ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Emine ÇINKILOĞLU CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ Emine ÇINKILOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez / / 2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza:... Prof. Dr. Nevin ÜNER JÜRİ BAŞKANI İmza:... Doç. Dr. Bedii CİCİK ÜYE İmza:... Yard. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2003YL4 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ Emine ÇINKILOĞLU ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Nevin ÜNER Yıl: 2007, Sayfa: 83 Jüri: Prof. Dr. Nevin ÜNER Doç. Dr. Bedii CİCİK Yrd. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ Bu araştırmada organofosforlu insektisid ve avisid fenthion içeren ortamda antioksidant ve GSH öncüsü NAC nin düşük (0,5mg/kg) ve yüksek (400mg/kg) intraperitonal dozlarının jüvenil Cyprinus carpio da beyin dokusunda GSH redoks durumuna, antioksidant enzim aktivitelerine, lipid peroksidasyonu ile protein düzeylerine ve AChE enzim aktivitesine etkileri incelenmiştir. Kontrol grubu dışında balıklar 96 saat süresince fenthionun LC 50 değerinin %80 inin etkisine bırakılmışlardır. Bileşiklerin GSH redoks durumuna etkilerini belirlemek amacıyla tgsh, GSH, GSSG düzeyleri ile GSH/GSSG oranı, antioksidant enzimlere etkilerini belirlemek amacıyla GR, GST, SOD ve CAT enzim aktiviteleri, lipid peroksidasyonuna etkilerini belirlemek amacıyla MDA düzeyi ve fenthionun nörotoksik potansiyelini belirlemek amacıyla AChE enzim aktivitesi spektrofotometrik yöntemler kullanılarak belirlenmiştir. Fenthion etkisinde kontrole göre tgsh, GSH düzeyleri ile GSH/GSSG oranında artışlar GSSG düzeyinde ise azalma belirlenmiştir. Fenthion CAT aktivitesi ile protein ve MDA düzeylerinde azalmaya neden olurken GST aktivitesinde artışa neden olmuştur. Düşük dozda NAC, tgsh, GSH düzeylerinde GSH/GSSG oranı ile GST ve SOD enzim aktivitelerinde artışa neden olurken GSSG düzeyinde azalmaya neden olmuştur. NAC yüksek dozda GSH/GSSG oranında artışa, GST aktivitesi ile protein düzeyinde ise azalmalara neden olmuştur. Fenthion tüm gruplarda AChE de inhibisyona neden olmamıştır. Bu sonuçlara göre fenthionun oksidatif strese bağlı toksisitesinde NAC nin düşük dozda GSH redoks kapasitesi ile GST ve SOD gibi antioksidant enzimlerin aktivitesini arttırarak oksidatif stresi azalttığı, yüksek dozda NAC nin ise beyinde GST aktivitesi ile protein düzeyini olumsuz etkileyerek oksidatif strese neden olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Fenthion, Glutatyon, N-asetilsistein, Lipid Peroksidasyonu, Balık. I

4 ABSTRACT MSc. THESIS EFFECTS OF FENTHION IN THE BRAIN OF CYPRINUS CARPIO ON ANTIOXIDANT DEFENCE SYSTEM, LIPID PEROXIDATION AND ACETYLCHOLINESTERASE ENZYME ACTIVITIES BY THE MODULATION OF N-ACETYLCYSTEINE Emine ÇINKILOĞLU UNIVERSITY of ÇUKUROVA INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY Supervisor: Prof. Dr. Nevin ÜNER Year: 2007, Page: 83 Jury: Prof. Dr. Nevin ÜNER Doç. Dr. Bedii CİCİK Yrd. Doç. Dr. Mehmet Sulanç The effects of low and high dose of NAC in the brain of organophosphate insecticide and avicide fenthion exposed Cyprinus carpio on GSH redox status, antioxidant and acetylcholinesterase enzyme activities, lipid peroxidation and protein levels was evaluated. Animals were injected with 0.5 mg/kg or 400 mg/kg of NAC intraperitoneally and exposed to 80% of LC 50 value of fenthion for 96-h. tgsh, GSH, GSSG, MDA, and protein levels, and GR, GST, SOD, CAT, and AChE enzyme activities were determined spectrophotometrically in brain tissue at the end of the 96-h. Fenthion treatment caused an increase in tgsh and GSH levels, GSH/GSSG ratio, and a decrease in GSSG levels. CAT enzyme activity, protein and MDA levels were decrease while an increase in GST activity was observed in the brain of fenthion-exposed C. carpio. Low dose NAC injection increases the tgsh and GSH levels, GSH/GSSG ratio, and SOD and GST enzyme activities. A significant decrease in higher NAC dose was observed in GST activity and protein levels, while GSH/GSSG ratio was elevated. No inhibition in AChE enzyme activity was found by fenthion treatment. In conclusion, NAC in lower dose alleviated the oxidative stress-inducing potential of fenthion with the elevation in GSH redox capacity, GST and SOD enzyme activities. Higher NAC dose elevated the oxidative stress-inducing potential of fenthion. Keywords: Fenthion, Glutathione, N-acetylcysteine, Lipid peroxidation, Fish. II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca her konuda yardım ve desteklerini gördüğüm tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Nevin ÜNER e; Sayın Yrd. Doç. Dr. Yusuf SEVGİLER e; Sayın Doç. Dr. Bedii CİCİK e; Sayın, Yrd. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ a, Uzman Biyolog Hülya DURMAZ ile Petek PİNER e ve değerli aileme teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELER DİZİNİ...VI ŞEKİLLER DİZİNİ....VIII 1. GİRİŞ Antioksidant Savunma Sistemi Süperoksid Dismutaz Katalaz Glutatyon Glutatyon Sentezi Glutatyon Redüktaz Glutatyon Redoks Döngüsü Ksenobiyotiklerin Detoksifikasyonu Glutatyon S-Transferazlar Pestisidler Organofosforlu Pestisidler Fenthion Asetilkolinestraz Lipid Peroksidasyonu Proteinlere Etkisi Beyin Dokusunun Önemi Kan Beyin Engeli Biyoindikatör Organizma ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Kimyasal Maddeler...34 IV

7 Cihazlar ve Diğer Gereçler Yöntem Analiz Yöntemleri Süperoksid Dismutaz Yöntemi Katalaz Yöntemi Total Glutatyon Yöntemi Okside Glutatyon Yöntemi Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Asetilkolinesteraz Yöntemi Malondialdehid Yöntemi Protein Yöntemi İstatistiksel Analiz BULGULAR Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri Antioksidant Enzim Aktivitelerine Etkileri Asetilkolinestraz Aktivitesine Etkileri Malondialdehid ve Protein Düzeylerine Etkileri TARTIŞMA Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri Antioksidant Enzim Aktivitelerine ve Lipid Peroksidasyonuna Etkileri Asetilkolinesteraz Aktivitesine Etkileri.65 6.SONUÇ VE ÖNERİLER...67 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Süperoksid Dismutaz Yöntemi.. Katalaz Yöntemi Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Total Glutatyon Yöntemi Okside Glutatyon Yöntemi Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Çizelge 3.7. Asetilkolinesteraz Yöntemi 46 Çizelge 3.8. Malondialdehid Standart Grafiğinin Hazırlanması 48 Çizelge 3.9. Malondialdehid Yöntemi 49 Çizelge 4.1. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri.. 53 Çizelge 4.2. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin antioksidant enzim aktivitelerine (U/mg protein) etkileri.. 55 Çizelge 4.3. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin AChE spesifik aktivitesine (U/mg protein) etkisi 56 Çizelge 4.4. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin MDA ve protein düzeyine etkileri.. 57 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1 Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin... 6 Şekil 1.2. Sistein ve N-asetilsisteinin (NAC) kimyasal yapısı.. 8 Şekil 1.3. Hayvanlarda glutatyonun sentezi ve dağılımı Şekil 1.4. Organofosfat (A), karbamat (B) ve piretroid (C) insektisidlerin kimyasal yapıları Şekil 1.5. Nörotransmitter asetilkolinin etki mekanizması ve asetilkolin (ACh) metabolizmasını bloke eden ilaçlar.. 19 Şekil 1.6. AChE aktivitesinin farklı mekanizmalar tarfından inhibisyonu Şekil 1.7. Bir omega-6 çoklu doymamış yağ asidi çeşidi olan linoleik asidin yapısı. 21 Şekil 1.8. Lipid peroksidasyonunun fazlarına genel bir bakış.. 22 Şekil 3.1. MDA standart grafiği 49 Şekil 4.1. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri. 53 Şekil 4.2 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin antioksidant enzim aktivitelerine etkileri. 55 Şekil 4.3. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin AChE enzim aktivitesine etkisi Şekil 4.4. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin protein ve MDA düzeylerine etkileri 58 VII

10 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU 1. GİRİŞ Biyolojik sistemler, serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri (ROS) gibi çeşitli radikallerin oluşumuna neden olan karmaşık zincir mekanizmalar içermektedir (Zhang ve ark., 2005). Serbest radikaller, paylaşılmamış bir ya da daha fazla elektron içeren moleküllerdir (Zwart ve ark., 1999). Radikal olmayan bir türün yalnızca bir elektron kaybetmesi ya da kazanmasıyla oluşmaktadırlar. Zayıf bir elektriksel alana sahip olmaları paylaşılmamış elektronlarından kaynaklanır. Bu özellikleri ile yüksek derecede reaktiftirler. ROS ya da oksidant terimi; sadece süperoksid (O -. 2 ) ve hidroksil (HO. ) gibi oksijen radikallerini değil, hidrojen peroksid (H 2 O 2 ) ve hipokloröz asit (HOCl) gibi bazı radikal olmayan oksijen türevlerini tanımlamak amacıyla kullanılmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Süperoksid anyonu, mitokondride normal solunum sürecindeki otooksidasyon reaksiyonlarında moleküler oksijenin (O 2 ) bir elektronla indirgenmesi sonucunda oluşan bir radikaldir. Elektron transport zinciri tam olarak korunamadığı için zincirden kaçan elektronların sitokrom oksidaza transferlerinden önce O 2 ye -. katılmaları, O 2 anyonunun oluşumu ile sonuçlanmaktadır (Evans ve Halliwell, 2001). O -. 2, direk hücre hasarına neden olmakla birlikte sitotoksisitesini daha reaktif türlerin oluşumuna neden olarak da gösterebilmekte ve dismutasyonu sonucunda H 2 O 2 oluşmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Hidrojen peroksid yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımayan bir moleküldür ve oksitleyici bir tür olarak kabul edilmesinin nedeni, demir (Fe) ya da bakır (Cu) varlığında HO. radikalinin öncüsü olmasıdır. Özellikle proteinlerin hem grubundaki Fe ile reaksiyona girerek reaktif Fe formlarını oluşturur. Oluşan reaktif Fe formları çok güçlü oksitleyicilerdir ve hücre membranında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimelerine neden olabilmektedir (Livingstone, 2001). Yüksüz olması sebebiyle hücre kompartmanları arasında kolaylıkla difüze olabilmektedir (Lledias ve ark., 1998). Endojen olarak oluşan H 2 O 2 ; suya (H 2 O) detoksifiye edilemezse; Fe tarafından katalizlenen Haber-Weiss ya da Fenton reaksiyonları sonucunda lipid peroksidasyonlarını başlatan ve çok kısa 1

11 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU ömürlü bir radikal olan HO. radikali ve türevlerine dönüşür (Reed, 2001) ve HO. radikali balıklar için çok tehlikeli bir türdür (Hidalgo ve ark., 2002). Haber-Weiss Reaksiyonu O H 2 O 2 + Fe 2+ O 2 + HO. + Fe 3+ + OH - (1) Fenton Reaksiyonu H 2 O 2 + Fe 2+ HO. + Fe 3+ + OH - (2) Hücrelerde ROS un oluşumunu başlatan birçok temel mekanizma bulunmaktadır. Hücre solunumu sırasında O 2, elektron taşıma sistemi içerisinde H 2 O ya indirgenmektedir. Bu indirgenme sırasında oluşan redükte ara bileşikler, prooksidant olarak görev yapmakla birlikte, hücrelerdeki ROS un birinci kaynağını oluşturmaktadır. ROS un oluşumununa neden olan ikinci hücresel kaynak ise bazı oksidasyon enzimleridir. Canlılarda, hücre içi oksiradikallerin üretimini arttıran ksenobiyotikler ise ROS un üçüncü kaynağıdır (Kelly ve ark., 1998). Kontaminantlar tarafından indüklenen sitokrom P 450 sistemi, hücrelerdeki ROS un oluşumunu hızlandırmaktadır. Ayrıca bilinen birçok ksenobiyotiğin mikrozomal enzimler tarafından metabolizasyonu sırasında da doğrudan serbest radikaller oluşmaktadır. Mitokondri, sitosol, endoplazmik retikulum, peroksizomlar ve lizozomlar gibi çeşitli hücre kısımlarında O 2 kullanımına bağlı olarak gelişen oksidatif prosesler sonucunda ROS oluşmaktadır (Cajarville ve ark., 2003) Çok reaktif özellikteki HO. radikali gibi ROS lar; DNA, protein ve lipidler gibi biyomolekülleri hızlıca oksitleyebilmektedir (Adams, 2002). Tüm aerobik hücrelerde ve dokularda ROS u detoksifiye ederek hücre yıkımlarını sınırlayan veya tamamen ortadan kaldırabilen antioksidant savunma sistemleri bulunmaktadır (Reed, 2001). Sağlıklı aerobik organizmalarda üretilen ROS ve reaktif nitrojen türleri (RNS) gibi oksidantlar, antioksidant savunma sistemi tarafından dengede tutulur. Bu kontrol mekanizmalarındaki prooksidant/antioksidant steady state durumunda oluşan her türlü dengesizlik oksidatif stres olarak tanımlanmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999; Reed, 2001). 2

12 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU 1.1. Antioksidant savunma sistemi Oksijen, elektron afinitesi nedeniyle oldukça reaktif bir moleküldür. Ayrıca O 2 nin H 2 O ya redüksiyonu sırasında çok daha reaktif ara bileşikler oluşmaktadır (Lledias ve ark., 1998). Fotosentetik organizmaların 2-3 milyar yıl önce gerçekleşen evrimleri, atmosfere O 2 girmesine ve O 2 ye bağımlı türlerin evrimlerine neden olmuştur. Oksidatif metabolizma glukozun aerobik organizmalar tarafından tam olarak parçalanmasını sağlamaktadır. Dolayısıyla; O 2 yönünden zengin bir atmosferin varlığı ROS ve RNS ye karşı çıkan endojen bir antioksidant sistemin gelişmesini sağlamıştır (Sen ve Packer, 2000). Antioksidant savunma sistemin en önemli özelliği, sistemin tüm bileşenlerinin ROS a karşı bir sinerji oluşturacak şekilde görev almasıdır (Chaudiere ve Ferrari- Illiou, 1999). Antioksidant enzimler oksidatif stres tarafından indüklenen anahtar bileşenlerdir (Oruc ve ark., 2004). Bu nedenle, antioksidant enzimler hücre homeostazisinin düzenlenmesinde yaşamsal bir öneme sahiptirler ve indüksiyonları kirleticilere karşı verilen tepkinin bir sonucudur (Doyotte ve ark., 1997). Antioksidant sistemin bileşenleri; enzimatik ve enzimatik olmayanlar şeklinde iki grupta incelenmektedir. Enzimatik olmayan antioksidantlardan glutatyon (GSH), ürik asit ve melaninler omurgalılar tarafından sentezlenebilirken; alfa-tokoferol (E vitamini), askorbik asit (C vitamini) ve β-karoten (Provitamin A) gibi bileşikler besinler yoluyla alınabilen enzimatik olmayan antioksidantlardır (Adams, 2002). Süperoksid dismutaz (SOD; EC ), glutatyon peroksidaz (GPx; EC ) ya da katalaz (CAT; EC ) enzimatik antioksidantlardır (Zwart ve ark., 1999). SOD ve CAT oksijen toksistesine karşı savunmanın ilk ve en önemli basamağındadır (Pandey ve ark., 2003) Süperoksid Dismutaz Süperoksid dismutaz, O 2. - anyonunu, daha az reaktif türler olan O 2 ve H 2 O 2 ye dönüştürür (Doyotte ve ark., 1997). 3

13 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU O O H + SOD O 2 + H 2 O 2 (3) Memelilerde üç farklı SOD bulunur. Bunlar; sitosol, nükleus ve lizozomlarda bulunan homodimerik yapıdaki bakır (Cu) ve çinko (Zn) taşıyan Cu, Zn-SOD; mitokondriyal matrikste bulunan homotetramerik mangan (Mn) içeren Mn-SOD; ekstraselüler boşluklarda heparine bağlı olarak bulunan homotetramerik Cu, Zn- SOD dir (Fridovic, 2001). Bakır, çinko içeren süperoksid dismutaz sitosol ve çekirdeğe, Mn-SOD ise mitokondriyal matriks içerisine yerleşmiştir (Olsvik ve ark., 2005). Cu, Zn-SOD; yaklaşık 32 kilodalton (kda) büyüklüğünde iki alt üniteden oluşmaktadır ve Cu ile Zn köprülerinden oluşan kısım enzimin aktif bölgesi olarak kabul edilmektedir (Banci ve ark., 1998). Cu eksikliği, Zn eksikliğine oranla enzimin aktivitesini daha çok engellemektedir (Evans ve Halliwel, 2001). Mn-SOD ortalama 86 kda molekül ağırlığında tetramerik bir proteindir. Prokaryotlarda Cu, Zn-SOD ve Mn-SOD ye ek olarak 41 kda moleküler ağırlığındaki dimerik bir protein olan Fe içeren SOD (Fe- SOD) bulunmaktadır. Metal katalizörleri ne olursa olun bütün SOD ler benzer bir mekanizmayı paylaşırlar. Ancak, prooksidantlar tarafından oluşturulan aşırı oksidatif stres şartlarında Cu, Zn-SOD daha hızlı indüklenir ve omurgalılarda SOD lerin %80 i sitosolik Cu, Zn-SOD dir (Ahmad, 1995). Süperoksid dismutaz tarafından gerçekleşen redüktif detoksifikasyonda, her. O - 2 radikali için bir adet H 2 O 2 molekülü oluşmakta ve NADPH gibi çeşitli hücresel indirgeyiciler tüketilmektedir. SOD tarafından gerçekleşen direk detoksifikasyonda. ise hücresel indirgeyicilere gereksinim duyulmaksızın, tüketilen her O - 2 radikali için 0,5 H 2 O 2 molekülü oluşmaktadır (Benov ve Fridovic, 1998).. Süperoksid dismutaz, O - 2 nin dismutasyonu için spesifik olduğu halde, HO., singlet oksijen ( 1 O 2 ) ile peroksil radikalleri gibi reaktif türlerle de reaksiyona girebilecek histidin ve diğer çeşit yan zincirler içermektedir (Halliwell ve Gutteridge, 1999). 4

14 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Katalaz Katalaz, her biri yaklaşık 60 kda ağırlığındaki dört alt ünitenin tetrahedral düzenlenmesiyle oluşan, tetramerik bir enzimdir. Dolayısıyla, dört protoporfirin grubu içeren enzimin moleküler ağırlığı, 240 kda civarındadır. CAT, H 2 O 2 nin hiç bir konsantrasyonu ile doygunluğa ulaştırılamayan tek enzimdir (Lledias ve ark., 1998). SOD aktivitesi sonucunda oluşan H 2 O 2 nin büyük bir kısmı, CAT tarafından H 2 O ve O 2 ye dönüştürülür (Halliwell ve Gutteridge, 1999). H 2 O 2 + H 2 O 2 CAT 2H 2 O + O 2 (4) İnsan ve sığır CAT ı enzime sıkıca bağlı olan dört NADPH molekülü taşır. Bu redükte nükleotid, CAT aktivitesi için gerekli olmayıp, sadece; enzimin H 2 O 2 nin düşük derişimlerinde gösterdiği inaktivasyona karşı duyarlılığını azaltır (Kirkman ve Gaetani,1984). Hücrelerde, H 2 O 2 üretiminden sorumlu oksidazların birçoğu peroksizomlara yerleştiği için; CAT ın büyük bir kısmı sitosol ve mitokondriye oranla peroksizomlarda bulunur. (Kelly ve ark., 1998). Mitokonriyal CAT peroksidazlar gibi görev yaparken, peroksizomal CAT daha çok dismutazlar gibi çalışmaktadır (Chaudiere ve Ferrari-Iliou, 1999). GPx in, CAT a oranla daha başarılı kabul edilmesinin nedeni; hidrojen peroksit dışındaki peroksitleri de detoksifiye edebilmesi ve enzimin hücrelerde, oksidatif stresin yoğun olarak gerçekleştiği bölgelere lokalize olmasıdır (Kelner ve ark., 1995) Glutatyon Glutatyon; hücrelerde suda çözünebilir formlarda bulunan düşük molekül ağırlıklı antioksidant bir moleküldür (Travacio ve ark, 2000). L-sistein, L-glutamat ve L-glisin amino asitlerinden oluşan ve glutamat ile sistein amino asitleri arasında 5

15 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU γ-peptid bağı içeren bir tripeptiddir. Bu bağ, GSH ı peptidazların hidrolitik etkilerinden korumaktadır. Şekil 1.1. Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin (Anderson, 1998) Glutatyon genellikle tüm hücrelerde milimolar (mm) düzeylerde bulunur (Sen, 1997). Hücre içi GSH derişimi hücre tipine bağlı olarak mm arasında değişmektedir. Bu değer karaciğer hücrelerinde 4-8 mm aralığındadır. GSH ın hücre içi lokalizasyonu incelendiğinde, sitoplazma ve mitokondriye ait havuzların, GSH içeriklerinin birbirinden farklı olduğu ve sitosolik havuzun hücresel savunma fonksiyonu ile karakterize edilirken, mitokondriyal havuzun mitokondrinin fonksiyonlarının korunabilmesi açısından gerekli olduğu düşünülmektedir (Reed, 2001). GSH; kan hücreleri, plazma, beyin, böbrekler ve sindirim sistemi gibi birçok organ ve dokuda bulunmakla birlikte temel kaynağı karaciğerdir. Eksikliği mitokondri ile hücre fonksiyonlarındaki bozukluklardan kaynaklanmaktadır (Faintuch ve ark., 1999). Hücrelerde, total glutatyonun %95 i GSH, kalan %5 lik kısmı ise okside glutatyon (GSSG) şeklinde bulunur. Hayvansal hücrelerin birçoğunda, GSSG nin protein sentezini inhibe ettiği bilinmektedir. Bu bilgi; GSSG nin hücrelerde neden daha düşük derişimlerde bulunduğunu ve GSSG nin neden kalp ve böbrek gibi organlar ile eritrositlerden dışarıya taşındığını açıklamaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Glutatyon düzeyi ile GSH a bağlı enzimlerin aktivitelerindeki değişiklikler ksenobiyotiklerin bazı türler üzerindeki etkilerinin belirlenmesinde kullanılan 6

16 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU biyomarkırlardır (Almar ve ark., 1998). GSH ın, antioksidant savunma, elektrofilik ksenobiyotiklerin detoksifikasyonları, sisteinin taşınması ve depolanması, immün tepkinin düzenlenmesi, prostaglandin metabolizmasının düzenlenmesi ve DNA sentezi gibi çok önemli fizyolojik görevleri bulunmaktadır (Sen, 1997). Bu görevlerinin yanı sıra hücre içersindeki tiyollerin %50 sini oluşturan GSH; E ve C vitaminleri gibi eksojen kaynaklı antioksidantların kullanılabilirliğini de arttırmaktadır. Reaktif oksijen türlerinin GSH a bağımlı detoksifikasyonu genel anlamda iki temel mekanizma yoluyla gerçekleşmektedir; 1. ROS ile direk ya da kendiliğinden gerçekleşen reaksiyonlar, 2. GPx tarafından katalizlenen reaksiyonlar, Her iki reaksiyonun sonucunda da GSSG oluşmaktadır (Sen ve Packer, 2000). Hücre içerisinde ve dokularda GSH içeriğini azaltan üç önemli faktör bulunmaktadır. Bu faktörler; a. Glutatyon sentezinin sınırlandırılması, b. Glutatyon kullanımının artması, c. Okside glutatyonun hücre içi redüksiyonunun azaltılmasıdır. Hücre içi GSH sentezini sınırlayan en önemli faktör, kullanılabilir formdaki substrat sistein amino asitidir (Sen, 1997). Hücre içerisinde, amino asitlerin çeşitliliği besin durumuna, türe ve dokuya bağlı olarak değişebilir. Ancak; L-sisteinin hücre içi düzeyi her zaman L-glutamat ile L-glisinden düşüktür (Griffith, 1999). Çünkü; sistein yüksek dozlarda sinirsel toksisiteye neden olmaktadır (Faintuch ve ark., 1999). Sistein; karaciğerde transsülfürasyon reaksiyonları aracılığıyla, metiyonin ve serin amino asitlerinden oluşturulduğu için, temel bir amino asit olarak kabul edilmemektedir. Protein sentezinin gerçekleştirilebilmesi için sülfür içeren amino asitlerin miktarı yeterli olduğunda, serin ve metiyoninden oluşan sisteinler ortadan kaldırılmak yerine GSH olarak depolanmaktadırlar. Sisteinin tiyol grupları, sadece hücrelerin redoks durumlarını düzenlemekle kalmayıp, aynı zamanda, proteinlerin kuaterner yapılarındaki moleküller arası bağların oluşumunda ve metal iyonları ligandı olarak da iş görmektedir (Vina, 1990). 7

17 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Hücrelere dışarıdan sistein sağlayıcı ajan olarak genellikle, N-asetil L-sistein (NAC) ve α-lipoik asit (α-la) kullanılmaktadır (Sen, 1997). Kimyasal formülü C 5 H 9 NO 3 S olan NAC, hücrelere alındığında L-sisteine deasetile olmaktadır. N-asetil D-sistein ise deasetilasyona uğrayamadığı için inaktiftir. GSH biyosentezi sırasında, sistin yerine sisteinin tercih edilmesinin nedeni; sisteinin hücre içerisine sistinden 10 kat daha hızlı girebilmesidir (Ercal ve Gürer, 2002). N-asetil L-sistein; tiyol içeren bir antioksidant olarak doğrudan serbest radikalleri temizleyebileceği gibi GSH sentezinde de iş görmektedir (Neal ve ark., 1998). Sistein N-Asetilsistein (NAC) Şekil 1.2. Sistein ve N-asetilsisteinin (NAC) kimyasal yapısı ( N-asetilsisteinin, toksisitesinin ve maliyetinin düşük olması ve suda çözünebilirliğinin yüksekliği nedenleri ile organofosforlu (OP) pestisidlerin etkisinde detoksifikasyon mekanizmalarını indüklemek amacıyla, oksidatif strese karşı güçlü bir GSH öncüsü ajan olarak kullanıldığı bildirilmektedir (Pena-Llopis ve ark., 2003a). N-asetilsisteinin merkezi sinir sistemi üzerindeki faydalı etkilerini kan beyin engelini (BBB) aşarak gerçekleştirdiği düşünülmektedir (Martinez ve ark., 1999). Glutatyon oksidatif strese karşı savunmanın en önemli basamağını oluşturmaktadır (Ahmed ve ark., 2000). Oksidatif stresin zayıf olduğu durumlarda devreye giren adaptasyon mekanizmaları sonucunda GSH düzeyi artmaktadır. Ancak; oksidatif stresin güçlü olduğu durumlarda zayıflayan adaptasyon mekanizmalarına ve artan GSSG oluşumuna bağlı olarak GSH düzeyi azalmaktadır (Zhang ve ark., 2005). Hücre içerisinde GSSG nin GSH a redüksiyonunu 8

18 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU katalizlemekle görevli olan enzim, glutatyon disülfid redüktaz (GR; EC ) olarak bilinmektedir. Sitosole yerleşen enzim, aktivitesi sırasında bir kofaktör olan nikotinamid adenin dinükleotid fosfat a (NADPH) gereksinim duymaktadır. Bu durumda; NADPH üretim yollarındaki herhangi bir bozukluk, enzimin inaktivasyonu ve dolayısıyla hücre içi GSH miktarının azalması anlamına gelmektedir (Sen,1997) Glutatyon sentezi Glutatyon biyosentezi; γ-glutamilsisteinil sentetaz (γ-gcs, EC ) ve glutatyon sentetaz (GS, EC ) adı verilen iki enzimin katalizlediği reaksiyon sonucunda iki adımda gerçekleşir; γ-gcs L-Glu + L-Cys + ATP GS L-γ-Glu-Cys + Gly + ATP L-γ-Glu + L-Cys + ADP + Pi (5) GSH + ADP + Pi (6) (Anderson, 1998). Sentez sırasında iş gören her iki enzimde hücre sitosolüne lokalize olmuştur (Griffith, 1999) ve adenozin trifosfat (ATP) her iki enzim içinde ko-substrat görevindedir (Camera ve Picardo, 2002). γ-glutamilsisteinil sentetaz, L-sistein ile L-glutamat arasındaki bağı katalizleyen ve glutatyon sentezini sınırlandırabilen önemli bir enzimdir (Pena- Llopis ve ark., 2003). Memeli γ-gcs enzimi, tüm substratların enzime bağlanmalarını sağlayan, katalitik olarak aktif ağır bir alt ünite ile ağır ünitenin substratlara ve inhibitörlere olan ilgisini kontrol eden hafif bir alt üniteden oluşmaktadır. Enzimin sentezlenmesi ve aktivitesi, GSH homeostazisinin sağlanabilmesi açısından kritik bir öneme sahiptir (Griffith, 1999). Hücre içi GSH sentezinin gerçekleştirilebilmesi için, GSH ın hücre dışında degradasyona uğratılması ve oluşan ürünlerin hücre içerisine alınması gerekmektedir. İşte bu görevi, membrana bağlı bir enzim olan γ-glutamil transpeptidaz (γ-gt, EC ) enzimi gerçekleştirmektedir (Anderson, 1998). 9

19 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Glutatyon Redüktaz Glutatyon disülfid redüktaz; sitoplazmaya lokalize olmuştur ve moleküler ağırlığı kda civarındadır. Şimdiye kadar birçok prokaryotik ve ökaryotik kaynaktan izole edilen enzim, tüm koşullarda aktif merkezinde molekül başına bir adet flavinoid adenozin dinükleotid (FAD) içeren dimerik bir flavoenzimdir (Patel ve ark., 1998). Glutatyon redüktaz aktivitesi hücrenin redoks durumu tarafından düzenlenir ve hücrenin oksidatif stres sırasındaki fizyolojik gereksinimlerini yansıtır (Reed, 2001). GR, sitosol GSH/GSSG oranını, 100 ün üzerinde tutmakla görevlidir (Farber ve ark., 1998). Normal hücrelerde GSH/GSSG oranı son derece yüksektir ve GSSG nin yeniden GSH a indirgenmesi gerekir. Enzimin katalizlediği reaksiyon sırasında FAD, NADPH tarafından indirgenirken açığa çıkan elektronlar, aktif merkezdeki disülfid bağına taşınır ve bu şekilde GSSG, iki GSH molekülüne indirgenmiş olur (Halliwel ve Gutteridge, 1999). GSSG + NADPH + H + GR 2GSH + NADP + (7) Glutatyon Redoks Döngüsü Redoks döngüsü; ksenobiyotiklerin, ksantin oksidaz ve NADPH-sitokrom P 450 redüktaz gibi çeşitli enzimler tarafından radikal bir ara ürüne redüksiyonu sırasında oluşan oksiradikallerin eliminasyonundan sorumludur (Kelly ve ark., 1998). Hücreler aerobik metabolizma sırasında sürekli olarak ROS ları ürettiği için hücresel redoks durumu hücre yaşamının korunması için önemlidir (Jefferies ve ark., 2003). Yabancı bileşiklerin redoks döngüsünü katalizleyen bütün enzimler, substrat spesifitesi düşük flavoproteinlerdir (Kappus, 1986). Ksenobiyotikler, radikal oluşumundan kaynaklanan ağır hasarları indükledikleri için glutatyon redoks döngüsü tetikleyicileri olarak kabul edilirler (Zwart ve ark., 1999). 10

20 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Ksenobiyotiklerin redoks döngüsü içerisindeki biyoredüksiyonları sırasında oluşan ve oksidatif strese neden olan reaktif ara bileşikler, glutatyon redoks döngüsü tarafından elimine edilir. GSH redoks döngüsünde, hidrojen peroksitlerin maksimum kapasiteyle eliminasyonlarında düzenleyici etkilerin büyük bir kısmı NADPH a bağımlı yollar tarafından dengede tutulur ve NADPH nin tüketim düzeyi, GR nin ROS u yüksek bir verimle detoksifiye ettiğini göstermektedir. Mitokondride çeşitli oksidantların engellediği sınırlı O 2 alınımı sonucunda, her 10 dakikada bir GPx molekülü eşliğinde tam bir GSH redoks döngüsü gerçekleşmektedir. GSH redoks döngüsünde, indirgeyici molekül akışının sürekliliği mitokondriyel NADPH üretiminin sürekliliği ile dengeleniyor gibi gözükmektedir (Reed, 2001). Şekil 1.3. Hayvanlarda glutatyonun sentezi ve dağılımı. Reaksiyonları katalizleyen enzimler şunlardır: 1) γ-glutamil transpeptidaz, 2) γ-glutamil siklotransferaz, 3) 5-oksoprolinaz, 4) γ-glutamil-sistein sentetaz, 5) glutatyon sentetaz, 6) dipeptidaz, 7) glutatyon peroksidaz, 8) Glutatyon redüktaz, 9) süperoksid dismutaz, 10) BCCA transaminaz (sitosolik ve mitokondriyal), 11) glutaminaz, 12) glutatmat dehidrojenaz, 13) glutamin: fruktoz-6-fosfat transaminaz (sitosolik), 14) nitrik oksid sentaz, 15) glutatyon S-transferaz, 16) NAD(P)H 11

21 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU oksidaz ve mitokondriyal solunum kompleksleri, 17) glikolizis, 18) glutatyona bağımlı tiyosülfid, tiyoltransferaz ya da enzimatik olmayan reaksiyon, 19) transsülfürasyon yolu, 20) deaçilaz, 21) serin hidroksimetiltransferaz. Kısaltmalar: AA, amino asit; BCKA, dallanmış zincir içeren α-keto asitler; GlcN-6-P, glukozamin-6-fosfat; GS-NO, Glutatyon-nitrik oksid bileşiği; KG, α-ketoglutarat; LOO, lipid peroksil radikali; LOOH, lipid hidroperoksid; NAC, N-asetilsistein; OTC, L-2-oksotiazoldin-4-karboksilat; R., radikaller; R, radikal olmayanlar; R-5-P, ribulaz-5-fosfat; X, elektrofilik ksenobiyotikler (Wu ve ark., 2004). İntraselüler GSSG içeriği, oksidatif stres durumuna bağlı olmakla birlikte GSH/GSSG oranı, hücrenin redoks durumu hakkında bilgi vermektedir (Cnubben ve ark., 2001). Oksidatif stres, GSH kullanımına paralel olarak artan GSSG oluşumuyla sonuçlanmaktadır. Hücredeki bu değişiklikler, artan GSSG nin, hücre dışına taşınmasıyla dengelenmektedir. GSSG nin hücre dışına taşınması, hücrelerin oksidatif strese karşı duyarlılıklarını belirleyen önemli faktörlerden biridir (Schafer ve Buettner, 2001). Patolojik bozuklukların birçoğu, hücrelerdeki GSH eksikliği ya da GSH/GSSG oranındaki dengesizliklerle karakterize edilmektedir (Camera ve Picardo, 2002). Dolayısıyla; hücresel metabolizmanın gücü, tiyollerin redoks durumu ile dengelenmektedir (Sen ve Packer, 2000) Ksenobiyotiklerin Detoksifikasyonu Ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ya da transformasyon reaksiyonları Faz I ve Faz II adı altındaki iki basamakta gerçekleşir. Faz I reaksiyonlarında, hidroksil (-OH), karboksil (-COOH), tiyol (-SH) ve amino (-NH 2 ) grupları gibi polar gruplar oksidasyon, redüksiyon ve hidroliz reaksiyonları ile ksenobiyotiğin yapısına eklenir. Faz II reaksiyonlarında; oluşan polar metabolit glukuronidler, sülfatlar, asetatlar ve amino asitler gibi endojen substratlar ile konjuge edilir. Sonuçta, üre ile kolayca uzaklaştırılabilen hidrofilik ürünler meydana gelir (Jokanovic, 2001). Faz II reaksiyonlarında görev alan enzimler transferazlar olarak tanımlanmaktadır (Sole ve ark., 2003). 12

22 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Glutatyon S-Transferazlar (GST, EC ) Glutatyon S-transferaz lar, GSH ile elektrofilik gruplar taşıyan bileşikler arasındaki konjugasyonu katalizleyen, çok fonksiyonlu faz II biyotransformasyon multigen enzim ailesinin üyeleridir (Hamed ve ark., 2003). Bu reaksiyonun sonucunda, bileşiğin hidrofilitesi artar ve molekülün lipid tabakası içerisindeki dağılımı ile hücre içi birikimi engellenmiş olur (Hudson ve ark., 1998). Enzimin suda çözünebilir formları moleküler ağırlığı 25 kda olan alt ünitelerden oluşan dimerik yapılı proteinlerdir. Dimerik enzimin her alt ünitesi farklı iki fonksiyonel bölge içeren bir aktif merkeze sahiptir. Hidrofilik G bölgesi fizyolojik substrat GSH ı bağlarken komşu H bölgesi faklı yapıdaki elektrofilik substratların bağlanabilmesi için hidrofobik bir ortam sağlar. G bölgesi yüksek GSH spesifitesi nedeniyle bütün GST lerde oldukça benzerdir. GST ler arasında tamamen farklı yapıda olan H bölgesinin substrat bağlama kapasitesi ve çeşitliliği son derece değişkendir. GST ler; GSH + R-X GSR + HX (8) şeklindeki genel bir reaksiyonu katalizlemektedirler. Enzimin fonksiyonu: 1. Aktif merkezine hem GSH hem de elektrofilik substratı bağlayarak GSH ile substratın etkileşimi sağlamak, 2. Glutatyonun sülfidril grubunu aktive ederek GSH ın elektrofilik substrat üzerindeki nükleofilik atağını sağlamaktır (Armstrong, 1997). Substratların elektrofilik fonksiyonel merkezleri karbon, nitrojen veya sülfür olabilmektedir. GSH ın sistein rezidüsü ile elektrofilik substrat arasında kurulan tiyoeter bağı genellikle daha az reaktif ve daha çok suda daha çok çözünebilir ürünlerin oluşumuyla sonuçlandığı için; GST reaksiyonları genellikle detoksifikasyon mekanizmalarıdır (Eaton ve Bammler, 1999). Glutatyon S-transferazlar; bitkiler ve hayvanlar alemi ile omurgalılar ve omurgasızlar ve de bakterilerde bulunur. Detoksifikasyonun yoğun olarak gerçekleştiği bölgelerde yüksek aktivite gösterirler ve endoplazmik retikulum 13

23 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU membranı ile nükleustaki interkromatin bölgeye yerleşirler. Ancak; enzimin en bol bulunan formları, homo ya da heterodimerik yapıdaki sitoplazmik GST lerdir. GST ler merkaptürik asit biyosentezinin başlangıç reaksiyonlarına aracılık etmektedirler. Merkaptürik asit biyosentezi başlangıçta GSH konjugatı ile başlayan ve sonra γ-gt tarafından glutamik asitin uzaklaştırılması ile sonuçlanan, sisteinilglisin konjugatının oluşumu ile devam eden birkaç basamaktan oluşmaktadır. Bu reaksiyonu glisinin uzaklaştırılması ile sisteinil S- konjugatının yani pre-merkaptürik asidin oluşumu izler. N-asetiltransferazlar tarafından sisteinil S-konjugatının asetilasyonu N-asetil türevi olan merkaptürik asit oluşumu ile sonuçlanır (Leblanc ve Dauterman, 2001). Glutatyon S-transferazlar; çevre kirleticilerinden ilaçlara, karsinojenlerden pestisidlere kadar birçok bileşiği metabolize edebilirler. GST ile reaksiyona girecek ksenobiyotiklerin genel özellikleri; hidrofobik olmaları, elektrofilik bir atom çekirdeği içermeleri ve GSH ile enzimatik olmayan koşullarda reaksiyona girebilmeleridir. Glutatyon S-transferazların diğer bir fonksiyonu, lipid peroksitlerinin bozunma ürünleri ile GSH arasındaki konjugasyondaki antioksidant görevidir. Balıklarda, organik hidroperoksitlerin detoksifikasyonlarında GST ler GPx ten çok daha gereklidir (Stephensen ve ark., 2002). GPx ten farklı olarak H 2 O 2 için inaktif olan GST ler; sadece organik hidroperoksitleri indirger ve selenyumdan bağımsız olarak iş görürler (Cnubben ve ark., 2001; Sen ve Packer, 2000). Selenyum eksikliği durumunda; GST devreye girer ve kayıp selenyuma bağımlı GPx aktivitesinin boşluğunu doldurur. Selenyum varlığında ise enzimin bu görevi baskılanmaktadır (Leblanc ve Dauterman, 2001) Pestisidler Pestisidler genellikle daha fazla ürün elde etmek amacıyla tarım ürünlerine zarar veren böceklerin ve hastalık etkeni olan çeşitli vektörlerin kontrolünde kullanılan bileşiklerdir (Abdollahi ve ark., 2004). Pestisidlerin tarım alanlarındaki gelişigüzel kullanımları sonucunda bozulan ekolojik denge sebebiyle, ticari önemleri 14

24 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU büyük olan balıklarıda içine alan birçok hedef dışı organizma zarara uğramaktadır (Oruç ve Üner, 1999). Şekil 1.4. Organofosfat (A), karbamat (B) ve piretroid (C) insektisidlerin kimyasal yapıları (Sogorb ve Vilanova, 2002). Günümüzde çevreye uygulanan pestisidlerin büyük çoğunluğu OP pestisidlerdir (Aydın ve Köprücü, 2005). Pestisidler, çevrede kalıcılıklarına göre iki grupta incelenirler. Organoklorlu (OC) pestisidlerin çevredeki kalıcılıkları uzun olmasına karşılık, OP ve karbamatlı pestisid grupları ile piretroidler, su ve güneş ışığının etkisiyle kolayca degradasyona uğradıkları için çevredeki kalıcılıkları oldukça kısadır. Biyoakümülasyonları düşüktür ve vücutta kısa süre içerisinde metabolize edilerek ekskresyona uğratılırlar (Barr ve Needham, 2002) Organofosforlu Pestisidler Organofosforlu pestisidler; fosfonik, fosforik, fosfotiyoik ya da fosfonotiyoik asitlerin ester, amid veya tiyol türevleridir. R 1 ve R 2, aril ya da alkil gruplarını ifade ederler ve fosfor (P) atomuna bir O atomu (fosfinatlar) veya bir kükürt (S) atomu (fosfatlar veya fosfotiyoatlar) ile bağlanırlar. X grubu halojen, alifatik, aromatik veya heterosiklik bir grup olabilir ve fosfor atomuna bir S ya da O atomu ile bağlanır. Fosfodiesterazlar etkisinde ya da protein hedefler ile etkileşim sonucunda kolayca parçalanabilen X grubu ayrılan grup olarak tanımlanır. P atomuna çifte bağ ile bağlanan kısım O ya da S atomudur. (Sogorb ve Vilanova, 2002). Bu bileşiklerin toksisite mekanizmalarının en önemli parçası oksidatif strese neden olmalarıdır (Abdollahi ve ark., 2004). OP pestisidler genellikle tiyo formunda 15

25 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU (P=S) kullanılırlar ve metabolik oksidatif desülfürasyonlar sırasında anti-kolinesteraz ajanı olan okson (P=O) formuna dönüşürler (Cocker ve ark., 2002). Organofosforlu bileşiklerin biyotransformasyonları, aktivasyon ve detoksifikasyon mekanizmalarını içine alır. Aktivasyon mekanizmaları, aktif olmayan bir OP bileşiğin, aktif hale dönüştürülmesi olarak tanımlanabileceği gibi; aktif bir OP bileşiğinin diğer bir aktif OP bileşiğine dönüşümü olarak da tanımlanabilir. Detoksifikasyon mekanizmalarında ise OP bileşiği toksik olmayan metabolitlerine dönüşür. Detoksifikasyon sonucu oluşan metabolitlerin antikolinerjik etkileri daha düşüktür ve bu metabolitler aynı zamanda idrar yoluyla uzaklaştırılabilen suda çözünür bileşiklerdir. Detoksifikasyon reaksiyonları A- esteraz, karboksil esteraz (CarbE; E.C ) ve GST enzimlerinin varlığında gerçekleşir. OP pestisidler; B-esterazlar adı verilen CarbE, AChE, kimotripsin ve tripsin enzimlerini, sıcaklığa ve zamana bağlı olarak inhibe ederler. A-esterazlar ise OP insektisidlerin, asetilkolinesteraz (AChE; E.C ) inhibitörleri olan aktif metabolitleri ile reaksiyona girerek, OP etkilenmelerine karşı koruyucu bir görev üstlenirler (Jokanovic, 2001) Fenthion Bu çalışmada etkileri incelenecek olan fenthion bir OP insektisid ve avisiddir. Fenthion (O,O-dimetil O-4-metiltiyo-m tolilfosforotiyoat) molekül ağırlığı, kda olan lipofilik karakterde bir bileşik olup Environmental Protection Agency (EPA) zehirlilik sınıfının ikinci grubunda yer alan, orta derecede toksik bir insektisiddir (EPA, 2001). Kapalı formülü C 10 H 15 O 3 PS 2, oktanol/su partisyon katsayısı (log K ow ) 4.09 dur (Pehkonen ve Zhang, 2002). Bir bileşiğin oktanol su partisyon katsayısı, o bileşiğin belirli bir sıcaklıktaki lipofilitesinin bir ölçüsüdür. Log K ow değeri 4 den küçük olan bileşikler hidrofilik, log K ow değeri 4 ün üzerinde olan bileşikler ise lipofilik karakterlidirler (Noble, 1993). 16

26 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Kapalı Formülü: Fenthion; Bayer Kimya tarafından 1960 yılında evcil hayvanlardaki dış parazitlere karşı şampuan ve sprey şeklinde üretilerek piyasaya sürülmüştür ( Baycid, Baytex, Dalf, DMTP, Lebaycid, Queletox, Talodex, Prentox Fenthion 4E, Mercaptophos, S 1752, Entex, Spotton ve Tiguvon ticari adları altında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bayer firmasının Amerika da fenthion üretimini durdurması ile birlikte EPA fenthion kullanımının 30 Haziran 2004 tarihinden itibaren yasaklanacağını duyurmuştur (EPA, 2003). Ancak ülkemizde Bayer firmasının ruhsat aldığı 1966 yılından (Aydınoğlu ve ark., 2002) başlayarak Gebze deki tesislerinde fenthion üretimine ve ülke genelinde çeşitli ürünlerde kullanımına devam edilmektedir. Türkiye genelinde yılları arasında L fenthion satılmıştır (Bayer firmasının yılları arası fenthion satış raporlarından derlenmiştir.). Çukurova Bölgesi nde 2003 yılının ilk altı ayında zeytin ve ekin zararlılarına karşı toplam 4515L, 2003 kış-2004 bahar aylarında 4685 L fenthion kullanılmıştır (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Adana Bitki Koruma Şube Müdürlüğü, Çukurova Bölgesi pestisid satış raporlarından derlenmiştir.). Fenthion kolaylıkla okson formuna dönüşmeyecek nispeten güvenli bir pestisid olarak geliştirilmiş (Roberts ve Hutson, 1999), ancak balıklarda ve sıçanlarda yapılan çalışmalar fenthionun fenoksona dönüşerek bu canlılara yüksek derecede toksik etkili olduğunu göstermiştir (Kitamura ve ark., 2000; Kitamura ve ark., 2003a). Fenthionun 25 C deki transformasyon ürünleri fenthion sülfon, fenthion sülfoksid, fenokson, fenokson sülfon ve fenokson sülfoksiddir. Fenthionun subletal derişimlerde akut ve kronik etkileri yanında çevrede fenthion oksona dönüştüğü bildirilmiştir (Lacorte ve ark., 1997). 17

27 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Bu bileşik öncelikle; dönüşümlü olarak fenthion sülfokside okside olmakta, ardından sitokrom P 450 sistemi tarafından insanda olduğu gibi okson formuna dönüştürülmek üzere desülfürasyona uğratılır. Balıklarda insandan farklı olarak fenthion sülfon oluşumu gerçekleşmez. Bileşiğin okson formu çok güçlü bir kolinesteraz (ChE) inhibitörüdür (Kitamura ve ark, 2000; Kitamura ve ark., 2003a). Çevredeki bazı kimyasallar organizmaların hormonlarını taklit ederek veya diğer etkiler ile endokrin sistemlerde kesintilere neden olabilmektedir. Bunlar doğal hormonların sentez, salınım, taşınma, bağlanma veya eliminasyonlarını etkileyerek üreme, gelişme ve davranışlarda olumsuz değişikliklere yol açmaktadırlar (EPA, 1997). Birçok endüstriyel ve tarımsal kirleticinin akuatik ortamlardaki canlıların endokrin sistemlerine zarar verdikleri bilinmektedir (Sumpter,1998). Endokrin etkili fenthionun dihidrotestosteronun androjenik aktivitesinin antagonisti olarak etki yaptığı bilinmektedir (Kitamura ve ark., 2003b) Asetilkolinesteraz (AChE) Asetilkolin (ACh), balıkların sinir ve nöromuskular sistemlerindeki başlıca nörotransmitterdir (Kirby ve ark., 2000). ACh nin sentezi, yıkımı ve depolanması bütün kolinerjik nöronlarda benzerdir. Asetil koenzim A ile kolinden, kolin asetiltransferaz (ChAT) enzimin katalizlediği reaksiyon sonucunda tek bir adımda sentezlenir. Asetil Koenzim A + Kolin ChAT ACh + Koenzim A + H 2 O (9) Reaksiyonda kullanılan asetil koenzim A nın büyük çoğunluğu, mitokondri iç membranında, glikolizis sırasında, pürivat dehidrojenaz enzimi tarafından oluşturularak ChAT nin bulunduğu sitoplazmaya taşınır. Bazı nöronlarda, kolinin de novo sentezi yapılmakla birlikte, merkezi sinir sisteminde, ACh sentezinde kullanılan kolinin üçte biri diğer kaynaklardan sağlanır. Kolinin yaklaşık %35 ile %50 si, sinaps aralığında AChE tarafından yeniden oluşturulup, ACh sentezinde kullanılan kolinin yarısını içeren akson ucuna taşınır. 18

28 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Kolinesterazlar; ACh, bütirilkolin ve asetiltiyokoliniyodid gibi çeşitli kolin türlerinin ayrıştırılma reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. AChE ve bütirikolinesteraz (BchE; E.C ) en bilinen kolinesteraz enzimleridir. Bir adet AChE enzim molekülü dakikada 4 x 10 5 adet ACh molekülünü hidrolize eder ve 150 µs lik turnover süresi, onu en etkin hidrolitik enzim yapar (Chang ve Strichartz, 2005). Şekil Nörotransmitter astilkolinin etki mekanizması ve asetilkolin (ACh) metabolizmasını bloke eden ilaçlar. 1. Bazı maddeler ACh ın reseptörle birleşmesini engeller: a) atropin kalp kası, düz kas ve bez hücrelerinde b) tubocurarine, iskelet kasında c) hexamethonium, ganglion hücrelerinde ACh ın reseptörle birleşmesini engeller; 2. Antikolinesterazlar: a) edrophonium, enzimin anyonik tarafı ile dönüşümlü olarak birleşir, b) karbamat ve organofosfor bileşikler, enzimle bileşik kurarlar; 3. Hemicholinium: membran yoluyla kolin transportunu inhibe eder ve sentezini engeller (Noyan, 1996). Kemikli balıklarda, beyinde AChE nin birden beşe kadar faklı moleküler formları bulunur ve tüm formlar, diğer kolin analogları içerisinde sadece ACh molekülüne özeldir. AChE, ACh nin hidrolizinde görev alan aktif bölgesinde serin hidroksil grubu içerir ve bu bölge türler arasında farklı konfigürasyonlara sahiptir. 19

29 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Enzimin çeşitli inhibitörlere olan afinitesini de sağlayan aktif bölgedeki farklar, aynı bileşiğin teleost türleri arasındaki toksisite farklılığına neden olmaktadır (Carr ve Chambers, 2001). Organofosfat bileşikler, canlılarda toksisite mekanizmalarını, ilk olarak, AChE yi inhibisyona uğratarak indüklemektedir. İnhibisyon enzimin aktif bölgesindeki serin rezidüsü ile OP insektisid arasında kurulan kovalent bağ sonucunda nörotansmitterin doğal katabolizmasının engellenmesiyle gerçekleşir (Klaassen, 2001; Barr ve Needham, 2002). İnhibisyona bağlı olarak sinapslarda aşırı ACh birikimi sonucunda, nikotinik ve muskarinik reseptörlerin aktivasyonları artar ve kolinerjik sistem sürekli uyarılır (Hazarika ve ark., 2003). AChE aktivitesindeki inhibitör etki, pestisitlerin aynı zamanda, sinir hücrelerindeki enerji metabolizması gibi önemli yaşamsal süreçleri de etkilediğini göstermektedir (Nath ve Kumar, 1999). Karbamatlı pestisidlerle gerçekleşen AChE inhibisyonu dönüşümlü olduğu halde; OP pestisidlerle gerçekleşen inhibisyon dönüşümsüzdür. AChE enziminin inhibisyonunun ölçülmesi, OP bileşikleriyle etkilenmenin belirlenmesinde kullanılan yararlı bir biyomarkırdır (Adams, 2002). OP bileşikler AChE nin serin OH grubuna bağlanır AChE aktivitesindeki değişiklikler ROS tarafından indüklenir AChE aktivitesi membranın akıcılığı ve yüzey yükü tarafından düzenlenir Membran tabakasının elektrik yükündeki değişiklikler AChE aktivitesini düzenler Şekil AChE aktivitesinin farklı mekanizmalar tarafından inhibisyonu (Bukowska ve Hutnik, 2006). Genellikle; serum, barsak, cilt ve sinir uçlarında bol bulunan BChE; ACh ve bütirilkolin için aktivite gösterebilmekle beraber bütirilkolin için daha spesifiktir (Lang ve ark., 1997). BChE nin rolü henüz tam olarak belirlenememiştir, bununla birlikte görevinin dokularda AChE tarafından temizlenemeyen ACh i uzaklaştırmak 20

30 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU olduğu düşünülmektedir ve C. carpio da beyin dokusunda BChE aktivitesi bulunmamaktadır (Chuiko ve ark., 2003) Lipid Peroksidasyonu Organofosfat insektisidlerin birçoğu hücrede lipid peroksidasyonuna neden olmaktadır (Altuntas ve ark., 2003). Nitro-aromatik yapılı OP bileşikler,.- organizmalardaki biyotransformasyonları sırasında O 2 grupları açığa çıkarmaktadırlar. Açığa çıkan bu gruplar, hücre zarı fosfolipidlerinde lipid peroksidasyonuna ve sonuçta hücre hasarına neden olmaktadır (Mercan, 2004). Lipid peroksidasyonu serbest radikaller tarafından indüklenmektedir ve bu reaksiyonlar sonucu açığa çıkan ürünler, radikal hasarlarının incelenmesinde kullanılan etkin parametrelerdir. Membran fosfolipidlerinin yoğun olarak bulunduğu bölgelerde, endojen hedefleri etkileyebilecek kapasitede ROS bulunmaktadır. Özellikle; çoklu doymamış yağ asitlerini (PUFA) içeren lipidler, serbest radikallere karşı oldukça duyarlıdır (Zwart ve ark., 1999). PUFA iki veya daha fazla sayıda karbon-karbon çifti taşıyan yağ asitleridir (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Şekil 1.7. Bir omega-6 çoklu doymamamış yağ asidi çeşidi olan linoleik asidin yapısı ( Ökaryotlarda membranın akıcılığı, membran lipidlerinin içeriğinde bulunan, PUFA zincirleriyle sağlanır. Genellikle PUFA zincirleri, fosfolipidlerden özellikle fosfatidil kolin ve fosfatidil etanolaminin gliserol molekülüne 2-C pozisyonuna bağlı olarak bulunur. Bazıları nötral lipitler üzerinde de bulunabilmektedir. Lipidlerin PUFA zincirlerinin bozulmasıyla başlayan reaksiyonlar zinciri sonucunda oluşan 21

31 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU radikaller, moleküler oksijenle reaksiyona girerek, lipid radikallerini oluşturmaktadır. Bu reaksiyonlar zincirinin tamamı lipid peroksidasyonu olarak kabul edilmektedir (Horton ve Fairhust., 1987). Lipid peroksidasyonu, balıklarda oksidatif stresin belirlenmesinde kullanılan önemli bir indikatördür. Biyolojik sistemlerde lipidlerin otooksidasyonuna neden olan zincir reaksiyon; inisiyasyon, propagasyon ve terminasyon olarak tanımlanan üç fazdan oluşur. İnisiyasyon fazında; 1.- O 2, O 2 ve HO. gibi ROS ile lipid molekülü arasında gerçekleşen reaksiyonun sonucunda meydana gelen lipid substratının (LH. ) metilen karbon çekirdeğinden H atomunun ayrılması ile çok daha reaktif bir karbon çekirdeği taşıyan lipid radikali (L. ) oluşur. Propagasyon fazında; L. ile O 2 reaksiyona girerek hızla lipid peroksil radikaline (LOO. ) dönüşür. LOO., DNA ve proteinler gibi birçok in vivo kaynaktan H atomu alarak temel oksidasyon ürünü lipid hidroperoksitini (LOOH. ) oluşturur. Antioksidantların yokluğunda ya da yetersiz kaldığı durumlarda ise LOO. diğer bir LH den H alarak yeni L. lerin oluşmasına neden olur. Bu da, zincir reaksiyonlar şeklinde devam eden yeni propagasyon reaksiyonları ile sonuçlanmaktadır. Şekil 1.8. Lipid peroksidasyonun fazlarına genel bir bakış. Kısaltmalar: NRP, nonradikal ürün; LOOH, lipid hidroperoksid; α-toh, tokoferol; α- TO, α-toh radikali; LH, lipid substratı; LOO, lipid peroksil radikal 22

32 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Lipid peroksidasyonun son fazı olarak kabul edilen terminasyon reaksiyonunda ise iki radikalin eşleşmesiyle radikal olmayan bir son ürün oluşur ve bu stabil ürün, lipid peroksidasyon zincirinin devamını sağlayamaz. Lipid peroksidasyonu ürünlerinin artışını ve lipid peroksidasyonunun yayılmasını, redoks yapan Fe 2+ ve Fe 3+ ile Cu tetiklemektedir. Lipid peroksidasyonu ürünleri olan lipid peroksitleri, hidroperositleri ve aldehidleri membran yapısını doğrudan, diğer hücresel bileşenleri ise aldehid üreterek dolaylı yoldan zarara uğratır ve membran yapısının bozulması sonucunda malondialdehid (MDA) oluşur (Kelly ve ark., 1998). Lipid peroksidasyonun düzeyi genellikle, MDA ile tiyobarbitürik asit (TBA) arasındaki in vitro reaksiyon sonucunda ölçülür ve MDA ph ya bağlı olarak çeşitli şekillerde bulunabilir. Fizyolojik ph şartlarında, MDA nın amino gruplarına karşı afinitesi düşüktür ancak; proteinlerin lizin gibi amino asitlerinde modifikasyonlar ile molekül içi ve moleküller arası çapraz bağlanmalara neden olur (Halliwell ve Gutteridge, 1999) Proteinlere etkisi Proteinlerin oksidatif strese karşı en duyarlı bölgeleri sülfidril gruplarıdır (Sen ve Packer, 2000). Proteinler ROS a karşı lipidlere oranla daha az duyarılıdır ve amino asit dizilerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür içeren moleküllerin ROS ile etkileşimleri son derece yüksektir. Bu nedenle yapısında triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri bulunduran proteinler ROS a karşı daha duyarlıdır. İmmünoglobin G ve albümin gibi disülfid bağı fazla olan proteinlerin ise üç boyutlu yapıları bozulmaktadır (Kelly ve ark., 1998) Beyin dokusunun önemi Beyin, çevresel kirleticilerden kaynaklanan oksidatif hasarda hedeftir (Hai ve ark., 1997). Teleostlarda beyin büyük oranda yüksek omurgalılarınkine benzer bir 23

33 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU yapıdadır. Omurgalı sınıfları arasında beyinde birçok yapı benzer olmakla birlikte, sadece bazı bölgelerde büyüklük açısından farklar bulunur. Teleostların sinir sistemindeki biyokimyasal prosesler memeli ve diğer balık türlerine benzerdir (Carr ve Chambers., 2001). İnsan dışındaki omurgalılar, vücuttaki toplam oksijenin %2-8 kadarını beyindeki metabolik aktiviteler için kullanırlar (Nilsson, 1996). Organizmalarda oksidatif strese karşı en duyarlı organın beyin olarak kabul edilmesinin nedeni, beyin hücrelerinde oksidatif metabolizmanın yüksek olması ve beyin membranlarının yapısında bol miktarda PUFA bulunmasıdır (Mates, 2000). OP bileşikleri degradasyona uğratan temel enzim olan CarbE lerin aktiviteleri de beyinde oldukça düşüktür. Bu, beyinin oksidatif strese karşı neden diğer organlardan daha duyarlı olduğunu açıklamaktadır (Hazarika ve ark., 2003). Beyinde Fe düzeyi son derece.- yüksektir ve ferritine bağlı durumdadır. Ancak; O 2 ve askorbat, Fe nin HO. oluşumuna neden olan mobilizasyonuna neden olurlar. Metallerin katalizlediği Fenton ya da nötr ph da yavaş olarak ilerleyen Haber-Weiss reaksiyonları sonucunda oluşan HO., beyinde lipid peroksidasyonuna neden olur (Halliwel ve Gutteridge, 1999). CAT gibi enzimatik antioksidantlar da beyinde diğer dokulara oranla daha az bulunmaktadır. Oysa E ve C vitamini gibi suda çözünebilir antioksidantların, beyindeki düzeyleri oldukça yüksektir. Çünkü bu bileşikler glukoz taşıyıcılarının eşliğinde kan beyin engelini (BBB) kolayca geçebilmektedirler (Sherki ve ark., 2001). Mitokondri, nitrik oksit sentetaz, monoamin oksidaz ve sitokrom P 450 enzimleri, ksantin oksidaz ve arakidonik asit metabolizması gibi süreçler beyinde ROS üretimine neden olmaktadır. Sağlıklı beyin hücrelerinde yüksek oranda enzimatik ve de küçük moleküler ağırlıklı antioksidantlar bulunur. Cu, Zn-SOD ve Mn-SOD, CAT, GPx ve küçük moleküler ağırlıklı GSH, C ve E vitaminleri ile besinsel flavonoidler bunlardan bazılarıdır (Schulz ve ark., 2000). Hücre ölümleri, motor nöron bozuklukları ve aksonal hasarlar gibi sinirsel dejenerasyon mekanizmalarında başrol ROS a aittir (Mates, 2000). Beyin hücre tiplerinde ROS a karşı direnç düşük moleküler ağırlıklı tiyollerin derişimlerine, enzim aktivitelerindeki değişikliklere, NADPH rejenerasyonundaki düzenlenmelere 24

34 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU ve GSH sentezi öncülerinin kullanılabilirliğine bağlıdır. Beyinde GSH miktarının azalması, beyin hücrelerinde çeşitli ksenobiyotiklere karşı duyarlılığın artmasına ve mitokondride bozukluklara neden olabilmektedir. Azalan GSH içeriği ve ATP miktarı, sinerjistik olarak oksidatif strese ve nöron kaybına neden olmaktadır (Dringen, 2000) Kan beyin engeli Nörotoksisite, çeşitli toksikantların beyin ve omurilikte bulunan duyarlı bölgelere ulaşmaları ile gerçekleşmektedir (Blake ve ark, 2001). Beyin, toksik bileşiklerin yıkıcı etkilerinden iki önemli bariyer ile korunmaktadır. Bunlar, BBB ve kan-beyinomurilik sıvısı engelidir. BBB, sıkı bağlantı bölgeleri (tight junction) ile birbirlerine bağlı olan beyin kapiller endotelyum hücreleri kökenli birimlerden oluşmaktadır (Demeule ve ark., 2002). Beyin, retina, omurilik ve çevresel sinir sistemi bu bariyerler tarafından korunmaktadır. Lipofilik ilaçlar ve bileşikler, pasif difüzyon yoluyla BBB yi kolayca geçebilmektedirler. Normal koşullarda, hidrofilik bileşiklerin BBB yi geçmeleri olanaksızdır, ancak; bazı aktif taşıma sistemleri aracılığıyla bu bileşiklerin bariyeri geçmeleri sağlanmaktadır (Narayanan ve Gunturi., 2005). Bunlar amino asit, heksoz amin, peptid, kolin ve nükleosid taşıma sistemleridir. Bu taşıma sistemlerindeki farklılıklar ile lipofilite ve moleküler ağırlık çeşitli bileşiklerin engeli geçerek beyin içine alınmasında önemlidir. Ksenobiyotiklerin merkezi sinir sistemi (CNS) üzerindeki etkileri, BBB tarafından düzenlenmektedir. BBB, beyni hedef alan ilaçların CNS de beklenen farmakolojik etkilerini göstermelerinde ve de ilaçların CNS deki yan etkilerinin azaltılamasında da önemli görevler üstlenmektedir (Tsuji ve Tamai, 1999). BBB; bir ksenobiyotiği elimine edebileceği gibi onun beyine girişini ya da metabolizmasını da düzenleyebilmektedir. Bir ksenobiyotiğin BBB bütünlüğü üzerindeki yıkıcı etkisi, nörotoksik türlerden tamamen farklı bir bileşiğin de beyine girişine neden olabilmektedir (Walker ve Coleman, 1995). Deneysel çalışmalarda bir bileşiğin beyin ya da kan dokusuna bağımlı afinitesi BBB partisyon katsayısı terimi ile ifade edilmektedir (Narayanan ve Gunturi., 2005). 25

35 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU 1.7. Biyoindikatör organizma Biyoindikatör türler organizmaların çeşitli stres koşullarına karşı gösterdikleri belirgin parametre değişiklikleri olan biyomarkırları, yüksek değerlerde dışa vuran belirleyici organizmalardır (Adams, 2002). Balıklar su kirliliğini belirlemede biyoindikatör türler olarak tercih edilmektedir (Fabacher ve Little, 2000). Memeliler ve birçok yüksek omurgalının sinir sisteminin fonksiyonlarından sorumlu olan biyokimyasal mekanizmaları etkileyen araştırmaların birçoğunda biyoindikatör tür olarak balıklar kullanılmaktadır. Bu araştırmaların çoğunda amaç, balığın sinir sisteminde oluşan tepkiden daha çok kirleticilerin sinir sistemini hangi şekilde etkilediğidir (Carr ve Chambers., 2001). Bu çalışmada kullanılacak olan C. carpio, Cyprinidae familyasından bir tatlı su balığıdır ve çevresel şartlara karşı direnci yüksektir. Yumuşak dip sedimentlerinde yaşayan omnivor bir türdür, besininin büyük kısmını sedimentten karşılar. Sıcaklık direnci 3-35 C arasındadır. Dünyanın birçok ülkesinde kültüre alınmıştır ( C. carpio, günümüzde Asya nın tamamı, Avrupa nın büyük bir kısmı ile Latin Amerika nın bazı bölgelerinde kültüre alınmıştır ve dünya üzerinde geniş bir yayılım alanına sahip olması nedeniyle biyodeneylerde sıklıkla kullanılmaktadır (Aydın ve Köprücü, 2005). Balıklarda ksenobiyotiklerin indirgenme metabolizmaları gibi önemli metabolik süreçler memeli türlerine benzer özelliktedir (Kitamura ve ark., 2000). Su ortamlarında oksidatif stres oluşturabilme potansiyelinde olan birçok çevresel kirletici bulunmaktadır ve memeli türlerine benzer şekilde balık dokularında sürekli olarak ROS üretimi gerçekleşmektedir (Kelly ve ark., 1998). 26

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Uzun süre kirleticilerin etkisinde yaşayan organizmalarda, kirleticiler doku ve organlarda birikime uğrayabilmekte ve ilerleyen zamanlarda, yıkıcı etkilere yol açan dönüşümsüz moleküler değişikliklere neden olabilmektedir (Lopes ve ark., 2001). Çevre kirleticilerinin ve de özellikle pestisitlerin balıklarda oksidatif strese neden olarak antioksidant enzimler ile glutatyon metabolizmasında düzensizliklere ve membranlarda lipid peroksidasyonuna yol açmasıyla ilgili birçok laboratuvar ve arazi çalışması bulunmaktadır. Cypermethrin insektisidinin subletal konsantrasyonları etkisinde C. carpio ve Oreochromis niloticus da böbrek dokularında SOD ve GPx aktivitelerinin önemli derecede arttığı bildirilmiştir (Uner ve ark., 2001). C. carpio ve Ictalarus nebulosus da dichlorvos etkisinde 24. saatte beyin, böbrek, kalp, karaciğer, solungaç ve kas dokularında antioksidant sistemler ve lipid peroksidasyonu incelenerek; C. carpio da en yüksek SOD aktivitesi karaciğerde bulunmuş, beyindeki SOD aktivitesindeki artışının pestisid derişimine bağlı olduğu saptanmıştır. I. nebulosus da beyinde SOD aktivitesinin değişmediği, karaciğerde ise SOD ve CAT aktivitelerinin artış gösterdiği bildirilmiştir (Hai ve ark., 1997). 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), azinphosmethyl ve bu pestisidlerin kombinasyonlarının etkisindeki O. niloticus ve C. carpio da solungaç, böbrek ve beyin dokularında antioksidant sistemlerin incelendiği çalışmada; O. niloticus da beyin dokusunda CAT aktivitesinin değişmediği, C. carpio da bu pestisidlerin tek başına ve kombine uygulamalarında, böbrekte CAT aktivitesinin yükseldiği ve her iki türün solungaç dokularında SOD aktivitesinin önemli derecede arttığı bulunmuştur (Oruc ve ark., 2004). Kırk gün süresince 2,4-D herbisitinin ön maddesi olan 2,4-dichlorophenol etkisindeki Carassius auratus da karaciğerde CAT aktivitesinin ilk 2 günde inhibe olduğu, SOD aktivitesinde ise en yüksek artışın 5. günde görüldüğü bildirilmiştir (Zhang ve ark., 2005). Kırkbeş gün süresince, 17 ve 27 o C de subletal derişimlerdeki paraquat etkisinde, O. niloticus dişi ve erkeklerinde karaciğerde, SOD, GST ve GR enzim 27

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU aktiviteleri cinsiyete ve farklı sıcaklık değerlerine bağlı olarak karşılaştırılmıştır. Aynı sıcaklık değerlerinde, SOD ve GST aktiviteleri erkek bireylerde dişilere oranla önemli derecede yüksek olduğu ancak; GR aktivitesinin sadece dişi bireylerde önemli derecede arttığı ve cinsiyete bağlı olarak değişim gösterdiği saptanmıştır. 17 o C deki dişiler dışında, kontrollere oranla tüm gruplarda hepatosomatik indeksin önemli derecede yüksek olduğu bildirilmiştir (Figueiredo-Fernandes ve ark., 2006). Doksanaltı saat süresince 2 mg/l OP insektisid methyl parathion etkisinde Brycon cephalon da beyaz kasta, karaciğerde ve solungaçlarda SOD, CAT ve GST aktivitelerinde önemli derecede artış saptanmıştır. Lipid peroksidasyonu miktarı solungaçlar ile kasta önemli derecede artarken, karaciğerde herhengi bir değişim gözlenmemiştir (Monteiro ve ark., 2006). Yirmi gün süresince μg/l hexachlorobenzene etkisinde jüvenil C. carpio da karaciğer ve beyinde oksidatif stres parametreleri incelenmiştir. 5. ve 10. gün sürelerinde karaciğerde GSH düzeyi ile SOD aktivitesinde değişiklik gözlenmemiş ancak ilerleyen sürelerde azalmalar saptanmıştır. Beyinde, tüm sürelerde, GSH düzeyi ile SOD aktivitesinde önemli derecede artış belirlenmiştir. Beyinde lipid peroksidasyonu ürünleri, ROS ve GSSG miktarında, GR, GST ve GPx aktivitelerinde önemli derecede artış olduğu bildirilmiştir (Song ve ark., 2006). Antioksidant savunma sistemine ait parametreler içerisinde, GSH düzeyi ile GR ve GST aktiviteleri, sucul organizmalarda çevresel kirliliğin belirlenmesinde kullanılabilecek yararlı biyomarkırlardır (Doyotte ve ark., 1997). Otuz gün süresince (1, 7, 15, 30) subletal derişimlerdeki diazinon etkisinde O. niloticus da solungaç, böbrek, sindirim kanalında (mide ve bağırsak) ve kas dokularında antioksidant enzim aktiviteleri ile MDA ve protein düzeyleri incelenmiştir. Tüm dokularda, SOD aktivitesinin arttığı, SOD ve oksidatif stres açısından diazinona karşı en duyarlı dokunun böbrek olduğu saptanmıştır. CAT aktivitesi sindirim kanalında artarken diğer dokularda değişmemiştir. Solungaç dokusunda MDA miktarı değişmezken kasta 15. ve 30. günlerde arttığı, sindirim kanalında 7. gün dışındaki tüm sürelerde MDA düzeyinin azaldığı ve böbrekte derişime bağlı olarak MDA miktarının önemli derecede arttığı saptanmıştır. Kas, 28

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU böbrek ve sindirim kanalında protein miktarının azaldığı ancak; 15. günde sindirim kanalı ile solungaçlarda arttığı bildirilmiştir (Durmaz ve ark., 2005). Farklı derişimlerde 2,4-dichlorophenol etkisine bırakılan C. auratus da karaciğerde GSH düzeyinin en yüksek derişim olan 1 ppm dışındaki tüm derişimlerde azaldığı, GSSG düzeyinin ise tüm derişimlerde önemli derecelerde arttığı belirlenmiştir. GSH/GSSG oranı tüm derişimlerde azalırken GR aktivitesinin sadece en düşük iki derişim olan ve 0.01 ppm de azaldığı ve diğer derişimlerde değişmediği saptanmıştır. GST aktivitesinin ise düşük derişimlerde artarken yüksek derişimlerde değişmediği bildirilmiştir (Zhang ve ark., 2004). Doksanaltı saat süresince herbisid molinat etkisindeki Anguilla anguilla da kas ve karaciğerde glutatyon metabolizması incelenmiştir. 29 saat sonunda ölen balıklarda karaciğer ve kas GSH düzeyinin azaldığı, GSSG nin değişmediği saptanmıştır. 48 saat sonunda ölen balıklarda ise karaciğerde GSH düzeyi değişmezken kas dokusunda azaldığı, GSSG miktarının ise her iki dokuda da değişmediği bulunmuştur. 72 saat sonunda ölen balıklarda karaciğer GSH düzeyi artarken kas dokusunda azaldığı, karaciğerde GSSG miktarı artarken kas dokusunda değişmediği belirlenmiştir. 96 saat sonunda ölen ve ölmeyen balıklarda, karaciğer GSH ve GSSG düzeyinin azaldığı, kasta ise GSH ve GSSG düzeylerinin değişmediği saptanmıştır. Her iki dokuda da GSH/GSSG oranının önemli derecede azaldığı, GR aktivitesinin ise balıkların direnç özelliklerine göre artış gösterdiği bildirilmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2001). Herbisid paraquat etkisindeki Oncorhynchus mykiss de karaciğerde total GSH ve GSSG düzeyleri ile GR aktivitesinin tüm derişim ve sürelerde arttığı, GST aktivitesinin süre ve derişime bağlı olarak arttığı bildirilmiştir (Stephensen ve ark., 2002). Kırksekiz saat süresince 0.75 μg/l piretroid insektisid deltamethrin etksindeki Channa punctatus da karaciğer, böbrek ve solungaçta antioksidant parametreler, lipid peroksidasyonu ve protein düzeyleri incelenmiştir. En fazla solungaçta olmak üzere tüm dokularda lipid peroksidasyonun ve GSH miktarının önemli derecede arttığı saptanmıştır. CAT aktivitesinin tüm dokularda azaldığı, GST aktivitesinin ise karaciğer ve böbrekte önemli derecede artarken solungaçlarda önemli derecede 29

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU azaldığı bulunmuştur. Karaciğer protein miktarında önemli derecede artış olurken böbrekte görülen artışın önemli derecede olmadığı ve solungaçlarda önemli derecede azalma olduğu bildirilmiştir (Sayeed ve ark., 2003). N-asetilsisteinin balıklarda pestisidlerin indüklediği oksidatif strese karşı koruyuculuğunu gösteren çalışmaların sayısı oldukça sınırlı olmakla birlikte, yapılan çalışmaların birçoğu, sıçanlar ve diğer memeliler üzerinde çeşitli kirleticilerin etkisindeki uygulamalar ile sınırlıdır. A. anguilla da; GSH metabolizması tam olarak düzenlenemediği zaman, OP pestisidlerin yol açtıkları oksidatif stresin hücresel nekrozlara ve daha ileri aşamalarda beyin, karaciğer ve kas dokularında işlev bozuklukları ile balığın ölümüne neden olduğu bildirilmiştir. Doksanaltı saat süresince OP dichlorvosun LC 85 inin etkisine bırakılmadan hemen önce A. anguilla ya intraperitonal olarak uygulanan NAC nin; karaciğerde ve kasta GSH içeriği ile GSH/GSSG oranını ve karaciğerde GR ve GST aktivitelerini artırdığı bildirilmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2003a). On gün süresince letal olmayan arsenic derişimlerinin etkisindeki Clarias batrachus da kuyruk aortuna uygulanan NAC preenjeksiyonun, karaciğerde sadece arsenic uygulanan gruba oranla lipid peroksidasyonu ile GSSG düzeyini düşük tutmada başarılı olduğu saptanmıştır. Ayrıca, NAC uygulanan grupta GSH miktarının ve GR aktivitesinin önemli derecede arttığı bildirilmiştir (Bhattacharya ve Bhattacharya, 2007). Kültüre alınan O. mykiss de karaciğer hücrelerinde kadmiyum toksisitesine bağlı olarak artan apoptosisin, mitokondriden sitokrom c salınması ve caspase enzimlerinin aktivasyonları ile ilişkili olduğu ve bu etkilerin antioksidant NAC uygulaması sonucunda azaldığı belirtilmektedir (Faverney ve ark., 2004). Streptozotocin etkisindeki diabetik sıçanlarda, altı hafta süresince içme suyuna eklenen NAC ile sistein öncüsü taurinin (%12 ve %0.8), karaciğerde diyabete bağlı olarak azalan GSH düzeyini arttırmada yetersiz olduğu bildirilmiştir (Patriarca ve ark., 2005). Danio rerio larvalarına uygulanan NAC nin, larvalarda kulak tüyü hücreleri ve nöron kayıplarına yol açan cisplatin ototoksisitesine karşı mükemmel bir koruma 30

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU sağladığı bildirilmiştir. NAC nin D. rerio larvaları üzerindeki koruyuculuğu, bileşiğin apoptosise karşı olan etkileri ile sinirsel fonksiyonları koruyucu ve antioksidant özellikleri ile açıklanmaktadır (Ton ve Parng, 2005). Nil nehrinin kirli bölgelerinden yakalanan O. niloticus da karaciğerde ve böbrekte GR ve GPx aktiviteleri, kontrol gruplarına oranla oldukça yüksek bulunmuştur (Hamed ve ark., 2003). Dichlorvos etkisindeki C. carpio da GSH düzeyinin karaciğer, böbrek, solungaç, kas ve kalpte azalırken beyinde değişmediği I. nebulosus da ise tüm dokularda derişime bağlı olarak arttığı belirlenmiştir. C. carpio da tüm dokularda lipid peroksidasyonu düzeyinin derişime bağlı olarak azaldığı, I. nebulosus da ise lipid peroksidasyonu düzeyinin tüm dokular içinde sadece beyin dokusunda arttığı belirlenmiştir (Hai ve ark., 1997). Doksan gün süresince farklı derişimlerdeki kağıt fabrikası atık sularının etkisindeki Heteropneustes fossilis de karaciğerde MDA düzeyinin değişmediği ancak; böbrek ve solungaçlarda arttığı bildirilmiştir (Fatima ve ark., 2000). Otuz gün süresince phosphorothionate insektisid 2-butenoic acid-3-(diethoxy phosphinothionyl) ethyl ester in (RPR-V) subletal derşimlerinin etkisinde O. mossambicus da karaciğerde nekrozis saptanmıştır. Plazma, beyin, solungaç, karaciğer, böbrek ve kasta GSH düzeyi ile GST aktivitesinde önemli derecelerde artış olduğu ve tüm dokularda lipid peroksidasyonun arttığı bildirilmiştir (Rao, 2006). Organoklorlu pestisid endosulfan etkisinde O. mykiss de böbrek üstü bezi hücrelerinde CAT aktivitesinin yüksek derişimlerde azaldığı diğer derişimlerde ise arttığı, GPx aktivitesinin ve GSH düzeyinin önemli derecede azaldığı, GST aktivitesinin ise yükseldiği saptanmıştır. Lipid hidroperoksidlerinin miktarında da önemli derecede artış olduğu bildirilmiştir (Dorval ve ark., 2003). Otuz gün süresince (10, 30 ve 90 mg/kg vücut ağırlığı/gün) subkronik ve kronik propoxur (2-isopropoxy phenyl N-methyl carbamate) etkisinde sıçan kanında glutatyon redoks döngüsü, antioksidant enzim aktiviteleri ve lipid peroksidasyonu miktarı belirlenmiştir. Serum MDA düzeyi ile eritrosit CAT ve SOD, plazma GR ve 31

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU serum GST aktivitelerinde doza bağlı olarak artış olduğu bildirilmiştir (Seth ve ark., 2001). Azinphosmethyl ve 2,4-diaminin birlikte ve ayrı ayrı etkisine bırakılan C. carpio ile Tilapia zillii de; her iki bileşiğin etkisinde C. carpio da karaciğerde MDA düzeyinin değişmediği saptanmış ve sadece azinphosmethyl etkisindeki T. zillii de karaciğerde MDA düzeyinin arttığı bildirilmiştir (Oruc ve Uner, 2002). D. rerio da, 250 gün süresince (0.2, 0.9, 4.3 ve 20 μg/l) OP parathion etkisinde derişime bağlı olarak AChE aktivitesinin inhibe olduğu ve AChE aktivitesinin OP pestisidlerin organizmalar üzerindeki etkisinin belirlenebilmesinden çok bu pestisidlerle etkileşim olduğunun belirlenmesinde kullanılan önemli bir biyomarkır olduğu bildirilmiştir (Roex ve ark., 2003). Doksanaltı saat süresince, OP chlorpyrifos (1.0, 10 and 100 μg/l) ve piretroid esfenvalerate (0.01, 0.1 and 1 μg/l) etkisindeki O. tshawytscha da chlorpyrifosun yüksek derişimlerinde, beyin ve kasta AChE nin önemli derecede inhibe olduğu ancak; esfenvalerate grubunda herhangibir inhibisyonun gerçekleşmediği bildirilmiştir (Wheelock ve ark., 2005). Abramis ballerus ve Rutilus rutilus da beyin ve plazma BChE enziminin OP dichlorvosa ve karbamat eserine karşı AChE enziminden çok daha duyarlı olduğu bildirilmiştir (Chuiko, 2000). Organofosfat pestisid malathion ve anilofosun ya da kombinasyonlarının uygulandığı sıçanlardaki eritrosit, kan ve plazma AChE ve BChE ile beyin AChE aktivitelerinin kontrol gruplarına oranla çok daha düşük olduğu belirlenmiştir (Hazarika ve ark., 2003). Organoflorlu etoxazolenin farklı derişimlerin etkisindeki O. niloticus da AChE nin tüm sürelerde derişime bağlı olarak inhibe olduğu bildirilmiştir (Sevgiler ve ark., 2002). Doksanaltı saat süresince in vivo ve in vitro chlorfenvinphos, chlorpyrifos, diazinon ve carbofuran etkisindeki juvenil C. carpio da; chlorpyrifos, diazinon ve carbofuranun en yüksek derişimindeki balıkların tamamının ilk 4 saat içinde öldüğü, kontrol grubuna oranla beyinde AChE inhibisyonu açısından önemli derecede bir fark bulunmadığı saptanmıştır. Düşük derişimlerde ise beyinde AChE inhibisyonun 32

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emine ÇINKILOĞLU önemli derecede arttığı belirlenmiştir. İn vitro açıdan, uygulanan tüm derişimlerde ve gruplarda beyinde %50 ye varan inhibisyon bildirilmiştir (Dembele ve ark., 2000). Karbamat herbisid thiobencarb (1/60 LC sa = 0.22 ppm 96 saat için) etkisindeki A. anguilla da gözlerde total ve spesifik AChE aktivitesi incelenmiştir. Uygulama sonrasında balıklar 1 hafta süresince yenilenme periyodu için temiz suya aktarılmıştır. 96 saat sonunda total AChE aktivitesinde %35, spesifik AChE aktivitesinde %75 inhibisyon olduğu ve yenilenme periyoduna alınan balıklarda da inhibisyonun devam ettiği bildirilmiştir (Sancho ve ark., 2000). Bu çalışmanın amacı, C. carpio da subletal fenthion derişiminin 96 saat süresince ve intraperitonal NAC uygulamasında beyin dokusunda, antioksidant sistemler, lipid peroksidasyonu ve AChE enzim aktivitesindeki değişimlerin incelenmesidir. Beyinde lipid peroksidasyonunu belirlemek amacıyla MDA düzeyine bakılmıştır. Beyin dokusunda, fenthion etkisiyle oluşan ROS ve serbest radikallerden kaynaklanan oksidatif stresi belirlemek amacıyla, GSH ve GSSG düzeyleri, glutatyona bağımlı enzimler olan GR, GST ile SOD ve CAT gibi enzimatik antioksidantların aktiviteleri belirlenmiştir. Fenthionun nörotoksik etkilerini belirleyebilmek amacıyla AChE aktivitesi incelenmiştir. 33

43 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Devlet Su İşleri (D.S.İ.) balık yetiştirme çiftliğinden alınan jüvenil C. carpio örnekleri, bir ay süresince içerisinde 100L dinlendirilmiş musluk suyu içeren cam akvaryumlarda 20±2 C sıcaklıktaki laboratuvar koşullarında adaptasyona bırakılmış ve günde üç defa ağırlıklarının %3 ü kadar hazır yem (Çamlı Yem, Türkiye) ile beslenmişlerdir. Suyun özellikleri; sıcaklık 19.48±0.25 o C, ph 8.40±0.05, çözünmüş oksijen 7.05±0.15 mg/l, alkalinite 235 mg/l CaCO 3, toplam sertlik 284 mg/l CaCO 3 tür. Balıklar 13.02±0.19 cm boyunda ve 28.36±1.23 g ağırlığındadır. Laboratuvarda, 12 saat aydınlanma periyodu uygulanmış ve akvaryumlar merkezi havalandırma sistemi ile havalandırılmıştır Kimyasal Maddeler 1-kloro-2,4-dinitro-benzen CDNB Sigma 2-Tiyobarbitürik Asit TBA Merck 2-Vinilpiridin 2-VP Aldrich 3-(Siklohekzilamino)-1-Propan Sülfanik Asit CAPS Sigma 5,5 -Ditiyo-bis (2-Nitrobenzoik Asit) DTNB Sigma 5-sülfosalisilik asit Sigma Asetik Asit CH 3 COOH Riedel-de Haen Asetilkolintiyoiyodür Sigma Bakır Sülfat CuSO 4.5H 2 O Sigma di-potasyum Hidrojen Fosfat K 2 HPO 4 Merck di-sodyum Hidrojen Fosfat Na 2 HPO 4.7H 2 O Merck 34

44 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Etil alkol C 2 H 5 OH Riedel-de Haen Etilendiamin Tetraasetik Asit EDTA Sigma Etopropazin Folin-Ciocalteu Fenol Ayıracı Sigma Sigma Glutatyon Redüktaz GR Sigma Hidrojen peroksid H 2 O 2 Merck Ksantin Merck N-Asetilsistein NAC Merck n-butanol Merck Okside L-Glutatyon GSSG Sigma Piridin Merck p-iyodonitrotetrazolyum Violet INT Sigma Potasyum Dihidrojen Fosfat KH 2 PO 4 Merck Redükte L-Glutatyon GSH Sigma Sığır Serum Albumini Sigma Sodyum Dihidrojen Fosfat NaH 2 PO 4 Merck Sodyum Dihidrojen Fosfat NaH 2 PO 4.2H 2 O Merck Sodyum Dodesil Sülfat SDS Sigma Sodyum Hidroksit NaOH Merck Sodyum Klorür NaCl Merck Sodyum Potasyum Tartarat Sükroz Merck Sigma 35

45 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Tiyobarbiturik asit TBA Merck Tris Baz Sigma Tris Hidroklorür Tris HCl Sigma β-nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat β-nadph Sigma Cihazlar ve Diğer Gereçler Analitik Terazi Sartorius CP-224 Benmari Memmert WB 22 Buz Makinası Scotsman AF 20 Distile Su Cihazı Şimşek Laborteknik SS 200 Homojenizatör Janke&Kunkel Ultra-Turrax T-25 Oksijenmetre Lovibond Sensodirect Oxi200 Otomatik Pipetler Eppendorf, Labart, Biohit ph metre Hanna Instruments PH 211 Santrifüj Hettich EBA 8S Soğutmalı Santrifüj Jouan MR 23i Terazi Sartorius BP-310S UV-Visible Spektrofotometre Shimadzu UV mini 1240 Vortex Janke&Kunkel VF Yöntem Denemeler kontrollü olarak 100 L lik dört cam akvaryumda 96 saatlik süre içerisinde gerçekleştirilmiştir. Kontrol grubu temiz suda bekletilmiş, diğer üç akvaryuma fenthionun [O, O-Dimethyl O-(3-methyl-4-methylthiophenyl) phosphorothioate, Lebaycid EC 50, Bayer (Bayer Türk Kimya Sanayi Ltd. Şti.), 525g/L] 96 saatlik LC 50 değerinin (2.16 mg/l) %80 i olan 1.73 mg/l pestisid 36

46 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU çözeltisi uygulanmıştır. Fenthionun C. carpio için LC 50 derişimi laboratuarımızda yapılan diğer bir çalışma ile belirlenmiştir. Enjeksiyondan hemen önce balıklar buzlu su içerisinde bayıltılmışlardır. Kontrol grubu ile fenthion etkisine bırakılacak olan bir gruba %0.59 luk 50 µl NaCl çözeltisi, geriye kalan ve fenthion etkisine bırakılacak olan gruplara ise sırasıyla 0.5 ve 400 mg/kg NAC intraperitonal olarak enjekte edilmiştir. Böylece kontrol, fenthion, fenthion mg/kg NAC ve fenthion mg/kg NAC olmak üzere dört farklı grup oluşturulmuştur. Bayılmadan kaynaklanabilecek stresi elimine edebilmek amacıyla, balıklar temiz suda bekletilmiş ve enjeksiyondan üç saat sonra pestisid uygulanan akvaryumlara aktarılmışlardır. Denemeler süresince her 24 saatte bir fenthion derişimdeki değişimleri en aza indirebilmek amacıyla su değişimi yapılmıştır. Su değişimi, balıkların temiz su doldurularak hazırlanmış akvaryumlara aktarılmaları şeklinde gerçekleştirilmiş ve aktarım sırasında oluşabilecek stresi en aza indirebilmek amacıyla kontrol grubundaki balıklar da benzer şekilde temiz su içren akvaryumlara aktarılmışlardır. Bütün gruplar 8 er adet bireyden oluşmaktadır. Deneme süresi sonunda, beyin omurilik bağlantısı kesilerek öldürülen balıkların beyin dokuları disekte edilerek bekletilmeden %0.59 luk soğuk NaCl çözeltisi ile yıkanıp tartılarak analizler gerçekleştirilene kadar -80 C de saklanmıştır. Analizler sırasında beyin dokusu 1/10 ağırlık/hacim (w/v) oranında, 0.25 M sükroz içeren, ph 7.4 olan 0.05 M sodyum-fosfat tamponu ile homojenizatörde rpm de 3 dakika homojenize edilmiş ve homojenat +4 C de 9500 g de 30 dakika santrifüjlendikten sonra süpernatantlarda MDA ve protein düzeyleri ile SOD, CAT, GR, GST ve AChE enzim aktiviteleri belirlenmiştir. Total GSH ile GSSG içeriğinin spektrofotometrik olarak belirlenebilmesi için elde edilen süpernatantlar 1/0.5 (w/v) oranında %10 luk sülfosalisilik asit çözeltisi ile 9500 rpm de 1 dakika homojenize edildikten sonra, +4 C de 9500 g de 5 dakika daha santrifüjlenmiştir. Tüm homojenizasyon işlemleri buz içerinde gerçekleştirilmiştir Analiz Yöntemleri Süperoksid Dismutaz Yöntemi 37

47 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Süperoksid dismutaz, O.- 2 nin, H 2 O ve O 2 ye dismutasyonunu katalizleyen antioksidant bir enzimdir. Ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) varlığında oluşturulan.- toksik O 2 radikalleri kırmızı renkli formazon bileşiği oluşturacak şekilde 2-(4- iyodofenil)-3(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolyum klorid ile reaksiyona girmektedir. Enzim aktivitesi SOD varlığında gerçekleşen formazon oluşumunun inhibisyonunun 505 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile belirlenmektedir (McCord ve Fridovich, 1969). O 2.- SOD O 2 + H 2 O 2 Yöntem Süperoksid dismutaz enzim aktivitesini ölçmek için ayıraçlar kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.1). Çizelge 3.1. Süperoksid Dismutaz Yöntemi Çözeltiler ve Kör (ml) Örnek (ml) Ayıraçlar Örnek Fosfat Tamponu (0.01 M; ph 7.0) Mixed Substrat (ph 10.2 CAPS Tamponu içerir) İyice çalkalanır XOD (80 U/mL)

48 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Tekrar çalkalandıktan sonra 30 sn sonra 37 o C de, 505 nm dalga boyunda havaya karşı başlangıç absorbansı (A1) 0. dakika okunur. 3 dakika sonra ise son absorbans (A2) okunur. Hesaplama A2 A1 A /dakika = 3 A/dakika %İnhibisyon = 100 A/dakika Elde edilen % inhibisyon değeri standart eğriden değerlendirilir. kör SOD spesifik aktivitesi (U/mg protein) = SOD Aktivitesi Protein Miktarı Katalaz Yöntemi Katalazın 37 o C de H 2 O 2 yi tüketmesi ve H 2 O ya yıkım hızı, H 2 O 2 nin 230 nm de ışığı absorbe etmesinden yararlanılarak spektrofotometrik olarak ölçülebilmektedir. Enzim aktivitesinin hesaplanmasında, H 2 O 2 nin 230 nm deki ekstinksiyon katsayısı kullanılmaktadır (Beutler, 1984). 2 H 2 O 2 CAT 2 H 2 O + O 2 Yöntem Katalaz enzim aktivitesini ölçmek için ayıraçlar kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.2). 39

49 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Çizelge 3.2. Katalaz Yöntemi Çözeltiler ve Ayıraçlar Kör (ml) Örnek (ml) Tris Tamponu (ph 8.0) H 2 O (10 mm) H 2 O C de 10 dakika inkübe edildi Örnek ölçülür. Kör ve örneğin absorbansı 230 nm dalga boyunda 0., 2.5 ve 5. dakikalarda Hesaplama Katalaz aktivitesi (U/mL) = ODxVt 0.71xVö OD= Zamana göre absorbans değişimi Vt = Toplam hacim Vö = Örnek hacim 0.71 = H 2 O 2 nin 230 nm deki ekstinksiyon katsayısı Katalaz spesifik aktivitesi (U/mg protein) = CAT Aktivitesi Protein Miktarı 40

50 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Total Glutatyon Yöntemi Total GSH miktarının belirlenmesi sırasında, DTNB tarafından okside edilen GSH ile GSH ın ortamdaki diğer çözünebilir tiyol bileşikleri ile oluşturduğu disülfid bağlanmaları ve GSSG, GR enzimi varlığında GSH a dönüşmekte ve bu sırada NADPH, NADP ye indirgenmektedir. Bu enzimatik döngü sırasında meydana gelen sarı renkli 2-nitro-5-tiyobenzoik asit miktarının 412 nm dalga boyunda ölçülmesi ve elde edilen absorbans değerlerinin standart GSH grafiği ile derişim değerlerine dönüştürülmesiyle total GSH miktarı spektrofotometrik olarak belirlenmektedir (Anderson, 1985). Yöntem Total GSH miktarını ölçmek için çözeltiler kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.3). Çizelge 3.3. Total Glutatyon Yöntemi Çözeltiler ve Kör (ml) Örnek (ml) Ayıraçlar NADPH (0.3mM) DTNB (6mM) Örnek Saf su Çalkalanır ve 30 o C de 3 dakika inkübe edilir. Glutatyon Redüktaz (50 U/mL) Çalkalanarak 412 nm dalga boyunda, 30 o C de, 0. ve 3. dakikalarda absorbanslar kaydedilir. Sonuçlar GSH ile hazırlanan standart eğriden değerlendirilir. 41

51 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Çalışma Standartlarının ve Standart Grafiğin Hazırlanması Çalışma tamponu kullanılarak hazırlanan 1000 ng/ml lik stok GSH çözeltisi, 10, 40, 80, 100 ng/ml lik derişimlerde seyreltilir ve bu şekilde çalışma standartlarının hazırlanmasında kullanılacak çözeltiler hazırlanır. Total GSH miktarının ölçülmesinde uygulanan yöntem kullanılırak standart grafik çizilir Okside Glutatyon Yöntemi Okside glutatyon miktarının ölçülmesinde; 5-sülfosalisilik asit içeren homojenata 2-vinilpiridin eklenerek GSH bağlanmakta ve total GSH miktarının ölçülmesinde kullanılan yöntem uygulanarak yalnızca ortamdaki GSSG miktarı belirlenebilmektedir (Griffith, 1980). Glutatyonun 2-vinilpiridin ile Türevlendirilmesi 100 µl örnek alınarak üzerine 2 µl 2-vinilpiridin eklenir kuvvetle vortekslenen örneğin ph sı, NaOH ile 7.0 a ayarlanır ve oda ısısında 1 saat inkübe edilir. Yöntem GSSG miktarını ölçmek için çözeltiler kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.4.). 42

52 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Çizelge 3.4. Okside Glutatyon Yöntemi Çözeltiler ve Kör (ml) Örnek (ml) Ayıraçlar NADPH (0.3mM) DTNB (6mM) Örnek Saf su Çalkalanır ve 30 C de 3 dakika inkübe edilir. Glutatyon Redüktaz (50 U/mL) Çalkalanarak 412 nm dalga boyunda, 30 C de, 0. ve 3. dakikalarda absorbanslar belirlenir. Hesaplama Elde edilen absorbans değerleri total GSH için hazırlanan standart grafik kullanılarak derişim değerlerine dönüştürülür Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon redüktaz, GSSG nin NADPH varlığında GSH a indirgenmesini katalizleyen bir enzimdir. GR aktivitesi, NADPH ın GSSG ile birlikte 37 C de ve 340 nm dalga boyunda yükseltgenmesi sırasındaki absorbans farkının okunması yöntemiyle belirlenmektedir (Carlberg ve Mannervik, 1975). Yöntem Glutatyon redüktaz enzim aktivitesini ölçmek için çözeltiler kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.5.). 43

53 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Çizelge 3.5. Glutatyon Redüktaz Yöntemi Çözeltiler ve Kör (µl) Örnek (µl) Ayıraçlar Saf Su Günlük Tampon (100mM, ph 8.0) Örnek Çalkalanarak inkübe edilmeden 340 nm dalga boyunda, 37 o C de, 0. ve 5. Dakikalarda absorbanslar köre karşı kaydedilir. Hesaplama GR aktivitesi (U/mL) = OD Vt x 6.22 V örnek OD= Zamana göre absorbans değişimi Vt = Toplam hacim Vö = Örnek hacmi 6.22 = 1 nmol NADPH ın 1 cm lik ışık yolunda verdiği OD değeri. GR spesifik aktivitesi (U/mg protein) = GR Aktivitesi Protein Miktarı Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Glutatyon S-transferaz, elektrofilik bileşikler ile GSH ın -SH grubu arasındaki tepkimeyi katalizleyerek bu bileşiklerin detoksifikasyonunu saglar. GST aktivitesi, GSH ile 1-kloro-2,4-dinitrobenzenin (CDNB) konjugasyonu sırasındaki absorbans farkının 340 nm dalga boyunda okunması ile ölçülür (Habig ve ark., 1974). 44

54 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Yöntem Glutatyon S-transferaz aktivitesini ölçmek için çözeltiler kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.6.). Çizelge 3.6. Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Çözeltiler ve Kör (ml) Örnek (ml) Ayıraçlar Tris Tamponu 1.1 ml 1.05 ml (100mM, ph 7.4) CDNB (1mM) 50 µl 50 µl GSH 50 µl 50 µl Örnek µl Çalkalanır ve 340 nm dalga boyunda, 25ºC de, 2 dakika boyunca absorbansdaki artış ölçülür. E 340 CDNB-GSH konjugasyonu: 9.6 mm -1 /cm Aktivite µmol/dakika/mg protein olarak tanımlanır. Hesaplama GST Aktivitesi (μmol/dakika/ml) = OD Vt x t xVö GST Spesifik Aktivitesi(μmol/dakika/mg protein) = GST Aktivitesi Protein Miktarı OD= Zamana göre absorbans değişimi Vt = Toplam hacim Vö = Örnek hacmi 45

55 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Asetilkolinesteraz Yöntemi Asetilkolinesteraz, asetiltiyokolinin tiyokolin ile asetata parçalanması reaksiyonunu katalizleyen bir enzimdir. AChE aktivitesi, tiyokolin ile DTNB arasındaki reaksiyonun sonucunda oluşan 5-tiyo-2-nitrobenzoik asitin verdiği sarı rengin yoğunluğunun, 412 nm dalga boyunda spektrofotometrede ölçülmesi ile belirlenmektedir (Ellman ve ark., 1961). Asetiltiyokolin AChE Tiyokolin + Asetat Tiyokolin + DTNB >5-tiyo-2 nitrobenzoik asit (sarı renk) Yöntem Asetilkolinesteraz enzim aktivitesini ölçmek için çözeltiler kör ve örnek küvetlerine tablodaki sırada eklenir (Çizelge 3.17.). Çizelge 3.7. Asetilkolinesteraz Yöntemi Çözeltiler ve Ayıraçlar Kör (µl) Örnek (µl) Fosfat Tamponu (0.1M, ph ) Örnek DTNB (0.01M) (0.1M, ph 7.0 Na-K Fosfat Etopropazin (8.52x10-3 M) Çalkalanır ve 30ºC de 5 dakika inkübe edilir. Asetilkolintiyoiyodür (0.015M)

56 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Örnek ve kör küvetlerinin 412 nm dalga boyundaki 0. ve 5. dakikalardaki absorbansları ölçülür. Hesaplama AChE aktivitesi (U/mL) = OD Vt x x13.6 t Vö OD= Zamana göre absorbans değişimi t = Zaman Vt = Toplam hacim Vö = Örnek hacmi AChE Spesifik Aktivitesi (U/mg protein) = AChE Aktivitesi Protein Miktarı Malondialdehid Yöntemi Antioksidant sistemin detoksifikasyonda yetersiz kaldığı durumlarda, özellikle; membran lipidlerinin bozulmasıyla sonuçlanan lipid peroksidasyonunun sekonder bir ürünü olan MDA nın aerobik koşullarda, ph 3.5 te tiyobarbitürik asit (TBA) ile 95ºC de inkübasyonu sonucunda oluşturduğu pembe renkli kompleksin spektrofotometrede 532 nm dalga boyunda ölçülmesi ile lipidlere ait peroksidasyon belirlenmektedir (Ohkawa ve ark., 1979). Ayıraçlar Stok standart: 1,1,3,3 tetrametoksipropan (yogunluk 0.99 g/ml) %8.1 Sodyum dodesil-sülfat (SDS) %20 Asetik asit (HAc) (ph 3.5) %0.8 Tiyobarbitürik asit (TBA) (ph 3.5) n-butanol-piridin (nbu-pri) çözeltisi (14/1) 47

57 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Standart Grafiğin Hazırlanması Günlük Standart: 400 nmol/ml lik günlük standarttan hazırlanan 10, 20, 40, 60, 80, 100 nmol/ml lik çalışma standartları standart egri çizimi için kör ve örnek olmak üzere farklı tüplere tabloda belirtildiği şekilde eklenir (Çizelge 3.8.) Çizelge 3.8. Malondialdehid Standart Grafiğinin Hazırlanması Çözeltiler Kör 10nmol 20nmol 40nmol 60nmol 80nmol 100nmol Standart %8.1 SDS %20 Hac %0.8 TBA Saf Su o C de benmaride 30 dakika inkübe edilip soğutulur. Saf Su n-butanol/pridin Kuvvetle vortekslenir ve 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki organik kısım alınarak 532 nm dalga boyunda absorbansı okunur. Yöntem MDA miktarını belirlemek için çözeltiler kör ve örnek olmak üzere farklı tüplere tabloda belirtildiği şekilde yerleştirilir (Çizelge 3.9) 48

58 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Çizelge 3.9. Malondialdehid Yöntemi Çözeltiler Kör (ml) Standart (ml) Örnek (ml) Standart (10 nmol/ml) Örnek %8.1 SDS %20 HAc %0.8 TBA Saf Su o C de 30 dakika inkübe edildikten sonra soğutulur. Saf Su n-butanol/pridin Kuvvetle çalkalanır ve 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki organik kısım alınarak 532 nm dalga boyunda absorbansı okunur. Sonuçlar standart grafikten değerlendirilir. 0,1 0,08 y = 0,0008x R 2 = 0,9968 0,06 0,04 0, Şekil 3.1. MDA standart grafiği 49

59 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Protein Yöntemi Yöntem alkali şartlarda proteinlerin peptid bağlarındaki nitrojenler ile tirozin atıklarının, bakır ile bakır-peptid bağı protein kompleksini oluşturmaları ve bakır tarafından okside olan halkaların fosfotungustik asit-molibdik asit ayıracını (Folin- Ciocalteu ayıracı) heteropolimolibdenum mavisine indirgemeleri sonucunda oluşan mavi rengin şiddetinin 750 nm dalga boyunda spektrofotometrede belirlenmesi prensibine dayanmaktadır. Fenol-Ciocalteu ayıracı eklenmesi, olası yanlış indirgenmelerin önlenmesi açısından gereklidir. Metod ph değerlerine karşı oldukça duyarlıdır ve çok az miktarda örnek ile çalışılmasına olanak vermektedir (Lowry ve ark.,1951). Ayıraçlar Alkali Na 2 CO 3 Çözeltisi Bakır Sülfat-Sodyum Potasyum Tartarat Çözeltisi %1 CuSO4.5H2O %2 Na-K tartarat Kullanılacağı zaman bu çözeltiler eşit hacimde karıştırlarak hazırlanır. Alkali Çözelti (Günlük olarak hazırlanır.): 50 ml alkali Na2CO3 çözeltisi 1 ml bakır sülfat-sodyum potasyum tartarat çözeltisi ile karıştırılarak hazırlanır. Folin-Ciocalteu Ayıracı: 1 ml Folin-Ciocalteu 1.5 ml saf su şeklinde hazırlanır. Yöntem 0.3 ml örnek çözeltisi alınarak üzerine 3 ml alkali çözelti ilave edilip 15 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Bu süre sonunda, 0.3 ml Folin-Ciocalteu ayıracı eklenerek 30 dakika oda sıcaklığında bekletilir ve örnekler 750 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur. Aynı işlem 0.3 ml saf su kullanılarak kör için de uygulanır. 50

60 3.MATERYAL ve YÖNTEM Emine ÇINKILOĞLU Hesaplama Sığır serum albumini kullanılarak çizilen standart eğri kullanılarak örneklerin içerdiği protein miktarı degerlendirilir İstatistiksel Analiz Biyokimyasal analiz sonuçları SPSS 10.0 paket programında OneWay Anova- SNK testi kullanılarak P<0.05 önem derecesinde belirlenmiştir. 51

61 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU 4. BULGULAR C. carpio da beyinde fenthion içeren ortamda NAC nin glutatyon redoks durumuna, antioksidant enzim aktiviteleri ile MDA ve protein düzeylerine olan etkileri belirlenmiş ve fenthionun nörotoksisite potansiyeli incelenmiştir Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri C. carpio da beyinde fenthion içeren ortamda NAC nin glutatyon redoks durumuna etkileri Çizelge 4.1 de ve Şekil 4.1 de verilmiştir. Fenthion ve farklı derişimlerdeki NAC etkisinde beyinde glutatyon redoks durumu incelendiğinde, fenthion grubuna oranla, fenthion+0,5 mg/kg NAC grubunda tgsh, GSH ve GSH/GSSG de artış olurken; fenthion+400 mg/kg NAC de ise tgsh, GSH ve GSH/GSSG de fenthion grubuna oranla önemli derecede bir değişim olmadığı ve GSSG düzeyinde, tüm gruplarda, kontrole ve fenthion grubuna oranla azalmalar olduğu bulunmuştur. Total GSH düzeyinde; kontrole oranla fenthion grubunda %27 düzeyinde artış belirlenmiştir. Fenthion+0,5 mg/kg NAC grubunda, fenthion grubuna göre % 116 oranında artış olduğu, fenthion+400 mg/kg NAC de ise fenthion grubuna oranla önemli derecede bir değişim olmadığı kaydedilmiştir. Redükte glutatyon düzeyinde tüm gruplarda artış olduğu belirlenmiştir. Fenthion grubunda kontrole oranla %59 düzeyinde artış belirlenmiştir. Fenthion+0,5 mg/kg NAC de, fenthion grubuna oranla %151 oranında artış gerçekleşirken fenthion+400 mg/kg NAC de, fenthion grubuna oranla önemli derecede bir değişim meydana gelmemiştir. Okside glutatyon düzeyinde; tüm gruplarda kontrole oranla azalmalar olduğu belirlenmiştir. Fenthion grubunda kontrole göre %42 düzeyinde azalma olduğu kaydedilmiştir. Fenthion grubuna oranla fenthion+0,5 mg/kg NAC ile fenthion+400 mg/kg NAC gruplarında sırasıyla %44 ve %90 düzeyinde azalmalar gerçekleşmiştir. Beyinde GSH/GSSG oranında tüm gruplarda artış gerçekleşmiştir. Kontrole göre fenthion grubunda %188 düzeyinde artış gerçekleşmiştir. Fenthion grubuna 52

62 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU oranla fenthion+0,5 mg/kg NAC de %176 ve fenthion+400 mg/kg NAC grubunda %53 düzeyinde artış belirlenmiştir. Çizelge 4.1. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri Gruplar tgsh GSH GSSG GSH/GSSG Kontrol 33,45±2,18 a* 23,34±2,23 a 4,99±0,33 a 11,252±0,9 a Fenthion 42,54±2,21 b 37,08±1,87 b 2,91±0,18 b 32,409±1,9 b Fenthion+0,5 mg/kg NAC Fenthion+400 mg/kg NAC 92,09±13,12 c 93,01±4,31 c 1,63±0,21 c 89,519±3,6 c 40,10±1,28 ab 38,53±1,00 b 0,28±0,03 d 49,580±4,1 d *a, b, c, d harfleri gruplar arasındaki ayrımı belirlemek amacı ile kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<0,05 düzeyinde ayrım vardır (N=8). Değerler Aritmetik ortalama ± Standart hata olarak verilmiştir. Fenthion 0,5mg/kgNAC+F 400mg/kgNAC+F Yüzde Değişim tgsh GSH GSSG GSH/GSSG Şekil 4.1 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri (Fenthion grubu kontrole göre % değişim, NAC+Fenthion grupları fenthion grubuna göre % değişim olarak verilmiştir). 53

63 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU 4.2 Antioksidant Enzim Aktivitelerine Etkileri C. carpio da beyinde fenthion içeren ortamda NAC nin antioksidant enzim aktivitelerine (U/mg protein) etkileri Çizelge 4.2 de ve Şekil 4.2 de verilmiştir. Fenthion ve farklı derişimlerdeki NAC etkisinde beyinde antioksidant enzim aktivitelerindeki değişimler incelendiğinde GST ve SOD spesifik aktivitelerinde fenthion+0,5 mg/kg NAC grubunda fenthion grubuna oranla artış belirlenirken, CAT spesifik aktivitesinde ise tüm gruplarda kontrole ve fenthion grubuna oranla azalmalar olduğu kaydedilmiştir. Ancak; bu azalmalar istatistiksel bakımdan önemli derecede bir değişim değildir. GR aktivitesinde ise tüm gruplarda kontrole ve fenthion grubuna göre önemli derecede bir değişim olmadığı belirlenmiştir. Glutatyon S-transferaz aktivitesinde; kontrole göre fenthion grubunda %43 düzeyinde artış belirlenmiştir. Fenthion+0,5 mg/kg NAC de, fenthion grubuna oranla %53 artış belirlenirken, fenthion+400 mg/kg NAC de fenthiona oranla %20 oranında azalama gerçekleşmiştir. Glutatyon redüktaz aktivitesinde; tüm gruplarda kontrole ve fenthiona göre herhangibir değişim kaydedilmemiştir. Süperoksid dismutaz spesifik aktivitesinde; fenthion grubunda kontrole göre önemli bir değişim gerçekleşmemiştir. Fenthion grubuna oranla fenthion+0,5 mg/kg NAC de %69 oranında artış kaydedilmiş, fenthion+400 mg/kg NAC de ise fenthion grubuna oranla önemli bir değişim gerçekleşmemiştir. Katalaz spesifik aktivitesinde fenthion grubunda kontrole göre %25 azalma meydana gelmiştir. Fenthion+0,5 mg/kg NAC ile fenthion+400 mg/kg NAC gruplarında fenthion grubuna oranla önemli derecede bir değişim belirlenememiştir. 54

64 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU Çizelge 4.2. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin antioksidant enzim aktivitelerine (U/mg protein) etkileri Gruplar GST GR SOD CAT Kontrol 43,821±2,573 a* 0,003±0,00022 a 0,065±0,004 a 1,428±0,09 a Fenthion 62,709±4,329 b 0,003±0,00014 a 0,070±0,007 a 1,071±0,14 b Fenthion+0,5 mg/kg NAC Fenthion+40 0mg/kg NAC 95,916±3,085 c 0,004±0,00019 a 0,118±0,007 b 1,032±0,13 cb 49,987±0,838 a 0,003±0,00003 a 0,082±0,001 a 0,185±0,02 ab *a, b, c harfleri gruplar arasındaki ayrımı belirlemek amacı ile kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<0,05 düzeyinde ayrım vardır (N=8). Değerler Aritmetik ortalama ± Standart hata olarak verilmiştir. 100 Fenthion 0,5mg/kgNAC+F 400mg/kgNAC+F Yüzde Değişim GST GR CAT SOD Şekil 4.2 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin antioksidant enzim aktivitelerine etkileri (Fenthion grubu kontrole göre % değişim, NAC+Fenthion grupları fenthion grubuna göre % değişim olarak verilmiştir). 55

65 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU 4.3 Asetilkolinesteraz Aktivitesine Etkileri C. carpio da beyinde fenthion içeren ortamda NAC nin AChE spesifik aktivitesine (U/mg protein) etkisi Çizelge 4.3 de ve Şekil 4.3 de verilmiştir. Kontrole göre fenthion grubunda %48 düzeyinde azalma belirlenmiştir. Fenthion+0,5 mg/kg NAC de fenthiona grubuna göre %5 düzeyinde artış, fenthion+400 mg/kg NAC de ise %16 oranında azalma gerçekleşmiştir. Ancak bu değişimlerden hiçbiri istatistiksel açıdan bir önem taşımamaktadır. Çizelge 4.3. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin AChE spesifik aktivitesine (U/mg protein) etkisi Gruplar Kontrol Fenthion Fenthion+0,5 mg/kg NAC Fenthion+400 mg/kg NAC AChE 0,152±0,097* 0,079±0,003 0,083± 0,004 0,066± 0,001 *(N=8). Değerler Aritmetik ortalama ± Standart hata olarak verilmiştir. Fenthion 0,5mg/kgNAC+F 400mg/kgNAC+F Yüzde Azalma AChE Şekil 4.3 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin AChE enzim aktivitesine etkisi (Fenthion grubu kontrole göre % değişim, NAC+Fenthion grupları fenthion grubuna göre % değişim olarak verilmiştir). 56

66 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU 4.4. Malondialdehid ve Protein Düzeyine Etkileri C. carpio da beyinde fenthion içeren ortamda NAC nin MDA ve protein düzeylerine etkileri Çizelge 4.4 de ve Şekil 4.4 de verilmiştir. Protein düzeyinde; fenthion grubunda, kontrole göre %23 düzeyinde azalma gerçekleşmiştir. Fenthiona oranla fenthion+0,5 mg/kg NAC de önemli derecede bir değişim belirlenemezken, fenthion+400 mg/kg NAC de fenthiona göre%22 oranında azalma meydana gelmiştir. Malondialdehid düzeyinde; kontrole oranla fenthion grubunda %81 oranında azalma olduğu belirlenmiştir. Fenthion grubu ile fenthion+0,5 mg/kg NAC ve fenthion+400 mg/kg NAC grupları arasında ise MDA düzeyi açısından istatistiksel anlamda önemli bir fark bulunmamaktadır. Çizelge 4.4. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin MDA ve protein düzeyine etkileri. Gruplar Kontrol Fenthion Fenthion+0,5 mg/kg NAC Fenthion+400 mg/kg NAC Protein 4,004±0,257 a* 3,098±0,13 b 3,071±0,010 b 3,769±0,057 a MDA 22,471±1,503 a 4,351±0,63 bc 7,248±2,198 b 2,796±0,033 c *a, b, c harfleri gruplar arasındaki ayrımı belirlemek amacı ile kullanılmıştır. Farklı harflerle gösterilen veriler arasında P<0,05 düzeyinde ayrım vardır (N=8). Değerler Aritmetik ortalama ± Standart hata olarak verilmiştir. 57

67 4. BULGULAR Emine ÇINKILOĞLU Fenthion 0,5mg/kgNAC+F 400mg/kgNAC+F Yüzde Azalma Protein MDA Şekil 4.4 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin protein ve MDA düzeylerine etkileri (Fenthion grubu kontrole göre % değişim, NAC+Fenthion grupları fenthion grubuna göre % değişim olarak verilmiştir). 58

68 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU 5. TARTIŞMA Antioksidant enzim aktiviteleri, glutatyon redoks düzeyi, lipid peroksidasyonu toksikolojik çalışmalarda sıklıkla tercih edilen biyomarkırlardır (Oruc ve ark., 2004). Özellikle hücre içi GSH düzeyindeki değişimler, balıklarda kirleticilerin neden olduğu oksidatif stresin önemli bir indikatörü olarak kabul edilmektedir (Zhang ve ark., 2004). Bu çalışmanın sonuçlarına göre fenthion içeren ortamda beyin dokusunda NAC nin düşük dozda, glutatyon redoks kapasitesini güçlendirdiği, SOD ve GST gibi antioksidant enzimlerin aktivitelerinde artış sağlarken, GR ve CAT aktivitelerini değiştirmediği belirlenmiştir. NAC yüksek dozda, GST aktivitesi ile protein düzeyinde azalmalara neden olmuştur ve fenthion etkisinde tüm gruplarda AChE de inhibisyon gerçekleşmemiştir Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri Hücre içerisinde, non-protein tiyol yapısındaki GSH düzeyindeki değişimler, prooksidant etkili ksenobiyotiklerin gerçekleştirdikleri hücresel toksisitenin ve oksidatif stresin bir sonucudur (Hazarika ve ark., 2003). Bu araştırmada, fenthionun 96 saatlik LC 50 değerinin (2.16 mg/l) %80 nin etkisine bırakılan C. carpio da beyinde GSH, tgsh miktarları ve GSH/GSSG de önemli derecede artışlar olurken MDA düzeyinde azalma olduğu belirlenmiştir. Kirleticilerin etkisinde GSH düzeyinde gerçekleşen artışlar, GSH sentezinde görev alan enzimlerin, GSH düzeyinin yerine koyulması için gerçekleştirebilecekleri düzenlenmeler ve aktivasyonlar ile açıklanabilir. Bu çalışmada fenthion etkisinde, beyinde kontrole oranla GSH ve tgsh düzeyleri ile GSH/GSSG de gözlenen artışların, GSH ın, aktive olan GSH sentez mekanizmaları ile yerine konmasına bağlı olabileceği düşünülebilir. Organofosfat insektisid dichlorvos etkisinde C. carpio da beyinde GSH düzeyinde artış olduğu bildirilmiştir (Hai ve ark., 1997). Herbisid paraquat etkisindeki O. mykiss de karaciğerde total GSH düzeyinin tüm derişim ve sürelerde 59

69 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU arttığı bildirilmiştir (Stephensen ve ark., 2002). 2,4-dichlorophenol etkisindeki C. auratus ta karaciğerde ilk günlerde azalan GSH düzeyi ile GSH/GSSG nin, ilerleyen günlerde artış göstermesinin yeni kurulan GSH dengesi ya da diğer detoksifikasyon mekanizmaları ile ilişkili olabileceği bildirilmiştir (Zhang ve ark., 2005). Hexachlorobenzene etkisinde jüvenil C. carpio da beyinde, tüm sürelerde, GSH düzeyinde gözlenen artışların oksidatif strese karşı verilen adaptif bir yanıttan kaynaklandığı belirtirmiştir (Song ve ark., 2006). Fenthion içeren ortamda C. carpio da karaciğerde, GSH ve tgsh ile GSH/GSSG düzeylerinde azalmalar olduğu bildirilmiştir (Sevgiler ve ark., 2007). C. carpio da karaciğerde, GSH düzeyinde artış olmazken bu çalışmada beyinde fenthion grubunda GSH ve tgsh ile GSH/GSSG düzeylerinde artış olması fenthionun ya da biyotransformasyon ürünlerinin BBB ye takılması ve kısmen GSH havuzu üzerindeki yıkıcı etkilerini gösterememesine de bağlı olabilir. Çünkü; fenthionun BBB yi tam olarak geçip geçmediği konusunda kesin bir bilgi bulunmamaktadır. Kan beyin engeli üzerindeki bazı GSH taşıyıcılarının kanda ve plazmadaki GSH ı beyin taşınması sayesinde ya da GSH ın direk olarak BBB yi aşarak beyine alınması yoluyla beyinde GSH düzeyinin korunduğu düşünülebilir. Beyin kapilleri ile beyin endotelyal hücrelerinde sodyuma bağımlı GSH taşıyıcıları olduğu belirlenmiştir (Kannan ve ark., 1999) ve GSH, BBB yi bozmadan beyine girebilmektedir (Dringen, 2000). Beyni oksidatif strese karşı koruyan potansiyel bir antioksidant molekül olan NAC, (Jayalakshmi ve ark., 2005) H 2 O 2 ile reaksiyona girerek hücre içi H 2 O 2 düzeyini azaltabilmekte ya da doğrudan bir antioksidant molekül olarak detoksifikasyonda görev alabilmektedir. NAC, GSH sentezinde sistein öncüsü bir ajan olarak hücrede oksidatif stresi azaltmaktadır. İntraperitonal olarak uygulanan NAC sağlıklı bir organizmada, BBB yi kolaylıkla geçememektedir. Ancak; herhangibir oksidatif hasar sonucunda bütünlüğü bozulabilen BBB ye difüze olan NAC, beyin hücrelerinde GSH sentezine öncülük edebilmektedir (Karageorgos ve ark., 2006). OP pestisidlerin, BBB nin geçirgenliğini ve bütünlüğünü bozarak BBB yi geçebileceği ve CNS ye ulaşabileceği bildirilmiştir (Gupta ve ark., 2000). 60

70 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU Sunulan çalışmada; düşük NAC dozunda, beyinde tgsh, GSH ve GSH/GSSG düzeyinde artışlar olması NAC nin, direk bir antioksidant molekül gibi davranmak yerine, fenthion etkisi sonucunda bütünlüğü bozulan BBB yi geçerek GSH öncüsü bir bileşik gibi davranmasına ve GSH redoks kapasitesini arttırmasına bağlı olabilir. Bu şekilde, GSH havuzunun oksidatif stres sırasında artan GSH gereksinimi, NAC nin sistein sağlayıcı bir molekül olarak GSH sentezini desteklemesi ile karşılanmaktadır. Organofosfat dichlorvosun LC 85 inin etkisine bırakılmadan hemen önce A. anguilla ya intraperitonal olarak uygulanan NAC nin; karaciğerde ve kasta GSH içeriği ile GSH/GSSG yi arttırdığı bildirilmiştir. NAC nin GSH sentezinde sistein sağlayıcı bir öncü olarak yer alması sonucunda GSH redoks kapasitesini ve OP bileşiklerinin etkisindeki balıklarda yaşam şansını arttırdığı belirlenmiştir (Pena- Llopis ve ark., 2003a). Organoklor bileşiği endosulfan etkisinde O. mykiss de adrenokortikal hücrelerde NAC, GSH düzeyinde olumlu bir etki yaparak GSH redoks kapasitesini arttırmış ve lipid peroksidasyonunu engellemiştir (Dorval ve ark., 2003). Letal olmayan dozlarda arsenic etkisindeki C. batrachus da intravenöz NAC preenjeksiyonun, NAC nin sistein kaynağı olarak davranmasıyla karaciğerde sadece arsenic uygulanan gruba oranla GSH miktarını arttırdığı ve oksidatif stresi önlediği belirlenmiştir (Bhattacharya ve Bhattacharya, 2007). Hipoksik şartlardaki sıçan beyninde, NAC, nöronlarda oksidatif stres ile ROS oluşumunu yavaşlatmış ve GSH düzeyini arttırmıştır (Jayalakshmi ve ark., 2005). Bu çalışmada, tüm gruplarda GSSG düzeyinde belirlenen azalmanın, GSH ın de novo sentezinden daha karlı bir yol olan GSSG nin GSH a indirgenme mekanizmasının kullanılması sonucunda GSSG nin tüketilmesinden kaynaklanabileceği düşünülebilir. Ayrıca, tüm gruplarda GR aktivitesinde herhangibir değişimin gözlenememesi, buna karşılık tüm gruplarda GSSG düzeyinde belirlenen azalma, GSSG nin GSH a oksidasyonu yerine sitotoksik etkilerinin önlenebilmesi açısından hücre dışına taşınmasına da bağlı olabilir. Aynı zamanda, tüm gruplarda GSH/GSSG oranında gözlenen artışın, GSSG deki azalmaya bağlı olabileceği de düşünülebilir. 61

71 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU GSSG nin iki GSH molekülüne indirgenmesi yoluyla GSH/GSSG düzeyinin artmasının, GSH ın de novo sentezi yolundan enerjetik olarak daha karlı olduğu bilinmektedir (Pena-Llopis ve ark., 2003a). Bazı durumlarda, hücrelerede aşırı NADPH tüketimini önlemek amacıyla GSSG, GR tarafından GSH a indirgenmek yerine bazı özel taşıyıcılar tarafından hücre dışına taşınmaktadır (Zhang ve ark., 2004). Hücrelerde oksidatif stresin yoğun olarak gerçekleştiği durumlarda meydana gelen GSSG, oluşturulduğu hızda redükte edilemediğinde hücre içi GSSG derişimi artmaktadır ve GSSG yüksek derişimlerde sitotoksik etkilidir (Sen ve Packer, 2000). Bu araştırmada, NAC nin yüksek dozda, GSH, tgsh düzeylerini arttırmada yetersiz olduğu görülmüş, GST aktivitesi ile protein düzeyinde azalmaya neden olduğu belirlenmiştir. NAC nin yüksek dozda, GSH/GSSG oranını düşük dozda NAC uygulamasına göre daha az düzeyde arttırmış olması, NAC nin yüksek dozda toksisite ve oksidatif stresi oluşturma potansiyeli ile ilişkilidir. Bu etki NAC nin yüksek dozlarda kullanıldığında bir prooksidant gibi davranarak olumlu etkilerini gösterememesinden kaynaklanmaktadır. Diclorvos etkisinde A. anguilla da NAC banyosunun karaciğerde GSH ve GSH/GSSG de herhangibir koruyucu etki sağlamadığı ve yüksek dozlardaki (10mM) NAC nin balıklarda mortaliteye neden olduğu belirlenmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2003b). Ethanol etkisindeki sıçan karaciğer hücrelerinde, ethanol uygulamasından sonra gerçekleştirilen NAC enjeksiyonunun, ethanol tarafından indüklenen oksidatif strese karşı koruma sağlayamadığı ve NAC nin bir prooksidant gibi davranarak akut karaciğer hasarını ve toksisteyi arttırdığı gözlenmiştir. NAC ethanol tarafından oluşturulan ROS ile reaksiyona girerek son derece önemli bir prooksidant radikal olan thiyl molekülünü oluşturmaktadır. Thiyl radikali çok daha tehlikeli türler olan O.- 2, OH. ve H 2 O 2 yi oluşturacak olan metallerin katalizlediği otooksidasyon reaksiyonlarına aracılık etmektedir (Wang ve ark., 2006). Listeria monocytogenes ile enfekte edilen ve farklı lipid içerikli besinlerle beslenen sıçanlarda, intraperitonal NAC enjeksiyonunun beslenme içeriğine bakılmaksızın yüksek dozlarda hücre ölümlerine neden olduğu belirlenmiştir (Puertollano ve ark., 2003). 62

72 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU 5.2 Antioksidant Enzim Aktiviteleri ile Lipid Peroksidasyonuna Etkileri Antioksidant enzimler oksidatif stres tarafından indüklenen anahtar bileşenlerdir. Bu nedenle, antioksidant enzimler hücre homeostazisinin düzenlenmesinde yaşamsal bir öneme sahiptirler ve indüksiyonları kirleticilere karşı verilen tepkinin bir sonucudur (Doyotte ve ark., 1997). Glutatyon S-transferazlar, elektrofiller ile GSH arasındaki konjugasyonu katalizleyerek detoksifikasyonda görev almaktadırlar. Bu çalışmada, fenthion ve özellikle düşük NAC dozunda, GST aktivitesinde gözlenen artış, aynı gruplarda GSH düzeyinde görülen artışla ilişkili olabilir. Yüksek NAC dozunda, GST aktivitesinde gözlenen azalama, NAC nin yüksek dozda, GSH düzeyini arttırmada başarısız olmasından kaynaklanabileceği gibi yüksek dozdaki NAC nin beyinde ciddi oksidatif stres şartları oluşturmasına da bağlı olabilir. Hexachlorobenzene etkisinde jüvenil C. carpio da beyinde, GST aktivitesinde gözlenen azalmanın, beyindeki ciddi oksidatif stres şartları ile beynin oksidatif strese karşı verdiği adaptif yanıtın başarısızlığından kaynaklandığı belirtilmiştir (Song ve ark., 2006). GST aktivitesindeki değişiklikler ile GSH düzeyi arasında bir bağlantı olabileceği belirlenmiştir. Bazı durumlarda, azalan GSH düzeyine bağlı olarak GST aktivitesi engellenebilmektedir (Zhang ve ark., 2004). OP dichlorvosun LC 85 inin etkisine bırakılmadan hemen önce A. anguilla ya intraperitonal olarak uygulanan NAC nin; karaciğerde ve kasta GSH içeriği ile GST aktivitesini arttırdığı belirlenmiş ve GST aktivitesindeki olumlu etki artan GSH düzeyi ile ilişkilendirilmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2003a). İntraperitonal menadione enjeksiyonun O. myskiss de tgsh düzeyindeki artışa paralel olarak GST aktivitesinde artışa neden olduğu gösterilmiştir (Stephensen ve ark., 2002). Glutatyon S-transferazlar, lipid peroksitlerinin detoksifikasyonunda da önemli görevler üstlenmektedirler. GST nin, GSH ile bileşik arasındaki reaksiyonu katalizlemesi sonucunda bileşiğin hidrofilitesi artmakta ve lipid tabakası içerindeki dağılımı ve de birikimi önlenmektedir (Hudson ve ark., 1998). GST aktivitesindeki 63

73 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU artış, enzimin ksenebiyotiklerin indüklediği lipid peroksidasyonuna karşı olan koruyucu etkisini göstermektedir (Leaver ve George, 1998). Lipid peroksidasyonu hücrelerde oksidatif stresin belirlenmesinde bir indikatör olarak tercih edilmektedir (Dorval ve ark., 2003). Bu çalışmada fenthion grubunda, lipid peroksidasyonunda görülen azalmanın GSH düzeyi ile GST aktivitesindeki artışa bağlı olabileceği düşünülebilir. Yoğun PUFA içerikleri nedeniyle prooksidant bileşiklerin en belirgin hedeflerinden biri olan beyin hücrelerinde PUFA daki çift bağın serbest radikaller tarafından etkilenmesi lipid peroksidasyonuna neden olmaktadır. Diclorvos etkisinde C. carpio da beyin dokusunda lipid peroksidasyonundaki azalmanın GSH düzeyindeki artışa bağlı olabileceği belirtilmiştir (Hai ve ark., 1997). Streptozotocin etkisindeki diabetik sıçanlarda, altı hafta süresince içme suyuna eklenen NAC nin, karaciğerde lipid peroksidasyonuna karşı koruyucu bir görevi olmadığı belirlenmiştir (Patriarca ve ark., 2005). NAC nin lipofilitesi daha yüksek olan amid türevinin, oksidatif strese karşı sıçan beyin endotelyal hücrelerinde ya da BBB de MDA miktarını azalttığı ve antioksidant enzim aktivitelerinde artış sağladığı bildirilmiştir. MDA düzeyindeki azalma, NAC nin antioksidant enzimlerin aktivitesi üzerindeki olumlu etkisi ile ilişkilendirilmiştir (Price ve ark., 2006). Süperoksid dismutaz ve CAT oksijen toksistesine karşı savunmanın ilk ve en önemli basamağındadır (Pandey ve ark., 2003). Bu çalışmada CAT aktivitesinde herhangibir değişimin gözlenenmemesi beyinde CAT gibi antioksidantların aktivitesinin düşük olmasından kaynaklanabilir. H 2 O 2 nin detoksifikasyonunda görev alan CAT gibi enzimatik antioksidantlar beyinde diğer dokulara oranla daha az bulunduğu ve daha düşük aktivite gösterdiği bilinmektedir (Sherki ve ark., 2001). -. O 2 anyonu üretimindeki artış bazı durumlarda CAT aktivitesinde azalmaya neden olabilmektedir (Pandey ve ark., 2003). -. Hücrelerde O 2 anyonu üretiminin yüksek olduğu durumlarda SOD enziminin indüksiyonu gerçekleşmekte ve O -. 2 anyonu H 2 O 2 ye dönüştürülmektedir. Bu yüzden; -. SOD aktivitesindeki yükselme artan O 2 üretiminin bir sonucudur. Düşük dozdaki -. NAC nin, GSH redoks kapasitesini arttırıcı etkisi nedeniyle artan O 2 üretimi sonucunda SOD aktivitesi artmış olabilir. Çünkü dehidrojenazlar ve oksidazlar gibi 64

74 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU birçok enzimin katalitik aktivitesi sonucunda ve de tiyolleride içine alan birçok -. biyomolekülün aerobik ortamlarda gerçekleşen oksidasyonlarında O 2 anyonu oluşmaktadır (Livingstone, 2001). Hepatik iskemia ve reperfüzyon etkisindeki sıçanlarda intraperitonal NAC preenjeksiyonun, karaciğerde SOD aktivitesini arttırdığı belirlenmiş ve bu artışın -. artan O 2 anyonu üretimine bağlı olabileceği bildirilmiştir (Demir ve Inal-Erden, 1998). Ancak; L. monocytogenes ile enfekte edilen ve farklı lipid içerikli besinlerle beslenen sıçanlarda, intraperitonal NAC enjeksiyonunun düşük dozlarda O -. 2 anyonu -. üretimini azalttığı belirlenmiştir (Puertollano ve ark., 2003). NAC ile O 2 anyonu -. arasında gerçekleşen reaksiyonun SOD ile O 2 anyonu arasında gerçekleşen reaksiyondan daha az etkin olduğu ve reaksiyonun sonucunda H 2 O 2 ve thiyl radikali oluşmadığı bildirilmiştir (Benrahmoune ve ark., 2000). 2,4-Dichlorophenol etkisinde karaciğerde SOD aktivitesinde azalma gerçekleşmiştir (Zhang ve ark., 2004). SOD aktivitesi sonucu oluşan H 2 O 2 ler enzimin sistein yapısını bozarak aktivitesini engellemektedir (Song ve ark., 2006). 5.3 Asetilkolinesteraz Aktivitesine Etkileri Asetilkolinesteraz aktivitesindeki değişimler OP pestisidlerin organizmalar üzerindeki etkilerinin belirlenebilmesi sırasında bioindikatör olarak kullanılmaktadır (Lang ve ark., 1997). Bu çalışmada; AChE de herhangi bir inhibisyonun gerçekleşmemesi, stres şartlarına bağlı olarak gerçekleşen bir adaptasyon mekanizmasının varlığından kaynaklanabilmektedir. Ayrıca; uygulanan fenthion dozu ya da uygulama süresi inhibisyonun gerçekleşebilmesi için yetersiz kalmış olabileceği gibi aktivitede değişiklik olmaması balığın türüne, yaşına ve cinsiyetine de bağlı olabilir. Çünkü; AChE inhibisyonundaki artışın doza ve süreye bağlı olduğu ancak inhibisyon derecesinin balığın türüne, dokuya ve pestisidin türüne bağlı olarak farklılıklar gösterebileceği bilinmektedir (Sancho ve ark., 1998). Bir balık türü olan Fundulus heteroclitus da, BBB de, ksenobiyotikleri CNS den kana ileten P-gikoproteini gibi bazı özel taşıyıcıların varlığı belirlenmiştir (Miller ve ark., 2002) ve bu çalışmada beyinde AChE aktivitesinde değişiklik 65

75 5. TARTIŞMA Emine ÇINKILOĞLU olmaması, beyinde yer alan ve CNS ile kolinerjik bölgeleri fenthion etkisinden koruyan özel taşıyıcıların varlığından kaynaklanabilir. Fenthion içeren ortamda C. carpio da NAC nin karaciğerdeki oksidatif etkilerinin incelendiği çalışmada tüm gruplarda AChE de inhibisyon gerçekleşmediği bildirilmiştir (Sevgiler ve ark., 2007). Azinphosmethyl ve parathion etkisinde C. auratus da beyinde AChE de önemli derecede inhibisyon olduğu ve OP bileşiklerde inhibisyon derecesinin doza bağlı olarak arttığı belirlenmiştir (Ferrari ve ark., 2004). Buna karşılık; OP diclorvos etkisinde C. carpio da beyinde AChE nin inhibe olduğu belirlenmiş ancak; OP etkisindeki AChE inhibisyonun her zaman da doza bağlı olarak gerçekleşmeyeceği vurgulanmıştır (Hai ve ark., 1997). Beyinde AChE inhibisyonu balıklarda yaşam şansını azalatan birçok fizyolojik ve davranışsal değişikliğe neden olmaktadır. Farklı derişimlerdeki diazinon etkisindeki Lepomis macrochirus da beyinde tüm derişimlerde AChE aktivitesinde önemli derecede azalma olduğu bildirilmiştir (Dutta ve ark., 1992). Aderenalin enjeksiyonunun Perca fluviatilis te beyinde protein sentez mekanizmalarını aktive ederek AChE aktivitesinde artışa neden olduğu bildirilmiştir. Pestisidlerin akut etkisine bırakılan balıklarda, stres şartlarında, benzer bir mekanizma yoluyla AChE inhibisyonunun engellenebileceği açıklanmıştır (Sancho ve ark., 2000). 66

76 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Emine ÇINKILOĞLU 5. SONUÇ ve ÖNERİLER 1. Fenthion etkisinde beyin dokusunda NAC nin düşük dozda, glutatyon redoks kapasitesini güçlendirdiği, SOD ve GST gibi antioksidant enzimlerin aktivitelerinde artış sağlarken, GR ve CAT aktivitelerini değiştirmediği belirlenmiştir. 2. NAC yüksek dozda, GST aktivitesi ile protein düzeyinde azalmalara neden olmuştur. 3. Fenthion etkisinde tüm gruplarda AChE de inhibisyon gerçekleşmemiştir Bu çalışmada elde edilen bulgular, 1. Fenthion ve NAC nin ve Cyprinus carpio nun beyin dokusunda GSH metabolizması, lipid peroksidasyonu ve AChE enzim aktivitelerine etkileri ile ilgili yeni bilgiler sağlanması açısından biyokimyasal toksikoloji alanında yapılan çalışmalara katkı sağlayacaktır. 2. Bulgular ülkemizde ve yurt dışında çevre koruma çalışmalarının kirlilik izleme programlarında ve ekotoksikolojik risk değerlendirme çalışmalarında kullanılabilecektir. 67

77 KAYNAKLAR ABDOLLAHI, M., MOSTAFALOU, S., POURNOURMOHAMMADI, S., SHADNIA, S., Oxidative stress and cholinesterase inhibition in saliva and plasma of rats following subchronic exposure to malathion. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 137: ADAMS, M.S., Biological Indicators of Aquatic Ecosystem Stress. American Fisheries Society, Bethesda, Mayland, 644sf. AHMAD, S., Antioxidant Mechanisms of the Enzymes and Proteins. (S. Ahmad editör), Oxidative stress and antioxidant defences in biology. Chapman and Hall, America, s AHMED, R.S., SETH, V., PASHA, S.T., BANERJEE, B.D., Influence of dietary ginger (Zingiber officinales) on oxidative stress induced by malathion in rats. Food and Chemical Toxicology, 38: ALMAR, M., OTERO, L., SANTOS, C., GALLEGO, J. G., Liver glutathione content and glutathione-dependent enzymes of twospecies of freswater fish as bioindicators of chemical pollution. Journal of Environmental Science and Health, 33: ALTUNTAS, I., DELIBAS, N., DOGUC, D.K., OZMEN, S., GULTEKIN, F., Role of reactive oxygen species in organophosphate insecticide phosalone toxicity in erythrocytes in vitro. Toxicology in Vitro, 17: ANDERSON, M.E., Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods in Enzymology, 113: ANDERSON, M.E., Glutathione; an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-Biological Interactions, : ARMSTRONG, R.N., Structure, catalytic mechanism, and evolution of the glutathione transferases. Chemical Research in Toxicology, 10:2-18. AYDINOGLU, H., DURSUN, H.Y., BAYRAKTAR, L., Bitki Koruma Ürünleri. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Koruma Kontrol Genel Müdürlüğü, 336s. AYDIN, R., KOPRUCU, K., Acute toxicity of diazinon on the common carp 68

78 (Cyprinus carpio L.) embryos and larvae. Pesticide Biochemistry and Physiology, 82: BANCI, L., BERTINI, I., CRAMARO, F., DEL CONTE, R., VIEZZOLI, M.S., The structural effects of dimerization. European Journal of Biochemistry, 269: BARR, D.B., NEEDHAM, L.L., Analytical methods for biological monitoring of exposure to pesticides: a review. Journal of Chromatagraphy B, 778: BENOV, L., FRIDOVICH, I., Growth in iron-enriched medium partially compensates Escherichia coli for the lack of manganase and iron süperoxide dismutase, The Journal of Biological Chemistry, 273: BENRAHMOUNE, M., THEROND, P., ABEDINZADEH, Z., The reaction of superoxide radical with N-acetylcysteine. Free Radicals in Biology and Medicine, 29: BEUTLER, E., Red cell metabolism, A Manual of Biochemical Methods Grune and Starton, New York, 160sf. BHATTACHARYA, A., BHATTACHARYA, S., Induction of oxidative stress by arsenic in Clarias batrachus: Involvement of peroxisomes. Ecotoxicolog and Environmental Safety, 66: BLAKE, B.L., LAWLER, C.P., MAILMAN, R.B., Biochemical Toxicology of the pheripheral nervous system (Hodgson, E., Smart, R.C. editörler). Introduction to Biochemical Toxicology. Wiley-Interscience, New York, Third edition. 697 s. BUKOWSKI, B., HUTNIK, K., ,4-D and MCPA and their derivatives: Effect on the activity of membrane erythrocytes acetylcholinesterase (in vitro). Pesticide Biochemistry and Phisiology, Baskıda. CAMERA, E., PICARDO, M., Analytical methods to investigate glutathione and related compounds in biological and pathological processes. Journal of Chromatography B, 781: CAJARVILLE, M. P., HAUSER, L., CARVALHO, G., HYLLAND, K., OLABARRIETA, I., LAWRENCE, A.J., LOWE, D., GOKSQYR, A., Genetic Damage and Molecular/Cellular Response to Pollution, (Lawrence, A., 69

79 Hemingway., K. editörler). Effects of Pollution on Fish, Blackwell Science, United Kingdom, 342s. CARLBERG, I., MANNERVIK, B., Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. The Journal of Biological Chemistry, 250: CARR, R.L., CHAMBERS, J.E., Toxic responses of the nervous system (SCHLENK, D. Ve BENSON, W.H. editörler). Target organ toxicity in marine and freshwater teleosts: volume 2, Taylor&Francis, London, 210s. CHANG, M.S., STRICHARTZ, G.R., Cholinergic pharmacology (GOLAN, D.E ve TASHJIAN, A.H. editörler). Principles of Pharmacology, Wolters Kluwer Company, New York, s CHAUDIERE, J., FERRAI-ILIOU, R., Intracellular antioxidants: from chemical to biochemical mechanism. Food and Chemical Toxicology, 37: CHUIKO, G.M., Comparative study of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in brain and serum of several freshwater fish: spesific activities and in vitro inhibition by DDVP, an organophosphorus pesticide. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 127: CHUIKO, G.M., PODGORNOYA, V.A., ZHELNIN, Y.Y., Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activities in brain and plasma of freshwater teleosts: cross-species and cross-family differences. Comparative Biochemistry and Physiology, 135: CNUBBEN, N.H.P., RIETJENS, I.M.C.M., WORTELBOER, H., ZANDEN, J.V., BLADEREN, P.J.V., The interplay of glutathione-related processes in antioxidant defense. Environmental Toxicology and Pharmacology, 10: COCKER, J., MASON, H.J., GARFITT, S.J., JONES, K., Biological monitoring of exposure to organophosphate peticides, Toxicology Letters, 134:

80 DEMBELE, K., HAUBRUGE, E., GASPAR, C., Concentration effects of selected insecticides on brain acetylcholinesterase in the common carp (Cyprinus carpio L.). Ecotoxicology and Environmental Safety 45, DEMEULE, M., REGINA, A., JODOIN, J., LAPLANTE, A., DAGENAIS, C., BERTHELET, F., MOGHRABI, A., BELIVEAU, R., Drug transport to the brain: key roles for the efflux pump p-glicoprotein in the blood-brain barrier. Vascular Pharmacology, 38: DEMIR, S., INAL-ERDEN, M., Pentoxifylline and N-acetylcysteine in hepatic ischemia / reperfusion injury. Clinica Chimica Acta, 275: DORVAL, J., LEBLOND, V.S., HONTELA, A., Oxidative stress and loss of cortisol secretion in adrenocorticalcells of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed in vitro to endosulfan, an organochlorine pesticide. Aquatic Toxicology 63: DOYOTTE, A., COSSU, C., JACQIUN, M.C., BABUT, M., VASSEUR, P., Antioxidant enzymes, glutathione and lipid peroxidation as relevant biomarkers of experimental or field exposure in the gills and digestive gland of freshwater bivalve Unio tumidus. Aquatic Toxicology, 39: DRINGEN, R., Metabolism and functions of glutathione in brain. Progress in Neurobiology, 62: DURMAZ, H., SEVGILER, Y., UNER, N., Tissue-specific antioxidative and neurotoxic responses to diazinon in Oreochromis niloticus. Pesticide Biochemistry and Physiology, 84: DUTTA, H.M., MARCELINO, J., RICHMONDS, C.H., Brain actylcholinesterase activity and opmotor behavior in bluegills, Lepomis macrochirus exposed to different concentrations of diazinon. Archives Internationels de Physiologie de Biophysique, 100: EATON, D.L., BAMMLER, T.K., Concise review of the glutathione S- transferases and their significance to toxicology. Toxicological Sciences, 49:

81 ELLMAN, G.L., COURTNEY, K:D:; ANDRES, V., FEATHERSTONE, R.M., A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7: EPA, Special report on environmental endocrine disruption: An effects assessment and analysis. EPA/630/R-96/012. EPA, Fenthion Facts. United States Environmental Protection Agency, Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7508C). EPA 738-F EPA, Fenthion; Notice of receipt of request to voluntarily cancel certain pesticide registrations. Environmental Protection Agency, OPP ; FRL , 68, 104, ERCAL, N., GURER, H.O., N-acetylcysteine (NAC): Its uses and abuses. Oxygen Society Education Program, EVANS, P., HALLIWELL, B., Micronutrients: oxidant/antioxidant status. British Journal of Nutrition, 85: FABACHER, D.L., LITTLE, E.E., Diversity of Fish, Early Observations and Descriptions, Fish in Experimentation. (Ostrander, G.K. Editör) The handbook of experimental animals. The Laboratory Fish. Academic Press, London, 678s. FAINTUCH, J., AGUILAR, P.B., NADALIN, W., Relevance of N- acetylcysteine in clinical practice: fact, myth or consequence?. Nutrition, 15: FARBER, P.M., ARSCOTT, L.D., WILLIAMS, C.H., BECKER, K., SCHIRMER, R.H., Recombinant Plasmodium falciparum glutathione reductase is inhibited by the antimalarial dye methylene blue, FEBS Letters, 422: FATIMA, M., AHMAD, I., SAYEED, I., ATHAR, M., RAISUDDIN, S., Pollutant-induced over-activation of phagocytes is concomitantly associated with peroxidative damage in fish tissues. Aquatic Toxicology, 49: FAVERNEY, R., ORSINI, N., SOUSA, G., RAHMANI, R., Cadmiuminduced apoptosis through the mitochondrial pathway in rainbow trout hepatocytes: involvement of oxidative stress. Aquatic Toxicology, 69:

82 FERRARI, A., ANGUIANO, O.L., SOLENO, J., VENTURİNO, A., D'ANGELO, A. M. P., Different susceptibility of two aquatic vertebrates (Oncorhynchus mykiss and Bufo arenarum) to azinphos methyl and carbaryl Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 139: FIGUEIREDO-FERNANDES, A., FONTAINHAS-FERNANDES, A., PEIXOTO, F., ROCHA, E., REIS-HENRIQUES, M.A., Effects of gender and temperature on oxidative stress enzymes in Nile tilapia Oreochromis niloticus exposed to paraquat. Pesticide Biochemistry and Physiology 85: FRIDOVICH, I., Oxidative stress. Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing Group, GUPTA, A., AGARWAL, A.K., SHUKLA, G.S., Effect of quinalphos and cypermethrin exposure on developing blood brain barrier: role of nitric oxide. Environmental Physiology and Pharmacology, 8: GRIFFITH, O.W., Determination of glutathione and glutathione disulfide using gluathione reductase and 2- Vinylpiridine. Analytical Biochemistry, 106: GRIFFITH, O.W., Biologic and pharmacologic regulation of mammalian glutathione synthesis. Free Radical Biology and Medicine, 27: HABIG, W.H., PABST, M.J., JAKOBY, W.B., Glutathione S- transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry, 249: HAI, D.Q., VARGA, S.H., MATKOVICS, B., Organophosphorus effects on antioxidant system of carp (Cyprinus carpio) and catfish (Ictalurus nebulosus). Comparative Biochemistry and Physiology, 117C: HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J.M., Free radicals in biology and medicine. Oxford Universty Press, London, s HAMED, R., FARID, N.M., ELOWA, S.H.E., ABDALLA, A.M., Glutathione related enzyme levels of freshwater fish as bioindicators of pollution. The Environmentalist, 23:

83 HAZARIKA, A., SARKAR, S.N., HAJARE, S., KATARIA, M., MALIK, J.K., Influence of malathion pretreatment on the toxicity of anilofos in male rats: A Biochemical Interaction Study. Toxicology, 185: rinus&speciesname=carpio+carpio. HIDALGO, M. C., EXPOSITO, A., PALMA, J. M., DE LA HIGUERA, M., Oxidative stress generated by dietary Zn-deficiency: studies on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 34: HORTON, A.A., FAIRHUST, S., Lipid peroxidation and mechanisms of toxicity. CRC Criticals Reviews in Toxicology, 18: HUDSON, C.E., KELLY, M.M., SCHWARTZ, D.A., SCHOFİELD, D.A, DEHAVEN, J.E, SCHULTE B.A, NORRİS, J.S., Glutathione S- transferase in hormonal carcinogenesis. Chemico-Biological Interactions : JAYALAKSHMI, K., SAIRAM, M., SINGH, S.B., SHARMA, S.K., ILAVAZHAGAN, G., BANERJEE, P.K., Neuroprotective effect of N-acetyl cysteine on hypoxia-induced oxidative stress in primary hippocampal culture. Brain Research, 1046: JEFFERIES, H., COSTER, J., KHALIL, A., BOT, J., MCCAULEY, R.D., HALL, J.C., Glutathione. ANZ Journal of Surgery, 73: JOKANOVIC, M., Biotransformation of organophosphorus compounds. Toxicology, 166: KANNAN, R., MITTUR, A., BAO, Y., TSURUO, T. AND KAPLOWITZ, N., GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. Journals of Neurochemical 73: KARAGEORGOS, N., PATSOUKIS, N., CHRONI, E., D KONSTANTINOU, ASSIMAKOPOULOS, S.F., GEORGIOU. C., Effect of N- 74

84 acetylcysteine, allopurinol and vitamin E on jaundice-induced brain oxidative stress in rats. Brain Research, 1111: KAPPUS, H., Owerviev of enzyme systems involved in bio-reduction of drugs and in redox cycling. Biochemical Pharmacology, 35: 1-6. KELNER, M.J., BAGNELL, R.D., UGLIK, S.F., MONTOYA, M.A., MULLENBACH, G.T., Heterologous expression of selenium-dependent glutathione peroxidase affords cellular resistance to paraquat. Archives of Biochemistry and Biophysics, 323: KELLY, S.A., HAVRILLA, C.M., BRADY, T.C., ABRAMO, K.H., LEVIN, E.D., Oxidative stres in toxicolojy: established mammalian and emerging piscine model systems. Environmental Health Perspectives, 106:1-24. KIRBY, M.F., MORRIS, S., HURST, M., KIRBY, S.J., NEALL, P., TYLOR, T., FAGG, A., The use of cholinesterase activity in flounder (Platichthys flexus) muscle as a biomarker of neurotoxic contamination in UK estuaries. Marine Pollution Bulletin, 40: KIRKMAN, H. N., GAETANI., G. E., Catalase: A tetrameric enzyme with four tightly bound molecules of NADPH. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81: KITAMURA, S., KATODA, T., YOSHIDA, M., JINNO, N.,OHTA, S., Whole-body metabolism of the organophosphorus pesticide, fenthion, in goldfish, Carassius auratus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 126: KITAMURA, S., SUZUKI, T., KATODA, T., YOSHIDA, M., OHASHI, K., OHTA, S., 2003a. In vitro metabolism of fenthion and fenthion sülfoxide by liver preparations of sea bream, goldfish, and rats. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 31: KITAMURA, S., SUZUKI, T., OHTA, S., FUJIMOTO, N., 2003b. Antiandrogenic activity and metabolism of the organophosphorus pesticide fenthion and related compounds. Environmental Health Perspectives, 111: KLAASSEN, C.D., Cassarett and Doull s Toxicology. The McGraw-Hill Compaines, Inc., United States of America, 1236s. 75

85 LACORTE, S., JEANTY, G., MARTY, J.L., BARCELO, D., Identification of fenthion and temephos and their transformation products in water by high performance liquid chromatography with diode array detection and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection. Journal of Chromatography, 777A: LANG, G., KUFCSAK, O., SZEGLETES, T., NEMCSOK, J., Quantitative distributions of different cholinesterases and inhibition of acetylcholinesterase by mediation and paraquat in alimentary canal of common carp. Genetic Pharmacology, 29: LEAVER, M.G., GEORGE, S.G., A Piscine Glutathione S-Transferase Which Efficiently Conjugates the End-Products of Lipid Peroxidation. Marine Environmental Research. 46: l-5, LEBLANC, G.A., DAUTERMAN, W.C., Conguation and Elimination of Toxicants, (Hodgson, E., Smart, R.C. editörler). Introduction to Biochemical Toxicology. Wiley-Interscience, New York, Third edition. 697 s. LLEDIAS, F., RANGEL, P., HANSBERGT, W., Oxidation of catalase by singlet oxygen. The Journal of Biological Chemistry, 273: LIVINGSTONE, D. R., Contaminant-Stimulated reactive oxygen species production and oxidative damage in aquatic organism. Marine Pollution Bulletin, 42: LOWRY, O.H., ROSENBROUGH, N.J., FARR, A.L., RANDALL, R.J., Protein measurement with the Folin-phenol reagent. The Journal of Biochemistry, 193: LOPES, P.A., PINHEIRO, T., SANTOS, M.C., MATHIAS, M.D.L., COLLARES- PEREIRA, M.J., VIEGAS-CRESPO, A.M., Response of antioxidant enzymes in freshwater fish populations (Leuciscus alburnoides) to inorganic pollutants exposure. The Science of the Total Environment, 280: MARTINEZ, M., MARTINEZ, M., HERNANDEZ, A.I., FERRANDIZ, M.L., Hypotesis : Can N-acetylcysteine be benefical in parkinson s disease?, Life Sciences, 64:

86 MATES, J.M, Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology. Toxicology, 153: McCORD, J.M., FRIDOVICH, I., Speroxide dismutase; an enzymatic function for erythrocuprein (homocuprein), Journal of Biological Chemistry, 244: MERCAN, U., Toksikolojide serbest radikallerin önemi. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Dergisi, 15: MILLER, D. S., GRAEFF, C., DROULLE, L., FRICKER, S., FRICKER, G., Xenobiotic efflux pumps in isolated fish brain capillaries. American Journals of Physiology and Regulation of the Integration in Comparative Physiology, 282: MONTEIRO, D.A., DE ALMEIDA, J.A., RANTIN, F.T., KALININ, A.L., Oxidative stress biomarkers in the freshwater characid fish, Brycon cephalus, exposed to organophosphorus insecticide Folisuper 600 (methyl parathion), Comparative Biochemistry and Physiology, 143: NARAYANAN, R., GUNTURI, S.M., In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 13: NATH, B.S., KUMAR, P.S., Toxic impact of organophosphorus insecticides on acetylcholinesterase activity in the silkworm, Bombyx mori L.. Ecotoxicology and Environmental Safety, 42: NEAL, R., COOPER, K., GURER, H., ERCAL, N., Effects of N- acetylcysteine and 2,3-dimercaptosuccinic acid on lead induced oxidative stress in rat lenses. Toxicology, 130: NILSSON, G.E., Brain and body oxygen requirements of Gnathonemus petersii, a fish with an exceptionally large brain. The Journal of Experimental Biology, 199: NOBLE, A., Partition coefficients (n-octanol-water) for pesticides. Journal of Chromatography, 642: NOYAN, A, Yaşamda ve hekimlikte fizyoloji. Meteksan A.Ş., Ankara, 1157 sf. 77

87 OHKAVA, H., OHISINI, N., TAGI, K., Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Chemistry, 95: OLSVIK, P.A., KRISTENSEN, T., WAAGBQ, R., ROSSELAND, B.O., TOLLEFSEN, K.E., BAEVERFJORD, G., BERNTSSEN, M.H.G., mrna expression of antioxidant enzymes (SOD:CAT and GSH-Px) and lipid peroxidative stres in liver of Atlantic salmon (Salmo salar) expopsed to hyperoxic water during smoltification. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 143: ORUC, E.O., UNER, N., Effects of 2,4-Diamin on some parameters of protein and carbohydrate metabolisms in the serum, muscle and liver of Cyprinus carpio. Environmental Pollution, 105: ORUC, E.O., UNER, N., Marker enzyme assessment in the liver of Cyprinus carpio (L.) exposed to 2,4-diamin and azinphosmethyl. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 16: ORUC, E.O., SEVGILER, Y., UNER, N., Tissue-spesific oxidative stres responses in fish exposed to 2,4-D and azinphosmethyl. Comparative Biochemistry and Physiology, 137: PANDEY, S., PARVEZ, S., SAYEED, I., HAQUE, R., BIN-HAFEEZ, B., RAISUDDIN, S., Biomarkers of oxidative stress: a comparative study of river Yamuna fish Wallago atto. The Sience of the Total Environment, 309: PATEL, M.P., MARCINKEVICIENE, J., BLANCHARD, J.S., Enterococcus faecalis glutathione reductase: purification, characterization and expression under normal and hyperbaric O 2 conditions, FEMS Microbiology Letters, 166: PATRIARCA, S., FURFARO, A.L., DOMENICOTTI, C., ODETTI, P., COTTALASSO, D., MARINARI, A.M., PRONZATO, M.A., TRAVERSO, N., Supplementation with N-acetylcysteine and taurine failed to restore glutathione content in liver of streptozotocin-induced diabetics rats but protected from oxidative stres, Biochimica et Biophysica Acta 1741:

88 PEHKONEN, S.O., ZHANG, Q., The degradation of organophosphorus pesticides in natural waters: A critical review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 32: PENA-LLOPIS, S., PENA J.B., SANCO, E. FERNANDEZ-VEGA, C., FERRANDO, M.D., Glutathione-dependent resistance of the european eel Anguilla anguilla to the herbicide molinate. Chemosphere, 45: PENA-LLOPIS, S., FERRANDO, M.D., PENA J.B., 2003a. Fish tolerance to organophosphate-induced oxidative stress is dependent on the glutathione metabolism and enhanced by N-acetylcysteine. Aquatic Toxicology, 65: ,2003b. Increased recovery of brain acetylcholinesterase activity in dichlorvos-intoxicated European eels Anguilla anguilla by bath treatment with N-acetylcysteine. Diseases of Aquatic Organisms, 55: PUERTOLLANO, M.A. DEPABLO, M.A. DECIENFUEGOS G. A., Antioxidant properties of N-acetyl-L-cysteine do not improve the immune resistance of mice fed dietary lipidsto Listeria monocytogenes infection. Clinical Nutrition, 22: PRICE, T.A., URAS, F., BANKS, W.A., ERCAL, N., A novel antioxidant N-acetylcysteine amide prevents gp120- and Tat-induced oxidative stress in brain endothelial cells. Experimental Neurology, 201: RAO, J.V., Toxic effects of novel organophosphorus insecticide (RPR-V) on certain biochemical parameters of euryhaline fish, Oreochromis mossambicus. Pesticide Biochemistry and Physiology, 86: REED, D.J., Mechanisms of Chemically Induced Cell Injuriy and Cellular Protections Mechanisms, (HODGSON, E., SMART, R.C. editörler). Introduction to biochemical toxicology. Wiley-Interscience, New York, Third edition. 697 s. ROBERTS, T.R., HUTSON, D.H., Metabolic Pathways of Agrochemicals: Part 2: Insecticides and Fungicides. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK,

89 ROEX, E.W.M., KEIJZERS, R., GESTEL, C.A.M., Acetylcholinesterase inhibition and increased food consumption rate in the zebrafish, Danio rerio, after chronic exposure to parathion. Aquatic Toxicology 64: SANCHO, E., FERRANDO, M.D., ANDREU-MOLINER, E., In vivo inhibition of AChE activity in the European eel Anguilla anguilla exposed to technical grade fenitrothion. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology 120: SANCHO, E., FERNANDEZ-VEGA, C., SANCHEZ, M., FERRANDO, M.D., ANDREU-MOLINER, E., Alterations on AChE activity of the fish Anguilla anguilla as response to herbicide-contaminated water. Ecotoxicology and Environmental Safety, 46: SAYEED, I., PARVEZ, S., PANDEY, S., BIN-HAFEEZ, B., HAQUE, RAISUDDIN, S., Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish, Channa punctatus Bloch, Ecotoxicology and Environmental Safety, 56: SCHAFER, F.Q., BUETTNER, G.R., Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide glutathione couple. Free Radical Biology & Medicine, 30: SCHULZ, J.B., LINDENAU, J., SEYFRIED, J., DICHGANS, J., Glutathione, oxidative stress and neurodegeneration. European Journal of Biochemistry, 267: SEN, C.K., Nutritional biochemistry of cellular glutathione. Nutritional Biochemistry, 8: SEN, C.K., PACKER, L., Thiol homeostasis and supplements in physical exercise. American Journal of Clinical Nutrition, 72: SETH, V., BANERJEE, B.D., CHAKRAVORTY, A.K., Lipid peroxidation, free radical scavenging enzymes, and glutathione redox system in blood of rats exposed to propoxur, Pesticide Biochemistry and Physiology 71: SEVGILER, Y., ORUC, E., UNER, N., Evaluation of etoxazole toxicity in the liver of Oreochromis niloticus. Pesticide Biochemistry and Physiology 78:

90 SEVGILER, Y., PINER, P., DURMAZ., H., UNER, N., Effects of N- acetylcysteine on oxidative responses in the liver of fenthion exposed Cyprinus carpio. Pesticide Biochemistry and Physiology, 87: SHERKI, G.Y., MELAMED., E., OFFEN, D., Oxidative stress inducedneurodegredative diseases: the needs for the antioxidants the penetrate the blood brain barrier. Neuropharmacology, 40: SOGORB, M.A., VILANOVA, E., Enzymes involved in the detoxification of organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis. Toxicology Letters, 128: SOLE, M., RALDUA, D., PIFERRER, F., BARCELO, D., PORTE, C., Feminization of wild carp, Cyprinus carpio, in a polluted environment: plasma steroid hormones, gonadal morphology and xenobiotic metabolizing system. Comparative Biochemistry and Physiology, 136: SONG, S.B., XU, Y., ZHOU, B.S., Effects of hexachlorobenzene on antioxidant status of liver and brain of common carp (Cyprinus carpio), Chemospere, 65: STEPHENSEN, E., STURVE, J., FORLIN, L., Effects of redox cycling compounds on glutathione content and activity of glutathione-related enzymes in rainbow trout liver. Comparative Biochemistry and Physiology, 133: SUMPTER, J.P., Xenoendocrine disrupters-environmental impacts. Toxicology Letters, : TON, C., PARNG, C., The use of zebrafish for assessing ototoxic and otoprotective agents. Hearing Research, 208: TSUJI, A., TAMAI, I., Carrier-mediated or specialized transport of drugs across the blood-brain barrier. Advanced Drug Delivery, 36: TRAVACIO, M., POLO, J.M., LLESUY, S., Chromium (VI) induces oxidative stress in the mouse brain. Toxicology, 150: UNER, N., ORUC, E.O., CANLI, M., SEVGILER, Y., Effects of cypermethrin on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in liver 81

91 and kidney of the freshwater fish, Oreochromis niloticus and Cyprinus carpio (L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 67: VINA, J., Glutathione: Metabolism and Physiological Functions. CRC Press, United States of America, 378sf. WALKER, I., COLEMAN, M.D., The blood-brain barrier: in vitro methods and toxicological applications. Toxicology in Vitro, 9: WANG, A., WANG, J.P., WANG, H., CHEN, Y., ZHAO, L., WANG, L., WEI, W., XU, D., 2006.A dual effect of N-acetylcysteine on acute ethanol-induced liver damage in mice. Hepatology Research, 34: WHEELOCK, C.E., EDER, K.J., WERNER, I., HUANG, H., JONES, P.D., BRAMMELL, B.F., ELSKUS, A.A., HAMMOCK, B.D., Individual variability in esterase activity and CYP1A levels in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) exposed to esfenvalerate and chlorpyrifos. Aquatic Toxicology 74: WU, G., FANG, Y., YANG, S., LUPTON, J.R., TURNER, N.D., Glutathione metabolism and its implications for health. The Journal of Nutrition, 134: ZHANG, J.F., SHEN, H., WANG, X.R., WU, J.C., XUE, Y.Q., Effects of chronic exposure of 2,4-dichlorophenol on the antioxidant system in liver of freshwater fish Carassius auratus. Chemosphere, 55: ZHANG,J.F., LIUB, H., SUN, Y.Y., WANG, X.R., WU, J.C., XUE, Y.Q., Responses of the antioxidant defenses of the Goldfish Carassius auratus, exposed to 2,4-dichlorophenol. Environmental Toxicology and Pharmacology 19: ZWART, L.L.D., MEERMAN, J.H.N., COMMANDEUR, J.N.M., VERMEULEN, N.P.E, Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radical Biology and Medicine, 27:

92 ÖZGEÇMİŞ 1981 yılında Adana da doğdum. İlk, orta ve lise öğrenimimi Adana da tamamladım yılında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü nden mezun oldum. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda yüksek lisans öğrenimime başladım ve aynı zamanda Ağustos-2007 yılından itibaren T. Halkbankası A.Ş de müşteri ilişkileri yöneticisi olarak çalışmaktayım. 83