üzerine oluşturdukları antifungal etki sıcaklık azaldıkça artış göstermiştir. D. hansenii suşlarının, P. chrysogenum K üzerine oluşturdukları antifungal etki en iyi ph., % NaCl ve 1 C koşullarında gözlenmiştir. D. hansenii Dh1 suşu, P. chrysogenum K üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 1 C, % NaCl ortamında göstermiştir. D. hansenii Dh2 suşu, P. chrysogenum K üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 1 C, % NaCl ve ph., 1 C, % NaCl ortamında göstermiştir. D. hansenii Dh3 ise, P. chrysogenum K üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl ortamlarında göstermiştir. D. hansenii suşlarının, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarında P. chrysogenum K üzerine, antifungal etkisini belirlenmesi için yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, her üç D. hansenii suşunun da, P. chrysogenum K üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkisinin olduğu belirlenmiştir. Oluşan zon çapları üzerinde, tek başına NaCl konsantrasyonu ve sıcaklığın her üç D. 1

57 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ hansenii suşu için önemli olduğu bulunurken (P<.), tek başına ph nın D. hansenii Dh1 ve D. hansenii Dh3 ün, oluşturduğu zon çapı üzerine önemli, D. hansenii Dh2 nin oluşturduğu zon çapı üzerine önemsiz olduğu görülmüştür (Şekil.1, Şekil.11, Şekil.12, Şekil.13). 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi. 2

58 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.11. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi. 2 zon çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.12. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etkisi. 3

59 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Bu çalışmada, D. hanseni nin üç suşunun da, P. chrysogenum K üzerine, antifungal etkisi olduğu belirlenmiştir. Hernandez ve ark (2), Debaryomyces in, farklı ph ve NaCl koşullarında inhibitör etkisini araştırdıkları çalışmada, Debaryomyces in inhibitör etkisinin, % ve % NaCl konsantrasyonlarında arttığını, fakat %1 NaCl konsantrasyonda azaldığını belirlemişlerdir. Çalışmamızda da benzer sonuçlar elde edilmiş olup, D. hansenii, % NaCl koşullarında P. chrysogenum K üzerine antifungal etki göstermezken, en iyi antifungal etkiyi % NaCl koşullarında göstermiştir. Şekil.13. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in P.chrysogenum K üzerine antifungal etkisi.

60 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ.2.3. Debaryomyces hansenii nin Penicillium nalgiovense K2 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, %, % ve % NaCl, ph.,. ve., 1 C ve 2 C de P. nalgiovense K2 (1 spor/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir (Çizelge.). Çizelge.. D.hansenii suşlarının farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi. K2 (P. nalgiovense) Dh1 Dh2 Dh3 ph % NaCl 1 C 2 C 1 C 2 C 1 C 2 C dirençli dirençli dirençli ++ dirençli +++ dirençli dirençli dirençli (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas Elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde, P. nalgiovense K2 nin tuzsuz ortamda D. hansenii suşlarının oluşturduğu antifungal etkiye karşı dirençli olduğu, ancak % NaCl konsantrasyonunda bu antifungal etkiye dirençliliğin en az olduğu, % NaCl konsantrasyonunda dirençliliğin arttığı görülmüştür. D. hansenii suşlarının, P. nalgiovense K2 üzerine oluşturdukları antifungal etki ph azaldıkça ve sıcaklık arttıkça artış göstermiştir. D. hansenii Dh1, P. nalgiovense K2 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl ve ph., 1 C, % NaCl ortamlarında, D. hansenii Dh2, P. nalgiovense K2 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortamlarında ve son

61 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ olarak da D. hansenii Dh3, P. nalgiovense K2 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii suşlarının, farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarında Penicillium nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisini belirlenmesi için yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, her üç D. hansenii suşunun da, P. nalgiovense K2 üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkisinin olduğu belirlenmiştir. Oluşan zon çapları üzerinde, tek başına NaCl konsantrasyonun her üç D. hansenii suşu için önemli olduğu bulunurken (P<.), tek başına ph nın D. hansenii Dh1 in oluşturduğu zon çapı üzerine önemli, D. hansenii Dh2 ve D. hansenii Dh3 ün oluşturduğu zon çapı üzerine önemsiz, tek başına sıcaklığın ise D. hansenii Dh2 nin, oluşturduğu zon çapı üzerine önemli, D. hansenii Dh1 ve D. hansenii Dh3 ün oluşturduğu zon çapı üzerine önemsiz olduğu görülmüştür (Şekil.1, Şekil.1, Şekil.16, Şekil.17). 2 2 zon çapı (mm) 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi. 6

62 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ zon çapı (mm) C 2 C,,,,,, ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.1. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi. 2 zon çapı (mm) C,,,,,, 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.16. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi. 7

63 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Sonuçta, D. hansenii suşlarının, P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi olduğu belirlenmiştir. Fan ve Tian (2) ın yaptıkları farklı bir çalışmada, benzer olarak antagonistik özellikte olan Cryptococcus albidus un, Penicillium expansum üzerine antifungal etkisinin olduğunu göstermişlerdir. Mercier ve Jimenez (2) in yaptıkları bir çalışmada, Muscodor albus un Penicillium üzerine antifungal etkisinin olduğunu rapor etmişlerdir. Antagonistik maya olan Pichia anomala nın, tahılların depolanması sırasında, Penicillium roqueforti nin neden olduğu bozulmaları inhibe ettiği bulunmuştur (Druvefors, 2). Yapılan başka bir çalışmada ise, Cryptococcus laurentii nin Penicillium expansum üzerine antifungal etkisinin olduğu bildirilmiştir (Zhang ve ark, 27). Şekil.17. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in P. nalgiovense K2 üzerine antifungal etkisi.

64 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ.2.. Debaryomyces hansenii nin Aspergillus parasiticus K7 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, %, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve 1 C ve 2 C de A. parasiticus K7 (1 spor/ml) üzerine antifungal etkisi agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir (Çizelge.9). Çizelge.9. D. hansenii suşlarının farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi. K7 (A. parasiticus) Dh1 Dh2 Dh3 ph % NaCl 1 C 2 C 1 C 2 C 1 C 2 C. dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli ++ dirençli ++ dirençli dirençli dirençli ++++ dirençli ++++ dirençli ++ dirençli +++ dirençli +++ dirençli ++ (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas Elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde, A. parasiticus K7 nin tuzsuz ortamda D. hansenii suşlarının oluşturduğu antifungal etkiye karşı dirençli olduğu, ancak NaCl konsantrasyonu arttıkça bu antifungal etkiye dirençliliğin azaldığı görülmüştür. D. hansenii suşlarının, A. parasiticus K7 üzerine oluşturdukları antifungal etki sıcaklık arttıkça ve ph azaldıkça artış göstermiştir. D. hansenii Dh1, A. parasiticus K7 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii Dh2, A. parasiticus K7 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 1 C, % NaCl - ph., 1 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl - ph., 2 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında 9

65 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ göstermiştir. D. hansenii 3, A. parasiticus K7 üzerine en fazla antifungal etkiyi 17 mm zon çapıyla, ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii suşlarının farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisini belirlenmesi için yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, her üç D. hansenii suşunun da A. parasiticus K7 üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkisinin olduğu belirlenmiştir. Oluşan zon çapları üzerinde, tek başına NaCl, sıcaklık ve ph nın her üç D. hansenii suşu için, önemli olduğu (P<.) bulunmuştur (Şekil.1, Şekil.19, Şekil.2, Şekil.21). 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.1. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi.

66 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.19. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi. 2 zon çapı (mm) 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.2. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi 1

67 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Liu ve ark (2), yaptıkları benzer bir çalışmada, D. hansenii nin, süt ürünlerinde bozulmalara neden olan Aspergillus ve Penicillium küfleri üzerine antifungal etki gösterdiğini belirtmişlerdir. Bu çalışma da elde edilen bulgular, Penicillium ve Aspergillus açısından benzerlikler göstermektedir. Şekil.21. ph., %NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in A. parasiticus K7 üzerine antifungal etkisi..2.. Debaryomyces hansenii nin Aspergillus flavus K12 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, %, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve 1 C ve 2 C de, A. flavus K12 (1 spor/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir (Çizelge.1). 2

68 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Çizelge.1. D.hansenii suşlarının farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine karşı antifungal etkisi. K12 (A. flavus) Dh1 Dh2 Dh3 ph % NaCl 1 C 2 C 1 C 2 C 1 C 2 C. dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli ++ dirençli +++ dirençli ++ dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli +++ dirençli ++ dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli dirençli +++ dirençli ++ dirençli ++ dirençli +++ dirençli +++ dirençli ++ (+) Az dirençli; (++) Orta hassas; (+++)Hassas; (++++)Çok hassas Elde edilen sonuçlar genel olarak incelendiğinde, A. flavus K12 nin tuzsuz ortamda D. hansenii suşlarının oluşturduğu antifungal etkiye karşı dirençli olduğu, ancak NaCl konsantrasyonu arttıkça bu antifungal etkiye dirençliliğin azaldığı görülmüştür. D. hansenii suşlarının, A. flavus K12 üzerine oluşturdukları antifungal etki sıcaklık arttıkça ve ph azaldıkça artış göstermiştir. D. hansenii Dh1, A. flavus K12 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl ve ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii Dh2, A. flavus K12 üzerine en fazla antifungal etkiyi, ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir. D. hansenii Dh3 ise, A. flavus K12 üzerine en fazla antifungal etkiyi ph., 2 C, % NaCl ortam koşullarında göstermiştir D. hansenii suşlarının farklı ph, sıcaklık ve NaCl koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisini belirlenmesi için yapılan istatistiksel değerlendirme sonucunda, her üç D. hansenii suşunun da, A.flavus K12 üzerine farklı ortam koşullarında antifungal etkisinin olduğu belirlenmiştir. Oluşan zon çapları üzerinde, tek başına NaCl, sıcaklık ve ph nın her üç D. hansenii suşu için önemli olduğu (P<.) bulunmuştur (Şekil.22, Şekil.23, Şekil.2, Şekil.2) 3

69 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.22. D. hansenii Dh1 in farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi. 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.23. D. hansenii Dh2 nin farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi.

70 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ 2 zon çapı (mm) 2 1 1,,,,,, 1 C 2 C ph ve tuz konsantrasyonu (%) Şekil.2. D. hansenii Dh3 ün farklı ortam koşullarında A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi. Bu çalışmada D. hanseni nin, A. flavus K12 üzerine antifungal etkisinin olduğu bulunmuştur. Yapılan benzer bir çalışmada, D. hansenii mayasının, elmalarda çürüme etkeni olan Botrytis cinerea üzerine antifungal etki gösterdiği belirtilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları değerlendirildiğinde, D. hansenii mayasının, Aspergillus ve Penicillium küfleri dışında, gıdalarda bozulma etkeni olan farklı küfler üzerine de antifungal etki gösterebildiği kanıtlanmıştır (Wisnievwski ve ark, 1991). Ayrıca, Paster ve ark (1993) Pichia guiliermondii nin özellikle tahıllarda bozulmalara neden olan A. flavus üzerine antifungal etkisini ve Petersson ve Schnurer (199) ise, Pichia anomala nın, Aspergillus türleri üzerine antifungal etkisinin olduğunu yaptıkları çalışmada bulmuşlardır. Yapılan çalışmalar, D. hansenii nin, ortamda NaCl bulunduğunda diğer mikroorganizmaların gelişimini önleyici etkisinin olduğunu göstermiştir. Yapılan bu çalışmada da D.hansenii suşları ortamda NaCl bulunduğunda P. chrysogenum K9, P. chrysogenum K, P. nalgiovense K2, A. parasiticus K7 ve A. flavus K12 üzerine antifungal etki göstermiştir. (Breuer ve Harms, 26). Ayrıca P. chrysogenum K9, P. chrysogenum K, P. nalgiovense K2, A. parasiticus K7 ve A. flavus K12 nin

71 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ belirtilen ortam koşullarında antifungal etkileri karşılaştırıldığında, etki, NaCl konsantrasyonu yükseldikce artmıştır. Şekil.2. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in A. flavus K12 üzerine antifungal etkisi Debaryomyces hansenii nin Geotrichum klebahnii K13 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve sıcaklık 1 C ve 2 C de, Geotrichum klebahnii K13 (1 7 spor/ml) üzerine antifungal etkisi agar kuyu difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. G. klebahnii K13, % NaCl içeren ortam koşullarında gelişemediğinden dolayı, % NaCl içeren deneme ortamı iptal edilmiştir. Sonuç olarak, D. hansenii nin 3 farklı suşunun belirtilen ortam koşullarında G.klebahnii K13 üzerine antifungal etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Şekil.26). 6

72 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Chalutz ve ark (199), yapmış oldukları çalışmada, D. hansenii nin turunçgillerde çürümelere neden olan Geotrichum candidum üzerine antifungal etkisinin olduğunu bildirmişlerdir. Şekil.26. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in Geotrichum klebahnii K13 üzerine antifungal etkisi Debaryomyces hansenii nin Rhodotorula glutinis M1 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve sıcaklık 1 C ve 2 C de Rhodotorula glutinis M1 (1 7 kob/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. R. glutinis M1 % NaCl içeren ortam koşullarında gelişemediğinden dolayı, % NaCl içeren deneme ortamı iptal edilmiştir. D. hansenii suşlarının, belirtilen ortam koşullarında R. glutinis M1 e karşı antifungal etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Şekil.27). 7

73 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Şekil.27. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in Rhodotorula glutinis M1 üzerine antifungal etkisi..2.. Debaryomyces hansenii nin Candida rugosa M16 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun % ve % NaCl, ph.,. ve. ve sıcaklık 1 C ve 2 C de Candida rugosa M16 (1 7 kob/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. C. rugosa M16, % NaCl içeren ortam koşullarında gelişemediğinden dolayı % NaCl içeren deneme ortamı iptal edilmiştir. Sonuç olarak, D. hansenii suşlarının, belirtilen ortam koşullarında C. rugosa M16 üzerine antifungal etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Şekil.2).

74 . ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dicle DÖNMEZ Şekil.2. ph., % NaCl, 2 C koşullarında D. hansenii Dh1 in Candida rugosa M16 üzerine antifungal etkisi Debaryomyces hansenii nin Rhodotorula mucilaginosa 2 M71 Üzerine Antifungal Etkisi Debaryomyces hansenii nin 3 farklı suşunun, % ve % NaCl, ph.,. ve. ve sıcaklık 1 C ve 2 C de, Rhodotorula mucilaginosa 2 M71 (1 7 kob/ml) üzerine antifungal etkisi, agar kuyu difüzyon yöntemi ile araştırılmıştır. R. mucilaginosa 2 M71, % NaCl içeren ortam koşullarında gelişemediğinden dolayı, % NaCl içeren deneme ortamı iptal edilmiştir. Sonuç olarak, D. hansenii,suşlarının, belirtilen ortam koşullarında R. mucilaginosa 2 M71 üzerine antifungal etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Şekil.29). 9