ZEYT N KARASUYUNDAN M KROB YAL L PAZ ÜRET M

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) ZEYT N KARASUYUNDAN M KROB YAL L PAZ ÜRET M Hasan Bu ra ÇOBAN Biyomühendislik Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunu Tarihi: Tez Danı manı: Prof. Dr. Murat EL BOL Bornova- ZM R

2 II

3 III Sayın Hasan Bu ra ÇOBAN tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan Zeytin Karasuyundan Mikrobiyal Lipaz Üretimi ba lıklı bu çalı ma, E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve 25/06/2009 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirli i / oy çoklu u ile ba arılı bulunmu tur. Jüri Üyeleri: mza Jüri Ba kanı : Prof.Dr. Murat EL BOL..... Raportör Üye : Yrd.Doç.Dr. hsan YA A... Üye : Yrd.Doç.Dr. Sayıt SARGIN...

4 IV

5 V ÖZET ZEYT N KARASUYUNDAN M KROB YAL L PAZ ÜRET M Hasan Bu ra ÇOBAN Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Murat EL BOL Haziran 2009, 76 sayfa Bu çalı mada temel olarak, zeytinya ı i letme atı ı olan zeytin karasuyun Rhizopus oryzae, Circinella sp., Streptomyces bombicola ve Streptomyces sp. türlerinde lipaz enzimi için substrat kayna ı olarak kullanılabilme potansiyeli ara tırılmı tır. Yapılan deneyler sonrasında bu türlerden lipaz aktivitesi açısından en iyi organizmanın R.oryzae oldu u bulunmu ve R. oryzae den lipaz üretimi için gerekli proses artları 250 ml lik erlenler, 1 L ve 3,6 L lik reaktörlerde incelenmi tir. Çalı manın ilk a amasında, R.oryzae nin sıvı ortamda büyümesine ve lipaz üretimine çe itli faktörlerin (ba langıç mikroorganizma konsantrasyonu, kullanılan azot ve karbon kaynaklarının türü ve konsantrasyonu, ba langıç ph de erleri v.b) etkileri incelenmi tir. Üretilen lipazı analiz etmek için sıcaklık, ph ve karı tırma hızının kontrol edilebildi i 50 ml çalı ma kapasiteli bir karı tırmalı kap kullanılmı tır. Hidroliz tepkimesi, ph-stat metoduyla ph de eri sabit tutulan tepkime ortamında, tribütürinin lipaz tarafından hidrolizi sonucunda olu an ya asitlerini nötralle tirmek için harcanan NaOH miktarının zamana kar ı ölçülmesiyle izlenmi tir. Nötralizasyon i lemi

6 VI için optimum ph 8 ve sıcaklık 30 o C dir. Lipaz üretimi serbest ve immobilize (kabak lifinde ve aljinatta tutuklanmı ) mikroorganizmalarla farklı karbon (glikoz, mısır ya ı, ayçiçe i ya ı, zeytinya ı, soya ya ı, fındık ya ı ve tribütürin) ve azot (nutrient broth, yeast extract, üre, pepton ve amonyum nitrat) kaynakları kullanılarak erlenlerde gerçekle tirilmi tir. Serbest haldeki mikroorganizmalardan elde edilen maksimum lipaz aktivitesi 39 IU, immobilize mikroorganizmalarla yapılan tekrarlamalı deneyler sırasında elde edilen maksimum lipaz aktivitesi ise 27,6 IU olarak bulunmu tur. mmobilize R.oryzae nin tekrar kullanılabilirli i ara tırılmı ve 120 saat süre boyunca aktivitesini kaybetmeden korudu u gözlemlenmi tir. Karı tırmalı reaktörlerde yapılan deneylerde ise karı tırma hızı ve hava akı hızı gibi i letim parametrelerinin enzim üretimine olan etkileri incelenmi tir. Anahtar kelimeler: Rhizopus oryzae, enzim, lipaz, immobilizasyon, zeytin karasuyu

7 VII ABSTRACT MICROBIAL LIPASE PRODUCTION FROM OLIVE MILL WASTE WATER Hasan Bu ra ÇOBAN MSc in Bioengineering Department Supervisor: Prof. Dr. Murat ELIBOL June 2009, 76 pages In this study, the potential use of olive mill waste water as a substrate source for lipase producion by various microorganisms, namely Rhizopus oryzae, Circinella sp., Streptomyces bombicola and Streptomyces sp. was mainly investigated. The results of experiments showed that the highest lipase activity was obtained with R.oryzae and therefore some process conditions for lipase production by using R.oryzae were studied in 250 ml flasks and also 1-L and 3.6 L bioreactors. In the first stage of study, the effects of some factors such as inoculum level, type and concentration of carbon and nitrogen sources, initial ph etc. on growth of R.oryzae and lipase production were investigated. Lipase activity was measured in a 50 ml stirred and temperature and ph value controlled reactor. Hydrolysis reaction was monitored by using ph-stat system in which lipase activity was assayed by reaction using tributyrin as the substrate followed by alkali titration. A

8 VIII unit of lipase activity was defined as the amount of enzyme that yields 1 µmol of fatty acids per minute in the assay conditions The experiments were performed in both shaken culture and stirred tank reactor. Lipase production was conducted in shake flasks using freely suspended as well as immobilized cell (encapsulated within alginate and adsorption on loofa sponge) systems. In both systems, various carbon (glucose, corn oil, sunflower oil, olive oil, soybean oil, hazelnut oil, tributyrin) and nitrogen sources (nutrient broth, yeast extract, urea, pepton and ammonium nitrate) were used. The maximum lipase activity produced via freely suspended cells measured as 39 IU, whereas by immobilized cells that used during repeated batches was 27,6 IU. Moreover, it was found that the immobilized cells keep up their activities with their first activity values for 120 h period. The effects of agitation rate and air flow rate on lipase production were also studied in the bioreactor. Key words: Rhizopus oryzae, enzyme, lipase, immobilization, olive mill waste water

9 IX TE EKKÜR Çalı malarımda destek ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, en yo un zamanlarında bile ilgisini eksik etmeyen, bilgi ve deneyimlerini benimle payla an de erli hocalarım Sayın Prof. Dr. Fazilet VARDAR SUKAN, Sayın Prof. Dr. Murat EL BOL ve Sayın Yrd. Doç. Dr. hsan YA A ya, yüksek lisans ö retimim boyunca laboratuvarda beraber çalı tı ım ve desteklerini her zaman hissetti im sevgili arkada larım Ar.Gör. Kerem BORA, Ar.Gör. Müge LETEN, Ar.Gör. Özlem ÜSTÜN, doktora ö rencisi I ık ÇOBAN ve lisans ö rencisi Ecem BEYTEK N e, de erli Biyomühendislik ve EB LTEM ailesine ve sonsuz sevgilerini hep hissetti im sevgili aileme ve Biyomühendis Merve ENSOY a te ekkür ederim.

10 X Ç NDEK LER Sayfa No ÖZET...V ABSTRACT...VII TE EKKÜR...IX EK LLER D Z N...XIII Ç ZELGELER D Z N...XVI 1. G R L TERATÜR ÖZET Lipaz Bakteriyel lipazlar Fungal lipazlar Lipaz üretimi Lipaz aktivite tayini Lipazların safla tırılması Lipazların özellikleri Optimum sıcaklık ve termal denge Uygulamalar Biyodizel Lipaz enziminin biyodizel üretimindeki önemi Biyoproseslerde optimizasyon (Response surface methodology) Zeytin karasuyu

11 XI Zeytin karasuyunun arıtımındaki yöntemler Zeytinya ı atık sularından yarar sa lamak mmobilizasyon Adsorpsiyon Jelde Tutuklama MATERYAL VE METOT Materyal Mikroorganizmalar Kimyasallar Cihazlar Metot Rhizopus oryzae nin ço altılması ve geli tirilmesi mmobilizasyon i lemi Erlenlerin kültivasyona hazırlanması Üretilen lipazın aktivitesinin ölçülmesi BULGULAR VE TARTI MA Kullanılan farklı mikroorganizmaların lipaz aktivitesine etkisi Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin sıcaklık ve ph de eri ile de i imi De i en ba langıç ph de erlerinin lipaz aktivitesine etkisi Üretim ortamında de i en zeytin karasuyu:çe me suyu seyreltmelerinin lipaz aktivitesine etkisi....49

12 XII 4.5. Üretim ortamında de i en karbon ve azot kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi RSM ile elde edilen optimizasyon sonuçları Üretim ortamında inokülasyon oranlarının lipaz aktivitesine etkisi mmobilizasyon i leminin lipaz aktivitesine etkisi litre çalı ma kapasiteli reaktörde de i en havalandırma ve karı tırma hızlarının lipaz aktivitesi üzerine etkisi Zeytin karasulu ortam ile sentetik ortamın aynı i letme parametreleri altında aktiviteye etkisi litre çalı ma kapasiteli reaktörde de i en havalandırma hızlarının lipaz aktivitesi üzerine etkisi Üretilen enzimin farklı sıcaklıklardaki saklama ko ullarında aktivite kayıpları SONUÇLAR...63 KAYNAKLAR D Z N...66 EKLER...73 ÖZGEÇM...75

13 XIII EK LLER D Z N ekil Sayfa No ekil 2.1: Trigliserid hidrolizi...3 ekil 2.2: Su-ya arabiriminde lipolitik reaksiyon....7 ekil 2.3: Ya ların ve serbest ya asitlerinin alkali esterlerine lipaz aracılıklı alkolitik transesterifikasyonları.24 ekil 2.4: Zeytinya ı üretiminde kullanılan proseslerin akım eması...31 ekil 2.5: mmobilizasyon yöntemlerinin sınıflandırılması ve ematik gösterimi...36 ekil 2.6: Aljinik asidin yapısı 37 ekil 3.1: a)cacl 2 ye damlatılan sodyum aljinatlar 42 b)mikroorganizmaları içeren kalsiyum aljinat boncukları...42 ekil 3.2: a) Uygun boyutlarda kesilmi kabak lifi.43 b) Erlene çelik ve paslanmaz telle yerle tirilmi kabak lifi.43 c) Kabak lifine tutunarak geli en büyüme ekli...43 d) Etrafı tamamen sarılmı kabak lifi...43 ekil 3.3.: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin ölçüldü ü ph stat cihazı 45 ekil 4.1: Kullanılan farklı mikroorganizmaların lipaz aktivitesine etkisi.46 Sekil 4.2: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin sıcaklıkla de i imi..47 Sekil 4.3: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin ph de eri ile de i imi.48 EK LLER D Z N (devam)

14 XIV ekil 4.4: De i en ba langıç ph de erlerinin lipaz aktivitesine etkisi...49 ekil 4.5: Üretim ortamında de i en zeytin karasuyu:çe me suyu seyreltmelerinin lipaz aktivitesine etkisi..50 ekil 4.6: Üretim ortamında de i en karbon kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi..51 ekil 4.7: Üretim ortamında de i en azot kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi.52 ekil 4.8: 45. saat fermantasyon süresinde, de i en yeast extract ve mısır ya ı konsantrasyonlarına ba lı olarak aktivitede gerçekle en de i im grafi i ekil 4.9: %1,35 yeast extract konsantrasyonu içeren erlende en az 30 IU aktivitesi olan enzim üretmek için gereken mısır ya ı konsantrasyonu ve fermantasyon süresinin optimizasyon grafi i ekil 4.10: Üretim ortamında seyreltilmi inokülasyon oranlarının lipaz aktivitesine etkisi..55 ekil 4.11: mmobilizasyon i leminin lipaz aktivitesine etkisi...57 ekil4.12: 1 L çalı ma kapasiteli reaktörde de i en havalandırma hızlarının lipaz aktivitesine etkisi 58 ekil 4.13: 1 L çalı ma kapasiteli reaktörde de i en karı tırma hızlarının lipaz aktivitesine etkisi.59

15 XV EK LLER D Z N (devam) ekil 4.14: 1 L lik reaktörde aynı karı tırma ve havalandırma hızlarında zeytin karasulu ortam ile sentetik ortamdan elde edilen aktivite de erleri...60 ekil 4.15: 3 L çalı ma kapasiteli reaktörde de i en havalandırma hızlarının lipaz aktivitesine etkisi 61 ekil 4.16: Üretilen enzimin 4 o C ve -20 o C de saklama ko ullarındaki aktivite kayıpları..62

16 XVI Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa No Çizelge 2.1: Mikrobiyal lipazların özellikleri.. 15 Çizelge 2.2: Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamalardaki önemli alanları..16 Çizelge 2.3: Presleme ve üç fazlı sistemden gelen zeytinya ı atık sularının özellikleri..31

17 1 1. G R Enzimler, hücrelerde biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir. Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler çe itli amaçlarla kullanılmak üzere günlük ve ekonomik hayata girmi tir. Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün olu turmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, sürekli ve fazla miktarda elde edilebilmeleridir. Bu mikroorganizmalar yalnızca enzim üretme yeteneklerine göre de il, toksik ve patojen olmamasına göre de seçilirler. Bugüne kadar 2000 den fazla enzim tanımlanmı ve bunlardan yakla ık 100 tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmu tur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir. Ticari olarak kullanılan enzimlerin %59 unu proteazlar, %28 ini karbohidrazlar, %3 ünü lipazlar ve %10 unu ise di er enzimler olu turmaktadır. Karbohidrazlar grubuna giren -amilaz üretimi %13 ile önemli bir yer tutmaktadır. Genellikle küflerden elde edilen lipazlar trigliseridleri digliseridlere, monogliseridlere, gliserin ve ya asitlerine hidrolizini katalizleyen ve uygun ko ullar altında ters tepkimeleri yani, gliserin ve

18 2 ya asitlerinden trigliserid olu turan enzimlerdir. Süt ürünleri ba ta olmak üzere gıda, kozmetik, deri, tekstil, deterjan ve ilaç sanayisinde yaygın olarak kullanılan lipazın dünyadaki talebinin kar ılanabilmesi için bitkisel ve hayvansal kaynaklardan öte mikrobiyal kaynaklardan elde edilmesi, günümüzde büyük öneme sahip bir çalı ma konusudur. Enzim teknolojisinin giderek geli mesi ürünlerin kullanım alanlarının çe itlili i ve ekonomik de erinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çe itli ara tırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son yıllarda stratejik alan eklinde de erlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ula mı ve kullanımı giderek yaygınla mı tır. (Eren Kıran, Ö., Çömlekçio lu, U. ve Dostbil, N, 2006) Bu çalı mada esas itibariyle, bir zeytinya ı i letme atı ı olan zeytin karasuyunun (ZKS) mikrobiyal lipaz üretiminde substrat olarak de erlendirilebilme potansiyeli ve lipaz üretiminin gerek nutrientler ve gerekse i letim parametrelerinin optimizasyonu hedeflenmi tir.

19 3 2. L TERATÜR ÖZET 2.1.Lipaz Lipazlar, gliserin ile ya asitlerinden olu an esterleri hidroliz eden enzimler olarak tanımlanır. Hidroliz tepkimesi sonucu digliserid, monogliserid, gliserin ve ya asidi olu ur. Lipazın katalizleyici etkisiyle olu an trigliserid hidroliz tepkimesi ekil 2.1 de gösterilmi tir. (Brocher ve Holf, 1979). Trigliserid + H 2 O Lipaz Digliserid + ya asidi + H 2 O Lipaz Monogliserid + ya asidi Lipaz + H 2 O Gliserin + ya asidi ekil 2.1: Trigliserid hidrolizi (Brocher ve Holf, 1979) Ester hidrolizi gerçekle tiren di er bir enzim grubu da esterazdır. Lipazlar, Uluslararası Biyokimya Birli i Enzim Komitesince verilen Glycerol-Ester Hydrolase ( ) sistematik adıyla tanımlanır. 3. Hidrolaz 3.1. Ester ba ını etkileyenler Karboksilik hidrolazlar Gliserol-ester hidrolazlar

20 4 Günümüzde lipazlar hem sulu hem de susuz ortamda yapılması güç reaksiyonları ba aran en önemli biyokatalizörler arasında yer almaktadır. Bu, her eyden önce onların geni bir substrat spektrumunu kullanabilme, a ırı sıcaklıklara, ph ve organik çözücülere ve enantiyoselektiviteye kar ı kararlılık gösterebilme yetenekleri sayesinde olmaktadır. Mikrobiyal lipazlar, bitki ve hayvan kaynaklı lipazlara göre çok geni uygulama alanına sahiptir. Bunun sebebi, mikroorganizmaların kolay ve hızlı ço alabilmeleri ve ayrıca lipazlarının çe itli hidrolitik ve sentetik birçok reaksiyonu katalizleyebilmeleridir. Lipazlar, gıda ve süt ürünleri (peynir olgunla tırma, aroma geli tirme, EMC (enzyme modified cheese)) teknolojisi, deterjan, ilaç sanayisi (naproxen, ibuprofen), tarımla ilgili kimyasal madde (insektisit, pestisit), ve oleokimyasal (katı-sıvı ya hidrolizleri, biyolojik yüzey aktif madde sentezleri) endüstrileri gibi çe itli biyoteknolojik alanlarda kullanılmaktadır. Lipazlar, potansiyel biyokatalizör olarak kullanıldıkları daha birçok yeni alanda ba arıyla görev almaktadırlar (Sharma vd., 2001). Endüstriyel enzimler, çok çe itli proseslerde uygulanabilmelerinden dolayı özellikle mikrobiyal kökenli olanlar için gelen talep sürekli artmaktadır. Enzim ortamlı reaksiyonlar, alternatifleri olan yorucu ve pahalı kimyasal reaksiyonlardan daha caziptir. Son on yılda lipazlar, özellikle organik sentez alanında, proteazlar ve amilazlara oranla kesinlikle büyük bir önem kazanmı tır. Lipazların do al enantiyoselektivite ve regiyoselektivitesinden, kiral ilaçların çözümlenmesi, ya modifikasyonu, bitkisel ya yerine kullanılan maddelerin sentezi, biyolojik yakıtların sentezi, ki isel bakım ürünlerinin

21 5 sentezi ve aroma artırıcıların sentezi için yararlanılmaktadır. Bu nedenle lipazlar, günümüzde, organik kimyacıların, eczacıların, biyofizikçilerin, biyokimya ve proses mühendislerinin, biyoteknologların, mikrobiyolog ve biyokimyacıların enzim seçimidir. Lipazların do al substratları olan trigliseridler, suda çok dü ük çözünürlü e sahiptir. Do al artlar altında lipazlar, çözünmeyen bir substratlı faz ile enzimin çözünmedi i sıvı faz arasındaki arabirimde bulunan ester ba larının hidrolizini katalizler. Bazı deneysel artlar altında, örne in su yoklu unda, reaksiyonu tersine çevirebilmektedirler. Ters çevirme reaksiyonları, esterifikasyon ve ya asitleri ile gliserolden gliseridlerin olu masına yol açar. Substrat ve sıvı faz arasındaki bir arabirim üzerinde lipaz reaksiyonunun olu u, reaksiyonun kinetik analizi ve denemede zorluklara neden olur. Alı ılmı endüstriyel lipazlar, katı ve sıvı ya lar üzerine etki eden ve onların ba langıçta gliserid ve ya asitlerinin yerine konulan maddeler için hidrolize ederler ve son olarak gliserol ve ya asitlerinin toplam hidrolizlerini gerçekle tirirler. Do ada lipazlar, reaksiyonlarının özgüllüklerinde önemli ölçüde çe itlilik gösteren türlü kaynaktan elde edilebilmektedir. Bu özellik genellikle enzim özgüllü ü olarak ifade edilmektedir. Bu nedenle, ya asitlerinin bulundu u taraftan bazı lipazlar kısa zincirli ya asitlerine (asetik, bütirik, kaprik, kaproik, kaprilik vs.) afinite gösterirler; di er birçok lipazlar özgül de ilken ve ya asitlerini trigliseridlerden rastgele ayırırken bazıları ayrılmamı ya asitlerini (oleik, linoleik, linolenik vs.) tercih ederler. Lipazlar, trigliseridlerin gliserol taraflarından sıkça pozisyonel özgüllük gösterirler ve gliserolün 1 veya 3 pozisyonundaki

22 6 karbonu üzerinde bulunan ya asitlerine veya her iki pozisyonda ve ya asiti dı ında gliserol molekülünün 2 pozisyonundaki karbonuna etki eder. Bununla birlikte açil grubunun rastgele uzakla tırılması sayesinde, monogliserid olan 2 pozisyonundaki ya asidini gliserol molekülünün 1 veya 3 pozisyonundaki ya asidini iterek yeniden düzenlenir. Açil grubunun uzakla tırılması yava bir i lemdir ve mevcut lipazlar gliserolün 2-mono ya asit esterlerinin üzerine etki etmez, hidroliz yava lar ve gliseride 1 ve/veya 3 nolu pozisyondan lipazın etki etmesini kolayla tırmak için açil grubunun uzakla masının tamamlanmasını bekler. Lipazların en önemli özelliklerinden biri hidroliz tepkimelerini hidrofobik ara yüzeylerde yüksek bir etkinlikle yürütmesidir. Bu özellik ekil 2.2 de gösterilmi olup ilk defa Wilstaetter vd. (1923) tarafından belirtilmi, daha sonra da kanıtlanmı tır (Sarda vd., 1957). Mevcut ya miktarı, ara birimdeki lipaz aktivitesini belirler. Bu ara birim alanı, çalkalama gibi emülsifiye edicilerin kullanımıyla doygunluk sınırına kadar önemli ölçüde artırılabilir. Doygunluk sınırı, içeri i olu turan maddelerin fiziksel artlarının da ılımına ba lıdır. Bu nedenle emülsifiye edici ajanların kullanımıyla, lipazların aktiviteleri artırılabilir (Saxena vd. 2008).

23 7 ekil 2.2: Su-ya arabiriminde lipolitik reaksiyon (Saxena vd., 2008) Lipazlar ester ba larına etki etti i için, ya ların ayrı tırılmasında, interesterifikasyonda (transesterifikasyon), peynirde farklı aromaların geli tirilmesinde, köpek maması yapımı için biftek ya ının tadının de i tirilmesinde vs. kullanılmaktadır. Günümüz uygulamalarından biri, organik asit ve alkollerden farklı de erlerde eklenmi esterlerin sentezi için susuz organik çözücüler için lipazların kullanımını gerektirmektedir. Ara tırmalar, bitki, hayvan ve mikrobiyal lipazların bilhassa bakteriyel ve fungal lipazların üzerinde uygulanmaktadır. Her ne kadar pankreatik lipazlar alı ılageldi i gibi çe itli maksatlar için kullanılsa da, günümüzde mikrobiyal lipazların çok yönlü özellikleri, kolay nesil vermeleri ve sınırsız gereçlerin olmasından dolayı ticari uygulamalarda tercih edildikleri kabul edilmektedir.

24 Bakteriyel lipazlar Bakteriyel lipazların bir kısmı glikoprotein, bir kısım hücre dı ı bakteriyel lipazlar da lipoprotein yapısındadırlar. Winkler vd., (1979) ço u bakteride enzim üretiminin bazı polisakkaritler tarafından etkilendi ini bildirmi tir. imdiye kadar çalı ılan bakteriyel lipazların büyük bir kısmının basit yapılı, substratlarına kar ı spesifik olmayan ve ancak çok azının sıcaklı a kar ı kararlı oldukları bildirilmi tir (Saxena vd., 2003). Bakteriyel lipaz üretiminde, Achromobacter sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., ve Chromobacterium sp. gibi mikroorganizmalardan faydalanılmaktadır (Saxena vd., 2003). Stafilolokokkal lipazlar do ada lipoprotein yapısında bulunurlar. S. aureus ve S. hyicus tan safla tırılan lipazlar yakla ık olarak kda a ırlı ındadırlar. Bu lipazlar, Ca +2 iyonu tarafından uyarılır ve EDTA tarafından inhibe edilirler. Optimum ph 7,5-9,0 arasında de i ir. S. hyicus ve S. aureus un lipaz genleri klonlanmı, sekans analizleri yapılmı ve di er lipazlarla kar ıla tırılmı tır. Farklı Pseudomonas türlerinden elde edilen lipazlar, süpernatant kültüründen asidifikasyonla, amonyum sülfat çöktürmesiyle, sefaroz CL- 6B kromatografisiyle ve CHAPS kullanılarak izoelektrik odaklama ile safla tırılmı tır. P.fragi, P. fluorescens ve P. Aeruginosa den elde edilen lipazlar sırasıyla 33 kda, 45 kda ve 29 kda a ırlı ında olup monomerik yapıdadırlar. Lipazlar, Zn +2, Fe +2 ve Al +3 iyonları tarafından aktive edilir

25 9 ve Ca +2 iyonu tarafından inhibe edilir. P. fragi nin lipaz geni klonlanmı ve sekans analizi yapılmı tır. (Saxena vd., 2003). Ertu rul ve arkada ları (2007) zeytin karasuyunda büyüyebilen ve lipaz üretebilen Bacillus türlerini taramı lar ve lipaz aktivitesi üzerine ph, sıcaklık ve ortam bile enleri gibi birçok parametrenin etkilerini incelemi lerdir Fungal lipazlar Fungal lipazlar üzerinde 1950 lerden beri çalı ılmaktadır. Bu lipazlar, dü ük maliyetli ekstraksiyonları, ısıya ve ph a kar ı dayanıklı olmaları, substrat özgüllü ü ve organik çözücülerdeki aktivitelerinden dolayı tercih edilmekte ve geni bir alanda kullanılmaktadırlar. Ticari lipazların büyük bir kısmı Aspergillus niger, Candida cylindracea, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus ve R. oryzae türlerinden üretilmektedir. Rhizopus un 1,3-(regio)-spesifikli inden dolayı, özellikle trigliseridlerin monogliseridlerine dönü ümü ve katı ve sıvı ya ların interesterifikasyon reaksiyonları için çok uygun olmasından dolayı lipazlar, özellikle gıda ve farmasötik uygulamalarda çok sıklıkla kullanılmaktadırlar. Çe itli Rhizopus türlerinin lipazları (40 tan 45 kda ya kadar olanlar) orta zincirli ya asitlerine kar ı maksimum aktivite gösterir.

26 10 Yapılan bir çalı mada R. delemar ın hücre dı ı ve hücre içi lipaz enzimleri izole edilebilmi tir (Saxena, 2008). Entomophthorales cinsleri içinde lipaz üreticileri olarak Entomophthora apiculata, E. coronata, E. thaxteriana, E. virulenta, Basidiobolus spp. ve Conidiobolus spp. sıralanabilir. Pichia, Hansenula ve Saccharomyces türlerinin de lipaz ürettikleri bildirilmi tir. Saccharomyces lipolytica dan iki çe it hücre ba layıcı lipaz safla tırılmı tır. Candida curvata, C. tropicalis, C. valida ve C. pelliculosa dan elde edilen lipazların, C. deformans ın hariç olmasıyla birlikte, trigliseridlerdeki farklı ester ba larına kar ı spesifik olmadıkları bildirilmi tir. Geotrichum candidum, ya ın hidroliziyle süt ürünlerinde asit olu umundan sorumludur. G. candidum lipazı, ya asitlerine kar ı 9. karbonda bir cis çift ba ı olu turma özelli ine sahiptir, bundan dolayı trigliseridlerin yapısal analizleri için kullanılmaktadır. Aspergillus niger in hücreler içi ve hücre dı ı lipazları 1,3- (regiyo)-spesifiktirler. A. oryzae nin, Rhizopus miehei ve Humicola lanuginosa lipazlarının heterolog durumlarında oldukça iyi bir konakçı oldu u bildirilmi tir. Penicillium roqueforti nin lipazı, mavi peynirin aromasını vermekten sorumludur. Brie ve Camembert peynirlerinin beyaz yüzlü küflü taraflarından, P.camemberti de de lipolitik aktivite varlı ı belirlenmi tir. Bütirik asit için özgüllük gösteren lipazlar, Penicillium cyclopium, P. verrucosum var. cyclopium ve P.crustosum

27 11 gibi Penicillium türlerinden izole edilmektedir. P. cyclopium lipazı, di ve monogliseridlere kar ı trigliseridlerden daha yüksek aktiviteye sahiptirler. H. lanuginosa DSM 3819 un lipazı, ısıya dayanıklılı ı, bazik ph da yüksek aktivitesi ve anyonik yüzey aktif maddelere kar ı dayanıklılı ı sayesinde bir deterjan katkı maddesi olarak kullanılmaya uygun oldu u bildirilmi tir Lipaz Üretimi Lipazlar bitkisel kaynaklardan, hayvansal dokulardan ve mikroorganizmalardan elde edilir. Hayvansal lipazlar, doku ve vücut sıvılarının ço unda; bitkisel lipazlar, bitkilerde katman doku, kabuk ve köklerde bulunurlar. Lipazlar, pek çok mikroorganizma türlerinin bünyelerinde do al olarak bulunur. Lipazlar elde edildikleri kaynaklar göz önüne alınarak u ekilde sınıflandırılabilirler: 1) Hayvansal lipazlar a) Sindirim sistemi lipazları (Pankreas lipazı vb.) b) Doku lipazları (Karaci er lipazı vb.) c) Süt lipazları 2) Bitkisel lipazlar (Gene otu lipazı, çörek otu lipazı vb.) 3) Mikroorganizma lipazları Lipitler suda çözünmezler ve e er hücre için nutrient olarak i lev görecekse, emilimi kolayla tırmak için daha polar parçalarına hücre

28 12 dı ında yıkılmaları gerekmektedir. Bu yüzden, lipazların ço u hücre dı ına salgılanırlar. Sıcaklık, ph, azot, karbon ve lipit kaynakları, çalkalama ve çözünmü oksijen konsantrasyonu gibi çe itli çevresel faktörlerin lipaz üretiminde etkili oldukları bilinmektedir. Lipaz üretimi genellikle lipitler tarafından indüklenmektedir. Lipaz aktivitesi sürekli olarak bir pik yapıncaya kadar artar ve azalır. Lipaz üretimi genellikle ortamda bulunan trigliseridlerin varlı ına ba lıdır. Serbest ya asitleri, hidrolizlenebilen esterler, safra tuzları ve gliserol de lipaz üretiminde indükleyici olarak görev yapabilen di er maddelerdir. Trigliserid, hem bir indükleyici hem de bir inhibitör olarak etki edebildi i için lipaz üretiminde önemlidir. Bir trigliserid olan zeytinya ının lipaz indüklenmesinde etkin oldu u gözlenmi tir. P. fragi tarafından yapılan lipaz üretimini doymamı ya asitlerinin tuzları inhibe etmektedir; halbuki tribütirin ve trioktanoin P. fragi ve M. freudenreichii tarafından yapılan lipaz üretimi üzerine hiç etki göstermemektedir. Tereya ı, mısır ya ı veya zeytinya ı, P. roqueforti, Saccharomycopsis sp., B. licheniformis, M. caseolyticus ve Staphylococcus sp. tarafından yapılan lipaz üretimini inhibe etmektedir. Zeytinya ı, yer fıstı ı ya ı, pamuk tohumu ya ı gibi trigliseridler ve oleik, linoleik ve linolenik asit gibi ya asitleri P. mephitica tarafından yapılan lipaz üretimini stimüle etmektedir.

29 13 Lipaz üretimi için kültür ortamının ba langıç ph ı daima önemlidir. P. fragi için maksimum aktivitenin ph > 7,0 ve P. aeruginosa için ise ph 9,0 da oldu u belirtilmi tir (Saxena, 2003). Bunun aksine, S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans, Mucor racemosus, R. oligosporus ve P. aeruginosa EF2 için maksimum lipaz aktivitesinin asidik ph da (4,0-7,0) oldu u bildirilmi tir. P. fluorescens ve P. fragi tarafından yapılan lipaz üretiminde sıcaklı ın 8 o C derecenin üstüne çıkarılmasının baskılayıcı bir etki yaptı ı gözlenmi tir. Bununla birlikte, P. fluorescens tarafından yapılan lipaz üretiminin 20 o C derecede ani inaktivasyonu, gizli proteinazlar tarafından e zamanlı bir ekilde potansiyel olarak bakteriyel lipazları inaktive edebildiklerini ve bu etkinin daha yüksek sıcaklıklardaki (30-40 o C ) kültür ortamlarında daha fazla oldu unu göstermektedir Lipaz aktivite tayini Lipazlar, trigliseridlerin hidroliziyle serbest ya asitleri ve gliserolların olu umuna yol açmalarıyla bilinmektedirler. Bu yüzden, deney metotları spektrofotometrik veya titrimetrik yöntemleri, florimetri yüzey gerilim metodu ve HPLC yöntemiyle serbest ya asitlerinin tahminini içermektedir. Spektrofotometrik ve titrimetrik yöntemler lipaz ile ilgili çalı malarda lipaz aktivitesini takip edebilmek için en çok kullanılan yöntemlerdir.

30 Lipazların safla tırılması Lipazlar, amonyum sülfat çöktürmesi, jel filtrasyonu ve iyon de i tirme kromatografisi yöntemlerini içeren çe itli metotlarla safla tırılmaktadır. Son zamanlarda, özelikle safla tırma basamaklarını dü ürdü ü için afinite kromatografi teknikleri oldukça sık kullanılmaya ba lanmı tır. Genellikle, ters miseller ve 2 fazlı sistemler, membran prosesleri lipazların safla tırılmasında kullanılan metotlardır Lipazların özellikleri Ara tırılan lipazlar, ph 4 e kadar asidik ve ph 8 e kadar bazik ortamlarda dayanıklı olmalarıyla birlikte, en fazla stabiliteyi ph 6,0-7,5 arasında göstermektedir. A. niger, Chromobacterium viscosum ve Rhizopus türlerinin hücre dı ı lipazları asidik ph da aktiftir. P. nitroreducens ten izole edilen lipaz ise ph 11,0 de aktivite göstermektedir Optimal sıcaklık ve termal denge Pankreatik lipazlar stok halindeyken 40 o C sıcaklı ın üzerinde dü ük aktivite gösterirler, fakat bazı mikrobiyal lipazlar sıcaklık inaktivasyonuna daha dayanıklıdırlar. A. niger, R. japonicus ve C. viscosum lipazları 50 o C de dayanıklı oldu u halde, H. lanuginosa ve P. sp. nitroreducens in termotolerant lipazları ise sırasıyla 60 o C ve 70 o C

31 15 sıcaklı a dayanıklıdır. Bazı mikroorganizmalardan elde edilmi lipazların özellikleri Çizelge 2.1 de gösterilmi tir. Çizelge 2.1: Mikrobiyal lipazların özellikleri Organizma Pseudomanas sp. Spesifikli i Molekül a ırlı ı (kda) zoelektrik nokta Optimum ph Optimum sıcaklık ( o C) Spesifik aktivite (U/mg) Regio P.fluorescens Regio Candida cylindracea Aspergillus niger Yok Regio Mucor miehei Regio Penicillium cyclopium Rhizopus arrhizus Rhizopus delemar Yok Regio Regio Uygulamalar Günümüz endüstrisinde, lipazların spesifikliklerine ba lı olarak hem sulu hem de organik sistemlerde çe itli reaksiyonlardaki gereksinimleri dolayısıyla birçok sektörde kullanım alanı bulunmaktadır. Kullanım alanları Çizelge 2.2 de özetlenmi tir.

32 16 Çizelge 2.2: Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamalardaki önemli alanları Sektör Etki Ürün Ekmekçilik Tatlandırma ve raf ömrü uzatımında Unlu mamuller Me rubat Aroma Me rubatlar Kimyasal Enantioseçicilik Kiral yapılar ve kimyasallar Temizleme Sentez ve hidroliz Kimyasallar, surfaktanlar gibi temizleme ajanlarının uzakla tırılması Kozmetik Sentez Emülsifiyerler, nemlendiriciler Süt Katı ve sıvı ya lar Sütteki ya ın hidrolizi, peynir olgunla tırılması, tereya ının modifikasyonu Transesterifikasyon hidroliz Tatlandırıcı, peynir, tereya ı Kakao ya ı, margarin ya asitleri, gliserin, mono ve digliseridler Gıda süsleme Kalite artırma Mayonez, süsleme Dericilik Hidroliz Deri i leme Et ve balık Tat geli tirme ve ya uzakla tırılması Et ve balık ürünleri Ka ıt Hidroliz Ka ıt ürünleri Sa lıklı gıda Transesterifikasyon Sa lıklı gıda ürünleri Süt ürünleri endüstrisinde lipazlar Lipazlar, süt ya ının hidrolizi için süt ürünleri endüstrisinde geni surette kullanılmaktadır. Günümüz uygulamaları, peynir aromasının artırılması, peynir olgunla masının hızlandırılması, peynir benzeri ürünlerin imalatı ve kaymak hidrolizi i lemlerini içermektedir. Lipazların ilavesi öncelikle kısa zincirli (C 4 ve C 6 ) ya asitlerinin

33 17 uzakla tırılmasıyla keskin ve ho aromanın geli mesine yol açar; orta zincirli (C 12 ve C 14 ) ya asitlerinin uzakla tırılması ise üründe sabunumsu bir tat olu umuna yol açmaktadır. Katkı içeri inde, serbest ya asitleri, aseto asetat, -keto asitleri, metil ketonları, aroma asitleri ve laktonlar gibi di er aroma içeriklerinin sentezini ba latan basit kimyasal reaksiyonların yerini almaktadır. Mucor miehei, Aspergillus niger ve A. oryzae gibi tamamen bir dizi mikrobiyal lipazlardan hazırlanmı preparatlar peynir imalatı endüstrisi için geli tirilmi tir. Birçok kaliteli peynir sadece mikrobiyal lipazların veya çe itli preparatlarının karı ımlarının kullanıldı ı proseslerde üretilmi tir (Saxena vd., 2008) Deterjanlarda lipazlar Temizlik malzemelerinde enzimlerin kullanımı hala endüstriyel enzimler için tek büyük pazar olmayı sürdürmektedir. Dünya çapında, evlerde kullanılan deterjan formülasyonu için daha dü ük çama ır yıkama sıcaklıklarına yönelme, taleplerin oldukça artmasına sebep olmu tur. (Saxena vd., 2008) Oleokimyasal endüstrisinde lipazlar Lipazların oleokimyasal endüstrideki kullanımı, hidroliz, gliseroliz ve alkoliz reaksiyonları sırasında termal bozunmayı minimize etti i ve ayrıca enerji tasarrufundan dolayı oldukça büyüktür. Japon

34 18 Miyoshi ya irketi, sabun üretiminde Candida cylindracea lipazının ticari bir ekilde kullanıldı ını bildirmi tir. Yeni nesil ucuz ve sıcaklı a daha dayanıklı enzimlerin piyasaya sürülmesi ile lipaz kullanımının artaca ı dü ünülmektedir. Oleokimyasal endüstrisinde bugünkü e ilim, organik çözücüler ve emülsifiyerlerin kullanımından uzakla ma yönündedir. Hidroliz, alkoliz ve gliseroliz reaksiyonlarını içeren çe itli reaksiyonlar, do rudan karı ık substratlar üzerinde bir dizi immobilize olmu lipazların kullanımıyla gerçekle tirilmektedir. Bunun sonucu olarak da proses sürekli i ledi i için yüksek verim elde edilmektedir. Enzimatik hidrolizlerin önümüzdeki zaman içerisinde, fazla miktarda enerji ve pahalı ekipman olmaksızın, ya ayrı tırma i lemlerinde ba arılı bir ekilde kullanılaca ı tahmin edilmektedir (Saxena vd., 2008) Ya sentezinde lipazlar Ya ların ticari de eri, yapılarındaki ya asitlerinin düzenleni ine ba lıdır. Bitkisel ya, çok kıymetli asimetrik trigliserid karı ımına tipik bir örnektir. Unilever ve Fuji ya irketleri, bitkisel ya yerine kullanılan maddelerin imalatı için 1,3-regiyospesifik lipazların potansiyellerini açıkça belirtmi tir. Ürün düzenleni inin analizinin de yer aldı ı bu teknoloji üzerinde kapsamlı görü ler mevcuttur. Monogliserid fraksiyonlarını içeren çoklu doymamı ya asitlerindeki mevcut zenginlik, lipazların katalizledi i alkoliz veya hidroliz i lemleriyle ba arılmaktadır.

35 Yüzey aktif maddelerin sentezinde lipazlar Poligliserol ve karbonhidrat ya asitleri esterleri, endüstriyel deterjanlarda ve çok çe itli gıda formülasyonlarında emülsifiye edici maddeler olarak geni ölçüde kullanılmaktadır. Fonksiyonel olarak yüzey aktif maddelere benzeyen enzimatik sentezler, oldukça iyi regiyoselektivite ile ºC sıcaklıklarda gerçekle tirilmektedir. Adelhorst ve arkada ları (1990) tarafından çözücü olmaksızın erimi ya asitleri ve immobilize Candida artarctica lipazını kullanarak basit alkilglikozidlerin esterfikasyonu gerçekle tirilmi tir. Fregapane ve arkada ları ise (1991), ba langıç materyali olarak eker asetallerinin kullanımıyla monosakkaritlerin mono ve diesterlerinden yüksek kazanç elde etmi tir. A. terreus lipazı, do al ya larla eker alkolleri arasında gerçekle tirdi i transesterifikasyon reaksiyonuyla biyolojik bir yüzey aktif madde sentezlemektedir. Lipazlar ayrıca lizofosfolipidlerin üretiminde fosfolipazların yerine geçebilirler. Mucor miehei lipazı bir dizi primer ve sekonder alkollerin içerisinde fosfolipidin transesterifikasyonu için kullanılmaktadır. Lipazlar ayrıca, aminoasit bazlı esterler ve amidler olarak adlandırılan bütün bir dizi biyolojik parçalama yapan amfoterik yüzey aktif maddelerin sentezinde de kullanılmaktadır.

36 Ki isel bakım ürünleri içeri ini olu turan maddelerin sentezinde lipazlar Geçti imiz günlerde Unichem Uluslararası irketi cilt ve güne yanı ı kremleri ve banyo losyonları gibi ki isel bakım ürünlerinden cilt yumu atıcı olarak kullanmak için isopropil miristat, isopropil palmitat ve 2-etilhekzil palmitat üretimine ba lamı tır. Balmumu esterleri de ki isel bakım ürünlerinde benzer uygulamaya sahiptir ve kesikli bir biyoreaktör içerisinde C. cylindracea lipazının kullanımıyla enzimatik yolla imal edilmektedir (Saxena vd., 2008) laç sanayisinde ve tarım kimyasallarında (agrokimyasallar) lipazlar Kiral ilaçların hazırlanmasında lipazların kullanımı oldukça iyi bilinmektedir ve ispat edilmi tir. Bu konuyla ilgili birçok proses ticarile tirilmi tir. Fenoksipropiyonat herbisitlerin sentezi için ba langıç materyalleri olan 2-halopropiyonik asitlerin çözümlenmesi (S)- izomerlerinin bütanolle, domuz pankreatik lipazının anhidröz hekzan içerisinde katalizlenen selektif esterifikasyonuna dayalı bir i lemdir. Lipazların, bazı prostaglandinlerin, steroidlerin ve karboksilik nükleosit analoglarının hazırlanmasında rasemik alkollerin çözümlenmesi için endüstriyel katalizörler olarak bir takım uygulamalara sahiptir. Çok fonksiyonlu organik bile iklerin regiyoselektif modifikasyonu, özellikle AIDS tedavisi alanında, lipaz uygulamasının yine hızla geni leyen di er

37 21 bir alanıdır. Lipazlar ayrıca oktaasetil sukrozun regiyoselektif hidrolizi ile yapay tatlandırıcı olan sukralozun sentezinde de kullanılmaktadır Polimer sentezlerinde lipazlar Optikçe aktif polimerlerin sentezi için lipazların stereoselektivitesi kullanılmaktadır. Bu polimerler asimetrik ayıraçlardır ve absorbent olarak kullanılmaktadır. Sıvı kristaller alanında, uygun monomerler alkollerin lipazlar tarafından katalizlenen transesterifikasyonu ile hazırlanabilir. Ayrıca ferroelektrik likit kristallerin hazırlanması için kiral glisidil tosilatların kullanıldı ı belirtilmektedir (Saxena vd., 2008). Lipazlar, pahalı kimyasalların ve farmasötiklerin yüksek teknolojik üretimlerinde oldu u kadar gıda endüstrisinde de ba arılı bir ekilde görev almaktadır. Üstelik, bu enzimin daha yeni alanlarda potansiyelleri mevcuttur, örne in ka ıt imalatında lipazlar ba arılı bir ekilde kullanılmaktadır; burada ka ıt hamurunun lipaz ile muamele edilmesi daha yüksek kalitede ürün olu umuna ve azaltılmı temizleme ihtiyacına yol açtı ı sanılmaktadır (Saxena vd., 2008) Biyodizel Ça ımızda yeni veya yenilenebilir enerji kaynaklarının çe itlili i artmakta, bir kısmı ekonomik alternatiflik açısından de er kazanmakta, bir kısmı üzerinde ekonomik analizler yapılmakta ve her gün ba ka enerji

38 22 kaynakları ortaya çıkmaktadır. Bu kaynakların neredeyse tamamının ortak yönü çevreye kısa ve uzun vadede olumsuz etki olu turmamasıdır. Biyodizel yakıtlar bu kapsamda en yeniler arasındadır yılında pazar piyasasına sunulan biyodizel enerji kayna ı önemli bir sektör olu turma a amasında çok hızlı bir potansiyel kazanmaktadır. Bunun nedenleri; Dizel yakıt yerine do rudan kullanılabilmesi Dizele yakın bir yakıt verimi olması Hayvansal ve bitkisel ya lardan elde edilebilir olması Enerji tarımı için i gücü ve ekonomik sektör olu turması, Çevreci olması vs... Petrol rezervlerinin kritik boyuta ula ması, çalı maları ister istemez yeni enerji kaynakları yönüne çevirmi tir. Bu çerçeve içerisinde alkil esterlere yani biyodizele olan ilgi de artmı ve bu konuda birçok yeni ara tırmalar yapılmı tır. Biyodizel, toksik olmayan, biyobozulur ve yenilenebilir bir enerji kayna ıdır. Ayrıca, egzoz emisyonu ve CO, CO 2, SO x gibi sera etkisi yaratan gazların dü ük oranda olması di er avantajları arasındadır. Alkil esterlerin konvansiyonel sentezi, kimyasal transesterifikasyonla kısa sürelerde ve yüksek verimle elde edilmesine ra men, ortamda su bulunması durumunda kullanılan substratın önceden i lenmesini gerektirmektedir. Katalizörün ve reaksiyon sonrası açı a çıkan gliserinin geri kazanımı ve ayrıca yüksek enerji gereksinimi, asit ya da alkali katalizli proseslerdeki mevcut dezavantajlardır. Biyodizelin

39 23 petrol kökenli yakıtların yerine kullanılabilirli i, biyolojik yollarla biyodizel üretimi çalı malarının artmasına neden olmu tur. (Shimada vd. 1999; Samukawa vd. 2000; Matsumoto vd. 2001; Ban vd. 2001) Lipaz enziminin biyodizel üretimindeki önemi Biyodizel yüksek oranlarda elde edilmesine ra men, yüksek fiyatından dolayı kullanımı sınırlı kalmaktadır. Biyodizel fiyatını a a ılara çekmek ve kullanımını artırmak için, dü ük maliyetli veya atık sayılan substratların biyodizel üretiminde kullanımı üphesiz iyi bir alternatif olabilir. Özellikle enzimatik yolla biyodizel üretimi hem di er konvansiyonel üretimdeki a ır proses artlarını hafifletecek, hem de üretilen biyodizelin ve gliserin gibi yan ürün olarak açı a çıkan maddelerin kalitesini artıracaktır. Lipazlar çift yönlü kataliz özelli ine sahip olan ve organik çözücülerin varlı ında ve de yoklu unda reaksiyonu gerçekle tirebilen enzimlerdir. Literatürde lipaz katalizli, ayçiçe inden, soya ya ından, karı ık bitkisel ya lardan, gres ve donya ından ve çe itli lokal ya lardan biyodizel çalı maları mevcuttur. (Mittelbach 1990; Kaieda 1999; Watanabe 2000; Nelson vd. 1996; Abigor vd. 2000; Kamini ve Lefuji 2001) Son yıllarda biyodizel üretiminde kullanılabilecek enzim katalizörlerinden, do al substratı ya lar olan lipazlar yaygın bir ekilde ara tırılmaktadır. Lipazlar canlı organizmalarda lipitleri tersinir olarak

40 24 hidrolizini katalize eden enzimlerdir. Susuz ortamda hidrolizin tersi sentez reaksiyonlarını katalizler. Ya ların lipaz aracılıklı alkolitik transesterifikasyonları ekil 2.3 te gösterilmi tir (Web1). ekil 2.3: Ya ların ve serbest ya asitlerinin alkali esterlerine lipaz aracılıklı alkolitik transesterifikasyonları. (Lipase Alcoholysis of Triglycerides to Produce Tallodiesel as a Transport Fuel, 2006) Transesterifikasyonla biyodizel üretiminde lipaz kullanımı birçok avantaj sa lar. Bunlar: mmobilize enzimin tekrar kullanılabilirli i ve rejenerasyonu. Enzimlerin reaktörde yüksek konsantrasyonlarda kullanımını mümkün kılar ki bu da enzimin daha uzun süreli aktif kalmasını sa lar.

41 25 Enzimin daha büyük termal kararlılı a sahip olması Lipazın immobilizasyonu ile reaksiyonda kullanılabilecek olan solventlerden korunması ve tüm enzim partiküllerinin bir araya gelmesinin önlenmesi sa lanmı olur. Ürünün ayrılma i leminin daha kolay olması. Ancak bunların yanı sıra bazı dezavantajları da vardır. Bunlar ise: Ya moleküllerinin hacminden dolayı lipaz ba langıç aktivitesinde olabilecek kayıplar. Destek enzim sayısının uniform olmaması. Lipazın pahalı olması eklindedir. Literatürde enzimatik biyodizel üretimi ile özellikle, optimum artları belirlemeye yönelik bir çok çalı ma mevcuttur. Protein ve genetik mühendisli i teknikleriyle, üphesiz enzim veya tüm hücrenin biyodizel üretiminde kullanım etkinli i ve stabilitesi artırılabilir. Luo ve arkada ları (2006) yaptıkları bir çalı mada enzimatik biyodizel üretiminin 20 ºC gibi dü ük sıcaklıkta olabilece ini rapor etmi lerdir. Çalı malarında, Pseudomanas fluorescens lipaz genini E. coli ye klonlamı lar, substrat olarak soya ya ı ve metanol kullanmı lardır. Bir ba ka çalı mada ise Burkholderia cepacia lipaz geni klonlanmı ve elde edilen rekombinant enzim; Aspergillus niger,

42 26 Candida rugosa, P. Fluorescens ve Rhizopus oryzae lipazları ile kıyaslanmı tır (Yang, 2007). Bir di er proses geli imi de enzimin özellikle endüstriyel uygulamalar için immobilize formda kullanılmasına dayanmaktadır. Bunun için, fiziksel adsorpsiyon, katı bir deste e kovalent ba lama ve polimer matriks içinde tutuklama gibi genel immobilizasyon yöntemleri en çok kullanılan metotlar olmu tur. Örne in, Ya ız ve arkada ları (2007) atık kızartma ya larından Lipozyme-TL IM enzimiyle biyodizel üretiminde immobilizasyon desteklerinin ve metil ester veriminin etkilerini incelemi lerdir. Çalı malarında, hidrokalsit ve dört farklı zeolit destek maddelerini kullanmı lar ve hidrokalsitin zeolite göre çok daha etkili oldu unu rapor etmi lerdir. Ghamgui ve arkada ları (2004) ise, ham R.oryzae lipazını silika jel 60, Amberlit IRC-50, Karboksi Metil Sefadeks, Celite 545 ve CaCO 3 gibi be farklı malzemedeki immobilizasyonunu incelemi ; katalitik aktiviteyi koruma, lipazın termal kararlılı ı ve maksimum adsorpsiyon kapasitesi gibi kriterlerde CaCO 3 ın en iyi adsorbent oldu unu bildirmi lerdir. mmobilize lipazların ayrıca proseslerde tekrar kullanılabilirli i ve kararlılıkları çalı ılmı ve oldukça iyi sonuçlar elde edilmi tir (Noureddini, 2005). Yapılan bir çalı mada her 1 saatlik transesterifikasyondan sonra, immobilize lipaz filtrasyonla geri kazanılmı ve bir sonraki adım için tekrar kullanılmı tır. Bu prosedür

43 27 birçok kere tekrarlanmı ve immobilize enziminin ne kadar süreyle kararlılı ını korudu u ara tırılmı tır. Ban ve arkada larının yaptı ı bir çalı mada, R. oryaze poliüretan destek maddesi üzerinde tutuklanmı ve biyodizelin üretimi saf enzimle de il tüm hücre ile üretimi ara tırılmı tır. (Ban ve arkada ları, 2002). Aynı çalı mada kübik destek maddesi üzerinde tutuklanan mikroorganizma glutaraldehit ile muamele edilmi ve her iki ekilde yapılan üretimin de endüstriyel biyodizel üretimi için gelecek vaat edebilece i belirtilmi tir. Enzimatik biyodizel üretimi konusunda literatürde daha birçok çalı ma mevcuttur. Ancak bu çalı manın konusu biyodizel üretiminden ziyade; biyodizel üretimini daha ılımlı hale getiren enzimatik yöntemdeki lipaz enziminin üretimini kapsamaktadır. Günümüz itibariyle pahalı olan enzimatik biyodizel üretimi için daha ekonomik madde temini; özelikle bu maddelerin eldesinde atıklardan faydalanması bu konuda yapılan veya yapılacak çalı maları çok daha cazip hale getirmektedir. Dolayısıyla, atıkların böyle bir sektöre yönelik çalı malarla de erlendirilmesi bu çalı manın çıkı noktası olmu tur Biyoproseslerde optimizasyon (Response surface methodology, RSM) RSM, temel olarak, farklı de i kenlerin sistem üzerine etkilerini belirlemek için matematiksel ve istatistiksel tekniklerin bir arada kullanıldı ı bir metoda dayanmaktadır. Son yıllarda özellikle biyoteknolojik proseslerin optimizasyonunda sıkça kullanılan bir

44 28 metottur. Birçok proseste oldu u gibi, lipaz üretimini etkileyen birçok parametre vardır. Klasik optimizasyon yöntemi ile, her bir parametrenin sistem üzerine etkileri birer birer incelenebilir; ancak iki, üç ve hatta daha fazla parametrenin etkile imlerinin de sistemi etkileme ihtimali, özellikle biyolojik üretimlerde, her zaman vardır. Bu anlamda RSM, klasik yöntemde çok uzun çalı ma sürelerini ve etkile imlerini, matematiksel ve istatistiksel yakla ımlarla çözen bir metottur. Ampirik modeller ve istatistiksel analizler, çok kompleks sistemlerdeki (biyolojik proseslerde oldu u gibi) temel veya daha basit mekanizmaları ortaya çıkarmakta büyük önem ta ır; böylelikle prosesin kontrolünde ve daha iyi anla ılmasında kolaylıklar sa lamı olur. Birçok RSM probleminde, prosesteki cevapla (ba ımlı de i ken), ba ımsız de i kenler arasındaki ili ki bilinmemektedir. Bundan dolayı, RSM de yapılması gereken ilk adım, prosesi ba ımsız de i kenlerin bir fonksiyonu (f) olarak ifade edebilmek veya en azından bir yakla ımı ortaya koyabilmektir. E er cevap, ba ımsız de i kene lineer bir fonksiyonla ilgiliyse, yakla ım fonksiyonu da birinci dereceden bir modeldir; sistemde veya incelenen optimum bölgede bir e ilme, kavislenme varsa cevap fonksiyonunda, daha yüksek dereceli bir polinom; mesela ikinci dereceden bir yakla ım kullanılmalıdır. Dolayısıyla, RSM nin temel amacı, incelenen sisteme ait optimum i letme artlarının veya i letim spesifikasyonlarını kar ılayacak bir çalı ma aralı ının belirlenmesidir. Bu durumda klasik yöntemlerle elde edilen bazı sonuçlar, RSM için bir ba langıç noktası olabilir.

45 Zeytin karasuyu Zeytinya ı üretimi, bilinen en eski endüstriyel aktivitelerden biridir. Üretimde kesikli ve sürekli olmak üzere iki yöntem mevcuttur. Kesikli üretim, geleneksel yöntem olup, presleme esasına dayanır. Sürekli üretimde ise, ya ın santrifüjlenerek çıkarılması esastır. Klasik yöntemde 1 ton zeytin için 0,4-0,5 m 3 karasu üretilirken, sürekli yöntemde bu de er 1,0-1,5 m 3 olmaktadır. Üretim, hiçbir kimyasal madde kullanılmaması ve büyük miktarlarda enerjiye ihtiyaç duyulmaması nedeniyle, çevre dostu olarak görülse de, üretim sonrasında karasu ve pirinanın atık olarak ortaya çıkması kaçınılmazdır. Ancak kullanılan üretim prosesine ba lı olarak bu atıkların miktarları ve özellikleri farklılık göstermektedir. Sanayi, zeytin hammaddesine ba lı olarak çalı tı ı için zeytin üretiminin o yıl az veya çok olu una ba lı olarak atık su kirlilik karakteristikleri farklılıklar göstermektedir. (Kavaklı, M., 2002) Zeytinya ı, zeytinler yıkanıp ezildikten sonra olu an zeytin hamurundan (pulpundan) üç yöntemle üretilir: 1. Geleneksel yöntem (sulu pres). Di er adı: Kesikli pres, kesikli i lem, pres. 2. Sürekli, kontinü yöntem (santrifüj). Di er bir adı: Sürekli katı-sıvı santrifüjü. 3. Süper pres (kuru pres).

46 30 Geleneksel yöntem: Zeytinler torbalara doldurulurarak üzerlerine bir presle basınç uygulanır. Geriye kalan katı posa olan prina kalır. Sıvı kısım ise zeytin meyvesinin özsularını, zeytinya ını ve zeytin pulpuna su ilave edilmi se bu suyu içerir. Bu yöntem ülkemizde en sık kullanılan metottur. Sürekli, kontinü yöntem: Bu i lemde zeytinler sürekli çalı tırılan bir santrifüje beslenir. Ayırım, birbirine karı mayan katı ve sıvı maddelerin özgül a ırlıklarındaki farka dayanır. Üç faz ve iki dual faz olmak üzere iki çe idi bulunmaktadır. Ancak, genellikle üç faz kullanılmaktadır. Karasuyun bile imi, operasyon ko ullarına ba lı olarak de i mektedir. Örne in santrifüj kapasitesi fazla zorlandı ında normalde ya da kalacak olan bazı maddeler karasuya geçebilmektedir. Süper pres: Birinci yönteme çok benzemekle beraber, burada daha yüksek basınçlar uygulanmaktadır. Bazı kaynaklarda ikisine birlikte klasik veya hatta geleneksel yöntem de denilmektedir. Üst üste kullanılan torba adedi, pulp kalınlı ı vs. karasu kompozisyonun etkilemektedir. Zeytinya ı üretiminde kullanılan bu üç yöntemin akım eması ekil 2.4 te, presleme ve üç fazlı sistemden gelen zeytinya ı atık sularının özellikleri ise Çizelge 2.3 te gösterilmi tir. (Yetkin, F., Gökçay, F. C., 2002)

47 31 ekil 2.4: Zeytinya ı üretiminde kullanılan proseslerin akım eması ( engül, F., Oktav, E., Çokay Çatalkaya, E., 2002) Çizelge 2.3: Presleme ve üç fazlı sistemden gelen zeytinya ı atık sularının özellikleri. PARAMETRE PRES YÖNTEM 3FAZ YÖNTEM Toplam katılar (g/l) 99,70 +/- 28,85 63,5 +/- 24,4 Toplam askıda katı madde (g/l) 4,51 +/- 3,27 2,8 +/- 2,2 Uçucu katılar (g/l) 87,20 +/- 27,57 57,37 +/-21,96 Kül (g/l) 9,69 +/- 2,58 6,13 +/- 2,44 Toplam organik karbon (g/l) 64,11 +/- 10,79 39,82 +/- 6,47 Toplam Kjeldahl azotu (g/l) 1,15 +/- 0,21 0,76 +/- 0,13 P 2 O 5 olarak toplam fosfor (g/l) 0,87 +/- 0,14 0,53 +/- 0,084 ph 4,50 +/- 0,60 4,8 +/- 0,8

48 32 BO (g/l) 68,71 +/- 12,64 45,5 +/- 8,2 KO (g/l) 158,18 +/- 32,63 92,5 +/- 17,5 Özgül a ırlık (g/cm 3 ) 1,05 +/- 0,06 1,048+/- 0,033 letkenlik (mmhos/cm) 18,00 +/- 5, /- 4 Toplam eker (g/l) 25,86 +/- 8,30 16,06 +/- 5,92 Ya lar (g/l) 2,80 +/- 1,03 1,64 +/- 0,64 Polialkoller (g/l) 4,75 +/- 1,77 3,19 +/- 1,22 Gliserol (g/l) 0,10 +/- 0,04 0,062+/- 0,023 Toplam protein (g/l) 28,30 +/- 9,95 17,91 +/- 6,88 Organik asitler (g/l) 4,88 +/- 2,41 3,21 +/- 1,23 Toplam fenolik bile ikler (g/l) 17,15 +/- 4,55 10,65 +/- 4,08 Fenolik asitler (g/l) 0,48 +/- 0,18 0,28 +/- 0,1 Tanninler (g/l) 6,74 +/- 2,94 4,01 +/- 1,54 Pektinler (g/l) 3,25 +/- 1,42 2,15 +/- 0,76 K 2 O olarak potasyum (g/l) 3,77 +/- 0,39 2,37 +/- 0,21 Na 2 O olarak sodyum (mg/l) 405,81 +/- 95, /- 62 CaO olarak kalsiyum (mg/l) 382,11 +/- 51, /- 34 FeO olarak demir (mg/l) 48,32 +/- 7, /- 5 MgO olarak magnezyum (mg/l) 74,00 +/- 17, /- 9 SiO 2 olarak silisyum (mg/l) 28,62 +/- 4, /- 4 Kükürt (mg/l) 101,43 +/- 14, /- 12 Toplam klor (mg/l) 219,48 +/- 43, /- 23 Manganez (mg/l) 18,24 +/- 2, /- 2 Çinko (mg/l) 19,68 +/- 3, /- 3 Bakır (mg/l) 10,50 +/- 1,34 6 +/- 1

49 33 Zeytinya ı atık suları, arıtım bakımından son derece sıkıntılı atık sulardır. Çok yüksek KO (kimyasal oksijen ihtiyacı)/bo (biyolojik oksijen ihtiyacı) oranına ve BO 'ye sahiptirler. çerdikleri toksik fenoller ile ya asitlerinin miktarı da yüksektir. çlerinde bir miktar zeytin hamuru ve ya da bulunur. eker, fosfat ve metaller içeren asidik zeytin karasuları kolay oksitlendikleri için koyu renklidirler. Co rafi bölge, i lem cinsi, ko ulları ve hatta aynı i lemi kullanan tesislerin akı emalarındaki farklar gibi hususlar bu atık suların bile im ve miktarlarında etkilidir. (Yetkin, F., Gökçay, F. C., 2002) Zeytin karasuyunun arıtımındaki yöntemler Üç fazlı üretimde, kesikli yöntemde i lenen zeytinin %50'si kadar atık su elde edilirken, sürekli yöntemde i lenen zeytinin %60 ile %100'ü oranında atık su olu ur. Üretim sırasında zeytin hammaddesi dı ında herhangi bir madde kullanılmamasına ra men, olu an karasuyun organik madde içeri i çok yüksektir. Karasuyun kirletici etkisinin yok edilmesi veya azaltılması için bugüne kadar pek çok çalı ma yapılmı, farklı arıtma teknolojileri geli tirilmi tir. Topra a sızdırma ve gübre olarak kullanma, kompost üretiminde kullanma, buharla ma ve sızma için araziye bo altma, lagünlerde buharla tırma, katı yakıt elde etmek, fizikokimyasal arıtmana, kimyasal arıtma, aerobik biyolojik arıtma, anaerobik biyolojik arıtma, karasu çamurunun stabilizasyonu, fermentasyona tabi tutularak de erli sön ürünlere dönü türme, tek hücre proteini elde etmek, buharla tırma, membran prosesler ile arıtmak,

50 34 bugüne kadar karasu arıtımında ve bertaraf edilmesinde uygulanan yöntemler olarak sıralanabilir Zeytinya ı atık sularından yarar sa lamak Zeytinya ı atık suları polifenollerinin, antioksidan özellikleri nedeniyle kalp ve kanser hastalıklarından korunmada kullanılabilecekleri bildirilmektedir. Hidroksitirosol ve Oleuropein'in (antioksidanlar) üzerinde duruldu u görülmektedir. Bir alternatif, dikkatli bir tutumla soruna beslenme açısından yakla maktır. Ham zeytin atık suyu polifenoller, karbohidrat1ar, polisakkaritler, ekerler, katı ve sıvı ya lar, aroma maddeleri ve tabii boyar maddeler gibi geri kazanmaya de ebilecek malzemeler içermektedir. Bu tip içerikleri açısından zeytinya ı atık suları aynı zamanda bir hammadde potansiyeli niteli indedir ve bazı endüstriyel mikroorganizmaların üretilebilmesi için kültür vasatı olarak da kullanılabilir. Bu mikroorganizmalardan tıpta da yararlanılabilir. Enzim, biyokütle, vitamin ve proteinlerin üretimi, hatta tu la yapımı için zeytinya ı atık sularının kullanılabilece i belirtilmektedir. (Yetkin, F., Gökçay, F. C., 2002) 2.5. mmobilizasyon mmobilizasyon, kelime anlamı olarak hareketi sınıflandırma demektir. Bilimsel anlamda ise çe itli hücrelerin ve enzimlerin suda çözünen veya çözünemeyen bir ta ıyıcıya fiziksel veya kimyasal olarak ba lanması veya tutuklanmasıdır.

51 35 mmobilize hücrelerle, enzim üretimi yapılabilmesi için mikroorganizmaların mutlaka istenilen enzimi ekstrasellüler olarak üretmesi gerekmektedir. Aksi takdirde immobilizasyonun hiçbir önemi kalmaz. Fakat seçilen tür iyi bir enzim üreticisi ise yapılan genetik manipülasyonlarla hücre zarında geçirgenlik artırılabilir. Hücrelerin immobilizasyonunda temel olarak kullanılan yöntemler; ba lama yöntemlerinden çapraz ba lama ve ta ıyıcıya ba lama (yüzeye adsorpsiyon, ta ıyıcıya kovalent ba lama vb.), tutuklama yöntemlerinden ise polimerik jellerde (aljinat, kitosan, agar, poliakrilamid vb.) tutuklamadır. Deneylerde kabak lifinde immobilizasyon (adsorbsiyon) ile aljinatla immobilizasyon (jelde tutuklama) yapılmı tır Adsorbsiyon Destek maddesi olarak sentetik veya biyolojik kökenli organik maddeler kullanılır. Ba lanma zayıf ve birim hacimdeki katalitik kapasite sınırlıdır. Fakat biyokatalizleyici hazırlamadaki kolaylık ve zehirleyici kimyasal maddelerin olmaması yöntemin avantajlı yönleridir. (Elibol M., Özer D., 2000)

52 Jelde Tutuklama Yöntemin temeli çapraz ba lamanın ve polimerizasyonun olu turuldu u ortamda hücrenin de bulunması halinde, hücrenin çapraz ba lama sonucu olu an odacıklarda tutuklanması olayına dayanır. Böylece hücrelerin ortama geçmeleri engellenirken, besinler ve ürünler gözeneklerden kolayca içeri ve dı arı difüze olabilirler. Gözeneklerin boyutu ise matriksin konsantrasyonuyla ters orantılıdır. Konsantrasyon artması gözenek boyutunu küçültür. Konsantrasyon, hücreleri tutuklayacak fakat besinler ve ürünlerin içeri ve dı arı çıkabilmesine izin verecek ekilde ayarlanmalıdır. (Park J.K., Chang H.N., 2000) mmobilizasyon yöntemlerinin sınıflandırılması ve ematik gösterimi ekil 2.5 te gösterilmi tir. ekil 2.5: mmobilizasyon yöntemlerinin sınıflandırılması (Telefoncu, A., 1997).

53 Aljinat ile immobilizasyon Aljinat özellikle Kuzey Atlantik deki kayalık kıyılarda (ABD, Norveç, ngiltere, sveç) çok yaygın bulunan kahverengi alglerden elde edilmektedir. Aljinat alglerde kalsiyum tuzu eklinde bulunur ve hücre zarında iyon de i tirici olarak etki eder. ekil 2.6 da gösterilen aljinik asit, ticari olarak piyasaya daha çok sodyum-aljinat formunda sunulmaktadır. (Kılınç, A., 1990) ekil 2.6: Aljinik asidin yapısı. (Telefoncu, A., 1993) Aljinat so uk suda çözünür fakat iki de erlikli katyonlarda ve asitli ortamda kıvamlı jeller olu turur. Katyonlara olan e ilim Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca > Co > Ni > Zn > Mn sıraya göre azalır. Aljinatın katyonlara olan affinitesi ve jel olu turma özelli i ise yapısındaki sürekli gluronik asit artıklarının varlı ından

54 38 kaynaklanmaktadır. ki gluronik asit artı ı yan yana geldi inde polivalent katyonlar için bir ba lanma noktası olu tururlar. Bu nedenle G blo unun varlı ı ona yapı üzerindeki jelin gücünü ve stabilitesini olu turur. Aljinatlar yüksek oranda, hücre tutuklayıcı olarak ve enzim immobilizasyonunda kullanılırlar. Kalsiyum aljinat jellerinde hücre tutuklamak günümüzde hücre immobilizasyonunda en çok kullanılan yöntem haline gelmi tir. Hücre ta ıyan aljinat boncukları üretmek ise oldukça basittir. Bir hücre çözeltisi, sulu aljinat solüsyonu ile istenilen hücre konsantrasyonuna ba lı olarak ve son karı ımda %1-4 sodyum aljinat olacak ekilde karı tırılır. Karı ım multivalent katyon solüsyonu ta ıyan ba ka bir solüsyona (0,05-0,1 M) CaCl 2 damlatılır. Damlalar çabucak katıla arak iyonotropik jel olu tururlar ve bu arada da hücreleri tutuklarlar. mmobilize hücrenin serbest hücreye üstünlükleri: Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzakla tırılabilirler ve ürünlerin hücre tarafından kirletilmesi gibi problemlerle kar ıla ılmaz. Çevre ko ullarına (ph, sıcaklık, karı tırma hızı v.b) kar ı daha dayanıklıdırlar. Birçok kez ve uzun süreli kullanılabilirler. Sürekli i lemlere uygulanabilirler. Serbest hücrelere kıyasla daha kararlıdır. Ürün olu umu kontrol altında tutulabilir. Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.

55 39 Bazı durumlarda serbest hücrelerden daha yüksek verim gösterirler. Hücrenin kendini parçalama (otolizis) olasılı ı azdır. Mekanistik çalı malar için uygundur. (Telefoncu A; 1997)

56 40 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Mikroorganizmalar Deneylerde kullanılan Rhizopus oryzae (NRLL-395 su u), Circinella sp., Streptomyces bombicola ve Streptomyces sp. mikroorganizmaları Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü ve Ege Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü nden temin edilmi tir Kimyasallar Mikroorganizmaların geli tirilmesinde; patates dextrose agar (PDA) (Oxoid, ngiltere), ortam bile iminde; zeytin karasuyu (Belevi ya san. A., Türkiye), mısır ya ı (Yonca, Türkiye), ayçiçe i ya ı (Bizimya, Türkiye), zeytin ya ı (Komili, Türkiye), fındık ya ı (Çotanak, Türkiye), soya ya ı (Büka, Türkiye), tribütirin (Merck Ltd., Almanya), yeast extract (Merck Ltd., Almanya), nutrient broth (Oxoid, ngiltere), pepton (Oxoid, ngiltere), üre (Carlo Erba laç Sanayi ve Ticaret A..), malt extract (Oxoid, ngiltere), amonyum nitrat (Merck Ltd., Almanya), D-glukoz (Merck Ltd., Almanya), MgSO 4 (Merck Ltd., Almanya), KH 2 PO 4 (Merck Ltd., Almanya), K 2 HPO 4 (Merck Ltd., Almanya), aktivite tayininde; tuz solüsyonu için NaCl (Merck Ltd., Almanya), CaCl 2.4H 2 O (Horasan boya ve kimya san., Türkiye) ve bütirik asit (Merck Ltd., Almanya), ph ayarlama ve dengeleme i lemlerinde;

57 41 NaOH (Merck Ltd., Almanya), HCl (Merck Ltd., Almanya), inokulasyonda; Tween 80 (Merck Ltd., Almanya), immobilizasyonda ise Na-aljinat (Sigma, ABD) ve CaCl 2 (Merck Ltd., Almanya) kullanılmı tır Cihazlar ph stat (Mettler Toledo), otoklav (Hirayama HV-110L), statik inkübatör (Sanyo), çalkalamalı inkübatör (Gerhardt Thermoshake), analitik hassas terazi (Precisa), santrifüjler (Hettich Rotofix 32 ve Hettich Mikroliter D7200), pastör fırını (Memmert), su banyosu (Polyscience), spektrofotometre (Jenway 6400 VIS), ph metre (Mettler Toledo), manyetik ısıtıcılı karı tırıcı (IKA), vakumlu kurutucu ( solab), mikroskop (Olympus), derin donduruculu buzdolabı (Bosch), peristaltik pompa (Master flex), reaktör 1 litrelik (Gallenkamp, modular fermenter), 3,6 litrelik reaktör (Infors labfors), derin dondurucu (Arçelik) 3.2. Metot Rhizopus oryzae nin ço altılması ve geli tirilmesi Lipaz üretimi için kullanılan Rhizopus oryzae, PDA içeren e ik agar solüsyonlarında (39 g PDA/L) 4 C de stok kültür olarak depolanmı tır. Ço altma ve geli tirme i lemi ise yine e ik agar i elerine ve 500 ml lik erlenlerde 50 ml PDA içerisine ekim yapılarak 28 o C deki inkübatörde 4 günlük inkübasyon süresinde gerçekle tirilmi tir.

58 ømmobilizasyon iúlemi Sodyum-aljinatta immobilizasyon iúlemi ømmobilize sporlarla gerçekleútirilen lipaz üretimi, hacimce 1:1 oranında spor solüsyonu ve %4 konsantrasyonlu Na-aljinat sulu solüsyonunun karıútırılıp peristaltik pompa ile 100 mm CaCl2 çözeltisi içerisine damlatılması ile hazırlanan 3 mm çapındaki boncuklarla gerçekleútirilmiútir. Kalsiyum aljinat boncuklarının oluúumu ùekil 3.1 de gösterilmiútir. a b ùekil 3.1: a)cacl2 ye damlatılan sodyum aljinatlar b)mikroorganizmaları içeren kalsiyum aljinat boncukları

59 Kabak lifinde immobilizasyon i lemi Kabak lifinde immobilizasyon i lemi için ortam kompozisyonu hazırlanmı erlen içerisine çelik ve paslanmaz tellerle ba lanmı ve boyutları bilinen kabak lifleri yerle tirilir. Otoklav i leminden sonra oda sıcaklı ına gelen erlenlere inokülasyon yapılır ve çalkalayıcıda inkübasyona bırakılır. Kabak lifinin üretime uygun hazırlanma ve R. oryzae nin kabak lifine tutunarak büyümesi ekil 3.2 de gösterilmi tir. a b c d ekil 3.2: a) Uygun boyutlarda kesilmi kabak lifi b) Erlene çelik ve paslanmaz telle yerle tirilmi kabak lifi c) Kabak lifine tutunarak geli en büyüme ekli d) Etrafı tamamen sarılmı kabak lifi

60 Erlenlerin kültivasyona hazırlanması Toplam çalı ma hacmindeki konsantrasyonları belli olan azot ve karbon nutrientleri 250 ml lik erlenler içerisine konulur. Seyreltme de eri ayarlanmı 50 ml zeytin karasuyu:çe me suyu karı ımı eklenir ve ortam içeri inin ph de eri ayarlandıktan sonra a ızları pamuklanıp alüminyum folyolanarak 121 o C sıcaklık ve 1,2 atm basınç de erlerinde 15 dakika süresince otoklavlanır. Oda sıcaklı ına gelen erlenler ekim odasına ta ınır. Burada stok mikroorganizmaları içeren erlen veya e ik agar i elerine arzu edilen mikroorganizma sayısına ba lı olarak tween 80 solüsyonu eklenir ve kazıma i lemi sonrasında elde edilen mikroorganizma solüsyonu otoklavlanmı bo bir erlen içerisine konur. Bu erlenden alınan örnek inokülasyon, mikroskop altında neubauer lamı ile sayım yapılarak hücre sayımı gerçekle tirilir. Bu erlenden alınan hacmi ve içerdi i hücre sayısı belli inokülasyonlar, otoklavlanmı ortamları içeren erlenler içerisine aktarılır. ( mmobilize hücrelerle yapılan üretimde, erlenlere hacimleri belli kalsiyum-aljinat boncuklarından belli sayıda ekleme yapılır). Bu erlenler de 28 o C ve 120 rpm hızında çalı an çalkalayıcılarda inkübe edilir Üretilen lipazın aktivitesinin ölçülmesi Üretilen lipazı analiz etmek için sıcaklık, ph ve karı tırma hızının kontrol edilebildi i 50 ml çalı ma kapasiteli bir karı tırmalı kap kullanılmı tır. Hidroliz tepkimesi, ph-stat metoduyla ( ekil 3.3) ph de eri sabit tutulan tepkime ortamında titrasyon yöntemiyle, tribütürinin

61 45 lipaz tarafından hidrolizi sonucunda olu an ya asitlerini nötralle tirmek için harcanan NaOH miktarının zamana kar ı ölçülmesiyle izlenmi tir. ekil 3.3: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin ölçüldü ü ph stat cihazı

62 46 4. BULGULAR VE TARTI MA 4.1. Kullanılan farklı mikroorganizmaların lipaz aktivitesine etkisi Kullanılan farklı mikroorganizmalarda lipaz aktivitesi en fazla Rhizopus oryzae ekilmi erlende görülmü tür. ( ekil 4.1) Circinella sp. 'nin özellikle zeytin karasuyunda büyümesinin zor oldu u buna ba lı olarak aktivitesinin az oldu u di er iki Streptomyces türlerinin de büyümelerinin neredeyse yok denecek kadar az olmalarından dolayı aktiviteleri çok dü ük çıkmı tır. Aktivite (IU) Zaman (saat) Rhizopus oryzae Streptomyces bombicola Circinella sp. Streptomyces sp. ekil 4.1: Kullanılan farklı mikroorganizmaların lipaz aktivitesine etkisi

63 Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin sıcaklık ve ph de eri ile de i imi Aktivite tayin solüsyonunun sıcaklı ının ve ph de erinin enzim aktivitesine etkisi incelendi i zaman en yüksek aktivitenin 30 o C ( ekil 4.2.) ve ph 8'de ( ekil 4.3.) elde edildi i görülmü tür. Bu de erler fermantasyon sırasında aktivitenin en yüksek elde edildi i zamandaki ph ve sıcaklık de erleridir Aktivite (IU) Sıcaklık ( o C) Sekil 4.2: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin sıcaklıkla de i imi

64 48 A ktivite (IU ) ph ekil 4.3: Üretilen lipaz enziminin aktivitesinin ph de eri ile de i imi 4.3.De i en ba langıç ph de erlerinin lipaz aktivitesine etkisi Ortamın ba langıç ph de erlerindeki de i imin lipaz aktivitesine etkisi incelendi inde ba langıç ph'ı için en uygun de erin 6 oldu u görülmü tür. ( ekil 4.4) Özellikle asidik bir ko ul olan ph 4 de erinde gerçekle tirilen üretimde, mikrobiyal üreme ve enzim aktivite de erlerinin çok dü ük oldu u gözlemlenmi tir. Daha önce literatür taramalarından da elde edilen bilgi do rultusunda di er çalı malar için ba langıç ph de erinin 6,2 olması uygun görülmü tür.

65 49 Aktivite (IU) Zaman (saat) ph 4 ph 5 ph 6 ph 7 ph 8 ekil 4.4: De i en ba langıç ph de erlerinin lipaz aktivitesine etkisi 4.4. Üretim ortamında de i en zeytin karasuyu:çe me suyu seyreltmelerinin lipaz aktivitesine etkisi ekil 4.5 te seyreltme i leminin aktivite üzerindeki etkisinin sonuçları gösterilmi tir. En yüksek aktivitenin %50 oranındaki seyreltmede meydana geldi i görülmü tür. Daha seyreltik oranlarda besi ortamı içeri inin yetersiz olmasına ba lı olarak aktivitenin azaldı ı görülmü tür. Saf zeytin karasuyunda gerçekle tirilen üretimde ise besi ortamında bulunan fenolik maddeler ve seyreltme oranın dü ük olmasından kaynaklanan hücre içine difüzlenebilen nutrientlerin azalmasına ba lı olarak aktivitede azalma görülmü tür.

66 Aktivite (IU) % 75% 50% 20% 10% 5% 3% 2% Su içerisindeki zks yüzdeleri ekil 4.5: Üretim ortamında de i en zeytin karasuyu:çe me suyu seyreltmelerinin lipaz aktivitesine etkisi 4.5. Üretim ortamında de i en karbon ve azot kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi Rhizopus oryzae ile lipaz üretiminde de i en karbon kaynaklarından aktiviteye en etkili olanının soya ya ı oldu u anla ılmı tır. ( ekil 4.6) Ancak aktiviteyi etkileme de erleri birbirlerine çok yakın olan fındık, zeytin, soya ve mısır ya larının arasından gelecekteki çalı malarda kullanılması için en ekonomik olan mısır ya ı seçilmi tir. Böylelikle bu çalı manın büyük ölçekli çalı tırılması durumunda daha az masraf olu ması sa lanmı tır.

67 51 Aktivite (IU) Fındık ya ı Zeytinya ı Soya ya ı Mısır ya ı Ayçiçek ya ı Tribütirin ekil 4.6: Üretim ortamında de i en karbon kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi Rhizopus oryzae ile lipaz üretiminde de i en azot kaynaklarından aktiviteye en etkili olanının yeast extract oldu u anla ılmı tır. ( ekil 4.7) Ayrıca inorganik azot kaynaklarından öte organik azot kaynaklarının aktiviteyi daha yüksek tuttu u görülmü tür.

68 52 Besi ortamında de i en azot kaynaklarının aktiviteye etkisi Aktivite (IU) Yeast extract Nutrient broth Pepton Üre Amonyum nitrat ekil 4.7: Üretim ortamında de i en azot kaynaklarının lipaz aktivitesine etkisi 4.6. RSM ile elde edilen optimizasyon sonuçları RSM ye ba langıç olarak, aktivite üzerine daha etkili oldu u dü ünülen azot kayna ı miktarı (yeast ekstrakt) ve mısır ya ı miktarı proses de i kenleri olarak belirlenmi tir. Bu iki de i kenin tek ba ına veya e zamanlı etkile imlerinin enzim aktivitesi olarak alınacak cevapları RSM ile analiz edilmi tir. Üretimde kullanılan yeast extract ve mısır ya ının konsantrasyonu ve inkübasyon süresi de erlerinin prosese etkisi incelendi i zaman %1,35 (w/v) yeast extract (C), %1,35 (v/v) mısır ya ı (B) içerikli ve 45 saat (A) inkübasyonda kalmı erlende 39 IU aktivite elde edilebilece i görülmü tür. ( ekil 4.8)

69 53 ekil 4.8: 45. saat fermantasyon süresinde, de i en yeast extract ve mısır ya ı konsantrasyonlarına ba lı olarak aktivitede gerçekle en de i im grafi i Yapılan optimizasyon i lemi ile en az 30 IU aktiviteye sahip olan enzim üretimi için gerekli erlen içi kimyasal kompozisyon de erleri ekil 4.9 da sarı alanla gösterilmi alandaki de erler olarak belirlenmi tir.

70 54 ekil 4.9: %1,35 yeast extract konsantrasyonu içeren erlende en az 30 IU aktivitesi olan enzim üretmek için gereken mısır ya ı konsantrasyonu ve fermantasyon süresinin optimizasyon grafi i. (A: saat, B: ya konsantrasyonu, C: yeast extract konsantrasyonu) 4.7. Üretim ortamında inokülasyon oranlarının lipaz aktivitesine etkisi ekil 4.10 da görüldü ü gibi erlenlerde yapılan üretimlerde e it inokülasyon hacimlerinde bulunan farklı spor sayılarının aktiviteye etkisi incelendi inde en yüksek aktivitenin 10 4 spor/ml ekim yapılmı erlende elde edildi i görülmü tür spor/ml ekim yapılmı erlendeki aktivite de eri ivmelenmesi, 10 4 spor/ml ekim yapılmı erlendekine nazaran dü ük olsa da maksimum aktivite de erinin çok yakın oldu u görülmü tür ve 10 6 spor/ml ekim yapılmı erlenlerde aktivite ilk ölçümlerde daha yüksek olsa da saatlerde di er erlenlerde elde