Genomik. Bölüm Giriş Bağlantı (linkage) Haritaları

Transkript

1 Bölüm 22 Genomik Hilal Betül Kaya (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Seda Nemli (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Hülya Yılmaz (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Yüksel Gezgin (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Yetkin Güntürk (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Devrim Semizer (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Sinem Melek Nalbantoğlu (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Cem Yalaza (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Selma Gülbitti Onarıcı (TÜBİTAK-MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloi Araştırma Enstitüsü / Kocaeli) Bahattin Tanyolaç (Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü / İzmir) Giriş Bir organizma genomunun bütününün analizine yönelik yapılan çalışmalar genomik bilimi olarak adlandırılmaktadır. Bu alan, organizmaların yüksek çözünürlükte genetik ve fiziksel haritalarının ortaya çıkarılmasının ve bütün DNA nın sekanslanmasının yanı sıra fonksiyonel ve karşılaştırmalı genomik gibi alanları da içermektedir. Genomik ayrıca, genom içindeki heterosis, epistasis, pleiotropy ve lokuslar ile aleller arasındaki interaksiyonu da incelemektedir. Bunun yanında, tek bir genin hücredeki rolünün ve fonksiyonunun araştırılması ise moleküler biyolojinin ve modern medikal ve biyolojik araştırmaların genel konusu olmuştur. Bu bölümde, genomik alanına giren bağlantı ve fiziksel haritaların oluşturulması, genom sekanslama, sekans bilgilerinin incelenmesi ve pratikte uygulamaları konusunda bilgiler verilecektir Bağlantı (linkage) Haritaları Bağlantı haritaları genom araştırmalarının temelini oluşturmaktadır. İnsanlardan bitkilere kadar birçok organizmanın bağlantı haritaları çıkarılmıştır. Bağlantı haritalarının ortaya çıkarılmasındaki en önemli aşamalardan birisi haritalama populasyonlarının oluşturulmasıdır. Herbiri mayoz ürünü olan bireylerin populasyondaki sayısının artması yüksek çözünürlükteki haritaların elde edilmesine yardımcı olacaktır. Haritalama populasyonları, bir tür içindeki bireylerden veya fenotipik özellikler açısından farklılık gösteren ebeveynlerin olduğu akraba türler arasındaki melezlemeler sonucu elde edilen bireylerden oluşmaktadır. Aynı türe ait farklı organizmalarda, genler allellerle temsil edilmekte ve kromozom üzerinde lineer bir sıra hâlinde bulunmaktadırlar. Farklı lokuslara ait alleller arasındaki rekombinasyona göre, genetik lokuslar arasındaki bağlantı değerleri tahmin edilebilmektedir ve tüm kromozomların bağlantı ilişkileri organiz-manın genetik

2 524 Moleküler Biyoloji haritasını oluşturmaktadır. Bağlantı haritalarının oluşturulmasında temel mantık genelde aynı olduğundan, bu bölümde, konunun bitkilerle örneklendirilerek anlatılması uygun görülmüştür. Bitkilerde haritalama populasyonunun tipi, bitkinin üreme şekline bağlıdır. Buna göre bitkiler, kendi kendine döllenen ve döllenmeyenler olarak iki gruba ayrılmaktadırlar. Doğal olarak kendilenen Arabidopsis thaliana, domates, soya fasulyesi ve patates gibi bitkiler kendilemeye (inbreeding) duyarlı bitkilerdir. Döllenme yönünden kendine uyuşmaz bitkiler, yüksek oranda heterezigotturlar ve bu türlerde kendileme depresyonu nedeni ile genellikle kendi polenlerini kendi dişi organının kabul etmesi mümkün değildir. Kendi kendine döllenen bitkiler için, F 2 populasyonları ve rekombinant inbred (rekombinant kendilenmiş) hatlar kullanılırken, kendi kendine döllenemeyen (selfincompatible) türler için F 1 populasyonları tercih edilmektedir. Geri melez populasyonları ve katlanmış haploid hatlar; iki tip populasyon için de kullanılmaktadır. DNA nın spesifik bölgelerinin kalıtımı, DNA polimorfizmlerinin görülmesini sağlayan DNA markörleri ile izlenmektedir. Karakterler ve markörler arasındaki rekombinasyon frekansı genetik uzaklığı belirtmektedir F 2 Populasyonları Haritalama populasyonlarının en basit formu F 2 bitkileri koleksiyonudur (Şekil 22.1). F 1 bitkilerinin kendilenmesiyle oluşturulurlar. F 2 bitkileri genetik materyalin yeniden kombine edildiği mayoz ürünleridir. F 2 bitkilerinde her kodominant markör için beklenen açılım oranı 1:2:1 dir Rekombinant Kendilenmiş Hatlar (RKH) RKH bitkileri, birçok jenerasyon boyunca F 2 bitkilerinin kendilenmesiyle elde edilmektedirler (Şekil 22.2). RKH konsepti fare genetiğinden geliştirilmiştir. Hayvanlarda homozigotluğa ulaşmak için yaklaşık 20 jenerasyon boyunca kendileme yapmak gerekmektedir. RK hatlar, bitki tümüyle kendine uyuşmaz olmadığı sürece, kendileme ile oluşturulmaktadırlar. Kendileme prosesinde her hattan gelen tohum, bir sonraki jenerasyon için kaynaktır. RK hatlara tek tohum nesli (single-seed descent) de denilmektedir. Kendi kendine tozlaşma RK hatların birkaç jenerasyonda elde edilmesini sağlamaktadır. Altı jenerasyonda tam homozigotluğa ulaşmak mümkündür. Rekombinasyon, RK hatların genomik yapısını artık değiştiremeyeceği için, projenide açılım görülmeyecektir. Böylece RK hatlar ile tekrarlı çalışmalar yapmak mümkündür ve birçok araştırma grubu tarafından ortak kullanılabilmektedirler.

3 Genomik 525 yonu yardımıyla birkaç jenerasyon geri melezleme yapılmaktadır Geri Melez Populasyonları A ebeveyninden türevlenen spesifik DNA fragmentlerini, B ebeveyni varlığında analiz etmek için, F 1 bitkisi B ebeveyni ile geri melezlenmektedir (Şekil 22.3). Bu durumda, A ebeveyni verici, B ebeveyni alıcıdır. Bu proses boyunca: Bağlı olan donör fragmentlerinin, geri melezleme yapılan ebeveyn ile rekombinasyonunun minimize edilmesi amaçlanmaktadır. Vericinin fragmentlerinin sayı ve boyut olarak azaltılması için geri melezleme tekrarlanarak, geri melez hatları oluşturul-maktadır. Her geri melezleme işleminde verici genom oranı %50 azalmaktadır (Şekil 22.3). Moleküler markörler bu işlemin izlenmesine ve daha hızlı sonuç alınmasına yardım etmektedirler. Bir iki lokus haricinde, genomunun her yeri aynı olan hatlara yakın izogenik hatlar (YİH) (nearly isogenic lines- NIL) denmektedir. YİH lerin oluşturulması için markör seleksi Katlanmış Haploid Hatlar Katlanmış haploid hatlarda, her hücrede birbirinin aynı 2 set kromozom bulunmaktadır. Katlanmış haploidler, haploid hatlardan üretilebilmektedirler. Haploid hatlar, kolza ve mısırda olduğu gibi ken-diliğinden oluşabileceği gibi, yapay olarak da üretilebilmektedirler. Haploid bitkiler neredeyse kısırdırlar ve olgunlaşmamış anterlerin özel bir ortamda kültüre alınmasıyla uyarılmaktadırlar. Haploid bitkiler daha sonra gametofitin haploid hücrelerinden yeniden üretilebilmektedirler. Diğer bir seçenek de mikrospor kültürüdür. Kültüre alınmış arpada haploid embriyoların jenerasyonu yabani tür Hordeum bulbosum poleni kullanılarak indüklenebilmektedir. Embriyonun ilk hücre bölünmesi süresince, H. bulbosum kromozomları elimine edilmekte ve yumurta

4 526 Moleküler Biyoloji hücresinden elde edilen haploid kromozom seti tek başına bırakılmaktadır. Haploidlerdeki kromozom sayısı bazen kendi kendine iki katına çıkmakta ve double haploid hâle gelmektedirler. Bu gibi hatlar ayrıca haploidlere ve bitki parçalarına kolşisin uygulaması yapılarak double haploid hâle getirilebilirler. Kolşisin, mitoz boyunca iğ iplikçiklerinin oluşumunu engellemekte bu da kromozomların ayrılmasını inhibe etmektedir. Haploid bitkilerde kallus indüklenirse endomitoz sırasında kromozom katlanması kendiliğinden oluşmaktadır ve katlanmış haploidler somatik embriyogenezis ile yeniden oluşmaktadırlar. Buna rağmen, in vitro kültür koşulları genetik harita için gerekli olan genetik çeşitliliği azaltabilmektedir. Katlanmış haploid hatlar kullanılarak, haritalama çalışmalarında kullanılmak üzere değişmez, kesin kaynaklar elde edilebilmektedir. Heterezigot olmadıkları için haritalama populasyonlarının oluşturulmasında öneme sahiptirler. Bu amaçla kullanımlarına ait buğday, arpa ve pirinç üzerinde yapılan çalışmalar bulunmaktadır (15, 39, 66). Burada anlatılan populasyonlar kullanılarak populasyonda bulunan herbir bireyin DNA ları izole edilmek suretiyle ebeveynlerle birlikte DNA markör analizlerine tabi tutulurlar. Geliştirilen DNA markörleri, genom haritalama yapan bilgisayar programlarında analiz edilerek bağlantı grupları hâlinde kromozom boyunca dizilirler. Elde edilen bağlantı grupları o organizmanın kromozomlarını temsil ederler. Aşağıda bağlantı gruplarına bazı örnekler verilmiştir Fiziksel haritalar Fiziksel haritalama, ökaryotik genom çalış-malarında sekanslama verilerinin, haritalanmış markörlerin ve klonların değerlendirilerek bir araya getirilmesini sağlayan önemli bir bilgi kaynağıdır. İyi bir fiziksel harita, spesifik genlerin klonlanmasında, genomların karşılaştırmasında ve genomların karmaşıklığı ile büyüklüklerinin anlaşılmasında ön bilgi sağlamaktadır. Genom çalışmalarında fiziksel haritaların yapımı, İnsan Genom Projesi (İGP) nin başlangıcından bu yana birçok genom projesinin temel bileşenini oluşturmuştur. Genetik, fiziksel, gen ve sekans haritalarının oluşturulması ve entegrasyonu İGP nin hedefidir (16). Bitki ve hayvanlardaki gene-tik haritalama çalışmaları 20 yılı aşkın süredir devam etmekte, klonlama ve klon parmakizi analizlerindeki gelişmeler fiziksel harita yapısının oluşmasında önemli rol oynamaktadır. Fiziksel haritalar genellikle bakteriyel yapay kromozomlar (bacterial artificial chromosomes, BACs) ve maya yapay kromozomları (yeast artificial chromosomes, YACs) gibi büyük fragmentlerin klonlanmasını sağlayan vektörlerin kullanılmasıyla oluşturul-maktadır. Fiziksel haritalama, uzaklıkların fiziksel uzaklık birimi (baz çifti) olarak belirtildiği DNA fragment dizilimidir. Tüm genomu klondan klona sekanslama metodunda, ilk olarak fiziksel harita oluşturulmakta, fiziksel harita oluşturulurken klonların minimum olarak üst üste çakışanlarından seçilmesine dikkat edilmektedir. Klon-klon metodunun alternatifi, tüm genomdan rastgele elde edilen sekans verilerini kullanan, tüm-genom shotgun sekanslama (Whole Genome Sequencing WGS) dır (31, 46, 55, 72, 111, 116). Bundan dolayı tüm-genom sekansı için iki metottan birisi olan hibrit stratejisi çok daha fazla yarar sağlamaktadır. Bu hibrit yaklaşımında WGS sekans verileri ile BAC-sonlu sekans haritalama verileriyle hizalandırma yapılmıştır. Bu birleştirilmiş DNA kontigleri; haritalanan moleküler markörleri ve sıralı düzenlenmiş BAC ları içeren fiziksel haritalara yerleştirilmiştir (52, 84).

5 527 Genomik LG3 MCATEAGC_ MCATEAGC_ MCTGEACT_ MCTAEAAG_ MCTGEAGC_5 7.4 MCTGEACA_ MCAGEACC_ MCTAEAAG_9 8.2 MCTTEAGG_1 9.0 MCTGEAGC_3 6.7 MCTGEACA_ MCACEACA_ I MCAGEAGG_ M18d 10.6 R16b 12.9 N MCACEACA_ MCAGEACC_10 LG2 O17b 7.2 b AB14b 0.7 AB14a 11.0 UBC UBC79b 0.0 UBC UBC79a 3.1 U CS D AB12b 4.6 U U D20b 4.5 D Q02a 5.8 UBC318a 2.5 N19a 11.6 AB D20e 12.3 CS I08c 12.9 UBC8401 LG1 MCTGEAAG_ MCTGEAAG_8 6.7 MCTGEAAG_ MCTGEAAG_ MCTGEAAG_ MCTGEAAG_6 5.4 MCTGEAAG_ MCTGEAAG_5 2.9 MCTGEAAG_4 6.2 MCTGEAAG_7 2.8 D01a 5.0 MCATEAAG_ AB07c 15.3 MCTGEAGC_ MCATEAGC_ MCTGEACA_ MCACEACT_ MCACEACA_ MCATEAAG_ D01b 12.1 MCTGEAGC_ MCTTEAGG_ MCACEAAC_ MCACEAGC_ MCTGEAAG_ MCATEAAG_9 1.1 MCATEAAG_ spotting 7.5 MCTAEACT_2 8.9 MCTAEAAG_ Q10c 11.4 MCAGEAGG_5 9.5 MCTGEAGC_ MCTGEACT_ MCATEAGC_ MCATEAAG_ MCTGEAAC_ MCTGEACG_ MCTGEAAC_7 8.1 MCTGEACG_ MCTGEACG_10

6 528 Moleküler Biyoloji Yüksek kalitede fiziksel haritaların bulunmayışı, karmaşık genomlar için yeni oluşturulmuş tüm genom sekansların oluşturulmasında sınırlayıcı faktörlerden birisidir. Büyük ölçekli haritalama ve sekanslama, bazı farklı organizmalar için yürütülmekte, bazı organizmalar için ise planlanmaktadır. Ancak bu girişimlerin çoğu insan, fare ve sıçan gibi organizmalar için çok büyük finansal kaynaklara ihtiyaç duymaktadır. Fiziksel haritalar tüm genom sekansı mevcut olmayan bazı türler için oluşturulabilmektedir. Bazı kaynaklar, örneğin radyasyon hibrit hücre hattı, memeli fiziksel haritaların yapımında yaygın olarak kullanılmaktadır, fakat bu diğer türler için imkansız veya çok zordur (53, 114). Kompleks genoma sahip türlerde gen sekansı belirleyebilmek için bazı alternatif stratejiler geliştirilmiştir (65). Bu stratejilerin bazıları metilasyon filtrasyon ve yüksek C 0 T seleksiyonudur. Bu teknikler geleneksel genom sekanslama tekniklerine alternatifler sunmaktadır ve son zamanlarda mısır bitkisine bu metot uygulanmıştır (78, 117). Bununla beraber, bu yaklaşımlarla oluşturulan sekans kontigleri genomik yapı üzerine sıralanmalıdır. Çünkü bu durum fiziksel haritalar için gereklidir. a) Bakteriyel yapay kromozom (bacterial artificial chromosome (BAC)) kütüphanesi. 7 den 30 a kadar genom benzeri yapı gösteren BAC kütüphanesidir. Farklı restriksiyon enzimleri ile elde edilen farklı kütüphanelerin kullanımı genom içeriğinin artmasını sağlamaktadır. b) BAC klonlarının DNA parmakizi. Her bir klon restriksiyon endonükleaz enzimleri ile kesilmekte ve oluşan fragmentler DNA parmakizi analizi için agaroz jelde ayrımlanmaktadır. Jel üzerinde ayrımlanan DNA fragmentlerinin boyutları her bir klon için tahmin edilmektedir. c) Otomasyon. Çalışmaya uygun yazılım kullanılarak her bir klona ait ortak bantların oranı ve tüm klonların karşılaştırılması yapılmaktadır. Örtüşen (Overlap) klonlar tanımlanmakta ve ortak bantların minimum oranının belirlendiği eşik temel değerine (SULSTON CUTOFF SCORE) göre kontiglerin içine yerleştirilmektedir. Klon sıralama algoritması her bir kontig içerisindeki BAC klonlarının göreceli sıralamasının bulunmasında kullanılmaktadır. Bu işlem tespit edilemeyen bazı overlap bölgeler ile sonuçlanmaktadır (Mavi bantlar boşlukları göstermektedir). d) Manuel düzeltme ve toparlama. Her bir kontigden sonlanan klonlar bir diğeriyle karşılaştırılabilmektedirler. e)harita hizalama, doğrulama. Kontigler, ortak markörlerin kullanıldığı hibrit haritalara veya genetik haritalara hizalanabilmektedirler.

7 Genomik Genomik DNA Restriksiyon enzimleriyle kesilir ve klonlan olu turulur sı ile her bir BAC bulunduğu plakadaki ismi almaktadır. Örneğin 1 nolu plaka A14 gibi (1A14). Oluşturulan kütüphanedeki BAC lar parmakizi yöntemi ile ortak kesim bölgelerinden faydalanılarak birbirini takip eden parçalar şeklinde kromozom boyunca dizilmektedir (Şekil 22.7). Ayrıca bağlantı haritalarından elde edilen DNA markörleri de kullanılarak hangi BAC üzerinde hangi DNA markörünün bulunduğu ve böylece sekanslamaya hangi BAC tan başlanacağı saptanabilmektedir. Harita verileri bilgisayara yüklenerek ç k k ve uklar doldurulur ve nükleotit dizileri belirlenir. Tüm genom dizisi Fiziksel haritaların hazırlanması sekanslama için son derece önemlidir. Bu haritalar her bir kromozomu temsil eden genetik haritalardır. Bu amaçla fiziksel haritalamada ilk adım Bakteriyel Yapay Kromozom (Bacterial Artificial Chromosome) (BAC))kütüphanelerinin hazırlanmasıdır. Bunun icin DNA yaklaşık kb büyüklükteki parçalara, restriksiyon enzimleri kullanılarak ayrılmaktadır. Kesilmiş DNA parçaları agaroz jele yüklenerek jel üzerinde ayrılmış olan kb arasındaki bölgeler jelden kesilip alınarak BAC vektörlerine transfer edilmekte bunlarda E. coli ye transformasyonla aktarılmaktadır. Klonlar agar plaka larına ekilerek kolonilerin oluşması sağlanmaktadır. Bu koloniler seçilerek 384 kuyucuklu plakalara aktarılmaktadır. Dolayı Genom Sekanslama İnsanlık tarihinin en büyük bilimsel projelerinden birisi de insan genomu ve model kabul edilen bazı organizmaların genomlarının sekanslanmasıdır. Bu sekans-lama çalışmalarından elde edilen bilgiler, bilgisayar ile biyolojinin birleşiminden meydana gelmiş olan biyoinformatik alanının doğmasına neden olmuştur. Mikroçiplerdeki ilerlemeler sayesinde milyonlarca nükleo-tite sahip genomlar arasında homoloji kurulabilmiştir ve bu genomların karakteri-zasyonu yapılabilmiştir baz çifti (bç) büyüklüğündeki bakteriyofaj fx174 genomu sekanslanan ilk viral genomdur (88).

8 530 Moleküler Biyoloji Fredric Sanger, ilerleyen yıllarda bütün bir genomdan PCR amplifikasyonu ile elde edilen rastgele DNA parçalarının sekanslanması stratejisine dayanan Shotgun Sekanslama Metodu nu geliştirmiştir. Bu metod sayesinde amplifiye edilen DNA parçalarının birbiri üzerine eşleşen bölgeleri bir araya getirilerek bütün parçalar elde edilmektedir. Bu parçalar arasındaki sekans boşluklarının doldurulması ile de uzun DNA parçaları elde edilmektedir. Sanger, bç büyüklügündeki bakteriyofaj DNA sının sekanslanmasından 5 yıl sonra shotgun sekanslama metodunu ilk kez kullanmıştır. Bu metot daha hızlı sekanslama olanağı sağlamaktadır. Bu metot sayesinde 229 kb olan Cytomegalovirus (CMV), 192 kb olan Vaccinia ve Marchanthi polymorpha nın 187 kb lik mitokondri ve 121 kb lik kloroplast genomları sekanslanabilmiştir. Genom sekanslamadaki bu başarılar sayesinde 1989 yılında Andre Goffeau, mayanın (Saccharomyces cerevisiae) 12,5 Mb lık genomunu sekanslamak için bir konsorsiyum oluşturmuştur. Goffeau nun Avrupa çalışma grubu, 74 laboratuvardan oluşmuş ve bu laboratuvarların çoğu Sanger in shotgun metodunu standart sekanslama metodu olarak kullanmıştır (27). S. cerevisiae nin model organizma olarak sekanslanmasındaki başarı insan genomunun da sekanslanabileceğini ortaya koymuştur. Amerika da Enerji Bölümü (Deparment of Energy) (DoE)) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (National Institude of Health (NIH)) kurumları birlikte 1990 yılında insan genom projesini başlatmışlardır. Bu proje üç aşamadan meydana gelmiştir. Bunlar genetik haritalama, fiziksel haritalama ve kromozomların sekanslanmasıdır. İlk iki aşama doğru bir sekanslamanın temellerini oluşturmaktadır. Bu aşamada E. coli, M. copricolum ve C. elegans gibi diğer model organizmaların genom sekanslama projeleri de tamamlanmış ve karşılaştırmalı genom analizleri yapılmıştır. Bu aşamada Genomik Araştırmalar Enstitüsü nde (The Institute for Genomic Research (TIGR)) çalışan J. Craig Venter ve John Hopkins Üniversitesi nde çalışan Nobel Ödülü sahibi Hamilton Smith yeni bilgisayar programı geliştirerek 1.8 Mb lık genoma sahip bakteri genomunu sekanslamışlardır. Önceleri, projelerden elde edilen çok büyük miktardaki rastgele sekansların bir araya getirilmesini sağlayabilecek bilgisayar programları bulun-mamaktaydı. Bu projelerde kullanılan metotla, genom 40 kb lik parçalara ayrılıp bu parçalar uç kısımlarından eşleştirilerek sıraya dizilmekte, daha sonra her bir 40 kb lik parça küçük kısımlara ayrılarak genomun sekanslanması yoluna gidilmekteydi. Venter in grubu H. influenza nın 1.8 Mb lik genomunu shotgun metodu ile sekanslamıştır (110). TIGR tarafından geliştirilen bu bilgisayar programına TIGR-Assembler adı verilmistir. Bu program yaklaşık DNA parçasını genomda birleştirmiştir. Ancak bu kadar çok sekans bilgisinin birleştirilmesi yaklaşık 30 saat sürmüştür. Venter in H. influenza genom sekanslama projesi Ulusal Sağlık Enstitüsü (National Institute of Health) tarafından bir takım şüpheler nedeniyle reddedilmiştir. Bu dönemde 1.8 Mb büyüklükteki bir genomun sekanslanma projesinin tek bir bilgisayar programı ile gerçekleşemeyeceğine inanılıyordu. Ancak Venter geleneksel metoda göre yarı yarıya masrafla ve 13 ay gibi daha kısa bir sürede bu organizmanın genomunu doğru olarak sekanslamayı başarmıştır. Bu yeni sekanslama metodu sayesinde TIGR birçok organizmanın genomunu sekanslamıştır. Bu organizmalardan birisi de üreme sistemlerinde enfeksiyona neden olan Micoplazma genitalum bakterisidir. Bu bakterinin tüm genomu sekiz ay gibi kısa sürede shotgun metodu ile sekanslanmıştır. Bunu takiben TIGR, Archeae sınıfını temsilen Methanococcus fannaschii, kükürt metabolize eden hipertermofilik organizma Archaeglobus fulgidis ve ülser hastalığının patojeni olan Helicobacter pylori bakterilerinin genomlarının sekanslanmasını tamamlamıştır. TIGR, genom sekanslama alanında lider duruma geldikten

9 Genomik 531 sonra, 1997 yılında E. coli ve S. cerevisiae organizmalarının genom sekanslamasını da tamamlamıştır. Dünya çapında 100 laboratuvardan 600 bilim adamı maya genomunun sekanslanması için bir konsorsiyum oluşturmuşlardır ve 12 Mb lik genomu sekanslamışlardır. Bilindiği gibi E. coli ve S. cerevisiae, (sahip oldukları küçük genomlara rağmen) biyokimya, genetik, moleküler biyoloji ve endüstri alanlarında önemli model organizmalardır. Günümüzde, insan genomunun sekansının okunması işlemi tamamlanmıştır yılında toplam 200 Mb lık sekanslama yapılmışken 2003 yılında yalnızca DoE nin genom enstitüsünde ayda 1,5 milyar sekanslama yapılabilmiştir. Bu büyük gelişme doğal olarak robot sekanslama cihazlarının geliştirilmesiyle sağlanabilmiştir. İnsan genom projesindeki büyük ilerlemeleri takiben 2000 yılında Nature dergisinde ilk kez bir bitki genomunun (Arabidopsis thaliana) tam bir taslağı yayınlanmıştır (105). Bu çok uluslu başarı, bitki biyolojisi alanında yeni ufuklar açmıştır. Bitki genom çalışmaları insan genom çalışmalarıyla karşılaştırıldığında daha az göze çarpmaktadır, ancak birçok bilim adamı genomik araştırmaların pratik sonuçlarının insan sağlığı alanından önce, tarımsal alanda ortaya çıkacağına inanmaktadır. Bitki genomlarının çok büyük boyutlu oluşu, çok sayıda tekrar bölgesi içermesi ve tekrar bölgelerinin klonlamada sorun çıkarıyor olması gibi sorunlar nedeniyle genom sekanslama çalışmaları model olarak kabul edilen bitkiler üzerinde yoğunlaşmıştır. Bilim insanları seçtikleri bitki sistemlerindeki gen yapısı ve kromozomal organizasyonu karşılaştırmak için model türlerden gelen genomik bilgileri kullanmaya yönelmişlerdir. Arabidopsis thaliana çok küçük genom boyutu ve kısa hayat döngüsü (altı hafta) nedeniyle 1990 lı yıllarda model çiçekli bitki olarak seçilmiştir. Beş kromozomu ve 125 Mbç lik DNA sı ile bilinen en küçük genomlu dikotil çiçekli bitkidir. Bu model sistemi detaylı bir şekilde anlayabilmek için tüm genomunun sekansını ortaya çıkarmak amacıyla 1996 yılında Arabidopsis Genome Initiative (AGI) oluşturulmuştur. Bu çalışma Amerika, Fransa, İngiltere ve Japonya dan laboratuvarların katılımıyla başlamıştır. AGI, herbiri tüm genomun bir bölümü üzerine yoğunlaşan konsorsiyum üyelerinin çalışmalarını düzenlemiştir. Başlangıçta amaç, tüm genomun sekansını 2004 yılında tamamlamak iken, beklenenden çok daha kısa bir süre içinde, 2000 yılında, çalışma sonuçlanmıştır. Bu nedenle 2010 yılına kadar sekanslama projesi ile bulunan genin tamamının işlevini saptamak amacını kapsayan yeni bir hedef belirlenmiştir. Bu proje 2010 Projesi olarak adlandırılmıştır. Bu genomik uygulamalarının, çiçekli bitkilerin hayat döngülerindeki metobolik yollar ve olaylar arasındaki tüm bağlantıları aydınlatacağı ümit edilmektedir. Monokotil bir bitki olan çeltik, beslenme açısından dünyadaki en önemli tahıldır. Çeltik genomunun nispeten küçük oluşu (~430 Mbç) ve ekonomik değeri nedeniyle, çeltik genomu dünya çapında birçok grup için öncelikli hâle gelmiştir. Çeltik genomu mısır genomundan altı kez buğday genomundan ise 37 kez daha küçüktür. On ülkedeki halk destekli laboratuvarların ve özel şirketlerin beraberce yaptıkları sekanslama çalışmaları çeltik genomu hakkında bol miktarda bilgi sağlamıştır. Çeltik Genom Araştırma Programı na (Rice Genome Research Program) ve Uluslararası Çeltik Genom Sekanslama Projesi ne (International Rice Genome Sequencing Project) göre 367 Mb dan fazla çakışmayan (non-overlapping) sekans bilgisi genel veritabanlarına kaydedilmiştir. Bu projede shotgun sekanslama metodu kullanılmıştır ve çeltik genom sekanslama projesi tamamlanmıştır (64). Medicago truncatula, alfaalfa nın akraba-sıdır ve jenerasyon süresinin kısalığıyla,

10 532 Moleküler Biyoloji nisbeten küçük genom boyutuyla (~520 Mbç) model baklagil olarak seçilmiştir. Bezelye ve soya fasülyesi gibi baklagiller azot fikse eden bakterilerle olan simbiyotik ilişkileri nedeniyle çok önemlidirler. 28 Ekim 2003 tarihinde TIGR, Medicago truncatula nın Arabidopsis ve çeltikten sonra, tamamen sekanslanmış olacak üçüncü bitki türü olabileceğini bildirmiştir. Agronomik önemi mısırın sekanslama çalışmalarını da cazip kılmaktadır, ancak 2500 Mb büyüklüğündeki genomunun %80-85 i tekrar (repetitive) DNA dır. Bu durum shotgun sekanslamayı zorlaştırmaktadır. Tüm genomu sekanslamadaki bu güçlük, gen olmayan bölgeleri ayıklamak için laboratuvarlarda yeni yöntemler geliştirmeyi zorunlu hâle getirmiştir. Bu yöntemlerden birisi, gen alanlarının metil filtrasyonudur. Bu yöntem genom içindeki tekrar sekansların genellikle metillenmiş olması gözlemi üzerine dayanmaktadır. Diğer bir yöntem ise, genlerin nispeten bol bulunduğu yerleri belirleyen high cot selection method dur (79). Soya fasülyesi, pamuk, buğday, darı ve pancar gibi çok büyük genomlu bitkilerin genomlarını araştırmaya yönelik çalışmalarda doğrudan tüm genomu sekanslamak yerine haritalar, ETS kütüphaneleri, cdna kütüphaneleri, etiketlenmiş genler ve filtre edilmiş kütüphaneler gibi genomik araçlar üzerine yoğunlaşmıştır. Bu tip genomları tamamen sekanslamak tekrar DNA bölgelerinin çok yoğun olması nedeniyle çok zahmetli ve pahalıdır. Buna rağmen hızla gelişen teknoloji sayesinde günümüzde birçok bitkinin tüm sekansı çıkarılmış durumdadır Fragment Sekanslaması 1940 lı yıllarda DNA baz kompozisyonunu belirlemeye yönelik çalışmalar yapılmaya başlanmış olmasına rağmen nükleotit dizilerinin doğrudan kimyasal analizleri 1960 lı yıllarda kullanılmaya başlanmıştır li yıllarda ise daha etkin ve doğrudan nükleotit dizi analizi yöntemleri geliştirilmeye başlanmıştır. İlk DNA sekanslama yöntemi Wu ve Taylor (120) tarafından lfaj DNA sının yapışkan uçlarının sekanslanması ile elde edilmiştir. Elde edilen bu sekans 12 bç uzunluğundadır. Bu çalışma RNA sekanslama yöntemi kullanılarak yapılmış ancak DNA dizisinin belirlenmesi için uygun olmadığından, sonraki yıllarda tercih edilmemiştir yılında Allan Maxam ve Walter Gilbert tarafından geliştirilen kimyasal kırılma yöntemi, bir ucunda 32 P ya da floresan boya ile işaretlenmiş tek zincirli DNA ile başlamıştır. Eğer radyoaktif işaretleme yapılacaksa dizisi saptanacak olan zincir 5 -hidroksil ucundan polinükleotit kinaz enzimi kullanılarak işaretlenmektedir. İkinci adımda DNA örneği dört ayrı tüpe ayrılmakta ve zinciri belirli nükleotitlerden kıran dört farklı kimyasal reaksiyon uygulanmaktadır. Reaksiyonlar için kısıtlı bir süre verilerek her tüpte farklı pozisyonlardaki hedef nükleotitlerden kırılmış DNA parçaları elde edilmektedir. Bu DNA parçalarının bir kısmı 5 -hidroksil uçlarından 32 P ile işaretlidir, ancak kırılmanın olduğu pozisyona bağlı olarak farklı uzunluktadırlar. Örneğin okunacak DNA dizisi aşağıdaki gibidir P-GCTACGTA-3 Dört farklı tüpte gerçekleştirilen kırılma reaksiyonu sonucunda aşağıdaki DNA fragmentleri elde edilir. 1. tüp A da kırılma : 32 P-GCT 32 P-GCTACGT 2. tüp G de kırılma: 32 P-GCTAC tüp C de kırılma: P-G 32 P-GCTA tüp T de kırılma: P-GC 32 P-GCTACG

11 Genomik 533 Her bir karışımdaki DNA fragmentleri poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrımlanır. Elektriksel alanın etkisi ile herbiri farklı uzunlukdaki DNA fragmentleri birbirinden ayrılır. Kısa olan fragmentler jelde önde giderken daha uzun fragmentler daha geride kalır. Elektroforez işleminden sonra jelin otoradyogramı alınır. Yukarıdaki örnek Şekil 22.8 de şematize edilmiştir. Bu yöntemde DNA molekülleri belirli bazları modifiye eden sonra da kıran kimyasallarla muamele edilmektedir. Pürinler, guanini N-7, adenini ise N-3 pozisyonundan metilleyen dimetilsülfat ile kırılmaktadır. Isı uygulandığında metillenmiş pürinin glikozidik bağı kırılmaktadır. Alkali ortamda guaninden zincir kırılması gerçekleşirken sulandırılmış asidik ortamda hem adeninden hem de guaninden zincir kırılması gerçekleşmektedir. Pirimidinlerin kırılma reaksiyonlarında hidrazin kullanılmaktadır. Yüksek tuz derişiminde (2 M NaCl) hidrazinolizis timini atlar. Daha sonra piperidinle muamele edildiğinde sadece sitozinden kırılma olmaktadır. Böylece DNA G+A dan, sadece G den, T+C den ve sadece C den kırılmış olur. Jelin otoradyogramı alındığında Şekil 22.9 daki gibi bir görüntü elde edilmektedir (97). Maxam ve Gilbert in kimyasal kırılma yöntemiyle eş zamanlı olarak geliştirilen ve günümüzde de hâlen tercih edilen diğer bir yöntem Sanger ve arkadaşlarının (1977) geliştirdiği dideoksi diğer adıyla zincir sonlama yöntemi dir. Bu yöntemde kimyasal değişikliğe uğratılmış dideoksinükleotit trifosfatlar kullanılarak bir dizi DNA fragmentleri elde edilmektedir. Dideoksinükleotit trifosfatlarda 3 -OH grubu bulunmamaktadır. Bu durumda, molekül yeni sentezlenen DNA ya katılmakta, ancak 3 -OH grubu taşımadığı için kendisine nükleotit ilave edilememekte ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA fragmenti elde edilmektedir (Şekil 22.10) (88). Dört reaksiyon karışımı hazırlanır. Herbir reaksiyon karışımı kalıp DNA zinciri, bir primer, dntp lerin dördü ve az miktarda

12 534 Moleküler Biyoloji dideosinükleotit trifosfatlardan sadece birini (ddttp, ddctp, ddgtp, ddatp) içerir. Reaksiyonların herbirinde çok az miktarda modifiye nükleozit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak, bir dizi DNA fragmenti meydana gelir. Sekans reaksiyonları sonucunda oluşan bantları görüntüleyebilmek için genellikle radyoaktif işaretleme yöntemi tercih edilir. DNA molekülü radyoaktif izotoplar yardımıyla işaretlenir. İşaretleme reaksiyonlarında 32 P, 33 P ve 35 S izotopları kullanılır. İşaretleme primerlere yapılacağı gibi eklenen dntp lerden birinin radyoaktif olması da yeterlidir. Sentez sonrası, dört reaksiyondan elde edilen farklı uzunluklardaki radyoaktif DNA fragmentleri, yüksek çözünürlüklü denatüre edici poliakrilamit jel elektroforezinde yan yana dört ayrı kuyucukta yürütülür. DNA bantları otoradyografi ile görüntülenir ve jel aşağıdan yukarıya doğru okunarak nükleotit dizisi saptanır (Şekil 22.11) Genom sekanslama çalışmalarında ya da başka amaçlarla yapılan büyük boyutlu DNA sekanslama çalışmalarında genellikle otomatik sekanslama sistemleri tercih edilir. Sanger ve arkadaşlarının (88) geliştirdiği dideoksi yöntemini temel alan bu sistemlerde herbiri karakteristik bir dalgaboyunda ışık yayan dört farklı floresan boya ile işaretlenmiş dideoksinükleotitler kullanılır. PCR reaksiyonları tamamlandığında reaksiyon karışımı herbiri floresan işaretli bir dideoksinükleotit ile sonlanmış farklı uzunluklarda DNA fragmentleri içerir. Tüm reaksiyon karışımı kapiller içinde yer alan poliakrilamit jelde tek bir kuyucuğa yüklenir ve elektroforez uygulanır. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile jelde ilerleyen fragmentler, jelin alt kısmında yer alan bir lazer dedektöründen geçerler ve herbir fragmentin yaydığı dalga boyu saptanır. Elde edilen veriler sisteme bağlı bir bilgisayar yardımıyla değerlendirilir. Sonuçta dört farklı renkteki piklerin oluşturduğu bir model ortaya çıkar (Şekil 22.12). Farklı renkteki her pik farklı bir nükleotidi simgeler (18) Tüm Genomun Sekanslanması Yaşayan tüm organizmalar genomları içinde depolanan bilgiyi temel alarak kendilerini inşa ederler. Uzun bir DNA zinciri organizma tarafından üretilen tüm proteinleri kodlar. Genom sekanslama, ilgili genomun birinci kromozomundan sonuncu kromozomuna kadar DNA yı meydana getiren Adenin (A), Timin (T), Guanin (G) ve Sitozin (C) nukleotitlerinin doğru sırada okunmasını sağlar.

13 Genomik 535 Genom sekanslamada iki temel yaklaşım kullanılır: Yukarıdan-aşağı yaklaşım ve aşağıdan-yukarı yaklaşım. Yukarıdan aşağı yaklaşımda önce tek bir kromozom çok büyük parçalara ayrılır ve bu büyük parçaları içine alabilecek vektörlere klonlanarak genomik kütüphane oluşturulur. Daha sonra in situ hibridizasyon ile klonların kromozom üzerindeki özgül bölgeleri haritalanır. Bu büyük klonlar daha küçük parçalara bölünerek tekrar klonlanır ve bir alt kütüphane oluşturulur. Bundan sonraki aşama bu küçük klonların haritalanması ve sekanslarının okunmasıdır. Bu yaklaşımda fiziksel haritaların ayrıştırma kapasitesi düşüktür ve bu durum belirli genlerin bulunmasında kullanışlı olmayabilir. Günümüzde çoğunlukla tercih edilen yaklaşım aşağıdan-yukarı olanıdır. Aşağıdanyukarı yaklaşımda birbiri ile küçük çakışmalar gösteren klonlardan başlanarak tüm genomu kapsayan daha büyük parçalar oluşturulur. (Şekil 22.13). Aşağıdan-yukarı yaklaşım daha önce sadece küçük genomlar için kullanılırken shotgun (rastgele atış) yönteminin gelişti-rilmesiyle büyük genomlar için de kullanılabilir hâle getirilmiştir. Bir genomu sekanslamak oldukça zahmetli bir iştir. Sadece genomu küçük parçalara ayırıp nükleotit sekanslarını belirlemek yetmez. Verilerin düzenlenmesi ve analizi genom sekanslamanın en önemli kısmını oluşturur. Sekanslama aletleri çok büyük miktarlarda veri üretir. Ortaya çıkan bu veriler bilgisayar programları tarafından düzenlenir ve binlerce küçük DNA fragmentinin nükleotit dizisi doğru sırada birleştirilir. Aşağıdan-yukarı yaklaşımda büyük genomları sekanslamak için genel olarak iki strateji izlenir: 1) Tüm genomu shotgun yöntemi ile sekanslama ve 2) klon temelli sekanslama

14 536 Moleküler Biyoloji Tüm genomun shotgun (rastgele atış) yöntemi ile sekanslanması Bu yöntemde klonlama temelli sekanslamadaki fiziksel haritalama basamağı atlanır. Bu nedenle büyük genomlu organizmalarda shotgun yöntemi zamandan tasarruf sağlar. Bu yöntem tüm genomu çeşitli boyutlarda birçok parçaya ayırmakla başlar. Genomu parçalara ayırma işlemi DNA yı fiziksel olarak parçalamayla gerçekleştirilir. Sonraki aşamada klasik olarak plazmitlere klonlanan fragmentlerle bir genomik kütüphane oluşturulur. Büyük klonların herbir dizisi çıkarılmak ve doğru sıraya konulmak üzere daha küçük parçalara bölünerek bir alt kütüphane meydana getirilir. Shotgun yönteminde klonların gelişigüzel dizi analizi yapılır. Sekans verileri bilgisayar programlarıyla değerlendirilerek çakışan klonlar belirlenir. Çakışan klonların kapsadığı ortak DNA parçası kontig olarak adlandırılır. Son aşama olarak okunan diziler kontigler hâlinde birleştirilir ve sıralanır (Şekil 22.14) Klon temelli sekanslama Bu yöntem hiyerarşik shotgun sekanslama olarak da adlandırılır. Birinci aşama fiziksel haritalamadır. İlk önce kromozomların bir haritası oluşturulur. Bunun için 100 kb lık düzenli aralıklarla kromozomlar işaretlenir. Sonra işaretlenmiş kromozomların tanımlanabilen segmentleri plazmitlere klonlanır. Genom sekanslamada BAC (bacterial artificial chromosome) adı verilen özel bir tip plazmit kullanılır. Bu plazmitler yaklaşık kb uzunluğundaki DNA fragmentlerini taşıyabilirler. BAC kütüphanesi oluşturulduktan sonra plazmitlerin taşıdığı fragmentler restriksiyon enzimleriyle kesilerek daha küçük parçalara ayrılırlar. Bu şekilde klonların restriksiyon haritaları oluşturulur. Haritalar özel bilgisayar programlarıyla değerlendirilerek çakışan klonlar belirlenir. Kontigler arasındaki küçük boşlukları dolduran klonlar bulunarak aradaki açıklıklar kapatılır. Son aşama olarak bilgisayarın sıraladığı kontiglerin otomatik sekans

15 Genomik 537 aletinde dizisi belirlenir ve tüm genomun sekansı ortaya çıkarılmış olur (Şekil 22.15). Genomik DNA Restriksiyon enzimleriyle kesilir ve klonlan olu turulur Harita verileri bilgisayara yüklenerek ç k k ve uklar doldurulur ve nükleotit dizileri belirlenir. Tüm genom dizisi BAC ın E. coli den İzolasyonu Plakalardan seçilen BAC klonu steril koşullarda bir kürdan yardımıyla sıvı ortamda (Liquid Broth), bir gece 37 0C de çalkalanarak çoğalmaya bırakılır. Çoğalan klonların santrifüjlenerek çökelmesi sağlanır. Buradan BAC DNA izolasyonu metodu ile BAC DNA sı E. coli den izole edilir (Şekil 22.17). Bu amaçla çeşitli firmaların BAC DNA izolasyon kitleri bulunmaktadır (100) Sekanslamaya Başlanacak BAC ın Seçimi Oluşturulan BAC kütüphaneleri robotlar aracılığı ile membran filtrelere aktarılmakta ve aktarım sırasında BAC lar iki tekrarlamalı olarak membran filtrelere yerleştirilmektedir. Bunun amacı yanlış hibridizasyonları engellemektir. Oluşturulan membran filtreler ilgili DNA probu ile hibridize edilir. Ardından bu filtreden elde edilen bilgilerden plakalara dönülerek ilgili BAC seçilmektedir (Şekil 22.16).

16 538 Moleküler Biyoloji BAC DNA sının Küçük Parçalara (2-4 ve 4-8 kb) Ayrılması BAC DNA sı hydroshear adı verilen cihaz ile istenilen büyüklükte parçalara ayrımlanabilmektedir. Bu cihaz, belli bir kuvvetle dar bir alandan geçirilen DNA nın kırılması prensibine göre çalışmaktadır (Şekil 22.18). Cihazın itme hızı ayarlanabilmektedir ve bu şekilde yavaş itme ile büyük DNA parçaları, hızlı itmeyle küçük DNA parçaları oluşturulabilmektedir. Cihazdan elde edilen küçük DNA parçalarına subfragment adı verilmektedir Subfragmentlerin Sekanslama Plazmitlerinde Klonlanması Hydroshear cihazından elde edilen subfragmentler DNA ligaz enzimi ile puc18 veya puc119 plazmitlerine yapıştırılmaktadır. Elde edilen rekombinant plazmitler competent E. coli bakterisine transforme edildikten sonra bakteriler agar plakalara ekilerek koloni oluşturması sağlanmaktadır. Kolonilerin her biri kürdan yardımıyla 96-kuyucuklu plakalara transfer edilmekte burada bir gece sıvı ortamda bakterilerin çoğalması sağlandıktan sonra bu plakalarda çoğalan bakterilerden DNA izolasyonları gerçekleştirilmektedir İlgili BAC Alt Kütüphanelerinin PCR ile Çoğaltılması ve PCR Ürünlerinin Sekanslanması İzole edilen alt kütüphane plazmit DNA ları 96-kuyucuklu plakalara transfer edilir. Üzerine DNA polimeraz enzimi, floresan boya, dntp, ddntp ve plazmitin klonlama bölgesine yakın sekanslardan elde edilmiş primerler ilave edilir. Klonlama bölgesindeki bu DNA parçaları kalıp olarak kullanılır. DNA polimeraz enzimi bu parçaların karşılığına gelen dntp leri kullanarak zincir oluştururken eğer en sona floresan işaretli ddntp gelmişse zincir sonlanır. Floresan işaret her bir nukleotide özgü renk verir. PCR reaksiyonu sonucunda ortamda zincirlere eklenmemiş dntp ve ddntp ler bulunmaktadır. Bunların sekanslama cihazına yerleştirilmeden önce uzaklaştırılması gerekir. Bu artık nükleotitler uzaklaştırılmazsa sekanslama cihazı tarafından genom sekansıymış gibi değerlendirilecektir. Bu amaçla dntp ler amonyum asetat ile çöktürülüp etanol ile temizlenir. 96 kuyucuklu plakalarda bulunan PCR ürünleri otomatik sekanslama cihazına yerleştirilir. Otomatik sekans aletindeki kapiller yapıda oluşturulmuş olan akrilamit jellere örnekler yüklenir. Belli bir zaman diliminde elektroforez uygulanan jellerde nukleotitlere has olan renkler akarken lazer okuyucu bu renkleri algılayarak bilgisayara nukleotit olarak sırayla göndermektedir. Bir defada 96 örnek sekanslanmaktadır. Her bir klonun 1000 sekanslık bölümü sekanslanmakta ve otomatik sekans aletinin kapasitesine göre dört 96 lık plaka (ABI 3700) veya oniki 96 lık plaka (ABI 3730 XL) yerleştirilmektedir. Dolayısıyla dört plaka analiz edilecekse 4 96=384 örnek aynı anda sekanslanır. Her bir klonun 1000 sekanslık bölümü sekanslanabileceğine göre bir defada baz sekanslanabilmektedir. Eğer bu ABI 3730 XL cihazında yapılacaksa 8 saat içerisinde 12 96=1.184, = baz sekanslanabilmektedir.

17 Genomik Okunan Sekansların Birleştirilip Sıralanması Kontigler Reverse-uç Farklı renklerde floresan boyalarla işaretlenmiş olan fragmentlere otomatik sekanslama cihazında elektroforez uygulan-maktadır (Şekil 22.12). Elektroforez sırasında mavi renk veren C nükleotiti lazer okuyucu tarafından C olarak algılanmakta ve lazer okuyucu bilgisayara her gördüğü rengi sırayla aktarmaktadır (29). Sekanslanan parçalar bir BAC a ait parçalardır. Bunlar, uçları üst üste gelerek devam eden parçalardır. Bilgisayar programı (Consed) bu parçaları üst üste ekleyerek bir BAC sekansını elde etmeye çalışmaktadır (Şekil 22.19). Şekil da şeklin sol tarafında alt fragment klonlarının isimleri yer almaktadır. Bu klonların sekansları bir noktaya kadar devam etmekte ve bu noktadan sonra uç kısımlarına homolog olan diğer bir klon devam etmektedir. Böylelikle birbirini takip eden klonlar kontigleri oluşturmaktadır. Şeklin üst kısmında ise Consensus ile ifade edilen sıradaki sekanslar, birbirini takip eden klonların

18 540 Moleküler Biyoloji bütün sekanslarını göstermektedir. Bazen bu parçalar bir noktaya kadar tamamlanabilmekte, bir boşluk oluşmakta, boşluktan sonra diğer bir büyük parçanın sekansı tamamlanmaktadır. Böylelikle bir BAC a ait 2,3,4 gibi büyük, sekansı tamamlanmış parçalar oluşmaktadır. Bu parçalara kontig denmektedir. İki kontig arasında sekansı yapılamamış bölgeler bulunmaktadır. Bunlara boşluk (gap) adı verilmektedir. Bu kontiglerin birleştirilebilmesi için boşlukların da sekanslarının yapılması gerekmektedir Sekanslanmamış Bölgelerin Doldurulması (Gap filling) İki kontig arasında kalan sekanslanamamış bölgelerin mutlaka sekanslanması gerekmek-tedir. Boşlukların sekanslanabilmesi için önce iki kontigin uç kısımlarından primerler geliştirilmekte sonra da bu bölgelerin PCR ı yapılmak suretiyle oluşan ürünün sekansı belirlenebilmektedir (7). Ancak bu boşluk PCR ürününden çok daha uzun olabilir. Bu durumda boşluk bölgelerinde yer alan alt kütüphanedeki klondan transpozon kitler kullanılarak transpozon kütüphanesi oluşturulmaktadır (Şekil 22.20). Transpozon ilgili fragmentin üzerinde birkaç yere rastgele yerleşmektedir. Transpozonun uç kısımlarının sekansı bilindiği için bu bölgelerin primerleri kullanılarak PCR ı yapılmaktadır. Böylece sekansı yapılamayan boşluk bölgesinin birkaç yerine yerleşen transpozon sayesinde PCR ürünleri elde edilmektedir. Bu ürünler sekanslandıktan sonra bilgisayar programına yerleştirilerek analizleri yapılır ve bütün kontigler birleştirilerek bir BAC klonunun sekansı tamamlanmış olur. Ancak bir genoma ait sekansların tümü ortaya çıkarıldığı zaman sekanslanması tamamlanmış demektir. Genomda aynı nukleotit motiflerini tekrarlayan bölgeler bulunmaktadır. Bu bölgeler genom içinde çeşitli bölgelerde tekrar etmektedir. Bu nedenle sekanslar ayrı ayrı bölgenin sekansıymış gibi görünmektedir. Bu bölgenin sayısı ve uzunluğu türlere göre değişmektedir (104). Bu nedenle bazı genomların sekanslanmaları tamamlanamamıştır. Örneğin Arabidopsis genomunun %92 si, Drosofila nın %97 si tamamlanabilmiştir (103) Elde Edilen Sekans Bilgilerinin Gen Bankasına Sunulması ve Sekans Analizi DNA sekanslama teknolojisi geliştiğinden beri çok sayıda sekans bilgisi gen bankalarına sunulmuştur. Dünyada üç adet gen bankası vardır. Bunlar National Center for Biotechnology Information (NCBI), The DNA Databank of Japan ve İngiltere deki The European Bioinformatic Institute tir (4, 5, 96, 101). Bu üç grup dünya çapında rapor edilen yeni sekans bilgilerini kabul etmektedir. Ayrıca bu üç grup kendi arasında bilgi akışını da düzenlemektedir. Böylelikle bu üç gruptan birinin web sitesine girilip ilgili formlar doldurularak sekans bilgileri de eklenmektedir. Web sitesi öncelikle otomatik olarak sunulan sekansın yeni olup olmadığını araştırmakta ve yeni ise kabul etmektedir. Dolayısı ile bu sekansın ilk yayınlama hakkı elde edilmiş olur. Diğer yandan elde edilen sekansın hangi organizmada var olduğu BLAST search programı ile yapılabilir. Ya da iki sekans bilgisi arasında ne kadar benzerlik olduğu yine bu web sitelerinden araştırılabilir. Son zamanlarda geliştirilen gen tahmin bilgisayar programları sayesinde elde edilen sekanslar içinde hangi bölgelerin gen bölgesi, hangi bölgelerin anlamsız bölgeler olduğu ve bu anlamsız bölgeler içinde hangi sekans motiflerinin bulunduğu saptanabilmektedir. Bu programlar gen tahminlerinde promotor sekans (TATA, CAT) motiflerini, ekzon-intron birleşme sekanslarını (AG/GU) ve stop kodonlarını dikkate alarak ORF leri ortaya çıkarır. Diğer yandan anlamsız bölgelerde ise tekrar eden sekans motifleri dikkate alınmaktadır. Örneğin, Haemaphilus influenza genom sekansı gen bankasında analiz edildiğinde 1743 adet protein kodlayan gen olduğu tah-

19 Genomik 541 min edilmiştir (26). Gen tahminleme bilgisayar programlarına göre bazı organizmalarda tahmin edilen gen sayıları: İnsanda , Arabidopsis te , Drosofila da , C. elegans ta , S. cerevisiae de dür. Görüldüğü gibi başlangıçta olarak tahmin edilen insandaki gen sayısı Celera Genomics in yaptığı çalışmalarla gene inmiştir. En son yapılan sekanslama çalışmalarıyla protein kod eden gen sayısının olduğu belirtilmektedir. European Molecular Biology Laboratory (EMBL) UK Human Genom Mapping Project GenBank DNA Databank of Japan Open Reading Frame (ORF) finder Sequence translation : Teknoloji Roche/GS-FLX Titanium Illumina/HiSeq 2000, HiScan Amplifikasyon Emulsion PCR Bridge PCR (Cluster PCR) Okuma uzunluğu bp bp ABI/SOLiD 5500 l Emulsion PCR bp Polonator/G.007 Emulsion PCR 26 bp Helicos/Heliscope No 35 (25 55) bp Yeni Nesil Sekanslama ( YNS) Son beş yıldır genom analizi için Sanger sekanslama uygulaması kullanılmamaktadır. Sanger metodu yaklaşık 20 yıl endüstride baskın olmuş ve insan genom sekanslamasının tamamlanması gibi çok sayıda önemli başarıların elde edilmesini sağlamıştır (45). Bu dönemde teknik açıdan pek çok ilerleme olmuşsa da, Sanger sekanslamanın kısıtları büyük insan genomlarının sekanslanması için yeni ve gelişmiş bir teknolojiye ihtiyaç olduğunu göstermiştir. Günümüzdeki çalışmalar, Sanger sekanslamanın avantajlarına rağmen bırakılarak yeni metotların geliştirilmesi yönünde ilerlemektedir (44, 67). Sanger metodu ilk-nesil teknoloji olarak isimlendirilirken, daha yeni metotlar ise yeninesil sekanslama (next-generation sequencing) olarak adlandırılmaktadır. Bu yeni teknolojiler, kalıp hazırlama, sekanslama, görüntüleme ile genom sıralama ve birleştirme işlemlerine dayalı çeşitli stratejiler oluşturmuşlardır. YNS teknolojilerinin pazara girmesi, temel, uygulamalı ve klinik araştırmalardaki bilimsel bakış açılarını değiştirmiştir. YNS tarafından sunulan en büyük fayda, çok büyük miktarda veriyi ucuza üretme yeteneğine sahip olmasıdır. Bazı durumlarda cihazın tek sefer çalıştırılması ile 1 trilyon bazlık kısa okumalar elde edilebilir. Bu özellik, sadece baz sıralarının belirlenme- Okuma miktarı 500Mbp/ çalışma 200Gbp/ çalışma >100Gbp/ çalışma 8 10Gbp/ çalışma 21 37Gbp/ çalışma Sentez yoluyla sekanslama Pyrosequencing Geri çevrilebilir terminatörler Ligasyonla sekanslama (oktamerler) Ligasyonla sekanslama (monomerler) Gerçek tek molekül sekanslama (tsms)

20 542 Moleküler Biyoloji sinin ötesinde bir dünya sunmuştur. Örneğin, gen ekspresyonu çalışmalarında kullanılan mikroarraylerin yerini, RNAseq (RNA nın direkt veya cdna ya çevrilerek dizilenmesi) gibi, belirli bir gene ait ön bilgiye ihtiyaç duyulmadan, az bulunan transkriptlerin tespit edilerek ölçümlenmesini ve tespit edilen genlerde alternatif splays ve sekans varyasyonu ile ilgili bilgi sağlayabilen sekans bazlı metotlar almıştır (113, 119). İlgili pek çok organizmanın genomunun tamamının sekanslanabilmesi, geniş ölçekli karşılaştırmalı çalışmalar ile evrimsel çalışmaların yapılabil-mesine olanak sağlamıştır ki bu sadece birkaç yıl öncesine kadar hayal bile edilemezdi. YNS nın en geniş uygulaması, genetik farklılıkların sağlık ve hastalıkta nasıl etkili olduklarının daha iyi anlaşılması amacıyla insan genomlarının tekrar sekanslanması olabilir. YNS özelliklerindeki çeşitlilik, çoklu platformların pazarda birlikte yer almasına neden olabilecektir ve böylelikle belirli uygulamalarda diğerlerine göre bazı avantajlar sağlanabilecektir YNS teknolojileri Sekanslama teknolojileri, genel olarak kalıp hazırlama, sekanslama ve görüntüleme ile veri analizine göre gruplanan birkaç metottan oluşur. Belirli protokollerin özgün kombinasyonları bir teknolojiyi diğerinden ayırır ve her bir platformdan elde edilen veri tipini belirler. Elde edilen verilerdeki bu farklılıklar, platformların veri kalitesi ve maliyetinin karşılaştırılmasında zorluklara neden olmaktadır. Kalite değerlendirmeleri ve doğruluk tahminleri her bir üretici tarafından sağlansa da, bir platform ile diğer bir platformun kalite temeli arasında ortak bir görüş bulunmamaktadır (70). YNS reaksiyonları için kalıp hazırlamada kullanılan iki metot bulunmaktadır: (i) Tek DNA molekülünden klonal olarak çoğaltılmış kalıplar ve (ii) Tek DNA molekülü kalıpları. Sentez yolu ile sekanslama kavramı literatürde çok sayıda DNA polimeraz bazlı metodu tanımlamak için kullanılır ancak burada kullanılmaz çünkü sekanslamanın içinde yer alan farklı mekanizmaları tanımlamak için yetersiz kalmaktadır (24, 67). Onun yerine bu metotlar döngüsel tersinir terminasyon (cyclic reversible termination), tek-nükleotit ekleme (SNA) ve real-time sekanslama şeklinde sınıflandırılır. Ligasyon ile sekanslama (LİS), DNA polimeraz yerine DNA ligaz ile gerçekleştirilen bir yaklaşımdır. Bu sekanslama stratejilerine eşlik eden görüntüleme metotları, biyolüminesans sinyallerin ölçü-münden tek molekül olaylarının dört renk görüntülenmesine kadar olan bir aralıkta değişmektedir. Günümüzde kullanılmakta olan dizileme teknolojileri Tablo 22.1 de özetlenmiştir. YNS platformları ile üretilen çok miktarda veri, veri depolama, izleme ve kalite kontrolü bakımından enformasyon teknolojisi üzerinde büyük bir yer teşkil etmektedir (82) DNA kalıp dizilerinin hazırlanması Araştırılan genomu temsil eden ve sapma göstermeyen bir nükleik asit materyali kaynağını üreten güçlü metotlara duyulan ihtiyaç göz ardı edilemez. Güncel metotlar genellikle genomik DNA yı ya fragment kalıpları ya da ikili eş kalıpları şeklinde rastgele küçük parçalara ayırır. YNS teknolojileri arasında, sekanslanacak DNA kalıbının katı bir yüzeye veya desteğe bağlanmış veya sabitlenmiş olması dolayısıyla benzerlik bulunmaktadır. Kalıp dizilerine ait her bir DNA molekülünün bölgesel olarak kısıtlı şekilde immobilizasyonu aynı anda binden milyara kadar sekanslama reaksiyonunun gerçekleşmesine olanak sağlar.

21 Genomik 543

22 544 Moleküler Biyoloji Klonal olarak çoğaltılmış kalıplar Pek çok görüntüleme sistemi tekli floresan olaylarının tespit edilmesi için tasarlanmamıştır ve bu nedenle de çoğaltılmış kalıplara gereksinim duyul-maktadır. En yaygın metotlardan ikisi emülsiyon PCR (empcr) (20) ve katı faz amplifikasyonudur (25). EmPCR, hücre içermeyen bir sistemin içinde sekanslama kalıplarının hazırlanması için kullanılır ve bu da genomik DNA nın gelişigüzel kaybını (bakteriyel klonlama metotlarının doğasında vardır) önlemek açısından avantajlıdır. Fragment veya ikili eş kalıplarının kütüphanesi oluşturulur ve ortak başlangıç dizilerini içeren adaptörler kalıp uçlarına bağlanır ve böylece karmaşık genomların ortak PCR primerleri ile çoğaltılması sağlanır. Ligasyondan sonra DNA tek ipliklere ayrılır ve her bir yuvarlak boncuk için bir DNA molekülü olmasını kolaylaştıran koşullarda taneciklerin yüzeyine tutturulur (Şekil 22.21a). Su damlacıkları içeren yağ-su emülsiyon sisteminde, kalıp DNA miktarının yeterince düşük tutulması, boncuk içeren herbir damlacıkta en fazla bir DNA molekülünün bulunmasıyla sonuçlanır (93). EmPCR taneciklerinin amplifikasyonu ve zenginleştirilmesinin ardından, poliakrilamit jel içinde standart mikroskop slaydının (Polonator) (92) üzerine immobilize edilebilir. Amino ile kaplanmış cam bir yüzeye (Life/APG; Polonator) (49) kimyasal olarak bağlanabilir veya içinde YNS kimyasının yürütülebileceği bireysel PicoTiter Plate (PTP) kuyucuklarının (Roche/454) (56) içine konulabilir. Katı faz amplifikasyonu da cam bir slayt üzerinde fragment veya eş-çifti kalıplarından elde edilen rastgele dağılmış ve klonal olarak çoğaltılmış kümelerin elde edilmesi amacıyla kullanılabilir (Şekil 22.21b). Yüksek yoğunluklu forward ve reverse primerler slayda kovalent olarak tutturulur ve destek üzerinde bulunan primerlerin kalıba göre oranı, çoğaltılan kümelerin yüzey yoğunluğunu tanımlar. Katı faz amplifikasyonu, YNS reaksiyonunun başlaması için hibridize edilen ortak bir sekanslama primeri için serbest uç sağlayan milyon sayıda farklı bölgelerde konumlandırılmış kalıp kümesini (Illumina/Solexa) oluşturabilir. Tek-molekül kalıpları Klonal amplifikasyon metotlarının bakteriyel klonlamaya göre avantajları olmasına rağmen, bazı protokollerin uygulaması zor olmakta ve çok miktarda genomik DNA materyaline (3-20 μg) gereksinim duyulmaktadır. Tek-molekül kalıpların hazırlanması daha kolaydır ve daha az başlangıç materyaline (< 1μg) gereksinim vardır. Daha da önemlisi, bu metotlar klonal olarak çoğaltılmış kalıplarda yanlış sekans okuma varyantları gibi davranan ve mutasyonlar yaratan PCR a gereksinim duymazlar. AT ve GC ile zengin hedef kalıp sekansları da, elde edilen üründe yanlış amplifikasyonlar gösterebilmekte ve bu da onların genom dizilimi ve kontiglerin birleştirilmelerinde olduklarından daha az temsil edilmelerine neden olmaktadır. RNA-seq (113) gibi kantitatif uygulamalar, amplifiye edilmemiş kalıp kaynakları ile daha etkili sonuç vermektedirler. Bu da mrna moleküllerinin temsili yoğunluğunda bir değişikliğe neden olmamaktadır.

23 Genomik 545 b YNS reaksiyonu gerçekleştirilmeden önce, tek-molekül kalıpları çoğunlukla katı yüzeylerin üzerine immobilize edilir. Bunun için ilk yaklaşımda, bölgesel olarak dağılmış bireysel primer molekülleri katı bir desteğe kovalent olarak bağlanır (37). Başlangıç materyalinin rastgele küçük parçalara (yaklaşık bç) ayrılarak ortak adaptörlerin parça sonlarına eklenmesiyle elde edilen kalıp, daha sonra katı desteğe immobilize edilmiş primer ile hibridize edilir (Şekil 22.21c). İkinci yaklaşımda, tek iplikli tek-molekül kalıplarının immobilize primerler ile başlatılması ve uzatılması ile bölgesel olarak dağıtılmış tek-molekül kalıpları katı desteğe kovalent olarak bağlanır (Şekil 22.21c). Daha sonra ortak bir primer kalıba hibridize edilir (Şekil 22.21d). Her iki yaklaşımda da, YNS reaksiyonunun başlaması için DNA polimeraz enzimi immobilize ve primer eklenmiş kalıp yapısına bağlanabilir. Bu yaklaşımların ikisi de Helicos BioSciences tarafından kullanılmaktadır. Üçüncü bir yaklaşım ise, dağınık tekli polimeraz moleküllerinin katı desteğe (22) tutturulmasıdır (Şekil

24 546 Moleküler Biyoloji 22.21e). Bu yaklaşım, Pacific Biosciences (22) tarafından kullanılmakta olup, Life/VisiGen (35) ve LI-COR Biosciences (118) patentlerinde açıklanmaktadır. Bu teknik ile daha büyük DNA molekülleri kullanılabildiği gibi, aynı zamanda bu teknik ile ilk iki yaklaşımın aksine potansiyel olarak daha uzun okumaların elde edildiği real-time metotları ile de kullanılabilir Sekanslama ve Görüntüleme Klonal olarak çoğaltılmış kalıplar ile tek molekül kalıpların sekanslanması arasında temel farklılıklar mevcuttur. Klonal amplifikasyon, her birinin sekanslama reaksiyonuna girdiği, birbirinin aynı kalıplardan oluşan bir populasyon ile sonuçlanır. Görüntülemede, gözlenen sinyal belirli bir döngü için birbirinin aynı olan kalıplara eklenen nükleotit veya probların bir sonucudur. Bu, ekleme işleminin etkinliğine daha büyük bir önem verilmesi ihtiyacını doğurmaktadır ve kalıp grubunun eksik uzaması (dephasing) kesintili DNA ipliğinin tamamlanamaması ile sonuçlanır. Belirli bir döngüde çoklu nükleotit veya prob eklenmesi de meydana gelebilir ve bu da kesintisiz DNA ipliğinin tamamlanamamasına neden olur. Floresan kirliliği ile birlikte erken sonlanma sinyalinin artması, baz hatalarına ve daha kısa okumalara neden olur (23). İpliğin tamamlanamaması tek molekül kalıplarıyla ilgili olmadığından döngü etkinliği gereksinimi yoğun değildir. Buna rağmen ortamda bulunan tek molekül kalıpları, herhangi bir döngüdeki çoklu nükleotit veya prob eklemelerine karşı hassastırlar. Burada komşu iki floresan molekülü arasında engelleme etkisinin olması nedeniyle ya delesyon hataları meydana gelecek veya floresan işaretlenmemiş nükleotitlerin veya probların da dâhil olması nedeniyle hiç bir sinyal tespit edilemeyecektir. Döngüsel tersinir terminasyon (DTT) İsminden de anlaşılacağı gibi DTT, nükleotit ekleme, floresan görüntüleme ve ayrılmayı içeren döngüsel bir metotta tersinir terminasyonları kullanmaktadır. İlk basamakta, DNA polimeraz primer eklenmiş kalıba bağlanır, bu enzim bağlandığı kalıba sadece bir adet floresan işaretlenmiş eşlenik nükleotit ekler. DTT nin önemli bir özelliği, tek bir nükleotitin eklenmesinden sonra DNA sentezinin sonlanmasıdır. Eklemenin ardından, geriye kalan eklenmemiş nükleotitler yıkanarak uzaklaştırılır. Daha sonra görüntüleme ile eklenmiş olan nükleotitlerin kimlikleri tespit edilir. Bu aşamayı floresan boyalar ve sonlandırıcı grupların uzaklaştırıldığı ayırma basamağı takip eder. Bir sonraki ekleme basamağından önce ek bir yıkama işlemi gerçekleştirilir. Şekil 22.22a, Illumina/Solexa tarafından kullanılan dört-renk DTT döngüsünü, Şekil 22.22c ise Helicos BioSciences tarafından kullanılan tekrenk DTT döngüsünü göstermektedir. DTT metodunun anahtarı 3 blokeli olan ve 3 blokeli olmayan iki çeşit tersinir terminatördür. Sanger sekanslamada zincir sonlandırıcı olarak görev yapan dideoksinükleotitin kullanımı, nükleotitlerin 3 ucuna bağlı olan tersinir engelleme gruplarının geliştirilmesinde temel olmuştur (11, 68). 3 -O-alil-2 - deoksiribonükleosid trifosfatlar (dntp ler) (47) ve 3 -O-azidometil-dNTP ler (33) gibi engelleyici gruplar DTT de başarılı bir şekilde kullanılmaktadırlar. 3 -blokeli terminatörler, nükleobazı florofordan ayırmak ve 3 -OH grubunu onarmak için iki kimyasal bağın ayrılmasını gerektirirler.

25 Genomik 547 Günümüzde YNS pazarında Illumina/ Solexa Genome Analyzer (GA) (6) daha yaygındır ve Şekil 22.22a da verilen dört-renk DTT metodu ile birlikte Şekil 22.21b de gösterilen klonal olarak çoğaltılmış kalıp metodunu kullanmaktadır. Bu dört renk, Şekil 22.22b deki gibi iki lazer kullanan total internal reflection fluorescence (TIRF) ile saptanmaktadır. Slayt, aynı anda birbirinden bağımsız örneklerin çalışılabildiği sekiz kanala bölünmüştür. Tablo 22.2, Baylor Tıp Koleji İnsan Genom Sekanslama Merkezin-de (BCM-HGSC) çalışılan Illumina/Solexa GA II platformunun güncel sekanslama istatistiklerini göstermektedir. En yaygın hata tipi yer değiştirmeler olup, bir önce eklenen nükleotitin G bazı olması durumunda daha yüksek olduğu belirlenmiştir (19). Illumina/Solexa verilerinin genom analizi, kalıp hazırlama sırasındaki amplifikasyon eğilimi nedeniyle AT (19, 36, 40) ve GC ile

26 548 Moleküler Biyoloji (36, 40) zengin bölgelerin daha az temsil edildiğini ortaya koymuştur. Sekans değişkenleri, MAQ (59) veya ELANG (6) gibi biyoinformatik araçlar ile dizilim okumalarının referans genoma göre hizalanmasıyla belirlenmektedir. Helicos BioSciences, tek-molekül sekanslama cihazını (HeliScope) ilk defa ticarileştiren gruptur (8). HeliScope, Şekil 22.21c ve 22.21d de gösterilen tek-molekül kalıp metodunu, Şekil 22.22c de yer alan tek-renk (Cy5 boyası) DTT metodu ile birlikte kullanmaktadır ve bir nükleotit eklenmesi bir floresan sinyaline neden olmaktadır. HeliScope ayrıca Cy5 boyasını (görüntüleme sonucu Şekil 22.22d de gösterilmiştir) görüntülemek için TIRF kullanmaktadır. Harris ve arkadaşları (37), terminatör grubu olmayan daha önceki bir sürüm (Cy5-12ss-dNTP ler) kullanarak homopolimerik tekrar bölgelerinde delesyon hatalarının oluştuğunu ve bu hataların Şekil 22.21c de gösterilen immobilize edilmiş primer stratejisi kullanıldığında en yaygın olan hata tipi (frekansı yaklaşık %5) olduğunu rapor etmiştir. Bu hatalar iki-geçişli sekanslama ile büyük oranda azaltılabilmektedir (Şekil 22.21d) yılında Genom Biyolojisi ve Teknolojisindeki İlerlemeler (AGBT) toplantısında Helicos grubu Caenorhabditis elegans genomunun sekanslanmasında kaydettikleri ilerlemeyi bildirmiştir. Cihazın 50 kanalından sadece 7 sinin kullanımı ile gerçekleştirilen tek bir HeliScope çalışmasında, yaklaşık olarak 2,8 Gb yüksek kalitede veri 8 günde elde edilmiştir. Bu veriler 0,1 veya 2 hata ile 25 bazdan daha büyük okumaları içermektedir. Bu sekanslama metodu ile genomun %99 undan fazlasının kapsandığı rapor edilmiştir, 5 kattan daha fazla kapsamanın olduğu bölgelerde doğruluk oranı % a varmıştır. Ligasyon ile sekanslama LİS, DNA ligaz (106) ile tek-baz veya iki-baz-kodlu probların kullanımı açısından DTT den farklılık gösteren bir başka döngüsel metottur. En basit şekliyle, floresan ile işaretlenmiş bir prob, primer eklenmiş kalıba komşu olan tamamlayıcı sekansa hibridize olur. Daha sonra DNA ligaz enzimi primere floresan ile işaretlenmiş olan probu ekler. Floresan eklenmemiş probların yıkanarak uzaklaştırılmasının ardından, ligasyona uğramış probun kimliğinin belirlenmesi için floresan görüntüleme yapılır (54). Bu döngü, floresan boyayı uzaklaştırmak ve takip eden ligasyon döngülerine yeni bir 5 -PO 4 grubu oluşturmak için, kırılabilir problar kullanarak (Şekil 22.23a), veya 5 -PO 4 grubu kalıptan uzaklaştırılıp kalıba yeni bir primer hibridize edilerek tekrarlanabilir. LİS metodu Escherichia coli MG1655 suş genomunun sekanslanmasında kullanılmıştır (92). A1 ve A2 adı verilen dört başlangıç bölgesi ile birbirinin eşleri olan kalıplar hazırlanmış ve empcr ile amplifiye edilmiştir (Şekil 22.21a). 1-problarından (1.bazı işaretli problardan) 7-problarına (7. bazı işaretli problara) değişen baz kodunu içeren tek baz kodlamalı problar kullanılmıştır. LİS in ilk döngüsünde A1 primeri kalıba bağlanır, bunu takiben 1-probunun (1. nükleotidi işaretli prob) hibridizasyonu ve yapışması, 4 renkli görüntüleme, ve kalıba bağlı olan katı fazdan primer prob sarmalının tümden ayrılması ve gerçekleşir. LİS döngüsü daha sonra A1 primeriyle fakat 2-probu ile tekrar edilir. A1 primeri ile ve 3-probuyla tekrar edilir ve bu böylece devam eder. Ardından, diğer 3 primer olan A2, A3 ve A4 benzer şekilde döngüye sokulur ve sonunda her bir genomik uçtan 6 (A2 ve A4 ile) ya da 7 (A1 ve A3 ile)bazlık (ayrık) okumalar oluşturulur ve her bir ikili eş (mate-pair) kalıbında toplam 26 bazlık okumalara ulaşılır. Cihazın iki defa çalıştırılması ile yaklaşık 48 milyon yüksek kalitede dizi üretilerek E. coli genomunun yaklaşık %70 i haritalanmıştır. Bu LİS metodu için Polonator cihazı kullanılmıştır.

27 Genomik 549

28 550 Moleküler Biyoloji Life/APG, support oligonucleotide ligation detection (SOLiD) adı verilen LİS platformunu ticarileştirmiştir (109). Bu metotta SNV sinyali ve renk sinyalinde (daha sonra bu sistem adjacent valid colour change olarak isimlendirilecektir) okuma doğruluğunu arttıran bir avantaja sahip olan iki baz kodlamalı problar kullanılmaktadır. Bu iki baz kodlamalı problar ile elde edilen gelişmiş renk kesinliği SOLiD e özgü bir özelliktir. Kalıplara hibridize edilen primer ile amplifikasyonlar empcr yoluyla gerçekleştirilir (Şekil 22.21a). 1,2-prob hibridizasyonu ve yapışması, görüntülenmesi ve prob ayrılması döngüsü on defa tekrar edilerek beş-nükleotit aralıklarla on renkli sinyaller üretilir (Şekil 22.23a). Nükleotit ilave edilmiş (Uzamış) primer daha sonra katı faza bağlı kalıplardan uzaklaştırılır. İkinci bir yapışma (ligasyon) işlemi, kodlu (işaretli) bazları sıfırlayan ve bunlara karşılık gelen on renkli sinyalleri bir baz sola kaydıran n-1 primeriyle gerçekleştirilir. Üç ligasyon döngüsünü on ligasyon döngüsü daha izler. Beş ligasyon döngüsünden gelen renk sinyalleri daha sonra lineer bir sekans içinde sıralanır ve referans bir genoma göre DNA sekansının şifresi çözülür (Şekil 22.23b). SOLID çalışma başına 2 slayt kullanır; her biri nokta adı verilen dört veya sekiz bölgeye bölünebilir. Tablo 22.2 de, BCM-HGSC de kullanılan Life/APG platformunun güncel sekanslama istatistiklerini gösterilmektedir. Bu tabloda görüleceği gibi, en yaygın hata tipi yer değiştirmelerdir. Illumina/ Solexa nın genom analizine benzer şekilde, SOLID verileri de AT ve GC ile zengin bölgelerin daha az temsil edildiğini ortaya koymuştur. Shen ve arkadaşları (91), SOLID verilerinin MAQ diziliminin gerçek değişkenlerin belirlenmesinde yetersiz olduğunu göstermiştir. Tek-nükleotit ekleme: pirosekanslama Pirosekanslama, bir dizi enzimatik reaksiyon ile inorganik pirofosfatı orantılı bir şekilde görünür ışığa dönüştürerek, serbest bırakılan inorganik pirofosfatın ölçüldüğü elektroforetik olmayan bir biyolüminesans metodudur (86, 87) (Şekil 22.23c). DNA sentezini sonlandırmak için modifiye nükleotitleri kullanan diğer sekanslama yaklaşımlarının aksine pirosekanslama metodu, sınırlı miktarda dntp nin tek bir sefer eklenmesi yoluyla DNA polimerazı manipule eder. Komplementer dntp nin eklenmesi üzerine DNA polimeraz primeri uzatır ve durdurur. Bir sonraki komplementer dntp nin uygulanan döngü içerisine dâhil olması ile DNA sentezi yeniden başlatılır. Işık tepe noktalarının sırası ve yoğunluğunun flowgramlar şeklinde kaydedilmesiyle DNA sekansı açığa çıkarılır (Şekil 22.23d). Margulies ve arkadaşları (63), pirosekanslamanın YNS platformuna ilk olarak entegre edilmesini kendi PTP cihazları ile gerçekleştirmiştir. Pirosekanslama, PTP kuyucuklarının içine 1-2 milyon boncuğun konulması ile gerçekleştirilen ve empcr ile hazırlanan DNA kalıplarını kullanan Roche/454 cihazı ile ticarileştirilmiştir (Şekil 22.21a). Roche/454 son günlerde titanyum kaplı PTP dizaynını piyasaya sunmuştur. Bu dizayn, klonal olarak amplifiye edilmiş tek tür boncukları içeren komşu kuyucuklar arasındaki çapraz iletişimi azaltarak okuma uzunluğunu ve veri kalitesini önemli ölçüde artırmıştır. Işık üretimini kolaylaştırmak için sülfürilaz ve lusiferaz bağlanmış olan daha küçük boncuklar, içerisinde kalıp boncuklarını bulunduran kuyucukların içine yüklenir. Ardından kuyucuklarda birbirinden ayrı dntp lerin akışı sağlanır ve dntp ler önceden belirlenmiş olan sekans sırasında dağıtılır. Biyolüminesans, bir charge-coupled device (CCD) kamerası ile görüntülenir (Şekil 22.23c). Tablo 22.2, BCM-HGSC de çalışılan Roche/454 platformuna ilişkin güncel sekanslama istatistiklerini göstermektedir. Daha kısa okumalar yapan platformların aksine Roche/454 platformu, ikili eş kalıplarının sekanslanması için iki kat daha fazla çalıştırılmaya gerek duymaz. Altı nükleotite kadar olan homopolimerik tekrarlar için eklenen dntp lerin sayısı ışık sinyali ile doğru orantılıdır.

29 Genomik 551 İnsersiyonlar, delesyonları takip eden en yaygın hata tipidir. Real-time sekanslama Günümüzde next-generation teknoloji metodunun ticari pazarını negatif etkileyen real-time sekanslama uygulamalarının başını Pacific Biosciences çekmektedir. Tersinir terminatörlerin aksine, real-time nükleotitleri DNA sentez işlemini durdurmaz. Real-time sekanslama metodu DNA sentezi sırasında floresan ile işaretli nükleotitlerin sürekli olarak eklenmesini görüntüleyen bir metottur (69). Pacific Biosciences platformunun çalışma prensibinde, DNA polimeraz molekülü zero-mode waveguide (ZMW) detektörünün alt yüzeyine tutturulmuştur (57) (Şekil 22.24a). Primere fosfor bağlanmış nükleotit eklendikçe (Şekil 22.24b) sekans bilgisini okumaktadır. Real-time sekanslamada konvansiyonel belirleme yöntemlerini kullanarak sinyal ölçümlerini iyileştirmeye yönelik başka yaklaşımlar da önerilmiştir. Örneğin, Life/VisiGen, daha gelişmiş sinyal verebilen floresan bir boyanın bağlı olduğu DNA polimerazlar geliştirmiştir. LI-COR Biosciences, baza bağlı floresan ışıma şiddetini azaltan bir grubun varlığında düşük sinyaller üreten floresan ışıma azaltıcı nükleotitler üzerinde çalışmaktadır. Boya ile işaretli pirofosfat analoğunun immobilize DNA polimerazdan uzaklaştırılması floresan bir sinyal üretir.

30 552 Moleküler Biyoloji Pacific Biosciences, işlem yeteneği yüksek, iplik yerini değiştiren φ29 DNA polimerazı kullanmaktadır. Çünkü bu polimeraz fosfo-bağlı nükleotitleri etkin bir şekilde ekler ve kapalı dairesel kalıpların yeniden sekanslanmasına izin verir. Bu metodun kesinliğini değerlendirmek için, bilinen 150 bç lik bir lineer kalıp kullanılarak dört-renkli sekanslama deneyi gerçekleştirilmiştir. Real-time okumalarından gelen bazlar, bunlara karşılık gelen floresan sinyalleri ile belirlenmiştir (Şekil 22.24b). Okumalar bilinen bir sekans ile karşılaştırıldığında, delesyon, insersiyon ve yanlış eşleşmeler sonucu 27 adet hatanın oluştuğu ve okuma kesinliğinin yaklaşık %83 e karşılık geldiği bulunmuştur. Söz konusu hatalar, iki ekleme olayı arasındaki interfaz aralığının çok kısa olmasından kaynaklanmaktadır yılı AGBT toplantı-sında, yapılan iyileştirmeler sonucunda E. coli genomunun sekanslanmasında %99,3 lük genom kavraması ile 38 kat baz kavraması elde edildiği rapor edilmiştir. Ortalama 964 bazlık okuma uzunlukları ile tüm genom için %99,999 dan daha fazla kesinliğe erişilmiştir Genom dizilerinin hizalaması ve bir araya getirilmesi YNS okumaları elde edildikten sonra bilinen bir referans sekansa göre sıraya dizilir veya de novo olarak birleştirilir (14, 82, 107). İki stratejiden hangisinin kullanılacağı kararı, maliyet, iş gücü ve zamanın yanında amaçlanan biyolojik uygulamaya da dayanır. Örneğin, belirli bakteri türleri (42, 43, 71, 73, 95, 98), C. elegans (40, 89, 91) ve Arabidopsis thaliana da (76) olduğu gibi birbirleriyle çok yakın ilişkili olan çok sayıda suş içindeki genetik varyasyonun belirlenmesi, YNS okumalarının kendi referans genomlarına göre sıraya dizilmesi ile başarılabilir. Bu yaklaşım Sanger sekanslamaya göre oldukça ucuz ve hızlıdır. SNV ler hemen tanımlanabilir ancak birçok durumda bulguların doğrulanması gerekmektedir. Sıraya dizme yaklaşımında bazı kısıtlamalar mevcuttur. Bunlar, okumaların referans genomun tekrarlı bölgelerinin veya referans genomda bulunmayan karşılık (referans genomda karşılığı bulunmayan) bölgelerinin içine yerleştirilmesi gibi bir takım kısıtlamalardır. Bunlardan ikincisi, referans genomdaki boşluklardan veya analiz edilen genomda yapısal varyantlardan (SVs) kaynaklanabilir. İkili eş okumaları, ikilinin içindeki bir nükleotit dizisi genoma özgü olduğu sürece, bazı tekrarlı bölgeler için doğru genom atamasına karar verebilir. Korbel ve arkadaşları (50) tarafından yapılan bir çalışma, 3 kb boyutundaki ikili eş genom kütüphanelerinden türetilen Roche/454 okuma verileri (ortalama 258 baz) ile insan genomunda daha geniş bir fraksiyon yakalandığını göstermiştir (48). Bakteriyel genomlar ve memeli bakteriyel yapay kromozomlar için de novo birleştirmeler rapor edilmiştir (10, 13, 38, 115, 121). Ancak insan genom uygulanmalarında önemli zorluklar mevcuttur. Okuma kapsamının genişletilmesi ile sıraya dizme ve bir araya getirmenin kalitesinin iyileştirilmesi mantıklı bir stratejidir. Harismendy ve arkadaşları (36) tarafından yazılan bir makalede, Roche/454, Illumina/Solexa ve Life/APG platformlarında farklı insan genomik bölgelerine spesifik lokal sekans bilgilerindeki sistemik değişkenlik rapor edilerek bu yaklaşıma karşı çıkılmıştır. Son günlerde, Roche/454 ve Illumina/ Solexa nın okuma verilerinin birbiri ile karıştırılmasının, her birinden ayrı olarak gelen verilere göre, mikrobiyal genomlarda daha iyi de novo birleştirilmesi ile sonuçlandığı rapor edilmiştir (3, 85).

31 Genomik 553

32 554 Moleküler Biyoloji Genomun zenginleştirilmesi Otomatik Sanger metodu (90) ile karşılaştırıldığında YNS teknolojileri, önemli bir maliyet düşüşü sağlamaktadır. Ancak bu yöntem ile genomun tamamının sekanslanması hâlen pahalı olmaktadır. YNS platformlarının ilgilenilen belirli bölgelerin hedeflenmesi için kullanılması bu soruna getirilebilecek çözümlerden biridir. Bu strateji genomdaki kodlayan bölgelerin tamamının incelenmesi için kullanılabilir. Buna örnek olarak genom çapında ilişkilendirme (genome-wide association) çalışmaları yoluyla hastalık (2) veya farmakogenetik etkiler (112) ile bağlantılı olduğu bilinen ilaç hedefleri veya mega baz boyutundaki bölgeleri içeren spesifik gen aileleri verilebilir. Genomun belirli bölgelerini hedef alma işlemi, küçük ölçekte de olsa en yaygın kullanılan metot olan PCR ile gelişmiştir. Sanger sekanslama ile birleştirilen PCR, birçok aday genin analizi için oldukça uygundur (34). Ancak hedefleme stratejileri için PCR ın yüksek verili YNS platformları ile birlikte kullanılması örnek hazırlanması açısından pratik olmamaktadır. RainDance Technologies in işbirliği ile Frazer ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, microdroplet PCR teknolojisi ile 3976 ürünün eş zamanlı amplifikasyonunun gerçekleştirildiği rapor edilmiştir (102) (Şekil 5a). Bu çalışmada, hedeflenmiş bazların %90 ı ile %84 lük bir yakalama etkinliği belirlenmiş ve kavramanın Roche/454 veya Illumina/Solexa platformları kullanıldığında da aynı olduğu bildirilmiştir. Özel olarak tasarlanmış oligonükleotit mikroarrayleri ve solüsyon bazlı hibridizasyon stratejileri de ilgilenilen bölgelerin hedef-lenmesi için kullanılmaktadır. Örneğin, Roche/ NimbleGen oligonükleotit mikro-arrayleri (94), ekzonların (1, 41) ya da onlara bitişik genomik bölgelerin (1, 41, 74) zenginleştirilmesi amacıyla katı-faz hibri-dizasyonuna komplementer sekans sağlanması için tasarlanmıştır (Şekil 22.25b). Son günlerde BCM-HGSC grubu, daha geniş kapsama bölgelerindeki prob sayısını düşürürken düşük kapsanan bölgelerde bu sayıyı yükselten çip optimizasyonu ile en az 10 kat baz kapsaması (Roche/454 ve Life/ APG platformları) ile %90 dan fazla yakalama etkinliği rapor etmiştir. Diğer gruplar, moleküler inversiyon probları (MIP) (51, 83, 108) ve biyotinlenmiş RNA yakalama sekansları (30) gibi solüsyon bazlı hibridizasyon metotlarını kullanarak genomun spesifik bölgelerini yakalamışlardır (Şekil 22.25c). Porreca ve arkadaşları (83), ilgilenilen ekzon için spesifik oligonükleotit uçlar tasarlayarak MIP leri ekzon hedeflemede kullanan ilk gruptur. Ancak iki defa yapılan deneylerde hedeflerin sadece %20 si yakalanmış ve her iki veri setinde (Illumina/Solexa platformu) de daha az sayıda ekzon bölgesi (%11) bulunmuştur. Krishnakumar ve arkadaşları (51), son günlerde, MIP yakalama etkinliğini %90 ın üstüne çıkaran (485 ekzonda hedeflerin yaklaşık %70 inin düştüğü 10 katlık bir aralık içinde) birkaç teknik iyileştirmeyi rapor etmiştir. Turner ve arkadaşları (108) da, başlangıç hedefin %91 ini yakalayabilen gelişmeyi (Illumina/Solexa platformu) bildirmişlerdir. Alternatif bir başka metot, biyotinlenmiş RNA yakalama sekanslarını geliştiren Gnirke ve arkadaşları (30) tarafından rapor edilmiştir (Illumina/Solexa platformu) (Şekil 22.25c). Bu grup, yakalama etkinliğini ekzonlar için %60, genomik bölgeler içinse %80 olarak hesaplamıştır Genom Projesi ve Ekzon Projesinde, ilgilenilen bölgenin hedeflenmesi için Roche/454, Illumina/Solexa ve Life/APG platformları ile mikroarray ve solüsyon bazlı stratejiler benimsenmiştir. YNS platformlarından hiçbiri hedef-lenmiş yakalamanın sekanslama fazını gerçekleştirememesine rağmen, bazıları diğerlerinden daha uygun olabilir (Tablo 22.2). Hedeflenmiş yakalamanın, yakalamada ve temsil etmedeki değişkenliğinin yüksek olması, hedef dışı fragmentlerin yakalanması, mikrogram mik-

33 Genomik 555 tarlarında başlangıç materyali-ne gereksinim duyulması ve mikroarraylerin maliyetinin yüksek olması nedenleri YNS platformlarının rutin kullanım için hazır olup olmadığına ilişkin kaygıları arttırmıştır (28, 75). Ancak bu kısıtlamaların giderilmesine yönelik iyileştirme çalışmaları bir yandan devam etmektedir (28). Bireysel genomlar İnsan genom çalışmaları, medikal amaçlar için bireyselleştirilmiş genomikte kullanılmak üzere SNV ler (single nucleotide variant) ve SV ler (structural variants) ile onların fenotipik farklılıklarla ilişkilerini listelemek amacını taşır yılında Uluslararası İnsan Genom Sekanslama Konsorsiyumu ilk ve tek tamamlanmış insan referans genomunu yayınlamıştır. Maliyetinin 300 milyon $ olduğu tahmin edilmektedir. Ekim 2007 de Venter ve meslektaşları (58), tüm-genom shotgun yaklaşımını otomatik Sanger sekanslama ile birlikte kullanarak J. Craig Venter in genom sekansını açıklamıştır (Tablo 22.2). Venter genomu referans genom ile karşılaştırıldığında 3,2 milyon SNV tespit edilmiştir. Ayrıca, SNV lerden daha fazla varyant baza tekabül eden in üzerinde SV belirlenmiştir. YNS i insan genomlarının tamamına uygulayan ilk grup, James D. Watson ın diploid genomunu rapor eden BCM-HGSC den Gibbs ve meslektaşlarının işbirliği ile Roche/454 tür (Tablo 22.2). Watson genomu referans genom ile karşılaştırıldığında kabaca 3,3 milyon SNV belirlenmiş ancak Venter ve arkadaşlarının çalışmasındakinden çok daha az sayıda SV bulunmuştur. Bu durum büyük önem taşımaktadır. Çünkü bulunamamış SV lerin pek çoğu hastalıklara neden olan toplam sekans varyant sayısının önemli bir bölümünü açıklamaktadır. Geçtiğimiz senelerde beş adet insan genomu daha açıklanmıştır. Bunlardan biri, iki farklı YNS platformunda sekanslanmıştır (Tablo 22.3). Bireysel genomik, ayrıca, hastalıkların çalışılmasında da uygulanmaktadır. Örneğin Mardis ve arkadaşları (62), Illumina/Solexa platformunu kullanarak iki akut miyeloid lökemia kanser genomunu sekansladıklarını rapor etmişler ve her iki çalışmada da hastalıkla ilişkili olabilecek somatik mutasyonlar belirlemişlerdir. Gibbs ve arkadaşları, Life/APG platformunu kullanarak Charcot-Marie diş hastalığının resesif bir formu ile ailedeki her iki allelik varyantın aydınlatıldığını belirtmişlerdir (61) (Tablo 22.3). Kanser Genom Atlası (17) ve Genom Projesi gibi daha çok bireyleri sekanslamayı amaçlayan birtakım projelerde de tüm genomun sekanslanması için Illumina/Solexa ve Life/454 platformları kullanılmaktadır. Complete Genomics son günlerde Bireysel Genom Projesine katılan bir Kafkas erkeğine (PGP1) ait ilk genom sekansını açıklamıştır. Bu projeler yakın gelecekte bireysel genom sekanslamalarında önemli bir artışa neden olacaktır.

34 556 Moleküler Biyoloji Otomatik Sanger sekanslama ile karşılaştırıldığında YNS platformları, çıktı miktarını dikkat çekici bir şekilde arttırmış, gider miktarını ise önemli ölçüde azaltmıştır. Birkaç grup reaksiyon maliyetlerinin $ ın altında olduğunu rapor etmiştir (Tablo 22.3). Ancak, YNS platformlarının kendi içlerinde ve aralarında kalıp boyutu ve hazırlaması, okuma uzunluğu, çıktı, baz ve genom kavrama bakımından değişkenlik bulunmaktadır (Tablo 22.3) ve bu değişkenlik maliyet konusu temelinde genomların kalitesinin değerlendirilmesini (baz doğruluğu, genom kavrama ve devamlılığı) güç hâle getirmektedir Haziran ayında Illumina $ a 30 kat baz kavraması sağlayan bir bireysel genom sekans-