YATAY İNKÜBATÖRLER İÇİN KULLANDIĞIMIZ CO2 YETERİNCE TEMİZ Mİ? IN-LİNE FİLTRELERİN EMBRİYO GELİŞİMİNE ETKİSİ

Transkript

1 T.C. BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ LİSANSÜSTÜ EĞİTİM ENSİTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KLİNİK EMBRİYOLOJİ YÜKSEK LİSANS PROGRAMI YATAY İNKÜBATÖRLER İÇİN KULLANDIĞIMIZ CO2 YETERİNCE TEMİZ Mİ? IN-LİNE FİLTRELERİN EMBRİYO GELİŞİMİNE ETKİSİ Melek BOZKIZIL DANIŞMAN Dr. Öğr. Üyesi Murat Başar Aralık, 2020

2 T.C. BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ LİSANSÜSTÜ EĞİTİM ENSİTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KLİNİK EMBRİYOLOJİ YÜKSEK LİSANS PROGRAMI YATAY İNKÜBATÖRLER İÇİN KULLANDIĞIMIZ CO2 YETERİNCE TEMİZ Mİ? IN-LİNE FİLTRELERİN EMBRİYO GELİŞİMİNE ETKİSİ Melek BOZKIZIL TEZ DANIŞMANI: Dr. Öğr. Üyesi Murat Başar İKİNCİ DANIŞMAN: Prof. Dr. Tülay İrez Aralık, 2020

3 T.C. BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ LİSANSÜSTÜ EĞİTİM ENSTİTÜSÜ YÜKSEKLİSANS TEZ ONAY SAYFASI Anabilim Dalı Program : HİSTOLOJİ ve EMBRİYOLOJİ : KLİNİK EMBRİYOJİ Öğrencinin; Adı ve Soyadı : MELEK BOZKIZIL Öğrenci No : Danışman : DR. ÖĞR. ÜYESİ MURAT BAŞAR Biruni Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Enstitüsü Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalında Melek BOZKIZIL tarafından hazırlanan Yatay İnkübatörler İçin Kullandığımız CO2 Yeterince Temiz Mi? In-Line Filtrelerin Embriyo Gelişimine Etkisi adlı tez çalışması jüri tarafından YÜKSEK LİSANS tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 18 /12 /2020 Jüri Üyesinin Unvanı, Adı, Soyadı Çalıştığı Kurum İmza DR. ÖĞR. ÜYESİ MURAT BAŞAR BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ DOÇ. DR. NAZLI ECE ORDUERİ DR. ÖĞR. ÜYESİ NECATİ FINDIKLI BİRUNİ ÜNİVERSİTESİ BEYKENT ÜNİVERSİTESİ Biruni Üniversitesi Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliği nin ilgili maddeleri uyarınca bu tez jüri tarafından onaylanmış ve Lisansüstü Eğitim Enstitüsü Yönetim Kurulu kararıyla kabul edilmiştir. Prof. Dr. Leman ŞENTURAN Lisansüstü Eğitim Enstitüsü Müdürü ENST.FR.03 Yayın Tarihi: Rev: 00

4 iii BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün aşamalarda etik dışı herhangi bir davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, çalışma ile elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve kaynaklar listesi şeklinde eklediğimi, patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığını beyan ederim. Melek BOZKIZIL

5 iv TEŞEKKÜR Tez çalışmamın başından itibaren en büyük katkıyı ve desteği gösteren saygıdeğer hocalarım ve tez danışmanlarım Dr. Öğr. Üyesi Murat BAŞAR ve Prof. Dr. Tülay İREZ başta olmak üzere Biruni Üniversitesi Klinik Embriyoloji Tezli Yüksek Lisans Programı ndaki bu aşamaya gelebilmemde emeği geçen tüm hocalarıma, her zaman yanımda olup bana güvenen, beni daima destekleyen babam Abubekir Bozkızıl a, annem Nurpınar Bozkızıl a ve kardeşlerime, hiçbir zaman sıkılmadan beni dinleyen her konuda yardımıma koşan değerli arkadaşım Merve Hazır Karakurt a, tezimi yazarken benden yardımlarını esirgemeyen, bana büyük sabır gösteren Selva Nur Öztürk e, ne zaman yardıma ihtiyacım olsa kendi işi gibi koşturan arkadaşım Sümeyye Bölükbaşı na saygılarımı ve teşekkürlerimi sunarım. Melek Bozkızıl

6 v İÇİNDEKİLER İÇ KAPAK TEZ ONAY SAYFASI... iii BEYAN... iii TEŞEKKÜR... iv İÇİNDEKİLER...v SİMGE/SEMBOL ve KISALTMALAR LİSTESİ... vii TABLO LİSTESİ... viii ŞEKİL LİSTESİ... ix TÜRKÇE ÖZET ve ANAHTAR KELİMELER...x İNGİLİZCE ÖZET ve ANAHTAR KELİMELER... xi 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Embriyo Gelişimi Dişi Üreme Hormonları HCG (İnsan Koryonik Gonadotropin) RH (Relasing Hormone) FSH (Follicle Stimulating Hormone): LH (Luteinizing Hormone) LTH (Prolaktin) IVF Laboratuvarında Embriyo Takibi Yumurta Uyarma İşlemi Yumurta Toplanması Yumurtaların Sperm ile Döllenmesi (Mikroenjeksiyon) Embriyo Gelişimi ve Transferi Embriyo Kültürü Filtre Sistemleri: Filtre Mekanizmaları Elek Etisi: Atalet Etkisi Yakalama Etkisi Difüzyon Etkisi HEPA Filtre... 13

7 vi Uçucu Organik Bileşik (VOC) Tutucu Filtre İnkübatör Endoplazmik Retikulum ve Katlanamayan Protein Cevabı GRP GEREÇ VE YÖNTEM Hasta Seçimi Ve Çalışma Planı Hasta Seçimi Çalışmada Kullanılan Yöntemler Embriyo Kalitesinin İncelenme Kriterleri; Hayvan Seçimi ve Çalışma Planı Morfolojik İnceleme İçin Embriyoların Elde Edilmesi Western Blot Yöntemi Kullanılan İnkübatör BULGULAR TARTIŞMA, SONUÇ VE ÖNERİLER Tartışma Sonuç ve Öneriler KAYNAKLAR EKLER Ek 1: Etik Kurul Onayı Ek 2: Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Onayı Ek 3: Hastane İzin Belgesi Ek 4: Gaz Analiz Raporu ÖZGEÇMİŞ İNTİHAL RAPORU... 68

8 vii SİMGE/SEMBOL ve KISALTMALAR LİSTESİ ER Endoplazmik Retikulum FSH Follicle Stimulating Hormone (Folikül Uyarıcı Hormon) GRP78 Glukoz Protein 78 HCG Human Chorionic Gonadotropin (İnsan Koryonik Gonadotropin) HEPA High Efficiency Particulate Arresting (Yüksek Verimli Partikül Yakalayıcı) ICSI Intra Citoplasmic Sperm Injection (Mikroenjeksiyon) IVF In Vitro Fertilization LH Luteinizing Hormone (Luteinize Edici Hormon) LTH Prolaktin MII Metefaz 2 RH Relasing Hormone UPR Unfolded Protein Response (Katlanamayan Protein Cevabı) VOC Volatile Organic Compounds (Uçucu Organik Bileşikler) WHO World Health Organization (Dünya Sağlık Örgütü)

9 viii TABLO LİSTESİ Tablo No Tablo Adı Sayfa No Tablo 2.1 Tablo 4.1 Tablo 4.2 Laboratuvarlarda ki hava kalitesinin IVF sonuçlarına etkisini gösteren bazı çalışmaların özeti (Alıntı: Air quality control in the ART laboratory is a major determinant of IVF success.) Laboratuvarda kullanılan CO2 gazının filtre eklenmeden ve eklenerek ölçülen safsızlık oranları Grup 1 ve Grup 2 de üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kalitelerinin karşılaştırılması

10 ix ŞEKİL LİSTESİ Şekil No Şekil Adı Sayfa No Şekil 1.1 İnfertilite Nedenleri... 2 Şekil 2.1 Blastokist oluşumu 5 Şekil 2.2 Elek Etkisi. 11 Şekil 2.3 Atalet Etkisi.. 12 Şekil 2.4 Yakalama Etkisi 12 Şekil 2.5 Difüzyon Etkisi. 13 Şekil 2.6 Karbon filtrasyonu nun yardımcı üreme teknolojisine etkisi Şekil 2.7 Katlanmamış Protein Yanıtı.. 20 Şekil 2.8 UPR yolakları. (Rutkowski ve Kaufman, 2004) Şekil 4.1 Toplam gaz miktarına göre safsızlıkların yüzdesi. Kırmızı işlem görmeden önce ve mavi işlem gördükten sonra Şekil gün embriyo kalitelerinin ekstra filtre olmayan (Grup 2) ve olanlara (Grup 1) göre oranları * p< Şekil 4.3 Grup 1 ve Grup 2 blastosist oranları * p< Şekil 4.4 GRP78 seviyeleri. * p<

11 x TÜRKÇE ÖZET ve ANAHTAR KELİMELER Bozkızıl, M., (2020). Yatay İnkübatörler İçin Kullandığımız CO2 Yeterince Temiz Mi? In-Line Filtrelerin Embriyo Gelişimine Etkisi. Yükseklisans Tezi, Biruni Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Enstitüsü, İstanbul. Bu tez çalışmasında laboratuvarlardaki yatay inkübatörlerde kullanılan CO2 in yeterince temiz olup olmadığı ve In-Line filtrelerin embriyo gelişimine etkileri incelenmiştir. Çalışmamızda CO2 gazının saflığının, embriyo kalitesine etkisini incelemek üzere 35 yaşından genç çiftlerin ICSI tedavisi sonrası 2PN görülen embriyoları kendi içlerinde (kardeş embriyolar) ekstra filtre olan (Grup 1) ve olmayan (Grup 2) şeklinde iki gruba ayrılarak takip edildi. Bu gruplar arasında ki üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kaliteleri incelendi. Ayrıca 3 farklı filtre (CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter) embriyo kalitesine etkileri yönünden incelendi. Hayvan deneyleri kısmında ise 10 haftalık dişi BALB/C fareler (n=10) FSH+hCG (5 IU, i.p.) ile uyarılarak yetişkin erkek fareler ile bir araya konuldu. 24 saat sonra vaginal plak görülen fareler sakrifiye edilerek 1-hücreli embriyolar toplandı, ekstra filtre olan ve olmayan inkübatörlerde takip edildi. Western blot yöntemiyle GRP78 seviyesi incelenmek üzere işleme alındı. İstatistiksel analiz Student s t-test ve ANOVA yöntemleri kullanılarak yapıldı ve p<0,05 anlamlı olarak kabul edildi. Sonuç olarak; bu çalışma da IVF laboratuvarında kullanılan CO2 gazların bildirildiği kadar temiz olmadığını ve bu olumsuzluğun ekstra filtre takılarak giderilebileceğini, buna bağlı olarak da stresin azalacağı ve embriyo kalitesinin artacağını gösterilmiştir. CO2 safsızlığının embriyo gelişimi üzerine etkisini Katlanamayan Protein Cevabı (UPR) üzerinden gerçekleştiğini öngörmekteyiz. Anahtar Kelimeler: GRP78, In-Line filtre, in vitro fertilizasyon, Katlanamayan Protein Cevabı, Western Blot

12 xi İNGİLİZCE ÖZET ve ANAHTAR KELİMELER Bozkizil, M., (2020). Is the CO2 Which Is We Use for Horizontal Incubators Clean Enough? The Effect of In-Line Filters on Embryo Development. Master Thesis, Biruni University Graduate Education Institute, Istanbul. In this thesis, whether CO2 used in horizontal incubators that is clean enough and the effects of In-Line filters on embryo development were investigated. In our study, to examine the effect of the purity of CO2 gas on the quality of the embryo, the embryos were seen 2PN after ICSI treatment of couples younger than 35 years old were divided into two groups as internal filters with extra filters (Group 1) and without (Group 2) additional filters. Embryo quality was examined on the third and fifth days between these groups. Also, three different filters (CODA XTRA INLINE FILTERS - BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter) were examined for their effects on embryo quality. In animal experiments, tenweek-old female BALB / C mice (n = 10) were stimulated with FSH + hcg (5 I.U., i.p.) and put together with adult male mice. After 24 hours, mice with a vaginal plaque were sacrificed, and 1-cell embryos were collected, followed by with extra filters and without additional filters incubators. With the Western Blot method, the GRP78 level was processed for examination. Statistical analysis was done using Student's t-test and ANOVA methods, and p <0.05 was considered significant. As a result; In this study, it has been shown that the CO2 gases used in the IVF laboratory are not as clean as reported, and this negativity can be eliminated by installing extra filters, therefore, the stress will decrease and the embryo quality will increase. We anticipate that the effect of CO2 impurity on embryo development occurs via the Unfolded Protein Response (UPR). Key words: UPR, GRP78, In-Line Filter, IVF, Western Blot

13 1. GİRİŞ VE AMAÇ İnsan gelişimi birbirini takip eden bir süreçtir. Başarılı bir hamilelik birkaç farklı aşamadan geçer. Bu süreç dişiden gelen oositin erkekten gelen sperm tarafından tuba uterinada döllenmesi sonucunda başlar ve zigot meydana gelir. Elde edilen zigot bölünür ve gelişimin beşinci gününde blastokist oluşur. Blastokist uterusun posterosuperior duvarına implante olur. İmplante olan blastokist, fetüse dönüşür. Bu sürecin herhangi bir noktasında başarılı bir hamileliği engelleyen sorunlar ortaya çıkabilir ve hamilelik gerçekleşmeyebilir (Janny and Menezo, 1996; İrez ve Erkan, 2016). İnfertilite, bir çiftin herhangi bir doğum kontrol yöntemi kullanmaksızın 12 ay veya daha uzun bir süre boyunca gebe kalamaması olarak tanımlanmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) nün infertilite tanımında ise bu süre 2 yıla kadar uzatılmaktadır. Herhangi bir doğum kontrol yöntemi kullanmayan, sağlıklı çiftlerin yaklaşık %85-90 ının 1 yıl içinde gebe kalması beklenir. İnfertilitenin görülme sıklığı, ülkeden ülkeye, bölgeden bölgeye değişmekle birlikte, gelişmiş ülkelerde çiftlerin yaklaşık %8-10 unda, gelişmekte olan ülkelerin ise %15-20 sinde infertilite görülmektedir (Denson, 2006). Çiftlere infertilite tanısı konulabilmesi için hem kadın hem de erkeğin değerlendirilmesi gerekir. İnfertilite nedenlerinin %40 ı erkek kaynaklı, %40 ı kadın kaynaklı, %10 u ise her iki çifte bağlı olarak geliştiği ve %10 unun da açıklanamayan olgular olduğu düşünülmektedir (Tanoomand et al., 2019). 1

14 Her İki Çifte Bağlı 10% Açıklanamayan Nedenler10% Kadın Kaynaklı 40% Erkek Kaynaklı 40% Kadın Kaynaklı Her İki Çifte Bağlı Erkek Kaynaklı Açıklanamayan Nedenler Şekil 1.1: İnfertilitede Problemlerin Dağılım Yüzdesi İnfertilite tanısı konan çift tüp bebek tedavisine alınır. Başarılı bir tüp bebek tedavisinde en önemli faktörlerden birisi de laboratuvar şartlarıdır. Embriyoların iyi gelişimi için onlara sunulan 37 C ye sabitlenmiş inkübatör içi kapalı ortamının CO2 seviyesinin de düzenli takibi gerekmektedir. İnkübatörlerin CO2 gaz takipleri de kesintisiz olarak kalite kontrol ve alarm sistemi ile takip edilmektedir. İnkübatör içi CO2 düzeyini kontrol etmekte ki amaç embriyoların büyümesini sağlayan sıvı ortamın ph ını dengede tutmaktır. Embriyo kültüründe kullanılan sıvı besi ortamlarının asitbaz oranlarını dengelemek için bikarbonat tamponu kullanılmaktadır ve bu tampon ortamda bulunan CO2 gaz seviyesinden etkilenir. Sonuç olarak sıvı besinin ph ı ortamın CO2 gaz oranına bağlıdır ve embriyoların kültür ortamlarının dengede tutulması için IVF laboratuvarlarında CO2 ölçümleri ve ph ölçümleri düzenli olarak yapılmalıdır (Ozawa et al., 2006; Tarahomi et al., 2018). Embriyo kültürü için en uygun ortamı oluşturmak, embriyo canlılığını sağlamak ve böylece istikrarlı hamilelik sonuçlarını korumak için önemlidir. Hava kalitesi, sıcaklık ve ışık gibi çeşitli faktörlerin oositleri ve embriyoları etkilediği bilinmektedir (Hill, 2001; Swain, 2010; Wale and Garner, 2016; Tarahomi et al., 2018; Chansel-Debordeaux et al., 2018). Hamilelik oranları düşmeye başladığında, hava kalitesinin gözden kaçırılması kolaydır. Fakat başarılı bir tüp bebek laboratuvarında en önemli faktörlerden birisi ortamdaki havanın temizliğidir. 2

15 Ortamda Uçucu Organik Bileşikler (VOC), mikrop ve parfüm gibi maddelerin bulunması in vitro embriyo gelişimi için son derece zararlıdır (Hall et al., 1998; Ritz and Wilhelm, 2008; Khoudja et al., 2012; Mortimera et al., 2018). Bundan dolayı tüp bebek laboratuvarlarında HEPA (High Efficiency Particulate Arresting - Yüksek Verimli Partikül Yakalayıcı) filtre sistemleri, CODA sistemleri gibi sistemler kullanılarak ortamdaki havanın temizliğinin en üst seviyede kalmasına çalışılmaktadır. IVF ortamındaki hava filtrasyonunun en önemli amacı, yüksek verimli filtrasyon sistemlerinin kullanılmasıyla zararlı parçacıklarının sayısının azaltılmasıdır. Bu önemlidir çünkü mikroorganizmalar kendilerini bu parçacıklara ekleyebilirler. Havadaki partiküllerin uzaklaştırılması, artan verimlilikteki bir dizi filtre yoluyla pozitif hava basıncı kullanılarak havanın zorla hareketi ile sağlanır (Sene et al., 2009; Morbeck, 2015). Öte yandan, VOC'ler, HEPA filtrelerin etkili gözenek boyutundan çok daha küçüktür bu yüzden yakalanamazlar (Khoudja et al., 2012). Laboratuvarda kullanılan malzemeler ve temizlik ajanları tarafından sürekli olarak üretilen uçucu organik bileşikler, iç mekân ozonuyla reaksiyona girer. Bu kimyasal reaksiyonlar, daha düşük IVF sonuçlarıyla ilişkilendirilen mikron altı boyutlu parçacıklar ve zararlı yan ürünler üretir (Little and Mirkes, 1990; Cohen et al., 1997; Cecchi et al., 1998; De Los Santos et al., 1999; Ritz and Wilhelm, 2008; Simopoulou et al., 2018). VOC ler, CO2 gaz silindirleri, hava kontrol sistemleri, soğutma gazı, temizlik malzemeleri, plastik kaplar, inşaat malzemeleri ve mobilyalarda bulunabilir. Embriyonik büyüme ve gelişme sırasında, VOC'ler doğrudan DNA'ya bağlanır ve büyümeyi durdurur. Epizodik hava kirliliğinin, insan sperminde semen kalitesinde başka değişiklikler olmadan artan DNA parçalanması ile ilişkili olduğu daha önce yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Little and Mirkes, 1990; Meng and Zhang, 1990; Evenson et al., 2005; Dadvand et al., 2011). Birçok çalışma, IVF laboratuvarının havasında bulunan az miktarda VOC'nin bile gebelik oranlarını olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermiştir (Boone et al., 1999; Dickey et al., 2010). CO2 gazının saflığı incelenerek bunun embriyo kalitesine etkisini incelemek üzere, Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi ne infertilite nedeniyle başvuran 35 yaşın altındaki 30 çiftin ICSI tedavisi sonrası döllenen (2PN) embriyolar ekstra filtre olan ve olmayan şeklinde iki gruba ayırarak takip edildi. Daha sonra bu 3

16 gruplara ait 3. gün ve 5. gün embriyo kaliteleri incelendi. Ayrıca 3 farklı filtrenin (CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter) embriyo kalitesine etkileri yönünden incelendi. Deneysel kısım için 10 haftalık dişi BALB/C fareler (n=10) FSH+hCG (5 IU, i.p.) ile uyarılarak yetişkin erkek fareler ile bir araya konuldu. 24 saat sonra vaginal plak görülen fareler sakrifiye edilerek 1-hücreli embriyolar toplandı, Grup 1 ve Grup 2 inkübatörlerde takip edildi. Beşinci gün sonunda embriyolardaki GRP78 seviyesi Western blot incelenmek üzere işleme alındı. İstatistiksel analiz Student s t-test ve ANOVA yöntemleri kullanılarak yapıldı. Yaptığımız bu çalışmada tüp bebek laboratuvarında kullanılan CO2 gazının saflığını ve bunun embriyo kalitesine etkisini inceleyerek; embriyo toksik madde içeren gazların süzülmesinde yatay inkübatörlerde bulunan filtrelerin yetersiz olacağını, ekstra filtre eklendiğinde embriyo kalitesinin artacağını ve bunda da Katlanamayan Protein Cevabı nın rolünün olabileceğini göstermek amaçlanmıştır. 4

17 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Embriyo Gelişimi Döllenme, sperm hücresinin başarıyla bir yumurta hücresine (ovum) girerek birleşmesiyle oluşur. Spermin ve yumurtanın genetik materyali daha sonra zigot adı verilen tek bir hücre oluşturmak üzere birleşir ve gelişimin germinal aşaması başlar. İnsandaki embriyonik gelişim, gelişimin ilk sekiz haftasını kapsar. Dokuzuncu haftanın başından itibaren embriyoya fetüs adı verilir. Gebeliğin normal dönemi dokuz ay veya 38 haftadır (Janny and Menezo, 1996). Germinal evre; döllenmeden, erken embriyonun gelişimine kadar uterusta implantasyon tamamlanıncaya kadar geçen süreyi ifade eder. Germinal evre yaklaşık 10 gün sürer. Bu aşamada, hücre mitoz bölünme ile bölünmeye başlar. Bölünme ile üretilen her bir hücreye blastomer denir ve bir blastomer kümesi (16-32 blastomer) morulayı oluşturur. Morula içine sıvı birikmesiyle birlikte blastokist boşluğu oluşur ve artık blastokist olarak adlandırılır. İlk haftanın sonunda, blastokist uterus duvarına implante olur (Şekil 2.1). Blastokist embriyonun blastula aşamasıdır. Embriyoda ikinci gelişim aşaması gastrulasyondur. Gastrulasyon, genelde döllenmeden 9 gün sonra başlar. Bu aşamada üç tabakalı embriyo oluşur. Bu embriyonik tabakalar farklılaşarak özgül organ sistemlerini oluşturur. Gelişmekte olan embriyoda doku ve organlar hücre şekillerinin değişimine, hücre göçüne ve programlanmış hücre ölümüne bağlı olarak şekillenir (Janny and Menezo, 1996, İrez ve Erkan, 2016). Şekil 2.1: Blastokist oluşumu 5

18 Embriyonik dönemin sona ermesiyle, tüm organ sistemleri ilkel olarak yapılandırılmıştır, fakat organların kendisi ya işlevsel değildir ya da sadece yarı işlevseldir Dişi Üreme Hormonları Hipotalamustan: RH Hipofizden: FSH, LH, LTH HCG (İnsan Koryonik Gonadotropin): İnsan koryonik gonadotropini, glikoprotein yapıdadır. İnsan embriyosunu çevreleyen trofoblast hücreleri tarafından üretilir. Bebeğin rahim içine tutunmasını sağlayan hayati bir hormon olan progesteronun devamlı olarak üretilmesini sağlayan bir hormondur (Kim et al., 2012; Cole, 2012). Fertilizasyonun başlangıcı ile hcg hormonu salınımı da başlar. HCG hormonunu alfa ve beta olmak üzere iki alt üniteden oluşmuştur. Alfa hcg aynı zamanda LH, FSH ve TSH nın bir kısmını oluşturur. HCG hormonunun beta ünitesi ise çok özel bir yapıdadır. Bu nedenle kanda gebelik testlerinde beta hcg ölçülür (Janny and Menezo, 1996; Cole, 2010; Yamaguchi et al., 2013). Döllenmeden yaklaşık 7 gün sonra idrarda hcg tespit edilebilir. Korpus luteumun, gebeliğin ilk 3 ayında progesteron üretmeye devam etmesini sağlayan hormon hcg dir. İlk 6 hafta kan dolaşımındaki hcg miktarı her 2-3 günde bir iki katına çıkar. Gebeliğin 6. Haftasından sonra hcg artışındaki hız azalmaya başlar. Yaklaşık 12. haftadan sonra plasenta devreye girerek gebeliğin devamı için gerekli olan hormonları salgılamaya başlar (Cole, 2012; Kim et al., 2012; Betz and Fane, 2019). Bu nedenle yumurtalıklardan salgılanan progesteron hormonuna olan ihtiyaç azalır. Bundan dolayı kan ve idrardaki hcg miktarı azalmaya başlar. 6

19 RH (Relasing Hormone): Hipotalamustan salgılanır. Görevi hipofiz bezini uyarmaktır. Üreme ile ilgili RH çeşidi GnRH tır. GnRH hipofizi uyardığı zaman hipofiz bezi FSH, LH ve LTH salgılar (Sanders et al., 1975) FSH (Follicle Stimulating Hormone): Folikül uyarıcı hormon; gonadotropik hormonlardan biridir. Hipofiz bezinden salgılanır. Üreme sisteminin önemli bir parçasıdır. Kadınlarda yumurtalıkların, erkeklerde testislerin fonksiyonları için gerekli bir hormondur. Kadınlarda FSH, yumurtlama döneminde yumurtalıkta bulunan folikülleri büyümesi için uyarır. Buna ek olarak östradiyol üretimini arttırır. FSH ın üretilmesi ve salgılanması hipotalamik hipofiz gonadal eksen tarafından sağlanır. Gonadotropin salgılayan hormon hipotalamustan salgılanır ve FSH ın sentezini ve salınımını uyarmak için ön hipofiz bezinde bulunan reseptörlere bağlanır. FSH tarafından uyarılan foliküller, östrojen salgılarlar. Salgılanan bu östrojen uterusu uyarır. Kandaki östrojen miktarı yükseldiğinde, hipofize yumurta oluştuğu bildirilir ve FSH salgılanması hipofiz tarafından durdurulur (Smitz et al., 2016; Das and Kumar, 2018; Orlowski and Sarao, 2018) LH (Luteinizing Hormone): Luteinize edici hormon, FSH gibi, ön hipofiz bezindeki hücreler tarafından üretilir ve gonadotropik hormondur. Kadınlarda yumurtalıkların, erkeklerde ise testislerin fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli rolü vardır. Folikülün yırtılarak ovulasyonun gerçekleşmesini ve bu folikülün korpus luteum olmasını sağlar. Gebeliğin erken evrelerini desteklemek için gerekli olan progesteronun üretim için korpus luteumu uyarır (Sanders et al., 1975; Deenadayal et al., 2013) LTH (Prolaktin): Hipofizin ön lobundan salgılanan bir hormondur. Korpus luteumun devamlılığını sağlar. Süt bezlerini uyarır ve süt oluşumunu sağlar (Freeman et al., 2000). 7

20 2.3. IVF Laboratuvarında Embriyo Takibi Tüp bebek tedavisinin 5 aşaması vardır. Bunlar; i) yumurtalıkların uyarılması, ii) yumurta toplanması, iii) yumurtaların sperm ile döllenmesi (mikroenjeksiyon), iv) embriyo gelişimi ve v) oluşan embriyonun transferi aşamalarından oluşur Yumurta Uyarma İşlemi Yumurtalıklardaki olgunlaşmamış yumurtalar hormonlarla uyarılarak istenilen büyüklüğe getirilir. Gelişen bu yumurtalar hcg hormonuyla uyarılarak olgunlaştırılır. HCG hormonu enjekte edildikten saat sonra yumurta toplama işlemi gerçekleştirilir (Tıraş ve Demir, 2014) Yumurta Toplanması Yumurta alımı, intravenöz sedasyon altında cerrahi operasyon odasında gerçekleştirilir. Over folikülleri, trans-vajinal ultrasonografi tarafından yönlendirilen bir iğne kullanılarak aspire edilir. Mevcut yumurtaları bulmak için foliküler sıvı incelenir ve elde edilen toplam yumurta sayısı belirlenir. Toplanan yumurtalar etrafını sarmış olan granulosa hücrelerinden ayrıştırılarak kaliteleri değerlendirilir ve olgunluk seviyelerine göre ayrılıştırılırlar. Seçilen yumurtalar, döllenme işlemine kadar bir inkübatörde kültür sıvısı içerisinde bekletilir (Tıraş ve Demir, 2014, Telfer, 2019) Yumurtaların Sperm ile Döllenmesi (Mikroenjeksiyon) Metefaz 2 (MII) aşamasına gelmiş olgun yumurtalar döllenebilir demektir. Erkekten alınan sperm örneği özel bir yıkama işleminden geçirilerek en iyi sperm seçilir ve enjekte edilecek spermlerin ikincil seçimi mikroskop altında gerçekleştirilir. İnce bir cam mikro iğne (enjeksiyon pipeti) kullanılarak tek bir sperm doğrudan yumurta sitoplazmasına enjekte edilerek döllenme işlemi gerçekleştirilir (Tıraş ve Demir, 2014). 8

21 Embriyo Gelişimi ve Transferi Döllenen yumurtaların gelişiminin sağlanması için gaz ve nem oranları özel olarak ayarlanmış sıvılar içerisinde inkübatörlere konulur. Döllenme değerlendirilmesi, sperm enjeksiyonundan yaklaşık saat sonra mikroskop altında gerçekleştirilir. Başarılı bir döllenmeden 24 saat sonra (anne ve babadan gelen pronükleusların görülmesi) embriyo bölünmesi gerçekleşir. 72 saat sonra embriyo yaklaşık 8 hücreye sahip olur. Embriyo transferi, hastanın klinik durumuna, embriyo sayı ve kalitesine bağlı olarak iki ile beşinci gün arasında yapılsa da genellikle beşinci gün transferi tercih edilmektedir. Bunun nedeni, morfolojik bozukluğa sahip embriyoların beşinci güne kadar yaşayamaması, rahime tutunma potansiyeli yüksek embriyonun daha doğru seçilebilmesi ve blastokist aşamasındaki embriyonun rahim içine tutunma oranının daha yüksek olmasıdır (Tıraş ve Demir, 2014, Kim et al., 2017) Embriyo Kültürü İn vitro fertilizasyon (IVF) sırasında kullanılan kültür ortamlarının embriyo kalitesi üzerindeki etkilerinden dolayı implantasyonun yanı sıra gebelik oranlarını da etkilediği birçok çalışma tarafından gösterilmiştir (Hall et al., 1998; Catt and Henman, 2000; Tao et al., 2012; Baltz, 2013; Swain et al., 2016; Simopoulou et al.,2018). Embriyo kültürünün kalitesi, laboratuvarda gelişen embriyoların kalitesini ve sağlıklı bir bebeğin başarılı doğum şansını arttırmaktır. Son yıllarda IVF sonuçlarının iyileşmesinin ana nedenlerinden biri embriyo kültür sistemlerinin gelişimi olarak kabul edilmektedir. Embriyo kültüründe kullanılan medyumlar, ilk zamanlar sınırlı kalite kontrolüyle kurum içerisinde üretilmekteyken şimdi ise besinler, vitaminler ve büyüme faktörleri içeren, yaygın olarak bulunabilen ve özel kalite standartlarına uyan üreticiler tarafından sıkı denetimler uygulanarak üretilmektedir (Mehta, 2001; Gruber and Klein, 2011; Chronopoulou and Harper, 2015; Morin, 2017). Embriyo kültürü, rahim içi ortam şartlarının laboratuvar ortamında oluşturulması ile karakterizedir. Özellikle laboratuvarda bulunan inkübatörler içindeki karbondioksit oranı, ph ve sıcaklık gibi koşullar embriyo gelişimini ve buna bağlı olarak da gebelik sonuçlarını önemli ölçüde etkilediği yapılan araştırmalarda 9

22 gösterilmiştir. İnsan oosit enjeksiyonu sırasında 37 C civarında sıcaklık stabilitesini korumak, döllenme oranlarını ve embriyo gelişimini de arttırmıştır. Karbondioksit oranı da kullanılan kültür ortamının ph ına (fizyolojik ph ) göre ayarlama yapılarak kullanılmalıdır (Swain, 2010; Chronopoulou and Harper, 2015; Wale and Garner, 2016; Gardner and Lanne, 2017). Modern embriyo kültür sisteminde, düşük oksijen kullanımı esastır. Memeli preimplantasyon embriyolarının, % 21'lik bir atmosferik konsantrasyona kıyasla düşük oksijen konsantrasyonunda (% 5 -% 6) kültür edilmesinin faydaları fare, koyun, inek ve domuz dahil hayvanlarda uzun yıllardır bilinmektedir (Morin, 2017). Ortam ph'ı, esas olarak ortamdaki bikarbonat konsantrasyonu ve kültür inkübatörünün CO2 konsantrasyonu ile belirlenir. Hücre içi ph'ındaki (phi) değişikliklerin embriyo metabolizmasını, gelişimini ve hatta kemirgenlerde fetal büyümeyi etkileyebileceği bilinmektedir (Swain, 2010; Mehta, 2001; Wale and Garner, 2016; Gardner and Lanne, 2017) Filtre Sistemleri: Filtre; havada var olan istenmeyen gaz, buhar ve diğer tanecikleri ayrıştırmaya yarayan malzemedir. Havalandırma sistemlerinde; dış ortamdaki tanecikleri (mikrop toz vb.) ve istenmeyen maddeleri tutmak, havalandırma girişlerinde gerekli ayrımları yapmak, havadaki virüs ve bakterileri azaltmak için kullanılır (Esteves and Bento, 2016; Ozawa et al.,2018) Filtre Mekanizmaları Filtrelerin, tozları yakalamasını sağlayan çeşitli fiziksel mekanizmalar vardır. Bunlardan en baskın olan mekanizmalar: Elek etkisi (Straining) Atalet etkisi (Impingement) Yakalama etkisi (Interception) Difüzyon etkisi (Diffusional) 10

23 Elek Etisi: Elek tipi filtrasyon en basit filtreleme mekanizması olarak tanımlanabilir. Bu filtreleme sistemi aşağıdaki şekilde görüldüğü üzere çapı filtre elemanı olarak kullanılan bitişik iki filtre elyafları arasındaki aralıktan daha büyük taneciklerin tutulması olayıdır. Büyüyen tanecik boyutu difüzyon etkisini azaltır fakat yakalanma ve atalet etkilerini yükseltir (Şekil 2.2). Şekil 2.2. Elek Etkisi Atalet Etkisi: Akım iplikçikleri bir filtre elyafıyla karşılaştıkları zaman elyafın etrafında paralelliklerini bozmayarak yollarına devam ederler. Fakat akış içerisinde ilerleyen tanecikler ataletleri nedeniyle elyaf etrafında dönemeyerek, elyafa çarparak elyafa yapışırlar. Bu etki; elyaf çapındaki daralma, tanecik çapındaki büyüme ve hava hızının artması ile artar (Şekil 2.3). 11

24 Şekil 2.3. Atalet Etkisi Yakalama Etkisi: Taneciğin çapı çok küçük olduğu zaman tanecik hava ile birlikte elyaf iplikçiyi çevresinde bir yörünge takip edebilir. Tanecik elyafın yarıçapından daha yakın bir yerden geçtiğinde elyaf tarafından yakalanarak elyafa yapışır. Bu etki; tanecik çapının artıp, elyaf çapı ve iplikçiklerin arasındaki mesafenin azalmasıyla artış gösterir (Şekil 2.4). Şekil 2.4: Yakalama Etkisi 12

25 Difüzyon Etkisi: Toz yüklü hava filtre ortamından geçerken, 1 μm den daha küçük olan parçacıklar akıntı çizgilerini tam olarak takip etmemektedir. Çünkü birbirleriyle çarpışırlar ve rasgele yollarda hareket ederler. Bu rastgele harekete Brownian hareketi denir. Brownian hareketi sonucu filtre elyafıyla çarpışan tanecikler filtre elyafına yapışabilir. Difüzyon etkisinin artması elyaf çapının, hava hızının ve tanecik çapını artışı ile ters orantılıdır. Bu değişkenler küçüldükçe difüzyon etkisi de artış göstermektedir (Şekil 2.5). Şekil 2.5: Difüzyon Etkisi HEPA Filtre HEPA nın açılımı, High Efficiency Particulate Arresting dir. Yani yüksek etkinlikte tanecik yakalayıcıdır. HEPA; hava filtrelerinin verimlilik standartıdır. Bu standarta girebilmek için belirli verimlilik seviyelerinden geçilmesi gerekmektedir. Bir HEPA standartını karşılamak için hava filtresinin içinden geçen havadan 0,3 mikron boyutunda parçacıkların en az %99,95 (Avrupa Standardı) veya %99,97(ASME, ABD DOE) verimle, uzaklaştırılması gerekmektedir. Bu, bir HEPA filtresinden on bin adet 0,3 mikrometre partikül gönderirseniz, HEPA'dan yalnızca üç partikülün geçeceği anlamına gelmektedir. HEPA filtreleri bir bariyer görevi yapan rastgele birbirine dolanmış liflerden oluşan bir mattan oluşur. Fiberler tipik olarak cam elyaftan oluşur ve 0,5 ila 2,0 mikrometre arasındaki çaplara sahiptir (Cecchi et al., 1997; Morbeck, 2015). 13

26 Uçucu Organik Bileşik (VOC) Tutucu Filtre: VOC Tutucu Filtre, tüp bebek merkezlerinde embriyoları korumak amaçlı gaz hatlarında bulunan zararlı mikroorganizmaları ve safsızlıkları engellemek için özel olarak tasarlanmıştır. VOC Tutucu Filtre içerisinde bulunan granül aktif karbon parçacıklarının büyük gözenekli yüzey alanı ve ek olarak çıkış bölgesinde yer alan HEPA filtre sayesinde uçucu organik bileşenleri, partikülleri, zararlı mikroorganizmaları engellediği yapılan test ve çalışmalarla kanıtlanmıştır. Bu filtrelerin inkübasyon ortamı için zararlı olan, CO2 gaz kaynakları içerisinde bulunan; özellikle Etil Metil Keton, Tetrahidrofuran, Fenol, 2-Heptanol, Formaldehit gibi safsızlıklara karşı başarı gösterdikleri yapılan testlerde gösterilmiştir (Cohen et al., 1997). IVF laboratuvarlarında kullanılan VOC tutucu filtrelerin ortamdaki havayı yeterince temizlememesi embriyo kalitesini azaltır. Yapılan birçok çalışma da, laboratuvar havasında bulunan az miktarda VOC'nin bile gebelik oranlarını olumsuz yönde etkilediği göstermiştir (Tablo 2.1). Embriyo kalitesindeki bu düşüşün sebebi ise safsızlık nedeni ile oluşan hücre içi strestir (Corazzari et al., 2017). ER; oosit olgunlaşması ve preimplantasyon embriyo gelişimi sırasında protein lipitleri ve salgı proteinlerinin biyosentezi için önemli bir görev görür (Yang et al., 2012; Zhang et al., 2012; Jin et al., 2012; Basar et al., 2014). Bu fonksiyonel proteinler, uygun oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimini sürdürmek için ER'de uygun şekilde katlanmalıdır (Michalak and Gye, 2015; Lin et al., 2019). Blastosist aşamasında, transkripsiyonun aktivasyonu nedeniyle hücre sayısında da ki artış ve protein sentezi ER stresine neden olabilir ve sonuç olarak ER homeostazını sürdürmek ve embriyonik gelişimin sonraki aşamasını desteklemek için spesifik başa çıkma tepkilerini aktive edebilir (Zhang et al.,2012; Jin et al., 2012; Basar et al., 2014; Lin et al., 2019). Oluşan bu stres katlanamayan veya hatalı katlanmış protein oluşumunu sağlar. Hücrenin yaşamsal fonksiyonlarının devamı için UPR sinyal yolları devreye girer (Zhang et al.,2012; Jin et al., 2012). Fakat uzun süre boyunca stres ortadan kaldırılamadığında UPR aktivasyonu stres ile başa çıkmak için yetersiz kalabilmektedir. Hücre içerisinde biriken bu hatalı proteinler ise blastokistin sağlıklı bir şekilde gelişmesini olumsuz yönde etkiler (Basar et al., 2014; Lin et al., 2019; Poletto et al., 2018). Tüm bu nedenlerden dolayı; embriyo kültür ortamını doğrudan etkileyen CO2 gazında bulunan safsızlıkların uzaklaştırılmasının embriyo kalitesini 14

27 ve dolayısı ile de gebelik şansını arttıracağı öngörülmektedir (Munch et al., 2015; Poletto et al., 2018). Boone et al. (1999) tarafından yılları arasında yapılan Retrospektif kohort çalışmasına göre IVF isteyen iki yüz yetmiş beş çift incelenmiştir yılında ameliyathanesini yenileyen tüp bebek merkezinde inşaat etkisiyle oluşan VOC nin gebelik oranına etkisi araştırılmıştır. Daha sonra temiz bir oda hazırlanarak embriyo kalitesi incelenerek sonuçlar karşılaştırılmıştır. Bu sonuçlara göre; Klinik gebelik oranları 1993'te %35'ten; 1994'te %16'ya düştü (1994'te çok sayıda inşaat kokusu tespit edilmiştir) ve temiz oda inşa edildikten sonra istikrarlı bir şekilde artış gözlemlenmiştir ( oranları% 20, %32 ve % 59). Döllenme oranları 1993 (%74) ile 1994 (%60) arasında azaldığı ve daha sonra temiz oda kurulumundan sonra sabit bir şekilde arttığı görülmüştür (1995'te %62, 1996'da %71 ve 1997'de %69). Dört hücreli aşamayı geçen embriyoların oranı 1993'te %66'dan 1994'te %61'e düştüğü, ancak temiz odanın inşa edilmesinden sonraki yıllarda istikrarlı bir şekilde arttığı gözlemlenmiştir (1995, 1996 ve 1997'de %78, %79 ve %83). Temiz odanın inşasından sonra transfer edilebilir embriyolar için döllenme hızında bir artış ve hücre evresi ve embriyo kalitesinde bir artış gözlemlenmiştir. Munch et al. (2015) yaptıkları bir diğer çalışmada ise karbon filtrasyonu nun yardımcı üreme teknolojisine etkisinin araştırılması için üç gruptan oluşan retrospektif bir çalışma yapılmıştır. Bu gruplar; hava kontrol ünitesinin karbon filtrasyonu içerdiği (karbon 1), filtrenin olmadığı (filtre yok) ve filtrenin tekrar eklendikten (karbon 2) sonraki fertilizasyon, klivaj ve blastosist oluşum oranları incelenmiştir (Şekil 2.6). Yapılan bu araştırmaya göre filtre kullanılmadığında bütün oranların düştüğü Şekil 2.6 da karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir. 15

28 Fertilizasyon oranı, % Klivaj oranı, % Blastosist oluşum oranı, % Karbon 1 Filtre yok Karbon 2 Şekil 2.6: Karbon filtrasyonu nun yardımcı üreme teknolojisine etkisi 16

29 Tablo 2.1: Laboratuvarlardaki hava kalitesinin IVF sonuçlarına etkisini gösteren bazı çalışmaların özeti (Alıntı: Air quality control in the ART laboratory is a major determinant of IVF success.) 17

30 2.6. İnkübatör IVF laboratuvarındaki inkübatörler, embriyo gelişimini ve klinik sonuçları optimize etmek için gerekli olan stabil ve uygun bir kültür ortamının sağlanmasında çok önemli bir rol oynamaktadır (Swain, 2014). Laboratuvar inkübatörleri genellikle, mikrobiyolojik inkübatörler olarak da bilinen gaz ve gazsız inkübatörler kullanılarak çalışan iki ana bölüme ayrılmaktadır. Genel olarak inkübatörler, sıcaklık, nem ve ph seviyeleri dahil değişkenler üzerinde kontrol olarak kullanılan karbondioksit gazı ile hücre kültürlerini büyütmek ve sürdürmek için kullanılmaktadır. CO2 inkübatörleri, bir hücrenin doğal ortamını kopyalamak için tasarlanır ve en yaygın olarak doku veya hücre yetiştiriciliği yapan biyoloji laboratuvarlarında kullanılmaktadır. CO2, bir atmosferi bir seferde günler veya haftalarca sürdürmek veya istenen sonucun ne olduğuna bağlı olarak büyümeyi artırmak için kullanılır. Karbondioksit gazı seviyesi genellikle yaklaşık% 5'e kadar ölçülür, ancak bu, uygulamaya bağlı olarak değişecektir. CO2 inkübatörlerinde genellikle sisteme yerleşik sensörler bulunur, bu nedenle seviyeler işlem boyunca sürekli olarak izlenebilmektedir. İnkübatör sayısı kritik önemdedir ve siklus sayısı ile embriyo kültür süresine göre belirlenir. İnkübatör açma-kapamaları en aza indirmek için gametler ve embriyolar inkübatörlere uygun şekilde paylaştırılmalıdır Endoplazmik Retikulum ve Katlanamayan Protein Cevabı Endoplazmik retikulum (ER), hücre sitoplazmasında madde sentezini ve iletimini sağlayan, birbirlerine paralel olarak uzanmış yassı kanalcık ve tüpçüklerden oluşmuş bir ağ sistemidir (Oakes and Papa, 2015). Bu kanallar iletimi sağlar, kesecikler ise depolamayla görevlidir. Hücredeki ER sayısı ve yapısı hücrenin etkinliğine göre değişiklik gösterir. Hücre zarı ve çekirdek arasında yer alır. Alyuvar hariç bütün ökaryot hücrelerde bulunur. ER hücre bölünürken ortadan kaybolur, bölünmenin tamamlanması ile tekrar ortaya çıkar (Schwarz and Blower, 2016). ER un hücre içerisinde; ER da yerleşik olan proteinlerin katlanması, salgılanması, olgunlaşması, proteinlerin kalite kontrolü, hücre içi madde iletimi, depo, gibi birçok önemli görevi vardır. ER un bir diğer görevi ise salgılanacak olan proteinler ve zar protein sentezi için bir bölge hazırlamasıdır. Ribozomdan sentezlenen proteinler; protein dizilerindeki sinyal tanıyan partikül (SRP) tarafından tanımlanır. Tanımlanan bu protein ER daki SRP reseptörü aracılığıyla ER a ulaşır. Proteinin sentezinin 18

31 tamamlanması ile sinyal kesilir. Sentezlenen bu protein düz bir aminoasit zincir halinde olur. Proteinin işlevini yapabilmesi için kendine özgü üç boyutlu bir yapıya dönüşmesi gerekir. Bu yapıya dönüşebilmesi ise, proteine bazı kimyasal gruplar ekleyen ve aminoasit zincirini farklı şekillerde katlayan proteinler yoluyla gerçekleşir (Schwarz and Blower, 2016). ER de protein katlanmasını glukoz protein 78 (GRP78), glukoz düzenleyici protein 94 (GRP94), lektin benzeri proteinler ve foldazlar sağlar. ER fonksiyon kapasitesini aşan fizyolojik veya patolojik durumlar söz konusu olduğunda ER lümeninde katlanmamış ya da yanlış katlanmış protein birikimi meydana gelir ve hücrede birikir. Bu proteinler ER da kalabilir veya protein parçalayan enzimler yoluyla parçalama yolağına girebilirler. Proteinin tanınmasının ardından ER un içinde bulunan ERAD (ER-associated degredation) bu proteinlerin yıkımını sağlayarak proteinlerin ER içinde birikimini önler (Michalak and Gye, 2015; Schwarz and Blower, 2016). ER de katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin birikmesi ve ER homeostazisinin bozulması durumunda ortaya çıkan hücresel cevap ER stresi olarak adlandırılır. ER stresi hücre içerisinde gerçekleştikten sonra, hücrenin yaşamsal fonksiyonlarının devamı için katlanmamış protein yanıtı (UPR) olarak adlandırılan sinyal yolları devreye girer. Protein kinaz RNA (PKR) benzeri ER kinaz (PERK), aktive edici transkripsiyon faktörü (ATF6), inozitol gerektiren kinaz 1 (IRE1) yolakları UPR sinyal yolaklarının başlıcalarıdır. (Jin et al., 2012; Michalak and Gye, 2015; Lin et al., 2019) UPR nin temel görevleri; normal ER un işlevini yeniden kurmak ve değişen çevreye adaptasyonunu sağlamak, ER lümenine gelecek yeni proteinlerin miktarını azaltmak, ER de proteinlerin katlanma kapasitesini arttırmak, ER de bulunan katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin degredasyonunu ve tekrar sitoplazmaya dönüşünü sağlamaktır (Bravo et al., 2013; Corazzari et al., 2017). 19

32 Şekil 2.7: Katlanmamış Protein Yanıtı 2.8. GRP78 ER şaperonları, ER'un normal çalışması için gereklidir. Bu şaperonlardan biri de Bağlayıcı Protein (BiP) veya HSPA5 olarak da bilinen 78-kDa glikoz düzenleyici proteindir (GRP78). GRP78, birçok hücresel görevde yer almaktadır (Wang et al., 2009). Yeni sentezlenmiş polipeptitlerin ER membranı boyunca yer değişimi, kalsiyum bağlanması, ER stres sensörü görevi, proteinlerin katlanması ve montajını kolaylaştırmak, ER ile ilgili yanlış katlanmış proteinleri hedeflemek ve apoptozizin düzenlenmesi gibi birçok hücresel görevi vardır (Gardner et al., 2013; So, 2018). GRP78; antiapoptotik özelliklere sahip büyük bir ER şaperonu olması ve UPR sinyal yolağının aktivasyonunu kontrol etme kabiliyetleri nedeniyle ER stresinde ana bir düzenleyici olarak rol oynamaktadır (Wang et al., 2009). UPR mekanizması; stres tarafından aktifleşen 3 yolak içerir. Bunlar; PERK, IRE1 ve ATF6 transmembran proteinleridir. Bu proteinler stres olmayan durumlarda GRP78 tarafından tutularak kontrol altına alınır. ER lümeninde katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin 20

33 toplanması durumunda GRP78; PERK, IRE1 ve ATF6 dan ayrılır. PERK ve IRE1 fosforilasyon geçirerek aktive olur (Bravo et al., 2013). ATF6 ise golgiye taşınarak orada S1P ve S2P proteazları aracılığıyla kesime uğrayarak aktive olur. Aktifleşen ATF6 nükleusa aktarılarak bir transkripsiyon faktörü olarak, ER daki stresi azaltacak olan genlerin transkripsiyonunu başlatır. Ayrıca apoptozisten sorumlu CHOP gen bölgesini aktive ederek apoptozisi indükler (Grootjans et al., 2017). PERK aktivasyonu sonrasında eif2α yı (translasyon başlatıcı faktör) fosforile eder. Hatalı proteinlerin birikmelerini engellemek için ER stres cevabının erken fazı sırasında genel protein translasyonunun inhibisyonundan sorumludur. Bunlara ek olarak CHOP gen bölgesinin ekspresyonunu artırır (Wang et al., 2009; Rozpędek, 2016). IREI transmembran bir proteindir. Sitoplazmik bölümü endoribonükleaz ve kinaz aktivitesine sahiptir. Aktivasyonu XBP-1 i de aktive ederek, protein katlanmasında etkili olan genlerin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörü olmasını sağlar (Huang et al., 2019). Ayrıca hücre için koruyucu olma özelliğine sahip olan IRE1; CHOP geninin transkripsiyonunu arttırarak apoptozise katılır (Zhu and Lee, 2015). Hatalı katlanmış veya katlanmamış protein miktarının çok fazla miktarda olması, ER stresinin şiddetli olması ve uzun sürmesi gibi durumlarda UPR aktivasyonu stres ile başa çıkmak ve normal hücre fonksiyonunu yenilemek için yetersiz kalabilmektedir. Bu durum karşısında ER stresi apoptozu tetiklemektedir. Apoptozun tetiklenmesinde proteazlar, kinazlar, transkripsiyon faktörleri, kaspaz ailesi ve Bcl-2 ailesi üyeleri rol almaktadır (Zhou et al., 2011; Zhu and Lee, 2015). 21

34 Şekil 2.8: UPR yolakları. (Rutkowski ve Kaufman, 2004) 22

35 3. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi, Akdeniz Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı ve Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi nde gerçekleştirildi. Çalışmamız süresince Biruni Üniversitesi Etik Kurul ve Akdeniz Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul kararlarına uyuldu. Çalışmadaki hastalar Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi ne infertilite nedeniyle başvuran çiftlerden sağlandı. Deneysel kısımda kullandığımız BALB/C, dişi ve erkek fareler ise Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi nden sağlandı. Çalışma da 2018 yılında, Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Merkezi ne infertilite nedeniyle başvuran hastaların kayıtları geriye dönük olarak incelendi. Çalışma önce Biruni Üniversitesi Girişimsel Olmayan Araştırmalar Etik Kurulu na sunuldu ve 2019/35-07 sayı ve tarihli etik kurul onayı alındı. Çalışma Aralık 2019-Ocak 2019 tarihleri arasında Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama Ve Araştırma Merkezi nde yapıldı. Çalışmada önce Akdeniz Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu na sunuldu ve 124 karar numaralı ve tarihli etik kurul onayı alındı Hasta Seçimi Ve Çalışma Planı Yaptığımız bu çalışmada Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek laboratuvarında bulunan yatay inkübatörlerde kullanılan CO2 gazının saflığı incelendi ve içerisinde embriyo kültürü için toksik olan moleküllerin olduğu tespit edildi. Bunun embriyo kalitesine etkisini incelemek üzere, Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Merkezi ne infertilite nedeniyle başvuran hastaların embriyoları incelendi Hasta Seçimi Bu retrospektif çalışmada Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi ne 2018 yılında infertilite nedeniyle başvuran ve ICSI tedavisi görmüş olan hastalar dahil edildi. Çalışmada 35 yaşın altındaki tubal faktör tanısı konmuş, 15 den fazla yumurta sayısına sahip olan hastaların embriyoları incelendi. 23

36 Çalışmada Kullanılan Yöntemler Bu çalışma ICSI tedavisi gören 30 hasta ile gerçekleştirildi. ICSI tedavi sonrası 2PN görülen embriyolar (kardeş embriyolar) kendi içlerinde ekstra filtre olan (Grup 1) ve olmayan (Grup 2) şeklinde iki gruba ayrılarak takip edildi. Bu gruplar arasında ki üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kaliteleri incelendi. Merkezde kullanılan K- System G210 model inkübatörde kullanılan asıl filtre sistemi olan BLUE; ORIGIO Gas Line Filter a ek olarak 3 filtre daha kullanıldı. Bu filtreler CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter. Ayrıca bu 3 farklı filtre de embriyo kalitesine etkileri yönünden ayrı ayrı incelenerek karşılaştırıldı. Çalışma yapılırken ortamdaki tüm şartların aynı kalması, tek farkın ekstra filtre olması esas alındı Embriyo Kalitesinin İncelenme Kriterleri; Embriyo kaliteleri üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kaliteleri olarak 2 grup şeklinde incelendi. Üçüncü Gün Değerlendirilmesi; Üçüncü gün embriyo kalitelerinin incelenmesi için ESHRE nin 2011 yılında embriyo kalitesini değerlendirmek için oluşturduğu skorlama sistemi kullanıldı. Embriyoların normalden daha yavaş veya hızlı bölünmesi implantasyon başarısını düşüren etkenlerden birisidir. Fragmantasyon miktarı, büyüklüğü ve dağılımı da embriyo kalitesi için önemli bir faktördür. Embriyo değerlendirmesi ICSI işleminden 68 saat sonra yapıldı. Bu skorlamada hücre sayısı, fragmantasyon oranı, blastomerler arası çap uyumluluğu gibi özellikler dikkate alındı. 1. Hücre (blastomer) sayısı: 3. Günde ideal olan hücre sayısı 7-8 dir. Embriyonun içerisinde çekirdek görünen hücreler sayılarak embriyonun hücre sayısı belirlendi. 2. Fragmantasyon oranı: Fragmantasyon hücre içerisinde bulunan, çekirdek gözlemlenmeyen, hücre çeperi bulunan sitoplazmik yapılardır. Bu yapılar incelenerek embriyonun hacmine göre kapladığı yüzde belirlendi ve bu oran % de lik olarak değerlendirildi. 24

37 3. Blastomerler arası çap uyumluluğu: Blastomerin çapları arasındaki uyumsuzluk oranı hesaplandı ve buna göre hafif, orta şiddetli veya çok şiddetli olarak değerlendirildi. Embriyolar değerlendirilirken kullanılan sınıflandırma sistemi aşağıdadır: Embriyoda %10 dan az fragmantasyon hafif, % fragmantasyon orta, %20 nin üzerinde fragmantasyon şiddetli olarak kabul edilir. Embriyo değerlendirmesi sonucunda; embriyoda fragmantasyon ve çap uyumsuzluğu yok ise; bu embriyo GRADE 1 olarak, fragmantasyon veya çap uyumsuzluğu var ise; GRADE 2 olarak sınıflandırılır. Fragmantasyon oranı 20% den fazla ise de bu embriyo GRADE 3-4 olarak sınıflandırılır. Beşinci Gün Değerlendirilmesi (Blastokist İncelemesi); Döllenmeden 5 gün sonra blastokist oluşumu başlamaktadır. Bu aşamadaki embriyo yaklaşık olarak 200 ila 300 hücreden oluşmaktadır. Blastokist evrelemesini incelemek için üç unsur morfolojik olarak değerlendirildi. 1. Blastoselin genişlemesiyle birlikte zona pellisudanın embriyo tarafından yarılarak embriyonun kısmen çeper dışına çıkmasına göre bir sınıflandırma yapılmaktadır. Buna göre 1 den 6 ya kadar olan sayılarla skorlama yapılır ve genel olarak 3 ila 6 büyüklüğündeki blastokistler iyi olarak değerlendirilir. 2. İç hücre kütlesi sınıflandırması; embriyoyu yapacak olan iç hücrelerin yoğunluğu ve birbirleri ile olan ilişkilerinin sıkılığına göre A, B, C olarak skorlama yapılır. En yüksek A, en düşük skorlama ise C dir. 3. Plasentayı yapan trofoektoderm hücre (TE) sınıflandırması; plasentayı yapan trofoektoderm hücrelerin yoğunluğu ve sıkı sıkı birbirleri ile olan ilişkilerinin sıklığına göre A, B, C olarak skorlama yapılır. En yüksek A, en düşük skorlama ise C dir. Genel olarak 3/4/5/6 ve de iç hücre kütlesi/te için de A/B skorlaması en iyi olarak kabul edilir. 25

38 3.2. Hayvan Seçimi ve Çalışma Planı Katlanamayan Protein Cevabı nın embriyo kalitesi üzerine rolünü araştırmak için yapılan bu çalışmada 10 haftalık 10 adet gram ağırlığında BALB/C türü dişi fareler ve 10 haftalık 4 adet gr ağırlığında BALB/C türü erkek fareler kullanıldı. Farelerin biyolojik ritimlerini sabit tutmak için yapay olarak 12 saat aydınlık 12 saat karanlık döngüsü uygulandı. 10 haftalık dişi BALB/C fareler FSH+hCG (5 IU, i.p.) ile uyarılarak yetişkin erkek fareler ile bir araya konuldu. Farelerden toplanan embriyolar ekstra filtre olan ve olmayan inkübatörlerde takip edildi. Western blot yöntemi kullanılarak UPR nin rolü araştırıldı. Çalışma yapılırken ortamdaki tüm şartların aynı kalması, tek farkın ekstra filtre olması esas alındı Morfolojik İnceleme İçin Embriyoların Elde Edilmesi FSH+hCG enjeksiyonundan 24 saat sonra vajinal plak görülen fareler ötenazi için seçildi. Fareler işlem için bir hazneye 5 fare olacak şekilde yerleştirildi ve haznelere karbondioksit eklendi. Haznelerdeki mevcut havaya eklenen CO2 hayvanlara en az sıkıntı ile hızlı bir bilinç kaybı hedefini gerçekleştirmek için dengeli bir gaz karışımı olarak (CO₂ akış hızı, dakika başına kafes hacminin %10 ila %30'unu değiştirecek şekilde) uygulandı. Bilinç kaybı için fareler haznede yaklaşık 3 dakika bekletildi. Bu süreçte farelerin soluk alıp vermesi takip edildi. Solunum eksikliği ve soluk göz rengi için her fare tek tek kontrol edildi. Solunum durduktan sonra en az 1 dakika CO2 akışı korundu. Her iki işaret de gözlendiğinde, fareler kafesten çıkartılıp embriyo toplama işlemi için ötenazi yöntemi olan servikal dislokasyonla sakrifiye edildi. Farelerin karın boşlukları açılarak oviduktları IVF medyumu içerisine alındı. Daha sonra stereomikroskop (Olympus SZX12) altında yeni bir IVF medyumuna alınan ovidukt penset ile sabitlendi ve ampulla bölgesi enjektör iğnesiyle zedelenerek embriyolar oviduktün içerisinden çıkartıldı. Medyuma yayılan embriyolar; %0,1 hiyaluronidaz içeren medyum içinde toplandılar ve IVF medyum ile yıkandılar. Mikroskop altında embriyoları toplamak için yapılan tüm işlemler 37 C ye ayarlı bir ısıtma tablası ve yine 37 C ye ayarlı bir ısıtma 26

39 tablası ile donatılmış bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen embriyolar ekstra filre olan ve olmayan inkübatörlere kaldırıldılar. Embriyoların gelişim aşamaları ışık mikroskobik olarak değerlendirildi ve bu değerlendirmede 3 kriter dikkate alındı. Bu kriterler blastomer boyutu ve regülaritesi, blastomer sitoplazmasının granülaritesi ve fragmantasyon oranı. Embriyonun kaliteli sayılabilmesi için eşit şekil ve büyüklükte blastomere sahip olması ve fragmantasyon içermemesi gerekmektedir. Fragmantasyon oranının artması, blastomerlerin şeklinin bozulması ve düzeninin azalması embriyo kalitesini düşürmektedir. Embriyo kaliteleri incelendikten sonra embriyolardaki GRP78 seviyesi Western blot yöntemi ile incelenmek üzere işleme alındı Western Blot Yöntemi Western Blot çalışması Akdeniz Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı nda gerçekleştirildi. Western Blot yöntemi herhangi bir örnek içerisindeki spesifik bir proteinin olup olmadığını, varsa ne kadar olduğunu anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem, ekstra filtre olan ve olmayan inkübatörlerde bekletilen fare embriyolarındaki GRP78 protein seviyelerinin incelenmesi için kullanıldı. İşlem özet olarak 4 aşamada gerçekleştirildi. Bu aşamalar sırasıyla; örneklerin hazırlanması, yürütme ve transfer, ilgili proteinin işaretlenmesi ve boyanması son olarak da görüntüleme ve analiz yapılarak gerçekleştirildi. Embriyoların homojenizasyon işlemi RIPA tampon (Radioimmunoprecipitation assay buffer) içerisinde gerçekleştirildi. Homojenizasyon işlemi sonrasında elde edilen homojenatlar RPM devirde 15 dakika boyunca +4 ºC de santrifüj edildi. Santrifüj sonrasında ortaya çıkan süpernatantlar uzaklaştırıldıktan sonra karışım yeni bir tüpe alınarak tekrar santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantlarda toplam protein miktarını ölçmek için Qubit 2.0 Fluorometre cihazı ile Qubit protein assay kit kullanıldı. Kuyucuklara yüklenecek olan protein miktarını öğrenmek için spektrofotometre ile örneklerden alınacak hacimler hesaplandı ve SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi) jelleri hazırlandı. Örnekler aynı miktarda olacak şekilde mikropipet yardımı ile SDS jele yüklenerek 80 Voltta 2 saat yürütüldü. Ayrıştırılmış proteinler PVDF membrana transfer edildi. Bloklama işlemi, membran distile sudan geçirildikten sonra bloklama tamponunun (TBST) 1 saat çalkalayıcı üzerinde uygulanmasıyla gerçekleştirildi. 27

40 Bloklama tamponu dökülerek membran 3 kere TBST ile yıkandı. Membran, birincil antikor çözeltisinde gece boyu +4 ºC de sallandırıldı. Sabah membranın üstündeki antikor döküldü. Üstüne TBST eklenerek 3 kez 10 dakika çalkalayıcıya konup sallanarak yıkandı. Yıkamadan sonra ikincil antikor muamelesi ile işleme devam edildi. İkincil antikorla bir saat inkübasyon işlemi yapıldı ve yıkama işlemi yapıldı. Sonrasında membran karanlık bir ortamda, görüntüleme sistemine alınarak görüntülendi Kullanılan İnkübatör K-System G210 İnkübatör Çalışmalarımızda K-System G210 model inkübatör kullanıldı. Bu inkübatör sayesinde; ph seviyeleri de dahil olmak üzere embriyo koşulları, gaz ve sıcaklığın gelişmiş ve doğru yazılım kontrolü ile tamamen stabil tutulur, böylece stressiz inkübasyon sağlandı. Oluklu özel ısıtma plakaları, tabağa doğrudan ısı aktarımı sağlar. G210, inkübatör içinde mantar oluşumu riskini büyük ölçüde azaltan ve temizlemeyi kolaylaştıran, ortam nemine sahip bir inkübatördür. Minimum stres sağlamak için çeşitli özelliklere sahiptir. Havadaki partikülleri temizlemek için yüksek verimli partikül filtresi ve organik bileşikleri gidermek için VOC filtresi bulunmaktadır. VOC filtresi ve HEPA filtreden oluşan yüksek stabilite ortamı, odalarda temiz hava sağlar. Her hasta için ayrı bölmeler bulundurmaktadır, toplamda 10 bölmelidir. Gelişmiş yazılım tabanlı ısıtma teknolojisi ile bazal vücut sıcaklığının doğal döngüsünü taklit eder. Yerleşik gelişmiş gaz karıştırıcısı, gaz konsantrasyonunun gerekli seviyeye ayarlanmasını sağlar Ortam nemine dayalı inkübasyon, mantar gelişimi ve çapraz kontaminasyon riskini önemli ölçüde azaltır. Tek yönlü gaz akış sistemi, odalar boyunca eşit gaz dağıtımını sağlar. Gaz tüketimini düşük tutmak için kapak açıkken gaz akışı duraklatılır. 28

41 Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Gereçler CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE ORIGIO Gas Line Filter REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter hcg (Pregnyl, ORGANON, İstanbul, Türkiye) Gonodotropin Salgılatıcı Hormon Agonist (GnRHa) (Lucrin, Leuprolde Asetat, ABBOT) FSH (Puregon, ORGANON, İstanbul, Türkiye) GRP78 antikoru Cell lysis Buffer SDS OPU iğnesi Gradient Medyum Embriyo Kültür Medyumu Oosit Medyumu Alkol (Riedel-deHaen 34870) Hyaluronidaz Enzimi (80 IU/ml, Linaris, Germany) IVF Medyumu (IVF Universal Culture Medium, Medicult, Denmark) Mineral Yağ (Sigma-Aldrich Chemie, Germany) Bisturi (Surgical Blade, HECOS) CCD Kamera Sistemi (Charge Coupled Device) Cerrahi Makas (Solingen, Germany) Ensülin Enjektörü (BD-Microfine enjektör, 1ml) Etüv (Heraus) 29

42 Gamet ve Embriyo Analiz Sistemi (Cronus Research Instrument LTD. Version 3.1.0) Inverted Mikroskop (Olympus) Işık Mikroskobu (Leica Microscopysystems, Wetzlar GmbH) Işık mikroskobu Kamera Sistemi (Leica Microscopysystems AG, DC 180) İnkübatör (K-System G210) Kültür Kapları (No.1016 FALCON petri dishes) Lam (İsolab, 50/kutu) Lamel (İsolab, 22X22 100/kutu) 36 Laminar Flow Hood ( K-System, Denmark) Pastör Pipetleri (Long 230 mm, No.567/2, Asistent) Penset (Aesculap, BD509R) Portegü (Solingen, Germany) Stereo Mikroskop (Olympus, SZX12) Steril Tüpler (14 ml Round Bottom Tube, No.2001, FALCON tubes) RIPA tampon Qubit 2.0 Fluorometre cihazı Qubit protein assay kit bloklama tamponu (TBST) İstatistiksel yöntemler: Bu çalışmada iki grup karşılaştırılması için Student s t test, ikiden çok grup karşılaştırması için ise ANOVA test kullanıldı. p<0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi. 30

43 4. BULGULAR Bu prospektif çalışmada laboratuvarlarda kullanılan yatay inkübatörlerde bulunan filtrelerin yetersiz olduğunu ve ekstra filtre kullanıldığında embriyo kalitesinde artış olacağını incelemek için, 2018 yılında Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi ne infertilite nedeniyle başvuran hastalar incelendi. Çalışmada üç farklı filtre kullanıldı. Ayrıca filtreler de kendi aralarında embriyo kalitesine etkileri yönünden incelendi. Kullanılan ek filtreler; CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter. Öncelikle laboratuvar da kullanılan CO2 gazının saflığı incelendi. Daha sonra kullanacağımız ekstra filtreler eklenerek CO2 gazının saflığı bu filtrelerle birlikte ölçüldü. CO2 gaz örneği içerisindeki safsızlıklarının giderim yüzdeleri en az 10 farklı deney yapılarak ve yüzdeler maksimum %0,5 standart hata ile belirlenmiştir. Kullanılan karbondioksit içerisindeki safsızlıkların yüzdesinin belirlenmesi için yapılan deneyden elde edilen sonuçlar birinci kolondaki safsızlıklar adları ile yüzde safsızlık değerleri ikinci kolonda verilmiştir (Tablo 4.1). Tablo 4.1: Laboratuvarda kullanılan CO2 gazının filtre eklenmeden ve eklenerek ölçülen safsızlık oranları Safsızlık Adı Safsızlık Ekstra Filtreler ile Uluslararası Yüzdesi (%) Giderim Yüzdesi Normlara Göre 1.Filtre 2.Filtre 3.Filtre H2O (Su) Uygun 2-metil propen Uygun Etanol Uygun Etilmetil keton Uygun Değil Propanol Uygun Bütanol Uygun 2-metil pentan Uygun 31

44 3-metil pentan Uygun n-hekzan Uygun Etil asetat Uygun Tetrahidrofuran Uygun Değil Siklopentanon Uygun 2,3-dimetil Uygun heptan Etil benzen Uygun Alfapinen Uygun Fenol Uygun Değil Asetikasit fenil Uygun esteri 2-heptenol Uygun Değil Oktanol Uygun Nonanal Uygun Dekanal Uygun Asetikasit oktil Uygun Esteri 2, Uygun diklorobenzoik Asit Formaldehid Uygun Değil Toluen Uygun Benzen Uygun Asetaldehid Uygun Trikloretan Uygun 32

45 İncelenen CO2 gazında Etilmetil keton, Tetrahidrofuran, Fenol, 2-heptenol ve Formaldehid (safsızlık yüzdeleri; , , , , ) maddelerinin saflıklarının uygun olmadığı tespit edildi. Tablo 4.1 incelendiğinde uygun değil denilen bu parametrelerin ekstra filtre sonrası miktarlarının oldukça düşürüldüğü görülmektedir. Bu nedenle de CO2 kalitesi oldukça fazla artmaktadır. Tabloda da görüldüğü üzere ekstra filtre eklendikten sonra birçok türün giderimi büyük oranda sağlanmış ancak CO2 içerisindeki bazı türlerin miktarlarının fazla olması nedeni ile herhangi bir ekstra filtre sonrasında kalan miktarların hala fazla olduğu gözlemlenmiştir. Eğer bu türlerce daha temiz bir CO2 kaynağı bulunabilirse, ekstra filtre eklendikten sonra sonuçta daha kaliteli bir karbondioksit elde edilmiş olur. 0,0018 0,0016 0,0014 0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 Önce 0 H2O (Su) 2-metil propen Etanol Etilmetil keton Propanol Bütanol Safsızlıkların Yüzdesi 2-metil pentan 3-metil pentan n-hekzan Etil asetat Tetrahidrofuran Siklopentanon 2,3-dimetil heptan Etil benzen Alfapinen Fenol Asetikasit fenil esteri 2-heptenol Oktanol Nonanal Dekanal Asetikasit oktil Esteri 2,4-diklorobenzoik asit Formaldehid Toluen Benzen Asetaldehid Trikloretan Şekil 4.1: Toplam gaz miktarına göre safsızlıkların yüzdesi. Kırmızı işlem görmeden önce ve mavi işlem gördükten sonra Şekil 4.1 de da görüldüğü üzere su ve bütanol hariç diğer tüm kimyasal maddelerin ekstra filtre olan kolonlardan geçirildikten sonra ki giderimlerinin yüzdeleri oldukça yüksek olarak bulunmuştur. 33

46 P değeri Yorumu p<0.05 İstatistiksel anlamlılık * p<0.01 Yüksek düzeyde istatistiksel anlamlılık ** p<0.001 Çok yüksek istatistiksel anlamlılık *** 0.05<=p<0.10 Anlamlılık eğilimi (sınırda anlamlılık) p>0.10 Fark tesadüften ileri gelmiştir (istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmamıştır) Kullanılan CO2 gazının saflığı ekstra filtre olan ve olmayan filtrelerde incelendiğinde; ekstra filtre kullanılmadığında CO2 gazının içerisinde bulunan bazı maddelerin saflık derecelerinin uygun olmadığı, ekstra filtre kullandıktan sonra saflığın yüksek miktarda arttığı gözlemlendi. Bunun embriyo kalitesine etkisini incelemek üzere Anadolu Sağlık Merkezi Tüp Bebek Birimi ne infertilite nedeniyle başvurup, ICSI tedavisi görmüş 35 yaşın altındaki tubal faktör tanısı konmuş 30 hasta incelendi. Hastaların 2PN görülen embriyoları kendi içlerinde Grup 1 ve Grup 2 şeklinde iki gruba ayrılarak, üçüncü ve beşinci gün embriyo kaliteleri incelendi. Üçüncü ve beşinci gün embriyo kaliteleri incelenirken kullanılan 3 filtre (CODA XTRA INLINE FILTERS BLUE; ORIGIO Gas Line Filter; REPROCARE GLF30 VOC Holder Filter) embriyo kalitesine etkileri yönünden incelendi. 34

47 Şekil 4.2: 3. gün embriyo kalitelerinin ekstra filtre olmayan (Grup 2) ve olanlara (Grup 1) göre oranları * p<0.001 Üçüncü gün embriyo kaliteleri incelendiğinde Grup 1 de, Grup 2 ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede bir artış gözlemlendi. Grup 1 %47, CODA %48, ORIGIO %51, REPROCARE %52; (p<0,001) (n=30/grup, p<0.001). (Şekil 4.2) 35

48 Şekil 4.3: Grup 1 ve Grup 2 blastosist oranları * p<0.001 Blastosist oranları incelendiğinde her üç ekstra filtre olanda; olmayana göre artış gözlemlendi. Grup 2 %26, CODA %36, ORIGIO %38, REPROCARE %42; (n=30/grup, p<0,001). (Şekil 4.3) 36

49 Ekstra filtre uygulanan gruplar arasında üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kalitelerini karşılaştırdığımızda istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p>0.05). (Tablo 4.2) Tablo 4.2: Grup 1 ve Grup 2 de üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kalitelerinin karşılaştırılması GRUP 2 CODA ORIGIO REPROCARE p Üçüncü Gün %47 %48 %51 %52 <0.001 Beşinci Gün %26 %36 %38 %42 <0.001 Ekstra filtre kullanıldığında embriyo kalitelerindeki bu farkın UPR ile bağımlı olabileceğini araştırmak için Akdeniz Üniversitesi Deney Hayvanları Uygulama Ve Araştırma Merkezi nde BALB/C fareler (n=10) ile deneysel bir çalışma yapıldı. GRP78 proteinin seviyesini ölçmek için Akdeniz Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı nda Western Blot yöntemi gerçekleştirildi. Doğal yolla fertilizasyon sonucu elde edilerek toplanan embriyolar ekstra filtre olan ve olmayan inkübatörlere kaldırıldı. Üçüncü gün embriyo kalitesindeki ve blastosist eldesindeki farkın UPR sinyal yolu bağımlı olabileceğini araştırmak için GRP78 protein seviyesini Western Blot yöntemi ile incelediğimizde GRP78 proteinin; Grup 1 (% 37) de Grup 2 (% 61) ye göre yüksek olduğu bulunmuştur (p<0.001) (Şekil 4.4). 37

50 Şekil 4.4: GRP78 seviyeleri. * p<

51 5. TARTIŞMA, SONUÇ VE ÖNERİLER 5.1. Tartışma Tüp bebek tedavisi kişiye özel şekillenen ve farklı koşullarda farklı sonuçlar verebilen karmaşık bir tedavi sürecini içerir. Özellikle bazı durumlarda gebe kalma şansı oldukça yükselebilirken, bazı koşullara bağlı olarak da gebe kalma şansı düşebilmektedir. Gebelik şansını düşüren en önemli faktörlerden birisi de ortamdaki havanın temizliğidir. Ortamda VOC gibi maddelerin bulunması in vitro embriyo gelişimi için son derece zararlıdır (Ritz and Wilhelm, 2008). Bu nedenle tüp bebek laboratuvarlarında HEPA filtre sistemleri, CODA sistemleri gibi sistemler ortamdaki havanın temizliğinin en üst seviyede kalmasını sağlamaktadır. Laboratuvarda kullanılan malzemeler ve temizlik ajanları tarafından sürekli olarak üretilen VOC'ler, iç mekân ozonuyla reaksiyona girerek gebelik oranlarını doğrudan etkileyecek mikron altı boyutlu parçacıklar ve zararlı yan ürünler üretir (Little and Mirkes, 1990; Cohen et al., 1997; Cohen et al., 1997; Cecchi et al., 1998; De Los Santos et al., 1999; Munch et al., 2015). Laboratuvar içindeki hava kalite kontrolü, canlı doğum oranları gibi parametreleri önemli ölçüde artırdığı gösterildiğinden, yardımcı üreme başarısının en önemli belirleyicilerinden biridir (Esteves and Bento, 2016; Esteves and Bento, 2016b). Çeşitli çalışmalar, gametlerin ve insan embriyolarının klinik ve laboratuvar ortamlarında bulunan kirleticilere duyarlı olduğunu göstermiştir (Boone et al., 1994, Cohen et al., 1997, Boone et al., 1999, Esteves et al., 2004, Dickey et al., 2010, Munch et al., 2014, Munch et al., 2015, Palter et al., 2016). Yapılan birçok çalışmada, iyileştirilmiş hava kalitesinin embriyo kalitesi üzerine etkisini araştırmıştır (Boone et al., 1994, Boone et al., 1999, Johnson et al., 2016). Bu çalışmada, laboratuvarda yatay inkübatörlerde kullandığımız CO2 gazının saflığını filtresiz ve filtreli olarak incelediğimizde; gazın içerisinde bulunan bazı maddelerin saflık derecelerinin uygun olmadığını, filtre kullandıktan sonra saflığın yüksek miktarda arttığını gözlemledik. Bunun embriyo kalitesine etkisini araştırmak üzere hastaların 2PN görülen embriyolarını kendi içlerinde Grup 1 ve Grup 2 şeklinde iki gruba ayrılarak, üçüncü ve beşinci gün embriyo kalitelerini inceledik. Üçüncü gün embriyo kaliteleri ve blastosist oranlarını incelendiğimizde Grup 1 de; Grup 2 ye göre anlamlı artışlar gözlemledik (Şekil 4.3). Filtreleri de kendi aralarında 39

52 karşılaştırdığımız da filtreler arasında da fark gözlemledik. Ekstra filtre uygulanan gruplar arasında üçüncü gün ve beşinci gün embriyo kalitelerini karşılaştırdığımızda istatistiksel olarak anlamlı bir fark görmedik (Tablo 4.2). Yapılan diğer bir çalışmaya baktığımızda; Munch et al. (2014) karbon filtrasyonu nun yardımcı üreme teknolojisine etkisinin araştırılması için yaptığı çalışmada laboratuvarda kullandıkları hava kontrol ünitesini karbon filtresi ile ve filtresiz olarak test ederek fertilizasyon, klivaj ve blastosist oluşum oranlarını incelemiştir. Sonuç olarak karbon filtresinin fertilizasyon, klivaj ve blastosist oluşum oranlarını yükselttiğini göstermişlerdir. Heitmann et al. (2015) yaptıkları çalışma da laboratuvarın hava kalitesini arttırdıklarında embriyo implantasyon oranının %24,3 ten %32 ye, canlı doğum oranının ise %31,8 den %39,3 e çıktığını gözlemlemişlerdir te Bento ve Esteves in yaptığı bir diğer çalışmada Brezilya ulusal temiz oda standartlarının uygulanmasından sonra bir IVF laboratuvarının yılları arasında ICSI sonrası IVF sonuçlarını karşılaştırmışlardır. Araştırmacılar, iki çalışma dönemi arasında spontan düşük oranının %28,7 den %20 ye düştüğünü, canlı doğum oranlarının ise %25,8 den %35,6 ya yükseldiğini göstermişlerdir. Bununla birlikte, çalışma döneminin geniş zaman aralığında oluşundan dolayı laboratuvar ve yardımcı üreme tekniklerindeki diğer ilerlemelerin de embriyo gelişimine etkisi olabileceğini düşündürmektedir. Yaptığımız bu çalışmada, yapılan diğer araştırmaların aksine filtreli ve filtresiz karşılaştırmaları eş zamanlı olarak değerlendirdiğimiz için daha güvenilir bir sonuç elde ettiğimizi düşünüyoruz yılında Khoudja et al. yaptıkları araştırmada laboratuvarda kullandıkları HEPA filtrelere ek olarak yeni teknoloji hava temizleme filtresi kullanarak embriyo kalitesinde ve doğum oranında artış ayrıca spontan düşüklerde azalma gözlemlemişlerdir. VOC lerin azaltılması ile embriyo kalitesinde artış olacağını belirtmişlerdir. Embriyo kalitesindeki bu değişikliğin asıl nedeni olarak ise ölçümlerde CO2 gazının içerisinde bulunan formaldehit fazlalığının etkisi olduğunu öngörerek buna karşı önlemler almışlardır. Araştırmacılar IVF sonuçlarını iyileştirmek için hava kalitesinin embriyo gelişimi üzerindeki temel etkileri üzerine daha fazla araştırma yapılması gerektiğini belirtmişlerdir. Bizim çalışmamızda laboratuvarlarda kullandığımız CO2 gazını incelediğimizde içerisinde Etilmetil keton, Tetrahidrofuran, Fenol, 2-heptenol ve Formaldehid maddelerinin safsızlıklarının uygun olmadığını tespit ettik (Tablo 4.1). Ekstra filtre kullanıldığı 40

53 zaman ise bu safsızlık oranlarının büyük oranda azaldığını gözlemledik. Fakat CO2 gazı içerisindeki bazı türlerin miktarlarının fazla olması nedeni ile herhangi bir ekstra filtre sonrasında kalan miktarların hala fazla olduğunu gözlemledik (Tablo 4.1). Eğer bu türlerce daha temiz bir CO2 kaynağı bulunabilirse, ekstra filtre eklendikten sonra sonuçta daha kaliteli bir karbondioksit elde edilebilir. Lin et al. (2019) da yaptığı çalışmada memeli oosit olgunlaşması ve preimplantasyon embriyo gelişiminde ER stres ve UPR nin etkisini araştırmışlardır. ER stresi genellikle oosit olgunlaşması ve / veya erken embriyo gelişiminde olumsuz bir rol oynadığını görmüşlerdir. In vitro insan embriyo üretimi sırasında ER stresi ile in vitro gelişim arasındaki mekanik ilişkilerin anlaşılması yardımlı üreme teknolojisinin gelişmesine yardımcı olabileceğini belirtmişlerdir. ER stresi ve UPR sinyal yolağının oosit olgunlaşması ve pre-implantasyon embriyolarının gelişiminde çok önemli rolleri vardır. Birçok faktör ER'yi, yeni protein sentezini ve protein işlemesini olumsuz etkileyebilir bu da ER stresi ve UPR sinyal yanıtlarını başlatır. ER stresine uyarlanabilir bir yanıt olarak UPR, katlanmamış veya yanlış katlanmış proteinlerin temizlenmesini ve hücre hayatta kalmasını kolaylaştırır. ER de protein katlanmasını GRP78, GRP94, lektin benzeri proteinler ve foldazlar sağlar. Boone et al yılları arasında yaptığı kohort çalışmasında ise VOC nin gebelik oranına etkisini araştırmış ve VOC nin azaltılmasıyla oosit ve embriyo kalitesinde artış gözlemlemişlerdir. Fakat hava kalitesinin etkisinin doğrudan ne ile ilgili olduğunun araştırılmasına ihtiyaç duyulduğunu belirtmişlerdir. Yaptığımız araştırmada bunun sebebini araştırmak üzere BALB/C fareleri kullanarak deneysel bir çalışma gerçekleştirdik. Embriyo kalitesindeki artışın nedeni olarak Katlanamayan protein cevabının etkisini araştırmak üzere GRP78 protein seviyesini inceledik. GRP78 protein seviyesinin; Grup 2 (%61) de Grup 1 (%37) e göre yüksek olduğunu gözlemledik (Şekil 4.4). Swain 2014 yılında yaptığı çalışmada embriyo kültürü inkübatörlerinin karşılaştırmalı analizini yapmıştır. İnkübatör seçiminin, cihazların embriyo gelişimini etkileyebilecek çeşitli çevresel değişkenleri düzenlediğinden, IVF laboratuvarı için en önemli kararlardan biri olduğunu belirtmiştir. İnkübatörün gaz kapasitesi ve sensör tipi gibi işlevsel yönlerinin yanı sıra sıcaklık kontrolü ve boyut / hasta kapasitesi de dikkate alınmalıdır. Daha küçük inkübatör üniteleri, özellikle masa üstü 41

54 / üstten yüklemeli cihazlar, daha hızlı gaz atmosferi ve sıcaklık geri kazanımı sağladığını gözlemlemiştir. Bununla birlikte, hiçbir çalışmanın, insan embriyo gelişimi veya klinik sonuçlar açısından herhangi bir spesifik inkübatör türünün belirgin bir avantajını açıkça göstermediğini belirtmiştir. Uygun işleyiş ve inkübatör performansını optimize etmede en önemli şey, uygun inkübatör yönetimidir. İnkübatör boyutundan veya kullanılan teknolojiden bağımsız olarak, vaka iş akışının yanlış yönetimi veya uygun kalite kontrolünün gerçekleştirilememesi, herhangi bir inkübatör tarafından sağlanan kültür koşullarını tehlikeye atabileceğini belirtmiştir Sonuç ve Öneriler Yaptığımız bu çalışmada yatay inkübatörlerde kullanılan CO2 in bildirildiği kadar temiz olmadığını, içerisinde embriyo kültürü için toksik olan moleküllerin bulunduğunu tespit ettik. Ekstra filtre kullandıktan sonra CO2 in saflığının yüksek miktarda arttığını gözlemledik. Bu artışın embriyo kalitesine etkisini incelemek üzere 30 çiftin embriyoları ekstra filtre olan (Grup 1) ve olmayan (Grup 2) şeklinde iki gruba ayrılarak incelendi. Grup 1 de, Grup 2 ye göre istatiksel olarak anlamlı derecede bir artış gözlemledik. Embriyo kalitesindeki bu artışta Katlanamayan Protein Cevabının rolünü araştırmak için deneysel bir çalışma yaptık. Ekstra filtre olan ve olmayan inkübatörlerde beklettiğimiz fare embriyolarındaki GRP78 proteinin seviyesini Western blot yöntemi ile incelediğimizde, protein seviyesinin Grup 2 de Grup 1 e göre yüksek olduğunu gözlemledik. Tüp bebek uygulamalarıyla gebelik elde edilmesinde laboratuvarda uygulanan her işlem çok büyük önem taşımaktadır. Embriyonun maruz kaldığı her türlü değişim strese neden olmaktadır ve bunun da embriyo gelişimini olumsuz yönde etkilediği bilinmektedir. Embriyo gelişimi olumsuz yönde etkileyen en önemli faktörlerden birisi de ortamda bulunan istenmeyen bileşenlerdir. Tüm embriyologlar içinde çalıştıkları laboratuvarın havasının temizliği ile yakından ilgilenirken gaz saflığının yeterli olduğunu düşünmektedirler. Biz yaptığımız bu çalışma ile tüp bebek laboratuvarlarında kullanılan gazların düşünüldüğü kadar temiz olmadığını, bu safsızlığın embriyo gelişimini olumsuz etkilediğini ve kullanılan inkübatörlere fazladan bir filtre takarak bu olumsuzluğun önüne geçilebileceğini göstermiş olduk. 42

55 Buna ek olarak, ortam hava/gaz safsızlığının uzun dönem kültürde (5 ya da 6 gün) embriyo gelişimini olumsuz etkilemesinde UPR rol aldığını göstermiş olduk. Bu tez çalışması sonucunda, tüp bebek laboratuvarlarında kullanılan inkübatörlere fazladan filtre eklenmesinin embriyolar üzerindeki stresi azaltarak daha iyi embriyo gelişimine ve buna bağlı olarak da daha yüksek gebelik sonuçları elde edilmesini sağlayacaktır. 43

56 6. KAYNAKLAR Baltz, J. M., (2013), Connections between preimplantation embryo physiology and culture. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 30(8), Basar, M., Bozkurt, I., Guzeloglu-Kayisli, O., Sozen, B., Tekmen, I., (2014), Unfolded protein response prevents blastocyst formation during preimplantation embryo development in vitro. Fertility and Sterility, 102(6), Betz, D., Fane, K., (2019), Human Chorionic Gonadotropin (HCG). StatPearls Publishing. Boone, W. R., Johnson, J. E., Price, T. M., Bowers, B. K., Morris, M. D., (1994), In vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) comes to the upstate. Journal of the South Carolina Medical Association, 90(08), Boone, W.R., Crane, M. M., Johnson, J. E., Locke, A. J., Price, T. M., (1999), Control of air quality in an assisted reproductive technology laboratory. Fertility and Sterilty, 71(1), Bravo, R., Parra, V., Gatica, D., Rodriguez, A. E., Torrealba, N., (2013), Endoplasmic Reticulum and the Unfolded Protein Response: Dynamics and Metabolic Integration. International Review of Cell and Molecular Biology, 301, Catt, J. W., Henman, M., (2000), Toxic effects of oxygen on human embryo development. Human Reproduction, (Suppl 2), Cecchi, M., Cohen, J., Hall, J., Gilligan, A., Schimmel, T., ( 1998), The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Human Reproduction, 13(4), Cecchi, M., Esposito, B., Gilligan, A., Garrisi, G.J., Schimmel, T., ( 1997), Removal of volatile organic compounds from incubators used for gamete and embryo culture. Fertility and Sterilty, 68(1), 165. Chansel-Debordeaux, L., Dagorne, V., Mercier, M., Soula, V., Chauzit, E., (2018), Method validation of a critical parameter in human embryos culture: culture media ph. Ann Biol Clin (Paris), 76(3),

57 Chronopoulou, E., Harper, J. C., (2015), IVF culture media: past, present and future. Human reproduction update, 21(1), Cohen, J., Dale, B., Esposito, W., Gilligan, A., Schimmel, T., (1997), Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Human Reproduction, 12(8), Cole, L. A., (2010), Biological functions of hcg and hcg-related molecules. Reprod. Biol. Endocrinol., 8, 102. Cole, L. A., (2012), hcg, the wonder of today's science. Reprod. Biol. Endocrinol., 28;10:24. Corazzari, M., Gagliardi, M., Fimia, G. M., Piacentini, M., (2017), Endoplasmic Reticulum Stress, Unfolded Protein Response, and Cancer Cell Fate, Frontiers in Oncology Journal, 7, 78. Dadvand, P., Rankin, J., Rushton, S., Pless-Mulloli,T., (2011), Association between maternal exposure to ambient air pollution and congenital heart disease: a register-based spatiotemporal analysis. American Journal of Epidemiology, 173(2), Das, N., Kumar, T. R., (2018), Molecular regulation of follicle-stimulating hormone synthesis, secretion and action. Journal of Molecular Endocrinology, 60(3), De Los Santos, M. J., Jackson, K.V., Kelley, JR., Racowsky C. vd., (1999). Carbon-Activated Air Filtration Results in Reduced Spontaneous Abortion Rates Following IVF. Proceedings of the 11 th World Congress on In Vitro Fertilization and Human Reproductive Genetics. Clean Room Technology in ART Clinics: A Practical Guide Sydney: Australia, s: Deenadayal, M., Gunasheela, D., Gutgutia, R., Haripriya, G., Govindarajan, M., (2013), Luteinizing hormone and follicle stimulating hormone synergy: A review of role in controlled ovarian hyper-stimulation. J Hum Reprod Sci., 6(4): Denson, V., (2006), Diagnosis and management of infertility. J Nurse Pract, 1:

58 Dickey, R. P., Potts, A., Wortham, J. W. E., Welch, A., (2010), Effect of IVF laboratory air quality on pregnancy success. Fertility and Sterilty, 94(4):151. Esteves, S. C., Bento, F. C., (2013), Implementation of air quality control in reproductive laboratories in full compliance with the Brazilian Cells and Germinative Tissue Directive. Reproductive Biomedicine Online, 26(1), Esteves, S. C., Bento, F. C., (2016), Air quality control in the ART laboratory is a major determinant of IVF success. Asian Journal of Andrology, 18(4): Esteves, S. C., Bento, F. C., (2016), Implementation of cleanroom technology in reproductive laboratories: the question is not why but how. Reproductive Biomedicine Online, 32,9-11. Esteves, S., Gomes, A. P., Verza, S., (2004), Control of air pollution in assisted reproductive technology laboratory and adjacent areas improves embryo formation, cleavage and pregnancy rates and decreases abortion rate: comparison between a class 100 (ISO 5) and a class (ISO 6) cleanroom for micromanipulation and embryo culture. Fertil Steril, 82(2), Evenson, D. P., Rubes, J., Selevan, S. G., Vozdova, M., Zudova, D., (2005), Episodic air pollution is associated with increased DNA fragmentation in human sperm without other changes in semen quality. Human Reproduction, 20(10), Freeman, M. E., Kanyicska, B., Lerant, A., Nagy, G., (2000), Prolactin: structure, function, and regulation of secretion. Physiological Reviews, 80(4), Gardner, D. K., Lanne, M., (2017), Embryo Culture Systems. In: Handbook Of In Vitro Fertilization. Gardner, D. K., Simón, C., CRC Press; 4 Edition. Gardner, M. B., Pincus, D., Gotthardt, K., Gallagher, M. C., (2013), Endoplasmic Reticulum Stress Sensing in the Unfolded Protein Response, Cold Spring Harb Perspect Biol., 5(3). Grootjans, J., Kaser, A., Kaufman, R.J., Blumberg, R.S., (2017), The unfolded protein response in immunity and inflammation. Nat Rev Immunol., 16(8):

59 Gruber, I., Klein, M., (2011), Embryo culture media for human IVF: which possibilities exist? Journal of the Turkish-German Gynecological Association, 12(2), Hall, J., Gilligan, A., Schimmel, T., Cecchi, M., Cohen, J., (1998), The origin, effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture. Human reproduction, 13(4), Heitmann, R. J., Hill, M. J., James, A. N., Schimmel, T., Segars, J. H., (2015), Live births achieved via IVF are increased by improvements in air quality and laboratory environment. Reproductive Biomedicine Online, 31(3), Hill, D. (2001), Role of the in vitro fertilization laboratory in a negative pregnancy outcome. Fertility and Sterilty, 75(2), Huang, S., Xing, Y., Liu, Y., (2019), Emerging roles for the E.R. stress sensor IRE1α in metabolic regulation and disease, J. Biol. Chem., 294(49): Ibrahim, I.M., Abdelmalek, D.H., Elfiky, A.A., (2019), GRP78: A Cell's Response to Stress. Life Sci., 226: İrez, T., Erkan, M., (Çev.) (2016), BRS: Embriyoloji. Dudek, R.W., BRM: Embryology, Wolters Kluwer Yayınevi. Janny, L., Menezo, Y., J., (1996), Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation. Mol. Reprod. Dev., 45(1):31-7. Jin, D. I., Zhang, J. Y., Diao, Y. F., Kim, H. R., Lim, H., (2012), Inhibition of Endoplasmic Reticulum Stress Improves Mouse Embryo Development. Public Library of Science One, 7(7), e Johnson, J. E., Boone, W. R., Bernard, R. S., The effects of Volatile Compounds (V.C.) on the outcome of in vitro mouse embryo culture. Fertil Steril, (Suppl 1): S98-9 Khoudja, R. Y., Xu, Y., Li, T., Zhou C. (2012), Better IVF outcomes following improvements in laboratory air quality. Journal of assisted reproduction and genetics, 30(1),

60 Kim, H. J., Yoon, H. J., Jang, J. M., Lee, W. D., Yoon, S. H., Lim, J. H., (2017), Evaluation of human embryo development in in vitro fertilization- and intracytoplasmic sperm injection-fertilized oocytes: A time-lapse study. Clinical and Experimental Reproductive Medicine, 44(2), Kim, J. H., Shin, M. S., Yi, G., Jee, B. C., Lee, J. R., (2012). Serum biomarkers for predicting pregnancy outcome in women undergoing IVF: human chorionic gonadotropin, progesterone, and inhibin A level at 11 days post-et. Clin Exp Reprod Med, 39, Lai, E., Teodoro, T., Volchuk, A., (2007), Endoplasmic Reticulum Stress: Signaling the Unfolded Protein Response. Physiology (Bethesda, Md.), 22: Lin, T., Lee, J. E., Kang, J. W., Shin, H. Y., Lee, J. B., (2019) Endoplasmic Reticulum (E.R.) Stress and Unfolded Protein Response (UPR) in Mammalian Oocyte Maturation and Preimplantation Embryo Development. International Journal of Molecular Sciences, 20(2),409. Little, S. A., Mirkes, P. E., (1990), Relationship of DNA damage and embryotoxicity induced by 4- hydroperoxydechosphamine in postimplantation rat embryos. Teratology, 41(2), Mehta, R. H., (2001), Growth of human preimplantation embryos in vitro. Reproductive BioMedicine Online, 2, Meng, Z., Zhang, L. Z. (1990), Chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges in lymphocytes of workers exposed to sulfur dioxide. Mutation Research, 241(1), Michalak, M., Gye, M. C., (2015), Endoplasmic reticulum stress in periimplantation embryos. Clinical and Experimental Reproductive Medicine, 42(1), 1-7. Morbeck, D. E., (2015), Air quality in the assisted reproduction laboratory: a minireview. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 32(7): Morin, S. J., (2017), Oxygen tension in embryo culture: does a shift to 2% O2 in extended culture represent the most physiologic system?, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 34(3),

61 Mortimera, D., Cohenb, Mortimera, S.T., Fawzyc, M., McCullohd, D.H., Morbecke, D.E., (2018), Cairo consensus on the IVF laboratory environment and air quality: report of an expert meeting. Reproductive biomedicine online, 36(6), Munch, E. M., Sparks, A. E., Duran, H. E., Van Voorhis, B. J., (2015), Lack of carbon air filtration impacts early embryo development. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 32(7), Munch, E. M., Sparks, A. E., Van Voorhis, B. J., Duran, H. E., (2014), Poor laboratory air quality and its impact on early embryo development. Fertil Steril, 101(2),e14. Oakes, S. A., Papa, F. R., (2015), The Role of Endoplasmic Reticulum Stress in Human Pathology. Annu Rev Pathol., 10: Orlowski, M., Sarao, M. S. (2018), Physiology, Follicle Stimulating Hormone. StatPearls Publishing. Ozawa, M., Nagai, T., Kaneko, H., Noguchi, J., Ohnuma, K., Kikuchi, K., (2006), Successful pig embryonic development in vitro outside a CO2 gas- regulated incubator: effects of ph and osmolality. Theriogenology, 65(4), Palter, S., DiPaola, K., Sparks, A. E., Degelos, S., Koulianos, G. T., (2016), Multicenter study: innovative control of ambient air quality in multiple IVF laboratories is associated with statistically significant improvements in clinical outcomes - analysis of 5319 cycles. Fertil Steril, 106, e27-e28. Poletto, K. Q., de Lima, Y. A. R., Approbato, M. S., (2018), Effect of the Air Filtration System Replacement on Embryo Quality in the Assisted Reproduction Laboratory. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, 40(10), Ritz, B., Wilhelm, M., (2008), Ambient air pollution and adverse birth outcomes: methodologic issues in an emerging. Field Basic Clin Pharmacol Toxicol, 102(2), Rozpędek, W., Pytel, D., Mucha, D., Leszczyńska, H., Diehl, J. A., (2016), The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress, Curr. Mol. Med., 16(6):

62 Sanders, F. J., May, P. B., Donabedian, R.K., (1975), In vitro pituitary responsiveness to gonadotropin-releasing hormone (LH-RH) in intact and castrated male and female rats. Molecular and Cellular Endocrinology, 3(1), Schwarz, D. S., Blower, M. D., (2016), The endoplasmic reticulum: structure, function and response to cellular signaling. Cellular and Molecular Life Sciences, 73(1), Sene, I.S., Carvalho, B.F., Freitas, T.A.F., Pádua, L.E.M., Sousa, G.N.S., Bona, L.N. (2009), Comparing HEPA versus HEPA-VOC filtration system: influence on embryo quality and clinical outcomes of in vitro fertilization. Fertility and Sterilty, 92(3), 234. Simopoulou, M., Sfakianoudıs, K., Rapani, A., Gıannelou, P., Anifandis, G., (2018), Considerations Regarding Embryo Culture Conditions: From Media to Epigenetics. In Vivo, 32(3), Smitz, J., Wolfenson, C., Chappel, S., Ruman, J. (2016), Follicle-Stimulating Hormone: A Review of Form and Function in the Treatment of Infertility. Reproductive sciences, 23(6), So, S. J., (2018), Roles of Endoplasmic Reticulum Stress in Immune Responses, Mol. Cells., 41(8): Swain, J. E., Carrell, D., Cobo, A., Meseguer, M., Rubio, C., Smith, G. D., (2016), Optimizing the culture environment and embryo manipulation to help maintain embryo developmental potential. Fertil Steril, 105(3), Swain, J.E., (2010), Optimizing the culture environment in the IVF laboratory: impact of ph and buffer capacity on gamete and embryo quality. Reproductive biomedicine online, 21(1), Swain, J.E., (2014), Decisions for the IVF laboratory: comparative analysis of embryo culture incubators. Reproductive biomedicine online, 28(5), Tanoomand, A., Hajibemani, A., Abouhamzeh, B., (2019), Investigation of the association of idiopathic male infertility with polymorphisms in the methionine synthase (MTR) gene. Clin Exp Reprod Med, 46(3):

63 Tao, T., Robichaud, A., Mercier, J., Ouellette, R., (2012), Influence of group embryo culture strategies on the blastocyst development and pregnancy outcome. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 30(1): Tarahomi, M., Melker, A., Wely, M., Hamer, G., Repping, S., Mastenbroek, S., (2018), ph stability of human preimplantation embryo culture media: effects of culture and batches. Reproductive biomedicine online, 37(4), Telfer, E.E., (2019), Future Developments: In Vitro Growth (IVG) of Human Ovarian Follicles. Acta Obstet Gynecol Scand., 98(5): Tıraş, M.B., Demir, S.C., (Çev.) (2014), Güncel Obstetrik ve Jinekoloji Tanı ve Tedavi, Decherney, A.H., Nathan, L., Laufer, N., Roman, A.S., Current Diagnosis and Treatment Series, McGraw-Hill Yayınevi. Wale, P. L., Gardner, D. K., (2016), The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human reproduction update, 22(1), Wang, M., Wey, S., Zhang, Y., Lee, A. S., (2009), Role of the Unfolded Protein Response Regulator GRP78/BiP in Development, Cancer, and Neurological Disorders. Antioxid Redox Signal., 11(9), Yamaguchi, M., Ohba, T., Tashiro, H., Yamada, G., Katabuchi, H., (2013), Human chorionic gonadotropin induces human macrophages to form intracytoplasmic vacuoles mimicking Hofbauer cells in human chorionic villi. Cells Tissues Organs (Print), 197, Yang, X., Wu, L. L., Chura, L. R., Liang, X., Lane, M., Norman, R. J., Robker, R. L., (2012), Exposure to lipid-rich follicular fluid is associated with endoplasmic reticulum stress and impaired oocyte maturation in cumulus-oocyte complexes. Fertility and Sterility, 97(6), Zhang, J. Y., Diao, Y. F., Oqani, R. K., Han, R. X., Jin, D. I., (2012), Effect of Endoplasmic Reticulum Stress on Porcine Oocyte Maturation and Parthenogenetic Embryonic Development In Vitro. Biology of Reproduction, 128,

64 Zhou, H., Zhang, Y., Fu, Y., Chan, L., (2011), Novel mechanism of anti- apoptotic function of 78-kDa glucose-regulated protein (GRP78): endocrine resistance factor in breast cancer, through release of B-cell lymphoma 2 (BCL-2) from BCL-2- interacting killer (BIK). J Biol Chem., 286: Zhu, G., Lee, A. S., (2015), Role of the Unfolded Protein Response, GRP78 and GRP94 in Organ Homeostasis, J. Cell. Physiol., 230(7):

65 7. EKLER Ek 1: Etik Kurul Onayı 53

66 Ek 2: Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Onayı 54

67 Ek 3: Hastane İzin Belgesi 55

68 Ek 4: Gaz Analiz Raporu HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ DÖNER SERMAYESİ İŞLETME MÜDÜRLÜĞÜ NE ANKARA Tekservis Teknik ve Tıbbi Ürünler Pazarlama Sanayi Ticaret LTd.Şti. tarafından gönderilen 3 adet ve aktif karbon ile doldurulduğu belirtilen kod numaralı Hollanda menşei, 11/15B kod numaralı Amerikan menşei ve kod numaralı Türkiye menşei dolgulu kolonlar ile yine tarafınızdan sağlanan CO 2 gazı içerisindeki safsızlıkların ne olduğu ve bu safsızlıklardan hangilerinin ve ne oranda bu gönderilen kolonlardan geçirildikten sonra tutunduğu (adsorplandığı) ile ilgili çalışmalarla birlikte kod numaralı Türkiye menşei dolgulu kolonun kapasite doygunluğuna ulaşana kadar ne kadar CO 2 gazı geçirilebileceği ve bir başka deyişle hangi süre ile emniyetli bir şekilde çalışabileceği bilgileri istenmiştir. Laboratuvarımızda var olan Termal Desorber-Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile işlemler gerçekleştirilmiş ve gaz içerisindeki safsızlıklar en az 1000 kat zenginleştirilerek ve yine en az 10 tekrar yapılarak tayin edilmiştir. Bunun yanı sıra kolonlar içerisindeki aktif madde miktarları ile yüzey alanları tayin edilerek fiziksel karakterizasyonları da gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak istenen tüm bilgiler aşağıdaki analiz raporunda sunulmuştur. Gereğini bilgilerinize sunarım. Saygılarımla, Prof. Dr. Bekir Salih Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyesi 56

69 Tekservis Teknik ve Tıbbi Ürünler Pazarlama Sanayi Ticaret LTd.Şti. Tarafınızdan gönderilen 3 adet ve aktif karbon ile doldurulduğu belirtilen kod numaralı Hollanda menşei, 11/15B kod numaralı Amerikan menşei ve kod numaralı Türkiye menşei dolgulu kolonlar ile ve yine tarafınızdan sağlanan CO 2 gazı içerisindeki safsızlıkların ne olduğu ve bu safsızlıklardan hangilerinin ne kadar bu gönderilen kolonlardan geçirildikten sonra tutunduğu ile ilgili çalışmalarla birlikte kod numaralı Türkiye menşei dolgulu kolonun kapasite doygunluğuna ulaşana kadar ne kadar CO 2 gazı geçirilebileceği ve bir başka deyişle hangi süre ile emniyetli bir şekilde çalışabileceği bilgileri istenmiştir. Laboratuvarımızda var olan Termal Desorber-Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile işlemler gerçekleştirilmiş ve gaz içerisindeki safsızlıklar en az 1000 kat zenginleştirilerek ve yine en az 10 tekrar yapılarak tayin edilmiştir. Bunun yanı sıra kolonlar içerisindeki aktif madde miktarları ile yüzey alanları tayin edilerek fiziksel karakterizasyonları da gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak istenen tüm bilgiler aşağıdaki analiz raporunda sunulmuştur. Gereğini bilgilerinize sunarım. Saygılarımla, Prof. Dr. Bekir Salih Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyesi 59

70 ANALİZ RAPORU 1. Fiziksel veriler kod numaralı Hollanda menşei kolon dolgu maddesinin miktarı: g, yüzey alanı m 2 /g olarak /15B kod numaralı Amerikan menşei kolon dolgu maddesinin miktarı: g, yüzey alanı m 2 /g olarak kod numaralı Türkiye menşei kolon dolgu maddesinin miktarı: g, yüzey alanı m 2 /g olarak dir. Yüzey alanları açısından değerlendirildiğinde tüm kolonlardaki malzemenin yüzey alanlarının oldukça büyük olduğu ve bu nedenle yüksek adsorpsiyon kapasitesine sahip oldukları ve bu amaç için uygun bir şekilde kullanılabilir oldukları tespit edilmiştir kod numaralı kolon içerisindeki malzeme mikron boyutunda olup çubuk şeklindedir. Diğer iki malzemenin ise partikül şekli toz halinde olup homojen bir yapıda değil ancak partiküllerin boyutları birbirlerine benzer durumlarda ve mikron boyutundadır. Ekte verilen BET deney verileri incelendiğinde tüm malzemelerin gözenekli yapıya sahip oldukları, bu durumun yüzey alanlarının artmasını sağladığını ve böylece adsorpsiyon kapasitelerinin yüksek olarak gerçekleşmesine neden olduğu tespit edilmiştir. Bu ise istenen bir durumdur. Her üç kolonda da kullanılan aktif karbon malzemelerinin farklı kaynaklardan elde edilen malzemelerden işlenerek üretildiklerinden dolayı karbondioksit içerisindeki farklı safsızlık türlerine karşılık farklı adsorpsiyon ilgisi göstermektedirler. Ancak tüm malzemeler safsızlık giderimin de aynı yüzdelerde olmamakla birlikte etkin bir şekilde kullanılabilecekleri aşağıda verilen tablodaki giderim değerlerinden açıkça görülmektedir. 2. Gönderilen CO 2 gaz örneği içerisindeki safsızlıklar ve giderim yüzdelerinin belirlenmesi Tablo 1. Üç farklı kolondan geçirilen karbondioksit in safsızlıklarının giderim yüzdeleri en az 10 farklı deney yapılarak ve yüzdeler maksimum % 0.5 standart hata ile belirlenmiştir. Kullanılan karbondioksit içerisindeki safsızlıkların yüzdesinin belirlenmesi için yapılan deneyden elde edilen sonuçlar birinci kolondaki safsızlıklar adları ile birlikte yüzde safsızlık değerleri ikinci kolonda verilmiştir. 60

71 Safsızlık adı Safsızlık Yüzdesi (%) Giderim Yüzdesi Uluslararası normlara Göre /15B H 2O (Su) Uygun 2-metil propen Uygun Etanol Uygun Etilmetil keton Uygun Değil Propanol Uygun Bütanol Uygun 2-metil pentan Uygun 3-metil pentan Uygun n-hekzan Uygun Etil asetat Uygun Tetrahidrofuran Uygun Değil Siklopentanon Uygun 2,3-dimetil heptan Uygun Etil benzen Uygun Alfapinen Uygun Fenol Uygun Değil Asetikasit fenil 61

72 esteri Uygun 2-heptenol Uygun Değil Oktanol Uygun Nonanal Uygun Dekanal Uygun Asetikasit oktil Esteri Uygun 2,4-diklorobenzoik asit Uygun Formaldehid Uygun Değil Toluen Uygun Benzen Uygun Asetaldehid Uygun Trikloretan Uygun NOT: Uygun değil denilen parametrelerin temizlenme sonrası miktarları oldukça düşürülmektedir ve karbondioksit kalitesi oldukça fazla artırılmaktadır. Ancak bu türlerin karbondioksitin üretiminden kaynaklanan proseslerden olabileceği ve daha kaliteli karbondioksitin varlığında çok daha yüksek saflıkta karbondioksit elde edilebilmesi mümkün olabilecektir. Ancak kolonlardan geçirilen gazın kalitesi en az %80 daha iyi bir duruma getirilebilmektedir ve daha emniyetli bir şekilde kullanılabilir haldedir. Orijinal karbondioksitin (arıtmadan önce) içerisindeki saflık yüzdesi % dir. Tablodan görüldüğü üzere giderim sonucunda birçok türün giderimi büyük oranda sağlanmış ancak Karbondioksit içerisindeki bazı türlerin miktarları fazla olması nedeni ile herhangi bir giderim sonrasında kalan miktarlarının hala fazla olduğu gözlemlenmiştir. Eğer bu türlerce daha temiz bir karbondioksit kaynağı bulunabilirse sonuçta daha kaliteli bir karbondioksit elde edilmiş olur (Kolondan 62

73 geçirildikten sonra). Bir başka önerilecek yol ise iki kolonun seri olarak bağlanması veya kolon boyunun uzatılmasıdır. Tüm bu karbondioksit safsızlıklarına rağmen gaz kalitesi kolondan geçirildikten sonra %80 daha iyi hale getirilmektedir. Diğer taraftan Türkiye menşei olan kod numaralı kolonun diğer kolonlarla karşılaştırılabilir olduğu hatta bazı kimyasal safsızlıkların giderimin de daha başarılı olduğu gözlemlenmiştir. 0,0018 0,0016 0,0014 0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 Önce 0 H2O (Su) 2-metil propen Etanol Etilmetil keton Propanol Bütanol Safsızlıkların Yüzdesi 2-metil pentan 3-metil pentan n-hekzan Etil asetat Tetrahidrofuran Siklopentanon 2,3-dimetil heptan Etil benzen Alfapinen Fenol Asetikasit fenil esteri 2-heptenol Oktanol Nonanal Dekanal Asetikasit oktil Esteri 2,4-diklorobenzoik asit Formaldehid Toluen Benzen Asetaldehid Trikloretan Şekil 1. Toplam gaz miktarına göre safsızlıkların yüzdesi. (A) Kırmızı işlem görmeden önce ve (B) mavi işlem gördükten sonra. Şekil 1 den görüldüğü üzere su ve bütanol hariç diğer tüm kimyasal maddelerin kolondan geçirildiklerinde giderimlerinin yüzdeleri oldukça yüksek olarak bulunmuştur. Aşağıda elde edilen bazı sonuçlar grafiksel olarak verilmiştir. Bu grafiklerden her üç kolondan geçirilen karbon dioksitin içerisindeki safsızlıkların nasıl değiştiği izlenebilmektedir. İzlemelerin daha açık bir şekilde yapılabilmesi için sistemdem elde edilen toplam iyon kromatogramının bazı bölgeleri genişletilerek değişikliklerin izlenmesinin daha kolay yapılabilmesi sağlanmış ve bu kromatogram bölgeleri Şekil 2 in devamında verilmiştir. 63

74 Şekil 2. Üç farklı kolon dolgu maddesi ile yapılan arıtma sonrası ve hiç arıtmadan Termal Desorber- Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile yapılan analiz sonucu elde edilen toplam iyon kromatografisinin 0. Dakika ile 25. Dakika arasında alınan kromatogramı. Siyah arısma yapılmamış karbondioksiti, Mavi /15B kodlu kolondan geçirildikten sonra, Yeşil kod no lu kolondan geçirildikten sonra ve Kırmızı kod no lu kolondan geçirildikten sonra alınan kromatogramları göstermektedir. İzleyen kromatogramlar ise bu geniş bölgeyi içeren kromatogramın belli bölgelerini detaylı olarak göstermektedir. Yine renkler aynı sıralamaları içermektedir. Şekil 2a, Şekil 2 deki kromatogramın alıkonma zamanı dakikalar arasındaki bölgesinin açılmış halini göstermektedir. 64

75 Şekil 2b. Şekil 2 deki kromatogramın alıkonma zamanı dakikalar arasındaki bölgesinin açılmış halini göstermektedir. Şekil 2c. Şekil 2 deki kromatogramın alıkonma zamanı dakikalar arasındaki bölgesinin açılmış halini göstermektedir. 65

76 Şekil 2d. Şekil 2 deki kromatogramın alıkonma zamanı dakikalar arasındaki bölgesinin açılmış halini göstermektedir. Şekil 3. Tetrahidrofuran ın kütle spektrumu. (Üstte görülen kromatogramda ci dakikada çıkan pike ait Kütle Spektrumu) 66

77 Şekil 4. 2,4-Diklorobenzoik asit in kütle spektrumu. (Üstte görülen kromatogramda ci dakikada çıkan pike ait Kütle Spektrumu) Şekil 3 ve Şekil 4 de ise kromatogramda gözlenen piklerin hangi kimyasal türlere ait olduğunu belirlemek için o piklerin üzerindeki herhangi bir noktada elde edilen kütle spektrumları ile birlikte verilmiştir. Sistemin veri bankasında bulunan tüm maddelerin spektrumları ile bunlar otomatik olarak karşılaştırılıp maddenin türünün belirlenmesi yapılmış ve sonuçlarda Tablo 1 de sunulmuştur. Piklerin altındaki alanlar da integre edilerek madde miktarlarının yüzdesine geçilerek safsızlık yüzdeleri tespit edilmiş ve yine Tablo 1 de verilmiştir kod numaralı kolona ait adsorpsiyon kapasitesi değerinin belirlenmesi Yukarıda verilen numaralı kolondan sürekli karbondioksit gazı geçirilerek kolonun çalışma kapasitesi test edilmiştir. Bu ölçümler sonucu saatte 1 m 3 gaz geçirilmesi (Normal koşullara altında: 25 o C ve 1 atmosfer basınçta) sureti ile bu kolonun 8 aylık bir süre ile doygunluk kapasitesine ulaşmadan çalışabileceği belirlenmiştir. Bu veriler hem deneysel hem de eklerde verilen yüzey alanı bilgilerinden yola çıkılarak bulunmuştur. Prof. Dr. Bekir Salih Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyesi 67