Clostridium difficile

Transkript

1 Clostridium difficile Enfeksiyonlarının Mikrobiyolojik Tanısında Yenilikler Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Yrd.Doç.Dr. Melda SINIRTAġ

2 Antibiyotikle iliģkili diyareler Antibiyotikle iliģkili ishaller Clostridium difficile Salmonella spp Clostridium perfringens Tip A Staphylococcus aureus Campylobacter jejuni Candida albicans

3 Gram pozitif Sporlu Zorunlu anaerob Kapsülsüz Zayıf hareketlidir

4 Pozitif regülatör sitotoksin enterotoksin Negatif regülatör

5 Pozitif regülatör sitotoksin enterotoksin Negatif regülatör NAP1/027 Kanada 2002/Ġngiltere 2005, Hollanda, Belçika,Fransa

6 Klinik Klinik Enterokolit/Psödomembranöz enterokolit (PME) Antibiyotik kullanımından 5-10 gün sonra semptomlar baģlar DıĢkı Kahverengi-sulu (%90-95) Kanlı (%5-10) PME mukuslu (%85) Karın ağrısı-bulantı-kusma AteĢ (%26-66) Lökositoz (%40-50)

7 C. difficile enfeksiyonlarında tanı Hasta için önemi : etkili tedavi Hastane için önemi: çevreye yayılım ve salgınları önlemek

8 C. difficile Mikrobiyolojik Tanı Kimden? Ne zaman? Nasıl?

9 2010 Zaman hastalıkların karekteristiğini değiģtirdiği gibi tanısal yaklaģımlarıda değiģtirmektedir

10 değiģenler %42 Diyare %34 Antibiyotik kullanım öyküsü Genç (8 sağlıklı hafta içinde) En az Gebe 3 gündür hastanede yatıģ Gençler > 65 yaģ hastane toplum Kutty PK. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;29: Candiotto A. J Med Microbiol 2010; 59:124-6.

11 Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-european hospital-based survey M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S. Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group. Turkey: B. Levent (N.C.), Refik Saydam National Hygiene Center, Ankara; S. Kacar (L.C.), Yuksek Ihtisas Hospital, Ankara; G. Hascelik (L.C.), Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; B. Sener (L.C.), Hacettepe University Medical Faculty, Ankara; O. Azap (L.C.), Baskent University Hospital, Ankara; H. Arslan (L.C.), Baskent University Hospital, Ankara; M. Sinirtas (L.C.), Uludag University, Bursa; H. Akalin (L.C.), Uludag University, Bursa; N. Ulger (L.C.), Marmara University, Kadikoy, Istanbul; G. Soyletir (L.C.), Marmara University, Kadikoy, Istanbul; 19. ECCMID

12 Clostridium difficile infection in Europe: the first pan-european hospital-based survey M.P. Bauer,1,2 D.W. Notermans,1 B.H.B. van Benthem,1 J.S. Brazier3, M.H. Wilcox,4 M. Rupnik,5 D.L. Monnet,6 J.T. van Dissel2 and E.J. Kuijper,2 on behalf of the ECDIS Study Group. Characteristic n/ N % Epidemiological characteristics: Female sex 287/ Age 65 years 319/ Age distribution [years]: median 71; IQR Epidemiological association: healthcare-associated 408/ indeterminate association 28/ community-associated 70/ Explicit request to test for CDI 441/ ECCMID

13 Toksinotip V 078/NAP7/BK Hayvan+insan yemeklerinde saptandı Binary toksin pozitif Salgınlar?????

14 Mikrobiyolojik tanı için optimal koģullar Sadece sulu dıģkı Epidemiyolojik araģtırmalar hariç Eküvyon ile gelen örnek kabul edilmemelidir Taze alınmıģ dıģkı örneği Hızlı çalıģılmalı 4 C de saklanmalıdır (2-3 gün) Uzun dönem saklamalarda -70 C (-20 C de değil) Brazier JJ;Clinical Infectious Diseases 16:228-33,1993 Freeman J; J Clinical Pathology 56:126-8,2003

15 Hangi yöntem Yöntem Sitotoksin nötralizasyon %5 %1 Immunokromotografik testler %26 %46 (GDH ve/yada Toksin) EIA toksin A %18 %2 EIA Toksin A/B %42 %43 Diğer %9 %8 College of American Pathology 2004, p:9 College of American Pathology 2008, p:9

16

17 Moleküler yöntemler Enzim immünoassay (Toksin A/B) Clostridium difficile Glutamat dehidrogenaz Toksijenik kültür (Kültür+sitotoksin nötralizasyon) Sitotoksin nötralizasyon

18 TOKSĠJENĠK KÜLTÜR SĠTOTOKSĠN NÖTRALĠZASYON

19 TOKSĠJENĠK KÜLTÜR Sikloserin Sefoksitin Fruktoz Agar (Cycloserine Cefoxitine Fructose Agar) CCFA Taze dışkı ısı/alkol ile yapılan işlem sonrası, selektif sikloserin sefoksitin fruktoz anaerobik agar besiyerine ekim

20 C. difficile : Koloni yapısı 2 mm çaplı, buzlu cam görüntüsü veren, sarımsı-beyazımsı renkli koloniler oluşturur Kültür at gübresi gibi kokar

21 365 nm UV de yeşil floresan beyin kalp infüzyon buyyona pasaj 24 saat ºC de inkübe edilir Bu kültür invitro toksin araştırılması için kullanılır

22 Toksijenik kültür Üreyen suģların toksin yapıp yapmadığı kontrol edilmelidir Sitotoksin nötralizasyon kadar spesifik değil Sonuçlanma süresi uzun 4 gün Tercih edilmiyor Amerika %77 tercih etmiyor 1 Avrupa %55 tercih ediyor (2003) 2 1 Gilligan PH. Clin Micro Net 2008;Oct,31. 2 Barbut F. Clin Microbiol Infect 2003;9:

23 HeLa SĠTOTOKSĠN NÖTRALĠZASYON 10 pg lık sitotoksin düzeylerini saptayabilen bir yöntemdir Sıvı dışkı örnekleri santrifüje edilir Süpernatan, filtrelerden geçirilir 1/40 bazı çalışmalarda 1/5 dilüe edilerek hücre dizilerinin üzerine eklenir 37 ºC de saat anaerob inkübasyondan sonra ışık mikroskobunda sitopatik etki (yuvarlaklaşma) aranır Nötralizan antikorlar (anti-c. sordellii antiserum) eklendiğinde bu sitopatik etki ortadan kalkar

24 Sitotoksin Nötralizasyon Testi Duyarlılık % PPD %90 ın üzerinde Zaman Pozitif sonuç 24 saat Negatif sonuç 48 saat Tercih edilmemekte %1 Zaman alıcı zor bir teknik CAP profciency test survey 2008

25 Moleküler yöntemler Enzim immünoassay (Toksin A/B) Clostridium difficile Glutamat dehidrogenaz Toksijenik kültür (Kültür+sitotoksin nötralizasyon) Sitotoksin nötralizasyon

26 Enzim immüno assay (EIA) Toksin A Toksin A+B Glutamat dehidrogenaz (GDH) Ġmmünokromotografik testler Toksin A+B GDH Toksin A+B+GDH

27 HIZLI UCUZ KOLAY EKĠPMAN UCUZ TEK/BĠRDEN ÇOK ÖRNEK ÇALIġILABĠLĠR test hedef zaman toxa test Oxoid Immunocard Meridian ColorPAC tox A BD CdTox A OIA Biostar Vidas CDA II BioMérieux Premier toxin A&B C.diff tox A/B Techlab Immunocard A/B Meridian Triage BMD A 45' A 20' A 20' A 20' A 60' A ve B 80' A ve B 80' A ve B 30 A ve GDH 20' C.DIFF Quik Chek Complete B ve GDH 45

28 EIA testlerinde duyarlılık nasıl? dilüsyon sitotoksin Premier tox A/B Techlab tox A/B Vidas (A) ColorPAC rapid tox A Immuno card (A) Oxoid CD toxin A / / / / / / /

29 DUYARLILIK % ÖZGÜLLÜK % PPD % NPD % Stampe PD. J Clin Microbiol 2009;47: Musher DM. J Clin Microbiol 2007;45: Sloan LM J Clin Microbiol 2008;46: Gilligan PH. J Clin Microbiol 2008;46: Tirehurst JR. J Clin Microbiol 2006;44:1145-9

30 hasta yöntem pozitiflik (%) referans diyareli EIA Toksin A 16 Büyükbaba Boral Ö; KLİMİK Derg 7:105-7,1994 diyareli EIA Toksin A 34 Öztürk R;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995 diyareli kültür 5.2 (Toksin %0.8) Karaer P;5. Ulusal İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi,1995 diyareli EIA Toksin A 5 Kocazeybek B;Türk Mikrobiyol Cem Derg 31:69-72,2001 diyareli EIA Toksin A 18,4 Altuğlu İ; İnfeksiyon Derg 15:495-7,2001 diyareli EIA Toksin A 4.7 diyareli EIA Toxin A/B 12 Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32: ,2002 Büyükbaba Boral Ö; Türk Mikrobiyoloji Cem Derg 32: ,2002 diyareli EIA Toksin A/B 3.2 Aygün G;ANKEM Derg 16:82,2002 diyareli EIA Toksin A/B 9 Ercis S;Mikrobiyol Bült 38:45-50,2004

31 Toksin Toksinin dıģkıda stabil kalmaması Mutasyon Toksin A - /B + Binary toksin +

32 Glutamat dehidrogenaz Hücre yüzey proteini Clostridium spp. Toksin A ve B den daha dayanıklı (dıģkıda) Tüm pozitif örneklerde doğrulama gereklidir

33 Antijen temelli testlerin duyarlılığı C. difficile ribotiplerinin saptanmasında değişiyor mu? Duyarlılık Ribotip GDH PZR 027 %90.1 % dışındakiler %72.2 %91.7 Toksin A+B PZR 002 %15.4 % %78.4 % %18.8 %75 Tenover FC.

34

35 3 other 001 (9.3%) 002 (4.6%) 012 (4.3%) /020 (15.7%) 015 (3.3%) 017 (3.5%) (5.8%) 023 (2.5%) 027 (4.8%) 078 (7.8%) 106 (5.1%) 126 (3.0%)

36 Moleküler yöntemler Enzim immünoassay (Toksin A/B) Clostridium difficile Glutamat dehidrogenaz Toksijenik kültür (Kültür+sitotoksin nötralizasyon) Sitotoksin nötralizasyon

37 Moleküler Yöntemler 45 dakika dakika ~3 saat 45 dakika Cepheid BD GeneOhm Gen-Probe Meridian

38 ALGORĠTMALAR

39 Algoritmalar Hızlı Kolay uygulanabilen Duyarlılığı yüksek Özgüllüğü biraz düģük + Özgüllüğü yüksek bir yöntemin

40 3 lü algoritma GDH (-) Son rapor: C. difficile negatif - 30 dakika (+) Toksin A+B (+) Son rapor: C. difficile pozitif 30 dakika (-) *Sitotoksisin Nötralizasyon *PZR (+) Son rapor: C. difficile pozitif (-) Son rapor: C. difficile negatif 45 dakika-48 saat

41 2 li algoritma (-) test (+)test antijen, toksin GDH / Toksin 30 dakika 1.aĢama GDH (+)/Toksin A+B (+) GDH (+)/Toksin A+B (-) GDH (-)/Toksin A+B (-) Son rapor: C. difficile pozitif *Sitotoksisin Nötralizasyon *PZR 2 aģama Son rapor: C. difficile negatif

42 ALGORĠTMALARDA DUYARLILIK EIA GDH+EIA GDH+EIA+ sitotoksin nötralizasyon GDH+Xpert Xpert örnek sayısı Duyarlılık Özgüllük PPD NPD Novak-Weekley SM. J Clin Microbiol 48:889-93, 2010

43 C DIFF Quik Check Complete GDH CDT VIDAS Xpert PZR BD PZR Sitotoksin nötralizasyon %Duyarlılık % Özgüllük % PPD % NPD Toksijenik kültür %Duyarlılık % Özgüllük % PPD % NPD Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.

44 QUIK CHEK COMPLETE TM GDH pozitif (22) GDH negatif (128) Son rapor: C. difficile negatif Toksin pozitif (11) Toksin negatif (11) %7.3 (+) %7.4 %85.3 (-) Swindells J. J Clin Microbiol 2010;48:606-8.

45 Algoritmaların dezavantajları GDH test duyarlılıklarındaki farklı raporlar Zaman Birden çok yöntemi laboratuvar düzeninde bulundurmak gerekliliği Maliyet

46 Hangi hastalar test edilmeli? Hangi test laboratuvarda kullanılmalı? Testi tekrarlamalı mıyım, ne zaman? Benim hastamda C. difficile enfeksiyonu var mı? Peterson LR. Ann Intern Med 2009;151:176-9.

47 C. difficile: Test tekrarı için kriterler Negatif sonuç: 3 örnek (aynı günde birden fazla olmamalı) Duyarlılığı düģük bir yöntem/kit kullanıyorsanız, klinisyenlerin tekrar taleplerini dikkate alın Pozitif sonuç: Tedavinin baģarısını ölçmek için kullanılmamalı Klinik=tedavide baģarı Barenfanger J, Khardori N: Clin Micro Newsl 18:142, 1996 Renshaw AA, et al: Arch Pathol Lab Med 120:49-52, 1996

48 Laboratuvarda ÇalıĢılacak Testlerin ve Malzemenin Seçilmesi

49 DOĞRULUK SONUÇLANMA SÜRESĠ MALĠYET KULLANIM KOLAYLIĞI

50 TOPLUMDAKĠ PREVALANS Onlar kaçmak istesede TARAMA TESTĠ, DOĞRULAMA TESTĠ Toksin üreten tüm izolatları yakalayın Prevalans düģük ise duyarlılığı yüksek bir test kullanılmalı

51

52 Firma var mı? Toksin A+B kit sayısı? Ücret 96 test/519,38 $ 50 test/663,75 $ 25 test/371,25 $ 25 test/500,00 $ TL Parasını geri alabilecek misiniz?

53 Clostridium difficile kültürü 36 21,20 21, Clostridium difficile toxin-a 29 17,00 17, Clostridium difficile toxin-a ve B 29 17,00 17, "Clostridium difficile kültürü", "Clostridium difficile toxin-a" "Clostridium difficile toxin-a ve B den yanlızca biri ödenebilir

54 TeĢekkürler