PAXgene. Blood RNA Kiti El Kitabı. Haziran Sürüm (katalog no ) TR

Transkript

1 Haziran 2015 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 50 (katalog no ) Sürüm R TR PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon PreAnalytiX için QIAGEN GmbH tarafından üretilmiştir

2 Ticari markalar: PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company); Eppendorf (Eppendorf AG). PAXgene Blood RNA Kitleri tüm ülkelerde bulunmaz, lütfen soruşturun. Sınırlı Lisans Anlaşması Bu ürünün kullanılması PAXgene Blood RNA Kitinin herhangi bir alıcısı veya kullanıcısının aşağıdaki şartları kabul ettiği anlamına gelir: 1. PAXgene Blood RNA Kiti sadece PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabına göre kullanılabilir ve sadece Kit içindeki bileşenlerle kullanım için uygundur. PreAnalytiX, PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabında açıklanan ve adresinde verilen ek protokollerde kapsananlar haricinde bu Kite dahil edilmemiş herhangi bir bileşenle bu Kite dahil edilmiş bileşenleri kullanma veya birleştirme açısından fikri mülkiyeti altında herhangi bir lisans vermez. 2. Açıkça ifade edilen lisansların haricinde, PreAnalytiX bu Kitin ve/veya kullanımının/kullanımlarının üçüncü tarafların haklarını ihlal etmediğine ilişkin herhangi bir garanti vermez. 3. Bu Kit ve bileşenlerine sadece bir kerelik kullanım için lisans verilmiştir ve yeniden kullanılamazlar, yenilenemezler veya yeniden satılamazlar. 4. PreAnalytiX özellikle açıkça ifade edilenlerin haricinde açık veya zımni diğer lisansları kabul etmez. 5. Kitin alıcı ve kullanıcısı yukarıda yasaklanan herhangi bir eylemin yapılmasına yol açacak veya kolaylaştıracak herhangi bir eylemi yapmamayı yada yapılmasına izin vermemeyi kabul eder. 6. PreAnalytix herhangi bir mahkemede bu Sınırlı Lisans Anlaşmasının yasaklamalarını uygulattırabilir ve bu Sınırlı Lisans Anlaşmasını veya Kit veya bileşenlerine ilişkin fikri mülkiyet haklarından herhangi birisini uygulamak için herhangi bir davada avukatlık ücretleri dahil araştırma ve Mahkeme bedellerini geri alacaktır. Güncelleştirilen lisans şartları için adresine bakın. Şartlı Satış Mevcut ürün, ürünü bir PAXgene Blood RNA Tüpünde örnek toplama seyri sırasında oluşan nükleik asit komplekslerini işlemek için kullanmak üzere US-7,270,953, ve US-7,682,790 ve ayrıca EP B1 altındaki çeşitli talepler ve bu patent taleplerinin yabancı eşdeğerleri altında bir lisansla gelir PreAnalytiX GmbH, tüm hakları saklıdır. PreAnalytiX Company PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon İsviçre PreAnalytiX Distribütörleri PreAnalytiX ürünleri PreAnalytiX için QIAGEN veya BD tarafından üretilir ve PreAnalytiX için QIAGEN veya BD tarafından dağıtılır. Ürünler PreAnalytiX GmbH dan sipariş edilemez. Lütfen yerel PreAnalytiX dağıtıcınıza ilişkin irtibat bilgileri konusunda 70 sayfasına bakınız.

3 İçindekiler Kit İçeriği 4 Semboller 6 Saklama koşulları 8 Kullanım Amacı 8 Ürün Kullanımı Sınırlamaları 8 Kalite Kontrol 8 Teknik Yardım 9 Güvenlik Bilgileri 9 Giriş 12 İlke ve İşlem 12 Örnek toplama ve stabilizasyonu 12 RNA konsantrasyonu ve saflaştırılması 17 Manuel RNA saflaştırma 20 Otomatik RNA saflaştırma 31 Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Reaktifler 35 Önemli Notlar 37 QIAcube Kullanımı 37 QIAcube Başlatma 37 QIAcube üzerine protokollerin yüklenmesi 37 QIAcube cihazının yüklenmesi 38 Protokol: PAXgene Blood RNA Tüplerine (BRT) Toplanmış İnsan Tam Kanından Total RNA nın Manuel Saflaştırılması 48 Protokol: PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT) içinde toplanmış İnsan Tam Kanından Total RNA nın Otomatik Saflaştırılması 54 Sorun Giderme Kılavuzu 60 Ek A: RNA Muamelesiyle İlgili Genel Notlar 62 Ek B: Total RNA Miktarı ve Kalitesinin Belirlenmesi 63 Ek C: PAXgene Blood RNA Tüplerinin Kullanılması 65 Sipariş Bilgisi 66 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015 3

4 Kit İçeriği PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalog no Terkip sayısı 50 BR1 Resüspansiyon Tamponu RES BUF 20 ml BR2 Bağlayıcı Tampon* BIND BUF 18 ml BR3 Yıkama Tamponu 1* YIKAM BUF 1 45 ml BR4 Yıkama Tamponu 2 A YIKAM BUF 2 CONC 11 ml (konsantre) A BR5 Elüsyon Tamponu ELU BUF 6 ml RNFW PK RNaz İçermeyen Su (şişe) Proteinaz K (yeşil kapak) PEL YIKAM A PROTK 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml PRC PAXgene RNA Döndürme Kolonları (kırmızı) PAXgene RNA COL 5 x 10 PT İşleme Tüpleri (2 ml) PROC TUBE 6 x 50 Hemogard Secondary BD Hemogard Closures (Sekonder BD Hemogard Kapakları) SEC CLOS 50 MCT Mikrosantrifüj Tüpleri (1,5 ml) MIC TUBE 3 x 50, 1 x 10 RNFD DNaz I, RNaz içermeyen (liyofilize) DNA REM 1500 Kunitz ünitesi Tablo izleyen sayfada devam etmektedir. * Çamaşır suyu içeren dezenfektan reaktiflerle uyumlu değildir. Bir guanidin tuzu içerir. Güvenlik bilgisi için bakınız 9. 4 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

5 Yıkama Tamponu 2 (BR4) bir konsantre olarak sağlanır. İlk defa kullanmadan önce bir çalışma solüsyonu oluşturmak için şişede belirtildiği üzere 4 hacim etanol (%96 100, saflık derecesi p.a.) ekleyin. Kunitz üniteleri yaygın olarak DNaz I ölçümü için kullanılmaktadır. 25 C sıcaklıkta, ph 5,0 da substrat olarak yüksek ölçüde polimerize DNA kullanıldığında A260'ta mililitre başına dakika başına 0,001 artışa yol açan DNase I miktarı olarak tanımlanmaktadır (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 ve 363). PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalog no Terkip sayısı 50 RDD DNA Parçalama Tamponu (beyaz kapak) DNA DIG BUF 2 x 2 ml DRB Dnaz Resüspansiyon Tamponu (tüp, eflatun kapak) DNaz RES BUF 2 ml PSC PAXgene Shredder Spin Columns (PAXgene Parçalayıcı Döndürme Kolonları (eflatun) PAXgene PARÇA LAMA COL 5 x 10 El Kitabı PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı (Sürüm 2) 1 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015 5

6 Semboller <N> <N> test için yeterli reaktif içermektedir Kullanma talimatına başvurun Son Kullanma Tarihi İn vitro diagnostik tıbbi cihaz Katalog numarası Lot numarası Materyal sayısı Bileşenler Numara STERİL R KU Sterilizasyon yöntemi: Radyasyon kullanımı Kunitz üniteleri Ekleme İçindekiler Sulandırılmış Deoksiribonükleaz I Etanol Guanidin izotiyosiyanat 6 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

7 RNaz içermeyen DNaz Seti RNaz içermeyen DNaz Seti Global Ticaret Madde Numarası Yeniden kullanmayın Sıcaklık sınırlaması Üst sıcaklık sınırı Üretici Önemli not Şişeye etanol kattıktan sonra geçerli tarihi yazın Gelince Şuna neden olur PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015 7

8 Saklama koşulları PAXgene RNA döndürme kolonları (PRC), PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonları (PSC), proteinaz K (PK) ve tamponları (BR1, BR2, BR3, BR4 ve BR5) kit etiketinde belirtilen sıcaklıkta kuru olarak saklanabilir. DNaz I (RNFD), DNA parçalama tamponu (RDD) ve DNaz resüspansiyon tamponu (DRB) içeren RNaz İçermeyen DNaz Seti ortam sıcaklığında sevk edilmektedir. RNaz İçermeyen DNaz Setinin tüm bileşenlerini alınır alınmaz etiket üzerinde belirtilen sıcaklıkta saklayınız. Uygun şekilde saklandığında kit, kit kutusundaki son kullanma tarihine kadar stabildir. Kullanım Amacı PAXgene Blood RNA Kiti, PAXgene Blood RNA Tüpünde (BRT) toplanan tam kandan intraselüler RNA saflaştırma içindir. Kit, PAXgene Blood RNA Tüpü (BRT) ile birlikte kullanıldığında sistem moleküler diagnostik testlerde kullanılan RT- PCR için tam kandan saflaştırılmış intraselüler RNA sağlar. PAXgene Blood RNA Tüplerinin (BRT) kullanımı hakkında bilgi için PAXgene Blood RNA Tube Product Circular (PAXgene Blood RNA Tüpü Ürün Sirküleri) belgesine bakınız. PAXgene Blood RNA Sisteminin performans özellikleri sadece FOS ve IL1B gen transkriptleri ile belirlenmiştir. Diğer hedef transkriptler için uygun PAXgene Blood RNA Sistemi performans özelliklerini belirlemekten kullanıcı sorumludur. Ürün Kullanımı Sınırlamaları PAXgene Blood RNA Kitinin in vitro diagnostik uygulamalar için insan tam kanından (4,8 x ,1 x 10 7 lökosit/ml) intraselüler RNA'nın saflaştırılması için kullanılması amaçlanmıştır. İnsan tam kanındaki genomik DNA nın veya viral nükleik asitlerin saflaştırılması için değildir. Stabilizasyon spesifikasyonları için doğrulanmış sınırlı sayıda transkript nedeniyle (FOS ve IL1B gen transkriptleri) performans özellikleri tüm transkriptler için belirlenmemiştir. Laboratuvar personeli diğer transkriptler için doğrulama gerekip gerekmediğini belirlemek üzere üretici verilerini ve kendi verilerini gözden geçirmelidir. Kalite Kontrol QIAGEN in ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, her PAXgene Blood RNA Kiti tutarlı ürün kalitesinin temin edilmesi için önceden belirlenmiş özelliklere göre test edilmiştir. 8 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

9 Teknik Yardım QIAGEN deki teknik desteğimizin kalitesi ve her an hazır bulunması yönüyle kendimizle gurur duyuyoruz. Teknik Hizmet Bölümlerimiz moleküler biyoloji ve PreAnalytiX ürünlerinin kullanımı ile ilgili geniş pratik ve teorik uzmanlığa sahip deneyimli bilim adamlarından oluşmaktadır. PAXgene Blood RNA Kiti ile ilgili sorularınız için lütfen bizimle irtibata geçmekten çekinmeyiniz. Teknik yardım ve daha fazla bilgi için lütfen QIAGEN Teknik Servisini arayınız (bkz sayfa 70). Güvenlik Bilgileri Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Biyolojik veya kimyasal materyaller ile çalışırken enfeksiyon (örn. HIV veya hepatit B virüsleri nedeniyle) veya kişisel yaralanma risklerinden kaçınmak için daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için lütfen uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Bunlar bu kit için güvenlik veri sayfalarını bulabileceğiniz, görebileceğiniz ve yazdırabileceğiniz sayfasında kullanımı kolay ve kompakt PDF formatında bulunmaktadır. DİKKAT: Örnek hazırlama atık maddesine doğrudan çamaşır suyu veya asit solüsyonları KATMAYIN. Bağlama tamponu (BR2) ve yıkama tamponu 1 (BR3) çamaşır suyu ile birleştiğinde yüksek derecede reaktif bileşikler oluşturabilen guanidin tiyosiyanat içermektedir. Eğer Bağlama tamponu (BR2) ve yıkama tamponu 1 (BR3) dökülürse uygun laboratuvar deterjanı ve suyla temizleyin. Enfeksiyöz olabilecek ajanlar içeren sıvı dökülürse etkilenmiş bölgeyi önce laboratuvar deterjanı ve suyla ve sonra %1 (h/h) sodyum hipokloritle temizleyin. PAXgene Blood RNA Tüpünden (BRT) RNA stabilize edici solüsyon ve kan karışımı, 9 hacim RNA stabilize edici solüsyon ve kan karışımı başına 1 hacim ticari çamaşır suyu solüsyonu (%5 sodyum hipoklorit) kullanılarak dezenfekte edilebilir. RNA saflaştırma işlemindeki santrifüj basamaklarından süpernatanlar gibi örnek hazırlama atığının enfeksiyöz olabileceği kabul edilmektedir. Atılmadan önce atık herhangi bir enfeksiyöz materyal imha etmek üzere otoklava sokulmalı veya yakılmalıdır. Atma, resmi yönetmeliklere göre yapılmalıdır. PAXgene Blood RNA Kiti için aşağıdaki tehlike ve önlem ifadeleri geçerlidir. PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT) hakkında güvenlik bilgisi için PAXgene Blood PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015 9

10 RNA Tube Product Circular (PAXgene Blood RNA Tüpü Ürün Sirküleri) belgesine bakınız. Tampon BR2 İçindekiler: guanidin tiyosiyanat. Tehlike! Yutulursa zararlıdır. Cilde temas ederse veya solunursa zararlı olabilir. Şiddetli cilt yanıkları ve göz hasarına neden olur. Sudaki organizmalara uzun dönemli etkilerle zararlıdır. Asitlerle temas çok toksik gaz ortaya çıkarır. İçeriği/kabı onaylı bir atık atma tesisine atın. GÖZLERDEYSE: Suyla dikkatle birkaç dakika yıkayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. CİLTTEYSE (veya saçtaysa): Hemen tüm kontamine giysileri çıkarın. Cildi suyla yıkayın/duş alın. Hemen bir ZEHİR MERKEZİ veya doktoru arayın. Kilit altında saklayın. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysiler/ göz koruması/yüz koruması kullanın. Tampon BR3 İçindekiler: etanol; guanidin tiyosiyanat. Tehlike! Şiddetli cilt yanıkları ve göz hasarına neden olur. Yanıcı sıvı ve buhar. Asitlerle temas çok toksik gaz ortaya çıkarır. İçeriği/kabı onaylı bir atık atma tesisine atın. GÖZLERDEYSE: Suyla dikkatle birkaç dakika yıkayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. CİLTTEYSE (veya saçtaysa): Hemen tüm kontamine giysileri çıkarın. Cildi suyla yıkayın/duş alın. Hemen bir ZEHİR MERKEZİ veya doktoru arayın. Isı/kıvılcım/açık alevler/sıcak yüzeylerden uzak tutun. Sigara içmeyin. İyi havalandırılmış bir yerde saklayın. Serin tutun. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysiler/ göz koruması/yüz koruması kullanın. 10 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

11 DNaz I İçindekiler: Deoksiribonükleaz. Tehlike! Alerjik cilt reaksiyonlarına neden olabilir. Solunursa alerji veya astım belirtileri veya solunum zorluklarına neden olabilir. Tozu/buğuyu/gazı/dumanı/buharı/spreyi solumaktan kaçının. İçeriği/kabı onaylı bir atık atma tesisine atın. Solunum belirtileri yaşanıyorsa: Bir ZEHİR MERKEZİ veya doktoru arayın. SOLUNMUŞSA: Solunum zorsa kişiyi temiz havaya çıkarın ve solunum için rahat bir pozisyonda istirahatte tutun. Kontamine giysileri çıkarın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysiler/ göz koruması/yüz koruması kullanın. Solunum koruması kullanın. Proteinaz K İçindekiler: Proteinaz K. Tehlike! Hafif cilt tahrişine neden olur. Solunursa alerji veya astım belirtileri veya solunum zorluklarına neden olabilir. Tozu/buğuyu/gazı/dumanı/buharı/spreyi solumaktan kaçının. İçeriği/kabı onaylı bir atık atma tesisine atın. Solunum belirtileri yaşanıyorsa: Bir ZEHİR MERKEZİ veya doktoru arayın. SOLUNMUŞSA: Solunum zorsa kişiyi temiz havaya çıkarın ve solunum için rahat bir pozisyonda istirahatte tutun. Solunum koruması kullanın. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

12 Giriş Hücresel RNA nın incelenmesi için tam kan alımı birçok moleküler analizde ilk adımdır. Ancak, söz konusu deneylerdeki büyük bir problem in vitro hücresel RNA profilinin istikrarlı olmayışıdır. PreAnalytiX araştırmaları tam kandaki ayrı mrna türlerinin kopya sayısının oda sıcaklığında saklama veya nakliye sırasında 1000 kattan fazla değişebileceğini göstermiştir.* Bunun nedeni kan alınmasından sonra hızlı RNA degradasyonu ve belirli genlerin indüklenen ekspresyonudur. RNA ekspresyonu profilindeki bu tür değişiklikler gen ekspresyonunun güvenilir çalışmalarını imkansız hale getirir. Bu nedenle flebotomi sırasında ve sonrasında RNA ekspresyon profilini koruyan bir yöntem insan tam kanında gen ekspresyonunun doğru analizi için şarttır. İlke ve İşlem PreAnalytiX, intraselüler RNA saflaştırma için hızlı ve etkin bir protokolle birlikte insan tam kan numunelerinin toplanması, stabilize edilmesi, saklanması ve taşınmasını mümkün kılan yeni bir sistem geliştirmiştir. Sistem kan toplama ve RNA stabilizasyonu için PAXgene Blood RNA Tüplerinin (BRT; ABD Patentleri 6,602,718 ve 6,617,170) kullanılmasını ve sonrasında PAXgene Blood RNA Kiti kullanılarak manuel veya otomatik RNA saflaştırmayı gerektirmektedir. RNA kalitesi ve verimi açısından manuel ve otomatik protokoller önemli ölçüde eşdeğer performans sağlarlar. Manuel protokol (sayfa 20 30) ve otomatik protokol (sayfa 31 34) için performans verileri bu el kitabına dahil edilmiştir. Örnek toplama ve stabilizasyonu PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT), patentli RNA stabilizasyon teknolojisi temelinde şirkete özel bir reaktif bileşimi içerir. Reaktif bileşimi RNA moleküllerini RNaz tarafından degradasyondan korur ve gen ekspresyonunda ex vivo değişiklikleri minimuma indirir. PAXgene Blood RNA Tüplerinin (BRT) insan tam kanının alınması ve C de 3 güne kadar (Şekil 1 ve 2, sayfa 14 ve 15) veya 2 8 C de 5 güne kadar (Şekil 3 ve 4, sayfa 16 ve 17) hücresel RNA stabilizasyonu için kullanılması amaçlanmıştır. Mevcut veriler hücresel RNA'nın 20 C veya 70 C'de en az 8 yıl stabilizasyonunu göstermektedir. Daha uzun süreler boyunca stabiliteyi değerlendiren devam eden çalışmalar hakkında daha fazla bilgi için lütfen QIAGEN Teknik Servisi ile irtibat kurun. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, PAXgene Blood RNA Tüplerinde kan saklamanın uzun dönemli bir çalışması devam etmektedir. 12 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

13 RNA stabilizasyonunun fiili süresi hücresel RNA nın türüne göre ve kullanılan aşağı yönde uygulamaya göre değişebilir. Stabilizasyon spesifikasyonları için doğrulanmış sınırlı sayıda transkript nedeniyle (FOS ve IL1B gen transkriptleri) performans özellikleri tüm transkriptler için belirlenmemiştir. Laboratuvar personeli diğer transkriptler için doğrulama gerekip gerekmediğini belirlemek üzere üretici verilerini ve kendi verilerini gözden geçirmelidir. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

14 Saklama (gün) Saklama (gün) Şekil C deki kan örneklerinde RNA stabilitesi: FOS. Kan ikişer örnek halinde 10 donörden toplanmış ve belirtilen gün sayısı kadar C de saklanmış ve bunu total RNA saflaştırması takip etmiştir. A Kan PAXgene Blood RNA Tüplerinde (BRT) toplanmış ve saklanmış ve total RNA PAXgene Blood RNA Kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. B Kan antikoagülan olarak standart kan toplama tüplerinde toplanmış ve saklanmış ve total RNA silika membranı temelli RNA temizlemeyle standart organik ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. FOS için relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart sapmaları ile grafiğe konmuştur. Kesik çizgiler analizin ±3x toplam kesinliğine işaret etmektedir (2,34 C T ). 14 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

15 Saklama (gün) Saklama (gün) Şekil C deki kan örneklerinde RNA stabilitesi: IL1B. Kan toplanmış ve Şekil 1 de belirtildiği şekilde C de saklama sonrasında total RNA saflaştırılmıştır. IL1B'nin relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart sapmaları ile grafiğe konmuştur. Kesik çizgiler analizin ±3x toplam kesinliğine işaret etmektedir (1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

16 Saklama (gün) Saklama (gün) Şekil C deki kan örneklerinde RNA stabilitesi: FOS. Kan ikişer örnek halinde 10 donörden toplanmış ve belirtilen gün sayısı kadar 2-8 C de saklanmış ve bunu total RNA saflaştırması takip etmiştir. A Kan PAXgene Blood RNA Tüplerinde (BRT) toplanmış ve saklanmış ve total RNA PAXgene Blood RNA Kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. B Kan antikoagülan olarak standart kan toplama tüplerinde toplanmış ve saklanmış ve total RNA silika membranı temelli RNA temizlemeyle standart organik ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılmıştır. FOS için relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart sapmaları ile grafiğe konmuştur. Kesik çizgiler analizin ±3x toplam kesinliğine işaret 16 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

17 etmektedir (2,34 C T ). Saklama (gün) Saklama (gün) Şekil C deki kan örneklerinde RNA stabilitesi: IL1B. Kan toplanmış ve Şekil 3 te belirtildiği şekilde 2-8 C de saklama sonrasında total RNA saflaştırılmıştır. IL1B'nin relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT- PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler, gösterilen tüm örneklerin ortalama ve standart sapmaları ile grafiğe konmuştur. Kesik çizgiler analizin ±3x toplam kesinliğine işaret etmektedir (1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

18 RNA konsantrasyonu ve saflaştırılması PAXgene Blood RNA Kiti bir PAXgene Blood RNA Tüpünde (BRT) toplanmış 2,5 ml insan tam kanından total RNA nın saflaştırılması içindir. İşlem basittir ve manuel veya otomatik işlemler kullanılarak yapılabilir (bakınız akış şeması). Her iki protokolde saflaştırma nükleik asitleri PAXgene Blood RNA Tüpünde (BRT) pelet haline getirmek için bir santrifügasyon adımıyla başlar. Pelet yıkanır ve resüspansiyon yapılır ve sonrasında manuel veya otomatik RNA saflaştırma yapılır. Prensip olarak, her iki protokol aynı kit bileşenleriyle aynı protokol adımlarını izler. Manuel PAXgene Blood RNA İşlemi Kan Proteinaz K ve bağlama tamponu ekleyin İnkübe Edin PAXgene Parçalayıcı Döndürme Kolonuna aktarın Karıştır ın Akış kısmının süpernatanını mikrosantrifüj tüpüne aktarın Etanol ekleyin PAXgene RNA Döndürme Kolonuna yükleyin Peleti yıkayın Total RNA'yı bağlayın Yıkama Resüspansi yon yapın DNA'yı sindirin Mikrosantrifüj tüpüne aktarın Yıkama Elüsyon 65 C ye ısıtın Kullanıma hazır RNA 18 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

19 Otomatik PAXgene Blood RNA işlemi Kan Proteinaz K ve bağlama tamponu ekleyin İnkübe Edin Karıştırı n PAXgene Parçalayıcı Döndürme Kolonuna aktarın Akış kısmına etanol ekleyin Peleti yıkayın Resüspansiyo n yapın Mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve QIAcube sallayıcıya yükleyin PAXgene RNA Döndürme Kolonuna yükleyin Total RNA'yı Yıkama DNA'yı sindirin QIAcube üzerinde tam otomatik Yıkama PAXgene RNA Döndürme Kolonuna aktarın Elüsyon Mikrosantrifüj tüplerinin kapaklarını kapatın ve QIAcube sallayıcıya aktarın 65 C ye ısıtın Kullanıma hazır RNA PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

20 Manuel RNA saflaştırma Ayrıntı olarak, resüspansiyon yapılmış pelet, protein parçalanmasını sağlamak üzere proteinaz K(PK) ile birlikte optimize edilmiş tamponlarda inkübe edilir. Hücre lizatını homojenize etmek ve kalan hücre kalıntılarını gidermek üzere PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonu (PSC) üzerinde ek bir santrifügasyon yapılır ve akış fraksiyonunun süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Bağlama şartlarını ayarlamak için etanol eklenir ve bir PAXgene RNA döndürme kolonuna (PRC) lizat eklenir. Kısa bir santrifügasyon sırasında RNA, kontaminanların içinden geçmesi sırasında PAXgene silika membranına selektif olarak bağlanır. Kalan kontaminanlar birkaç etkin yıkama adımında giderilir. Birinci ve ikinci yıkama adımları arasında membrana bağlanmış DNA'nın eser miktarlarını gidermek üzere DNaz I (RNFD) uygulanır. Yıkama adımlarından sonra, RNA elüsyon tamponunda (BR5) elüsyona tabi tutulur ve ısıyla denatüre edilir. PAXgene Blood RNA Sistemi kullanılarak saflaştırılan total RNA yüksek ölçüde saftır. Manuel protokolü kullanarak beta aktin geninin bir sekansının kantitatif ve gerçek zamanlı PCR işlemiyle ölçüldüğü şekilde örneklerin %95'inde %1 (a/a) genomik DNA ve 1,8 ile 2,2 arasında A 260 /A 280 değerleri mevcuttur. Örneklerin en az %95 i elütün %30 una kadarı kullanılırken RT-PCR'de inhibisyon göstermez. Manuel protokol kullanılarak ortalama örnek hazırlama süresi (12 örnek hazırlamadan veriler temelinde) yaklaşık 90 dakikadır ve bunun sadece 40 dakikası orada bulunmayı gerektirir. 2,5 ml sağlıklı insan tam kanından RNA verimi işlenen örneklerin %95'i için 3 μg şeklindedir. Verimler donöre yüksek ölçüde bağımlı olduğundan bireysel verimler farklılık gösterebilir. Bireysel donörler için PAXgene Blood RNA sistemi yüksek ölçüde tekrar üretebilir ve tekrarlanabilir verimler (Şekil 5 ve 6, sayfa 21 ve 22) ve tekrar üretilebilir ve tekrarlanabilir RT-PCR (Şekil 7 ve 8, sayfa 28 ve 29) verir ve böylece klinik diagnostik testler için yüksek ölçüde güçlüdür. Şekil 5 (sayfa 21), PAXgene Blood RNA Sisteminin genel tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirliğini göstermektedir. Farklı PAXgene Blood RNA Kiti lotları ve farklı kullanıcıların RNA veriminin ve gerçek zamanlı RT-PCR performansının tekrar üretilebilirliği üzerine etkisini göstermek üzere ek çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalar için ayrı PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT) yerine birleştirilmiş kan örnekleri kullanıldığından sonuçlar sistemin ayrı kan alınmaları arasındaki oynama dahil olmak üzere tekrarlanabilirliğini yansıtmaz ve sadece örnek hazırlamanın tekrarlanabilirliğini yansıtır (bakınız Şekil 6, sayfa 22). 20 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

21 RNA verimi ortalaması (μg/2,5 ml kan) RNA verimi (μg/2,5 ml kan) Donör Donör Şekli 5. Tekrar üretilebilir ve tekrarlanabilir RNA saflaştırma. 14 donörden dörtlü kan örnekleri 3 teknisyenin (A, B, C) her biri tarafından manuel olarak işlenmiştir. Üç ekipman seti kullanılmış ve tek bir teknisyen tarafından hazırlanan tüm örnekler aynı ekipman kullanılarak işlenmiştir. A Aynı donörlerden ve farklı teknisyenlerle replikat örnek başına RNA veriminin ortalaması ve standart sapmaları gösterilmiştir. B 14 donörün her birinden 12 eşit kan örneği 3 farklı teknisyen tarafından işlenmiştir. Aynı donörlerden ve tüm teknisyenlerden örneklerin RNA veriminin ortalamaları ve standart sapmaları sunulmaktadır. Tüm RNA örnekleri için A 260 /A 280 oranları 1,8 ile 2,2 arasında değişmiştir. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

22 RNA verimi için CV (%) RNA verimi (μg/2,5 ml kan) Donör havuzu Donör havuzu Şekil 6. Birleştirilmiş kan örnekleri kullanılarak farklı operatörler ve PAXgene Blood RNA Kiti lotları için RNA veriminin tekrarlanabilirliği ve tekrar üretilebilirliği. PAXgene Blood RNA Tüplerine 30 farklı donörden kan örnekleri toplanmıştır (BRT; donör başına 12 tüp, toplam 360 tüp). 3 donörden tüplerin içeriği birleştirilmiş ve sonra 36 örneğe tekrar bölünmüştür. 3 donör havuzu başına bu 36 örnek 3 farklı operatör tarafından manuel olarak işlenmiştir. Her bir operatör ekstraksiyon için 3 farklı PAXgene Blood RNA Kiti kullanmış ve 10 donör havuzunun her birinden dörtlü örnekleri işlemiştir. A Her operatör-lot kombinasyonu için RNA verimi ve standart sapma. 10 donör havuzundan dörtlü kan örnekleri 3 farklı operatör (A, B, C) tarafından 3 kit lotunun (1,2,3) her biri ile işlenmiştir. Aynı donör havuzundan farklı operatör ve farklı kit lotu için dörtlü örnek başına ortalama verimler (kolonlar) ve standart sapmalar (hata çubukları) sunulmaktadır. B Tüm operatör lotu kombinasyonları (A,B,C, 1, 2, 3) için ortalama verim ile verimin standart sapmasından hesaplandığı şekilde donör havuzu başına RNA verimi için CV Şekil 6A da gösterilmiştir. 22 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

23 Tablo 1A. Seçilen donör havuzları için her lot içinde ve kullanıcı içinde tekrar üretilebilirlik (1, 6, 9, 10) Donör havuzu 1 5,1 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 6 6,5 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 9 8,4 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 10 10,2 x 10 6 hücre/ml Veri kombinasyonu Lot 1, kullanıcı A Lot 1, kullanıcı B Lot 1, kullanıcı C Lot 2, kullanıcı A Lot 2, kullanıcı B Lot 2, kullanıcı C Lot 3, kullanıcı A Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) 8,03 0,42 5 9,55 0, ,52 0,41 6 7,96 0,49 6 7,98 1, ,38 1, ,82 1, ,90 0,76 9 7,87 0, ,71 0, ,14 1, ,22 1, ,32 0, ,78 1, ,92 0,27 4 7,63 1, ,09 1, ,82 2, ,20 0, ,00 0,56 8 6,87 0, ,37 0,74 7 9,14 1, ,56 1, ,04 0, ,96 0,68 8 8,18 0,76 9 7,85 0,82 10 CV (%) Lot 3, kullanıcı 6,98 1, ,73 0, ,41 0, ,88 2,17 24 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

24 B Lot 3, kullanıcı C 8,78 0, ,59 1, ,78 0, ,88 0, PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

25 Tablo 1B. Seçilen donör havuzlarından (1, 6, 9, 10) her kullanıcı içinde ve tüm lotlar arasında tekrar üretilebilirlik. Donör havuzu 1 5,1 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 6 6,5 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 9 8,4 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 10 10,2 x 10 6 hücre/ml Veri kombinasyonu Kullanıcı A, tüm lotlar Kullanıcı B, tüm lotlar Kullanıcı C, tüm lotlar Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) 7,46 0, ,43 1, ,54 0, ,81 0, ,02 1, ,98 2, ,48 1, ,26 1, ,84 0, ,56 1, ,02 1, ,89 1,10 10 CV (%) Tablo 1C. Seçilen donör havuzlarından (1, 6, 9, 10) her lot içinde ve tüm kullanıcılar arasında tekrar üretilebilirlik. Donör havuzu 1 5,1 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 6 6,5 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 9 8,4 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 10 10,2 x 10 6 hücre/ml Veri kombinasyonu Ortalama verim SS (µg) CV (%) Ortalama verim SS (µg) CV (%) Ortalama verim SS (µg) CV (%) Ortalama verim SS (µg) CV (%) PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

26 Lot 1, tüm kullanıcılar Lot 2, tüm kullanıcılar Lot 3, tüm kullanıcılar (µg) (µg) (µg) (µg) 7,96 0,69 9 9,88 1, ,83 1, ,02 1, ,76 0, ,99 1, ,75 1, ,73 2, ,60 1, ,09 1, ,46 1, ,20 1, PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

27 Tablo 1D. Seçilen donör havuzlarından (1, 6, 9, 10) tüm lotlar ve tüm kullanıcılar arasında tekrar üretilebilirlik. Donör havuzu 1 5,1 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 6 6,5 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 9 8,4 x 10 6 hücre/ml Donör havuzu 10 10,2 x 10 6 hücre/ml Veri kombinasyonu Lot 1, tüm kullanıcılar Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) CV (%) Ortalama verim (µg) SS (µg) 7,44 1, ,66 1, ,35 1, ,99 1,80 20 CV (%) 4 temsili donör havuzunun ayrıntılı analizi. Havuzlar lökosit sayısına göre seçilmiştir ve normal lökosit sayımı aralığının (4,8 x ,1 x 10 7 lökosit/ml) üst, orta ve alt değerlerini yansıtmaktadır. Lökosit sayımı donör havuzu başına 3 donörden 3 lökosit sayımının ortalama değerini temsil etmektedir. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

28 Kullanıcı Kullanıcı Şekil 7. Kullanıcılar arasında RT-PCR tekrar üretilebilirliği. Gerçek zamanlı RT-PCR için Şekil 6'da tanımlanan deneyde saflaştırılmış RNA kullanılmıştır. A FOS ve B IL1B relatif transkript seviyeleri, dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler kullanıcı 1 değerlerine relatif olarak (10 donör havuzu x 3 kit lotu x 4 replikat = her gen için 120 veri seti) grafiğe konmuş ve ortalamalar (kırmızı çizgiler) ve standart sapmalar (siyah çubuklar) tüm örnekler için gösterilmiştir. Kesik çizgiler analizlerin ±3x total kesinliğine işaret etmektedir (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 28 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

29 Lot Şekil 8. Kit lotları arasında RT-PCR tekrar üretilebilirliği. Gerçek zamanlı RT-PCR için Şekil 6'da tanımlanan deneyde saflaştırılmış RNA kullanılmıştır. A FOS ve B IL1B relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Tüm örnekler için değerler kit lotu 1 değerlerine relatif olarak (10 donör havuzu x 3 kullanıcı x 4 replikat = her gen için 120 veri seti) grafiğe konmuş ve ortalamalar (kırmızı çizgiler) ve standart sapmalar (siyah çubuklar) tüm örnekler için gösterilmiştir. Kesik çizgiler analizlerin ±3x total kesinliğine işaret etmektedir (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). Lot PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

30 Tablo 2. Şekil 7 ve 8 den RT-PCR verilerinin özeti Test sistemi FOS/18S rrna analizi IL1B/18S rrna analizi Verilerin karşılaştırılması Ortalama ( C T ) ± SS ( C T ) Ortalama ( C T ) ± SS ( C T ) Her kullanıcı içinde ve tüm lotlar arasında tekrar üretilebilirlik Tüm kullanıcılar, lot 1 lot 1 Tüm kullanıcılar, lot 1 lot 2 Tüm kullanıcılar, lot 1 lot 3 0,00 0,00 0,00 0,00-0,03 0,48-0,07 0,66-0,21 0,52 0,11 0,71 Her kullanıcı içinde ve tüm lotlar arasında tekrar üretilebilirlik Tüm lotlar, kullanıcı A kullanıcı A Tüm lotlar, kullanıcı A kullanıcı B Tüm lotlar, kullanıcı A kullanıcı C 0,00 0,00 0,00 0,00-0,46 0,44-0,06 0,69-0,31 0,60-0,15 0,71 Kullanıcı: Çalışmayı yapan teknisyen. Lot: Çalışmada kullanılan kit lotu sayısı. SS: Standart sapma. Ortalama C T değerleri (N = 120) ve standart sapmalar Şekil 7 ve 8 de sunulan veriler için gösterilmektedir. 30 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

31 Otomatik RNA saflaştırma QIAcube kullanılarak örnek hazırlama manuel işlemle aynı adımları izler ve böylece PAXgene Blood RNA Kiti yüksek kalitede RNA saflaştırma için kullanılabilir. QIAcube hakkında daha fazla bilgi için QIAcube User Manual (QIAcube Kullanıcı Kılavuzu) ve adresine bakınız. Otomatik RNA saflaştırma protokolü 2 kısımdan (veya protokolden) oluşur, PAXgene Blood RNA Part A (PAXgene Blood RNA Kısım A) ve PAXgene Blood RNA Part B (PAXgene Blood RNA Kısım B) ve 2 kısım arasında kısa bir manuel işlem vardır. Santrifüje edilmiş, yıkanmış ve resüspansiyon yapılmış nükleik asit peleti (bakınız RNA konsantrasyonu ve saflaştırma, sayfa 18) PAXgene Blood RNA Tüpünden (BRT) QIAcube çalışma tablasında termosallayıcı içine yerleştirilmiş işleme tüplerine (PT) yerleştirilir. Operatör menüden PAXgene Blood RNA Part A protokolünü seçer ve başlatır. QIAcube protokolün elüsyon tamponunda (BR5) RNA elüsyonuna kadar olan adımlarını gerçekleştirir. Operatör saflaştırılmış RNA'yı içeren mikrosantrifüj tüplerini (MCT) QIAcube cihazının termosallayıcı ünitesi içine aktarır. Operatör menüden PAXgene Blood RNA Part B protokolünü seçer ve başlatır ve QIAcube tarafından ısı denatürasyonu yapılır. Ortalama örnek hazırlama süresi (12 örnek hazırlama temelinde) 125 dakikadır ve sadece 20 dakikası orada bulunmayı gerektirir. 2,5 ml sağlıklı insan tam kanından RNA verimi işlenen örneklerin %95'i için 3 µg şeklindedir. Şekil 9 (sayfa 32) 3 operatör tarafından 3 kit lotunda otomatik protokol kullanılarak hazırlanan toplam 288 örnekten RNA verimlerini göstermektedir. Ayrı PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT) yerine birleştirilmiş kan örnekleri kullanıldığından bu sonuçlar ayrı kan almaların tek örneklerinden beklenen RNA verimini yansıtmaz. Verimler donöre yüksek ölçüde bağımlı olduğundan ayrı verimler farklılık gösterebilir (Şekil 9, sayfa 32). PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

32 RNA verimi (μg/2,5 ml kan) Şekil 9. RNA verimi otomatik işleme. 48 farklı donörden kan örnekleri PAXgene Blood RNA Tüplerine (BRT; donör başına 6 tüp, toplam 288 tüp) toplanmıştır. 6 donörden tüplerin içeriği birleştirilmiş ve sonra 36 örneğe tekrar bölünmüştür. Bu 6 donörlük havuz başına 36 örnek 3 farklı operatör (A, B, C) tarafından işlenmiştir. Her operatör otomatik ekstraksiyon için 3 farklı lot (1, 2, 3) PAXgene Blood RNA Kiti kullanmış ve 8 donör havuzunun her birinden dörtlü örnekleri işlemiştir. Tüm ayrı örneklerin RNA verimleri her operatör-lot kombinasyonu için gösterilmiştir. Örneklerin en az %95 i elütün %30 una kadarı kullanılırken RT-PCR'de inhibisyon göstermez. Otomatik protokol kullanıldığında örnekler arasında çapraz kontaminasyon, aynı çalışmada RNA pozitif örneklerle (insan tam kanı) eşleştirilmiş RNA negatif örneklerde (su) beta globin ve FOS transkriptlerinin sekanslarının kantitatif, gerçek zamanlı RT-PCR işlemiyle ölçüldüğü şekilde saptanamaz. PAXgene Blood RNA Sistemi ve otomatik protokol ile saflaştırılan RNA RT-PCR inhibisyonunun olmaması ile gösterildiği gibi (yukarıya bakınız) ve 1,8 ile 2,2 arasında A 260 /A 280 değerleriyle gösterildiği şekilde yüksek ölçüde saftır. Genomik DNA tüm örneklerin %95'inde %1 (a/a) seviyesinde, beta aktin geninin bir sekansının kantitatif, gerçek zamanlı PCR işlemiyle ölçüldüğü şekilde bulunmaktadır. Şekil 10 ve 11, 3 operatör tarafından 3 kit lotuyla otomatik protokol kullanılarak hazırlanan toplam 288 örneğin relatif genomik DNA sı ve A 260 /A 280 değerlerini göstermektedir. 32 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

33 Genomik DNA (a/a) (%) RNA saflığı (A 260 /A 280 ) Şekil 10. RNA saflığı (A 260 /A 280 değerleri) otomatik işleme. RNA, 3 farklı operatör tarafından (A, B, C) Şekil 9'da tanımlanan deneyle PAXgene Blood RNA Kitinin 3 farklı lotu (1, 2, 3) kullanılarak saflaştırılmıştır. Tüm ayrı örneklerin A 260 /A 280 değerleri her operatör-lot kombinasyonu için gösterilmiştir. Şekil 11. RNA saflığı (% genomik DNA kontaminasyonu) otomatik işlem. RNA, 3 farklı operatör tarafından (A, B, C) Şekil 9'da tanımlanan deneyle PAXgene Blood RNA Kitinin 3 farklı lotu (1, 2, 3) kullanılarak saflaştırılmıştır. Her ayrı örnekteki genomik DNA miktarları (a/a) her operatör lot kombinasyonu için gösterilmiştir. PAXgene Blood RNA Sistemi kullanılarak otomatik RNA saflaştırma protokolü Şekil 12 de (sayfa 34) gösterildiği şekilde yüksek ölçüde tekrar üretilebilir ve tekrarlanabilir RT-PCR sonuçları verir ve böylece klinik diagnostik testler için yüksek ölçüde güçlüdür. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

34 Ortala ma Ortala ma Şekil 12. Otomatik ve manuel protokoller arasında RT-PCR tekrar üretilebilirliği. RNA, 3 farklı operatör tarafından (A, B, C) Şekil 10'da tanımlanan deneyle otomatik protokol kullanılarak PAXgene Blood RNA Kitinin 3 farklı lotu (1, 2, 3) kullanılarak saflaştırılmıştır. Paralel olarak RNA, manuel protokol kullanılarak karşılık gelen replikat tüplerden saflaştırılmıştır. A FOS ve B IL1B relatif transkript seviyeleri dahili standart olarak 18S rrna kullanılarak gerçek zamanlı dupleks RT-PCR ile belirlenmiştir. Her iki ekstraksiyon protokolü (otomatik ve manuel protokol) kullanılarak eşleştirilmiş kan örneklerinden hazırlanan RNA arasında transkript seviyelerinde olası farklılıklar C T yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Tüm örnek çiftlerinin (4 replikat x 8 donör havuzu x 3 kit lotu x 3 operatör = her gen için 288 çift) ayrı C T değerleri ayrı noktalar olarak grafiğe konmuş ve tüm örnekler için ortalamalar (daha büyük noktalar) ve standart sapmalar (siyah çubuklar) gösterilmiştir. Kesik çizgiler analizlerin ±3x total kesinliğine işaret etmektedir (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 34 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

35 Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Reaktifler Kimyasallarla çalışırken daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın. Daha fazla bilgi için ürün tedarikçisinden elde edilebilecek uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Tüm protokoller için PAXgene Blood RNA Tüpleri (BRT; kat. no ) Etanol (%96 100, saflık derecesi p.a.) Pipetler* (10 µl 4 ml) Steril, aerosol-bariyeri, RNaz içermeyen pipet uçları Dereceli silindir x g hızına ulaşabilecek ve PAXgene Blood RNA Tüplerini (BRT) tutmak için dışarı doğru açılır bir rotor ve kovalar içeren santrifüj* Vorteks karıştırıcı* Parçalanmış buz Etiketleme için silinmez kalem Manuel protokol için x g hızına ulaşabilecek ve 2 ml mikrosantrifüj tüpleri için bir rotorla donatılmış değişken hızlı mikrosantrifüj 55 C ve 65 C de inkübasyon yapabilen ve 400 devir/dk hızda 1400 devir/dk hızı geçmemek üzere sallayabilen sallayıcı-inkübatör* (örn., Eppendorf Thermomixer Compact veya eşdeğeri) * Cihazların üreticinin önerilerine göre düzenli olarak kontrol edildiği, bakımının yapıldığı ve kalibre edildiğinden emin olun. RNA muamelesi ile ilgili kılavuz ilkelere aşina olduğunuzdan emin olun (Ek A, sayfa 62). Tampon BR4 konsantresine etanol eklemek için. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

36 Otomatik protokol için QIAcube* (QIAGEN, kat. no [110 V], kat. no [230 V]) Makas QIAcube sarf malzemeleri Filtre Uçları, 1000 µl (1024) (QIAGEN, kat. no ) Reaktif Şişeleri, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. no ) Rotor Adaptörleri (10 x 24) (QIAGEN, kat. no ) QIAcube aksesuarları Reaktif Şişesi Rafı (QIAGEN, kat. no ) Rotor Adaptör Tutucu (QIAGEN, kat. no ) * Cihazların üreticinin önerilerine göre düzenli olarak kontrol edildiği, bakımının yapıldığı ve kalibre edildiğinden emin olun. Ayrıca Başlangıç Paketi, QIAcube içinde bulunmaktadır (QIAGEN, kat. no ). 36 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

37 Önemli Notlar QIAcube Kullanımı QIAcube kullanımına aşina olduğunuzdan emin olun. Lütfen QIAcube User Manual (QIAcube Kullanım Kılavuzu) ve QIAcube ile sağlanan herhangi bir ek bilgiyi otomatik PAXgene Blood RNA protokollerine başlamadan önce güvenlik bilgilerine özellikle dikkat ederek okuyun. QIAcube Başlatma QIAcube kapağını kapatın ve QIAcube'u güç anahtarıyla açın (bakınız Şekil 13, sayfa 38). Bir bip sesi duyulur ve başlangıç ekranı görülür. Cihaz otomatik olarak başlamaya hazırlama testlerini yapar. QIAcube üzerine protokollerin yüklenmesi QIAcube üzerinde ilk RNA hazırlama çalışmasının yapılabilmesinden önce bir başlangıç protokol yüklemesi gereklidir. Hem PAXgene Blood RNA Part A hem PAXgene Blood RNA Part B protokollerini yükleyin. Protokoller adresinde sağlanmaktadır ve QIAcube ile sağlanan USB belleğe indirilip QIAcube cihazına USB port yoluyla aktarılması gereklidir. Koruyucu panelin (bakınız Şekil 13, sayfa 38) arkasında bulunan USB portu QIAcube cihazının bir USB belleğe (QIAcube ile sağlanmıştır) bağlanmasını mümkün kılar. Günlük dosyaları veya rapor dosyaları gibi veri dosyaları da USB port yoluyla QIAcube cihazından USB belleğe aktarılabilir. USB port sadece QIAGEN tarafından sağlanan USB bellek ile kullanılmak üzeredir. Bu porta başka cihazlar bağlamayın. USB belleği, protokolleri indirirken veya veri dosyaları aktarırken veya bir protokol çalışması sırasında çıkarmayın. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

38 Şekil 13. QIAcube cihazının önden görünümü. 1 Dokunmatik ekran 4 Koruyucu panel arkasında USB portu 2 Kapak 5 Güç anahtarı 3 Koruyucu panel arkasında RS232 seri portu (sadece QIAGEN Cihaz Servisi Uzmanları tarafından kullanılmak üzeredir) 6 Atık çekmecesi QIAcube cihazının yüklenmesi Zamandan tasarruf etmek için yükleme şuradaki 10 dakikalık santrifügasyon adımlarının (adım 3 ve 5) biri veya her ikisi sırasında yapılabilir: Protokol: PAXgene Blood RNA Tüplerine (BRT) Toplanmış İnsan Tam Kanından Total RNA nın Otomatik Saflaştırılması, sayfa PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

39 Reaktif şişeleri 4 QIAcube reaktif şişesini Tablo 3'te liste halinde verilen reaktiflerle dikkatle doldurun (şişeleri reaktif şişelerindeki gösterge seviyesine kadar doldurun). Şişeler ve kapakları tampon adlarıyla dikkatle etiketleyin ve reaktif şişesi rafındaki uygun konuma yerleştirin (bakınız Şekil 14, sayfa 40). QIAcube üzerinde her çalışma öncesinde Tablo 3'te liste halinde verilen dört reaktif şişesini maksimum gösterge seviyesine kadar dikkatle doldurun veya bu mümkün değilse PAXgene Blood RNA Kitinde sağlanan tampon hacimlerinin izin verdiği seviyeye kadar doldurun. Şişeleri ve kapakları tampon adlarıyla dikkatle etiketleyin ve doldurulmuş reaktif şişelerini reaktif şişesi rafındaki uygun konumlara yerleştirin. Rafı QIAcube çalışma tablasına gösterildiği şekilde yükleyin (Şekil 14 ve 15, sayfa 40). Sağlanan Tampon BR2 hacmi bir reaktif şişesini gösterge seviyesine kadar doldurmayacaktır. Tampon BR3 ve BR4 önceki çalışmalarda çok sayıda örneğin işlenmesinden sonra şişeyi gösterge seviyesine kadar doldurmayabilir. Çalışma tablasına yerleştirmeden önce kapakları şişelerden çıkardığınızdan emin olun. PAXgene Blood RNA Kiti (50) içinde sağlanan tampon hacimleri QIAcube üzerinde maksimum 7 RNA hazırlık çalışması için yeterlidir. 50 örneğin tümünü işlemek için yeterli tampon hacimlerini mümkün kılmak üzere birkaç örnekle çok sayıda çalışmadan kaçınılmalıdır. Tablo 3. Reaktif şişesi rafında konumlar Konum Reaktif 1 Bağlama tamponu (BR2) 2 % etanol 3 Yıkama tamponu 1 (BR3) 4 Yıkama tamponu 2 (BR4)* 5 (boş bırakın) 6 (boş bırakın) * Yıkama tamponu 2 (BR4) bir konsantre olarak sağlanır. İlk defa kullanmadan önce bir çalışma solüsyonu oluşturmak için şişede belirtildiği üzere 4 hacim etanol (%96 100, saflık derecesi p.a.) ekleyin. A PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

40 Konum 1 Bağlama tamponu (BR2) Konum 2 % etanol Konum 3 Yıkama tamponu 1 (BR3) Konum 4 Yıkama tamponu 2 (BR4) B Konum 5 boş Konum 6 boş Şekil 14. Reaktif şişesi rafını yükleme. A Reaktif şişesi rafında şişelerin konumları ve içindekilerin şeması. B Rafı QIAcube üzerine yükleme Şekil 15. QIAcube cihazının iç görünümü. 1 Santrifüj kapağı 6 Mikrosantrifüj tüpü yuvaları 2 Santrifüj 7 Uç rafları 3 Sallayıcı 8 Uçlar ve kolonlar için atma yuvaları 4 Reaktif şişesi rafı 9 Robotik kol 5 Uç sensörü 40 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

41 Döndürme kolonları (PRC, PSC), mikrosantrifüj tüpleri (MCT) ve QIAcube plastik malzemesi QIAcube üzerine Filtre Uçları 1000 µl ile dolu 2 uç rafı yerleştirin (bakınız Şekil 15, sayfa 40). Rafları gerektiğinde uçlarla tekrar doldurun. Sadece QIAcube ile kullanılmak için tasarlanmış 1000 μl filtre uçlarını kullanın. Her örnek için rotor adaptörleri ve mikrosantrifüj tüplerini (MCT) silinmez bir kalem kullanarak işaretleyin. Kullanılacak PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonlarını (PSC) açın ve kapakları makas kullanarak tamamen kesip çıkarın (bakınız Şekil 16). QIAcube robotik tutucunun uygun çalışması için kapağı PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonlarına bağlayan tüm plastik kısımları ve kapakları tamamen çıkarın (PSC; bakınız Şekil 16). Aksi halde robotik kavrayıcı döndürme kolonlarını (PSC, PRC) uygun şekilde tutamaz. PAXgene RNA döndürme kolonunu (PRC), PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonunu (PSC, kapaksız) ve etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpünü (MCT) Tablo 4 ve Şekil 17'de gösterildiği gibi her etiketli rotor adaptöründe uygun konumlara yerleştirin (sayfa 42). Döndürme kolonu (PRC) ve mikrosantrifüj tüpü (MCT) kapaklarının Rotor adaptörünün kenarında yuvaların altına gidebildiği kadar itildiğinden emin olun yoksa santrifügasyon sırasında kapaklar kopacaktır. Kolon kapağı doğru şekilde çıkarılmış Kolon kapağı yanlış şekilde çıkarılmış; kapağın bir kısmı duruyor Şekil 16. Bir PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonunun (PSC) yüklenmesi. PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonu (PSC) rotor adaptörünün orta konumuna yüklenir. Kolonu (PSC) yüklemeden önce kapağı kesip çıkarın. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

42 Tablo 4. Rotor adaptöründe laboratuvar malzemesi Konum Reaktif Kapak konumu 1 PAXgene RNA döndürme kolonu (kırmızı, PRC) L1 2 PAXgene Parçalayıcı döndürme kolonu (eflatun, PSC) (rotor adaptörüne yerleştirmeden önce kapağı kesip çıkarın) 3 Mikrosantrifüj tüpü (MCT)* L3 * PAXgene Blood RNA Kitine dahil edilmiş mikrosantrifüj tüplerini (1,5 ml) kullanın. Şekil 17. Rotor adaptöründe konumlar. Rotor adaptöründe üç tüp konumu (1 3) ve üç kapak konumu (L1 L3) vardır. Santrifüjü yükleme Kurulu rotor adaptörlerini santrifüj kovalarına Şekil 18 (sayfa 43) içinde gösterildiği gibi yükleyin. 12 den az örnek işleniyorsa, santrifüj rotorunu radial olarak dengelenmiş şekilde yüklediğinizden emin olun (bakınız Şekil 19, sayfa 44). 12'den daha az sayıda örnek işlenecek olsa bile bir protokol çalışmasından önce tüm santrifüj kovaları monte edilmiş olmalıdır. Tek (bir) örnek veya 11 örnek işlenemez. 42 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

43 Şekil 18. Santrifüjü yükleme. Kurulu rotor adaptörlerini santrifüj kovaları içine yükleyin. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

44 2 örnek 3 örnek 4 örnek 5 örnek 6 örnek 7 örnek 8 örnek 9 örnek 10 örnek Şekil 19. Santrifüj ve sallayıcıyı yükleme. Santrifüj ve sallayıcı konumları, iki (2 örnek) ila on (10 örnek) örnekten işleme için gösterilmiştir. Bir veya 11 örnek işlenemez. 44 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

45 İşleme tüpleri (PT) Önceki çalışmalardan mikrosantrifüj yuvalarında bırakılmış herhangi bir işleme tüpünü (PT) çıkarın (bakınız Şekil 15, sayfa 40). 3 işleme tüpünü (PT) çalışmadaki örnek sayısına göre Tablo 5'te verilen reaktif miktarıyla doldurun. DNaz I inkübasyon karışımı için belirtilen DNA parçalama tamponu (RDD) hacmini bir işleme tüpüne (PT) pipetleyin ve belirtilen DNaz I (RNFD) stok solüsyonu hacmini ekleyin. Tüm karışımı bir 1000 µl pipet ucu kullanarak yukarı ve aşağı üç kez yavaşça pipetleyerek karıştırın. PAXgene Blood RNA Kitine dahil edilen 2 ml işleme tüplerini (PT) kullanın. Tüpleri (PT) reaktif adlarıyla açıkça etiketleyin ve bunları Tablo 6 da (sayfa 47). belirtildiği gibi mikrosantrifüj tüpü yuvalarında uygun konuma yerleştirin. DNaz I (RNFD) fiziksel denatürasyona özellikle duyarlıdır. Kırpmayı azaltmak üzere geniş açıklıklı pipet uçları kullanarak, sadece pipetlemeyle karıştırın. Vortekslemeyin. Tablo 5 te belirtildiği gibi sadece gereken hacmi pipetlediğinizden emin olun. Tablo 5. Mikrosantrifüj tüpü yuvaları için işleme tüplerinde gereken reaktiflerin hacmi Örneklerin sayısı Proteinaz K (PK) Belirtilen örnek sayısı için reaktif hacmi (μl) DNaz I inkübasyon karışımı (23 DNaz I Tampon RDD) Elüsyon tamponu (BR5) (33 DNaz I Tampon RDD) (42 DNaz I Tampon RDD) (51 DNaz I Tampon RDD) (60 DNaz I Tampon RDD) (69 DNaz I Tampon RDD) (78 DNaz I Tampon 831 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

46 RDD) (88 DNaz I Tampon RDD) (97 DNaz I Tampon RDD) (115 DNaz I Tampon RDD) PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015

47 Tablo 6. Mikrosantrifüj tüpü yuvaları İçindekiler Proteinaz K (PK) Konum A B C DNaz I inkübasyon karışımı Elüsyon tamponu (BR5) Kap İşleme Tüpü (PT)* İşleme Tüpü (PT)* İşleme Tüpü (PT)* * PAXgene Blood RNA Kitine dahil edilen 2 ml işleme tüplerini (PT) kullanın. PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/

48 Protokol: PAXgene Blood RNA Tüplerine (BRT) Toplanmış İnsan Tam Kanından Total RNA nın Manuel Saflaştırılması Başlamadan önce önemli noktalar Kit kutusunun sağlam ve hasarsız olduğundan ve tamponların sızmamış olduğundan emin olun. Hasarlı bir kiti kullanmayın. Bir pipet kullanırken doğru hacme ayarlandığından ve sıvının dikkatli ve tam olarak aspire edilip dağıtıldığından emin olun. Örnekleri yanlış tüp veya döndürme kolonuna aktarmaktan kaçınmak için tüm tüpler ve döndürme kolonlarının silinmez bir kalemle uygun şekilde etiketlendiğinden emin olun. Her tüpün (PT, MCT) kapağı ve gövdesini etiketleyin. Döndürme kolonları için işleme tüpünün (PT) gövdesini etiketleyin. Sıvı aktarıldıktan sonra her tüp veya döndürme kolonunu kapatın. İşlem sırasında örnekler veya tamponların dökülmesi RNA verimi ve saflığını azaltabilir. Aksi belirtilmediği sürece bu protokolün santrifüj adımları dahil olmak üzere tüm adımları oda sıcaklığında (15 25 C) gerçekleştirilmelidir. Nükleik asit amplifikasyonu teknolojilerinin hassasiyeti nedeniyle örneklerin muamelesi sırasında çapraz kontaminasyondan kaçınmak için şu önlemler gereklidir: Örneği kolon kenarını ıslatmadan dikkatlice döndürme kolonuna (PRC, PSC) pipetleyin. Sıvı transferleri arasında daima pipet uçlarını değiştirin. Aerosol bariyerli pipet uçları kullanın. Döndürme kolonu (PRC, PSC) membranına pipet ucu ile dokunmaktan kaçının. Bir mikrosantrifüj tüpünü (MCT) vorteksledikten veya ısıttıktan sonra kapağın içindeki damlaları gidermek için kısa süre santrifüje edin. Tüm işlem boyunca eldiven kullanın. Eldivenler ile örneğin teması durumunda eldivenleri hemen değiştirin. Mikrosantrifüje yerleştirmeden önce döndürme kolonunu (PRC, PSC) kapatın. İşlemde tanımlandığı şekilde santrifüje edin. Her defasında sadece bir döndürme kolonu (PRC, PSC) kullanın ve aerosoller oluşturmaktan kaçının. 48 PAXgene Blood RNA Kiti El Kitabı 06/2015