Hücre Kültürü Ekipmanları

Transkript

1 Hücre Kültürü Ekipmanları

2 Hücre Kültürü Ekipmanları Hücre kültürü yapılırken kullanılacak ekipmanlar temel olarak yapılan çalışmaya göre belirlenir. Fakat bütün hücre kültürü laboratuvarlarının temel olarak patojenik mikroorganizma barındırmama ve de bir kısım ortak ekipmanları bulundurma gibi özellikleri olmalıdır.

3 Hücre Kültürü Ekipmanları Temel Ekipmanlar Laminar Kabin İnkübatör Su Banyosu Santrifüj Buzdolabı (+4 C) ve dondurucu (-20 C) Hücre sayacı (otomopk veya hemasitometre) İnvert Mikroskop Sıvı azot Otoklav Yaygın Ekipmanlar Aspirasyon pompası (peristalpk veya vakum) ph metre Konfokal Mikroskop Flow Sitometre Ek Malzemeler Hücre büyüme kapları (flask, petri kabı,çok kuyulu plate) Pipet ve pipetör Şırınga ve şırınga ucu AYk kapları Medyum,serum ve ajanlar Hücreler

4 Hücre Kültürü Ekipmanları

5 Hücre Kültürü Ekipmanları

6 Laminar Kabin Hücre kültürü laminar kabinlerin en büyük avantajı çalışma çevresini kontaminasyon ve tozdan koruyarak aseppk bir çalışma alanı sağlamasıdır. AraşYrmanın Ppine ve klinik ihpyaçlara göre üç Pp laminar labin vardır; Class I Class IIA Class IIB

7

8 Laminar Kabin Class I Class I biyogüvenlik kabinlerinde ön açıklıktan doğruca çalışma alanına giren hava üst kısımda yer alan HEPA filtreden geçerek aylır; bu özelliği ile çalışanı ve çevreyi mikrobiyal bulaştan korurlar ancak hücre kültürü gibi çalışılan materyalin de korunması gereken durumlar için önerilmezler.

9 Laminar Kabin Class IIA Class II biyogüvenlik kabinlerinde de ön açıklıktan hava girişi olmasına rağmen, sistem bu havanın çalışma alanında dolaşıma girmeden önce HEPA filtreden geçmesini sağlayacak şekilde dizayn edilmişpr. Kabinin üst kısmında yeralan HEPA filtreden geçerek çalışma alanına giren hava, çalışma alanında sabit bir akış hızı (velocity) ile düşey bir hava perdesi (laminar akım) oluşturur ve herhangi bir türbülans olmadığında yaklaşık 10 dakika sonra kabin içi dolaşan hava prapk olarak parpkülsüz (steril) kabul edilebilir.

10 Laminar Kabin Class IIB Class IIB (3. ayrı alt Pp olarak) toksik veya karsinojenik ajanlarla yapılan ya da düşük yoğunluklu nükleer madde kullanılan çalışmalar için dizayn edilmişlerdir. Bu tür çalışmaların niteliği gereği, Class IIB kabinlerde üreplen ayk hava da tümü ile bina dışına yönlendirilir.

11 CO 2 İnkübatör Hücreler hem kültür çözelpsinin ph ının kontrol edilebilmesi, hem de çoğalmak için bikarbonata (HCO3-) gereksinim gösterirler. Bu nedenle, içindeki CO2 düzeyi ayarlanabilen inkübatörler kullanılmalıdır. Hava ceketli inkübatör Su ceketli inkübatör Isı ceketli inkübatör

12 Invert Mikroskop Hücrelerin içerisinde bulundukları hücre kültür kaplarında görüntülenmesinde kullanılır.

13 Santrifuj Hücreler pasajlanırken hücrelerin pellet olarak toplanıp, kullanılmış besi yerinin uzaklaşyrılmasında kullanılır.

14 Depolama ve Buzdolapları Bir hücre kültürü laboratuvarı, medyum, anpbiyopk ve ilaç gibi kimyasallar için, aylabilir pipet, kültür kapları, eldiven, medyum şişeleri ve cam pipetler gibi cam malzemelerin saklanması için depolama alanına sahip olmalıdır. Cam malzemeler ve plaspkler-oda sıcaklığında saklanır. +4 C Medyum, ajanlar, kimyasallar epketlerinin üstünde yazan sıcaklıkta saklanmalıdır. (medyum: +4 C, anpbiyopk ve serum; -20 C) Bazı medyum, ajanlar ve reakpfler ışığa duyarlıdır, bu yüzden kullanılmadıkları durumda kapalı ortamda veya alüminyuma sarılı şekilde saklanmalıdır. -20 C

15 Kriyojenik Depolama Sonsuz hücre hatlarının pasaj numaraları arckça genepk stabiliteleri azalmaktadır, bu yüzden hücreler ile çalışırken stok hazırlamak ve bu stokları kriyojenik olarak depolamak gereklidir. Hücreler -20 C veya -80 C dondurucuda saklandıklarında canlılıkları hızla düşmektedir, bu nedenle depolamak amaçlı azot tankları kullanılmaktadır (-196 C ).

16 Kriyojenik Depolama Hücreler sıvı azot içinde -196 C de, bu düşük sıcaklığa dayanacak özel plaspk tüpler yada cam vialler içinde saklanır. Hücreler, büyüme çözelpleri %10-20 serum ve %5-10 gliserol yada DMSO içeren bir çözelp alınarak dondurulurlar.

17 Petri ve Flasklar Flasklar, plateler ve petriler hücrelerin beslenip çoğalylmasında ve deneylerin gerçekleşprilmesinde kullanılır. Flasklar, plateler ve petriler nemli inkübatörden alındığında dış yüzeyleri kontaminasyona eğilimlidir, bu nedenle her zaman alkol ile silinmelidir.

18 Pipet ve Pipetör AYlabilir plaspk pipetler kullanılmalıdır. Çapraz kontaminasyonu engellemek için her pipet yalnız bir kere kullanılmalıdır. Sıvılar ile çalışırken pipetör kullanılmalıdır.

19 Besi Yeri (medium) Hücre kültürü besi yerleri (medyum) laboratuvar ortamında hücrelerin normal metabolik akpvitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solüsyonlardır. Hücre kültürü besi yerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuvar ortamında hücrelerin çoğalylabilmesi için uygun ph, sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besi yerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve ph ı da sağlarlar.

20 Besi Yeri (medium) Besi yeri ihpyacı hücrelerin Ppine, adaptasyon kabiliyepne ve hücre kaynağı organizmanın türüne göre farklılık gösterir. Hücreler farklı besi yerlerinde farklı davranabilirler. Bu yüzden çalışmanın amacına göre hücrenin besi yeri ihpyaçlarının belirlenmesi gerekir.

21 Besi Yeri (medium) Besi yeri Pcari destekleyicilerden sağlanır ve sterillik durumları sıkı kontrol alyndadır. Bununla birlikte şişelerin dış yüzeyi steril olmaz. Bu nedenle şişeler %70 alkol ile çalışma alanına alınmadan önce silinmelidir.

22 Earle s Balanced Salt SoluPon (EBSS) Earle s Minimum EssenPal Medium (EMEM) Hank s Balanced Salt SoluPon (HBSS) ZenginleşPrilmiş formları ; DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) F12 1:1 karışımı olan DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) RPMI 1640 (Roswell Park Memorial InsPtute) M199 (Medium 199 with Earle's Salts) en sık kullanılan çözelplerdir. Bu çözelplere eklenen diğer moleküller esansiyel aminoasitler,vitaminler (özellikle B vitaminleri), hormonlar ( insülin,hidrokorpzon ) ve glikozdur.

23 Serum Serum hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak tanımlanmamış zengin bir protein çözelpsidir. Bu protein çözelpsinin içinde hormonlar, enzimler, hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesini sağlayan hücreler arası matris proteinleri bulunur. Hücre çeşidine ve uygulamalara göre besi yerindeki serum oranı değişebilir. Standart bir somapk hücre kültüründe serum oranı %10 dur. Fetal Calf Serum Fetal Bovine Serum

24 Serum Serum ürepmi pahalı ve zahmetli bir süreçpr. Sığır embriyolarının kanlarının toplanmasıyla hazırlanan serumların ürepminde bir standart yoktur. Farklı hayvanlardan elde edilen serumlar birbirlerinden farklılık gösterirler. Bu da deneylerin sonuçlarını etkilemektedir. Bu dezavantajlarından dolayı bazı laboratuvarlar serumsuz besi yerlerini kullanmaktadırlar. Serum kullanılmayan bir besi yerinin çeşitli büyüme ve tutunma faktörleriyle desteklenmesi gerekir. Fetal Calf Serum Fetal Bovine Serum

25 Phosphate Buffered Saline (PBS) Hücre içi ve dışındaki ozmopk basıncı dengede tutan bir tuz solüsyonudur. İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su, hücre metabolizmasını destekler. ph tamponlayarak hücreler için uygun bir ortam sağlar. Kalsiyum ve magnezyum iyonları içermez.

26 Tripsin/EDTA Tripsin hücre pasajlamalarında kullanılan temel enzimdir. Tripsin, bir serin proteaz Ppi enzimdir, lizin ve arjinin aminoasitleri içeren peppdleri yıkar. Laboratuvarlarda genellikle %0,25 EDTA lı tripsin solüsyonu kullanılmaktadır. -20 C de saklanır, daha yüksek sıcaklıklarda bekleyen tripsinin akpvitesi düşer, bu yüzden alikotlanarak saklanması en uygunudur.

27 Tripsin/EDTA Serum tripsin inhibitörlerini içerir, hücrelere tripsin uygulanmadan önce mutlaka bir kere Ca +2 ve Mg +2 içermeyen PBS ile yıkanmalı ve yüzeylerindeki serum uzaklaşyrılmalıdır. Tripsin hücrelerin yüzeyini örtecek kadar uygulanır. Tripsin sıcaklık arckça daha etkili çalışır. Tripsin uygulanan hücreler inkübatöre konduklarında daha çabuk yüzeylerden ayrılırlar, oda sıcaklığındaysa daha yavaş ayrılırlar.

28 Fenol Red Hücre kültüründe iyon bileşimi bakımından ekstraselüler ortama yakın olan, bunun yanı sıra hücre çoğalması için serum içeren çözelpler kullanılır. ph 7.4 civarında olmalıdır, çoğunda ph indikatörü olarak fenol red kullanılır. Yapılan çalışmalar fenol kırmızısının östrojeni taklit etme özelliği olduğunu ileri sürmektedir.

29 HEPES, Sodyum Bikarbonat ÇözelPlere tampon olarak eklenen bikarbonat, CO 2 ile dengededir. Bu yolla oluşan karbondioksit çözelpden havaya karışarak ph yı yükselpr. Hücrelerin oluşturduğu lakpk asit ph yı düşürür. Bu değişimleri tamponlamak için içlerine 20mM HEPES eklenmelidir.

30 GÜVENLİK ve ÇALIŞMA KOŞULLARI

31 Güvenlik Hücre kültürü laboratuvarı insan veya hayvan hücre ve dokuları ile ilişkili olduğu gibi toksik, korosif veya mutajenik bileşikler ve ajanlar ile oluşabilen spesifik tehlike türlerine sahippr. Bu kazalar genellikle ; Şırınga ucunun veya diğer keskin kontamine aletlerin deriye batması Deri ve mukoz membran üstüne kimyasal dökülmesi Ağız yoluyla pipetleme İnfeksiyöz aerosollere inhalasyon yoluyla maruz kalma şeklinde görülmektedir. Bir hücre kültürü laboratuvarında güvenlik için dikkat edilmesi gereken en önemli faktör standart mikrobiyolojik tekniklerin kay şekilde uygulanmasıdır.

32 Asep[k Teknik Hücre kültüründe karşılaşılan en büyük problemlerden biri mikroorganizma kontaminasyonudur. Bakteri, mikoplazma, maya ve mantar sporları kişi,hava,çalışma yüzeyi,solüsyonlar ve diğer bir çok kaynakla taşınabilir. Doğru uygulanan aseppk teknikler ile kontaminasyonları elimine etmek mümkündür. Bu nedenle doğru prapk uygulamaları yerleşprip uygulamak çok önemlidir. Kontaminasyon, birkaç kültür arasında veya sadece deneyi enfekte edecek kadar küçük veya yayılıp tüm laboratuvarı enfekte edecek kadar büyük olabilir.

33 BAKTERİ KONTAMİNASYONU MİKOPLAZMA KONTAMİNASYONU

34 Çalışma Yüzeyi Çalışmaya başlamadan önce ve sonra yüzey %70 lik alkol ile iyice silinmelidir. Çalışılacak alana yalnızca ilgili ekipman geprilmelidir. Çalışma tezgahının merkezi geniş ve temiz olmalıdır. Görüş alanı içinde çalışılmalı, çalışma alanının dışına çıkılmamalıdır. Yüzeye dökülen herhangi bir kimyasal derhal silinmelidir. Silme işlemi alkol ile yapıldığından işaret ve yazıları siler bu nedenle alkole dirençli markerlar kullanılmalıdır.

35 Kişisel Hijyen Çalışmadan önce ve sonra mutlaka ellerinizi yıkayınız. Cerrahi pudrasız eldiven giyilmeli ve %70 lik alkol ile sıklıkla silinmelidir. Hastalık durumlarında yüz maskesi kullanılmalıdır. Çalışma esnasında konuşulmaktan kaçınmalıdır.