FISH ve in situ melezleme

Transkript

1 FISH ve in situ melezleme

2 In situ melezleme belirli bir mrna nın doku içinde nerede bulunduğunu görmemize yarar. Bu metod inceleyenin ilgilendiği mrna nın normal yerini görmesine olanak sağlar. In situ melezleme oldukca kolay bir tekniktir ve histolojik dokulardaki hedef mrna nın işaretlenmis nükleik asit probuna hibridizasyonunu sağlayarak dengeli hibridler oluşturur ve böylece probun yeri görülür. Bu teknoloji ayrı türlerdeki hücre populasyonlarında gen anlatımı calısmak için kesin bir metoddur.çünkü tek bir hücre çözünürlüğünde hedef mrna nın bulunmasına izin verir.

3

4 Kullanılan prob tipleri: DNA probları: Yüksek spesifik aktivite gösterir. Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir. RNA probları: RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir. RNA probları düsük stabilite gösterir ve RNaz larla kolaylıkla yok edilebilirler. Oligonükleotid probları (15-50 nükleotid): Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak tasarlanır. Problar çok stabildir. Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.

5 Prob işaretleri Radyoaktif işaretler Direkt işaretleme Radyoaktif olmayan işaretler Affinity molekül Marker molekül Direkt işaretleme Indirekt işaretleme Reporter molekül

6 FISH Floresan in situ hibridizasyon çoklu, sayı, yapı ve mikrodelesyon gibi kromozom anomalilerini saptamak için kullanılan bir metodtur. Üstünlükleri: Sonuca hızlı ulaşılılır. Bütün doku tiplerine uygulanabilir (kan, ilik vb.) Standart sitogenetik metodlarla saptanamayan delesyonları saptar.

7 Olumsuz yönleri: Standart G-bantlama calışmalarının yerine geçemez fakat yanında kullanılabilir. Tüm kromozom için iyi olmasına rağmen sadece birkaç kromozomal segmentle sınırlıdır.

8 Bu teknolojide ilk aşama; floresan özelliği taşıyan bir kimyasalın spesifik DNA dizilerini tanıyabilecek bir molekülle bağlanmasıdır. Bu işaretli moleküle prob denir. Kromozomlar, probun kromozomun üzerinde aranan DNA dizisine bağlanmasına izin verilecek şekilde hazırlanırlar. Bu işleme hibridizasyon denir. Kromozoma bağlı olan işaretli DNA probu kromozomlar UV ışığa maruz bırakıldıklarında ışıma yaparlar. Eğer probda floresan ışıma olursa gen mevcuttur, floresan ışıma yok ise delesyona uğramıştır.

9 Her metafaz kromozomun tam bir setinden oluşur ve bu setin küçük bir segmenti her bir prob tarafından aranır ve prob buraya baglanır. Her prob kromozomun belli bir bölgesine özeldir ve floresan molekülle işaretlenmiştir. Her mikroskop lamı birçok metafaz içerir.

10 İlk aşama çift iplikli kromozom DNA sını ve prob DNA sını denatüre etmektir. Böylece prob ve kromozom DNA sı birbirine bağlanabilirler. Bu işlem DNA nın yüksek sıcaklıkta ısınmasıyla gerçekleşir

11 Prop lam üzerine konulduktan sonra üstüne buharlaşmayı engellemek için lamel örtülür ve lamelin kenarlari iyice kapatılır.lamel 37 c lik inkubatore koyulur ve bir gece boyunca bekletilir. Böylece prob hedef kromozomla hibridize olur.

12 Gece boyunca prob DNA spesifik kromozom üzerinde hedef diziyi arar ve ona yapışır.

13

14 This image shows a paint of chromosome 22. In addition to the two normal copies of 22, there is also a small extra piece, a marker, derived from 22 material.

15

16 Spektral Karyotipleme Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların 24 kromozomla hibridizasyonuna ve tek bir filtreye sahip floresan mikroskobu ile analizine dayalıdır.

17

18

19

20

21 M-FISH (Multicolor FISH) 5 florokromun çeşitli kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı flouresans sinyalleri ile analizine dayalı bir yöntemdir.

22

23

24 M-band

25 COBRA-FISH Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si diğer gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla hibridleştirilirken, 2. gruba ek olarak dördüncü florokrom uygulanır.

26 R x FISH Gibbon kromozomları prob olarak kullanılır. Gibbon ve insan kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98 dir. RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça değişimleri değil, aynı zamanda kormozom içi değişimler de belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon).

27 Cosmid prob Cosmid (unique sequence) prob, belli kromozomların spesifik küçük segmentlerine bağlanır. Bu problar bir kromozomun bir bölgesinin varlığı veya yokluğunun belli bir sendrom veya anomalinin tanısını kolaylaştıracağı mikrodelesyon calışmaları için uygundur.

28 Elastin Williams Syndrome probe

29

30 Alfa satellit probları Alfa satellit DNA insan kromozom sentromerlerinin yanında bulunan yüksek tekrarlı dizileri karsılastırmaya olanak sağlar. Bu tür problar anoploidileri tanımlamak ve küçük marker kromozomlarının kökenini teşhis etmek için kullanılır.

31

32

33

34 Painting probes Gerçekte bir sürü ayrı bölgeye özel problardır yanlızca tek bir kromozoma bağlanırlar ve hep beraber bütün kromozomu boyuyor gibi bir görüntü yaratırlar.

35

36 Karşılaştırmalı genomik hibridasyon CGH floresan moleküler sitogenetik bir tekniktir ve DNA kayıplarını, amplifikasyonlarını normal metafaz kromozomlarında gösterir. CGH niceliksel 2 renk floresan in situ hibridizasyonuna dayanır.eşit miktardaki farklı işaretlenmiş tumör genomik DNA ve normal referans DNA sı karıştırılır ve hibridize edilir.işaretlenmiş problar iki farklı floresan ile belirlenir. Referans metafaz alanındaki kromozomlar boyunca floresan yoğunluklarındaki farklılıklar, tumor DNA daki kopya numara değişikliklerine karşilik gelir.

37 CGH tümör genomlarındaki kromozomal kopya numarası değişikliklerini incelemek için güçlü bir tekniktir ve tek bir deneyde tüm genomları analiz etmesi gibi bir avantaja sahiptir. Özellikle Sitogenetik analiz için yeterli metafaz vermeyen tümörlerin incelenmesi için kullanılabilir ve donmuş veya taze dokulara uygulanabilir.

38

39

40 Exon-array CGH

41 Kromogenik in situ hibridizasyon (CISH) CISH pratik, etkili ve FISH a alternatif bir metodtur. FISH ile karşılaştırıldığında üç önemli avantajı vardır: 1) Parafin bölgelerin histolojik ayrıntıları aydınlık alanda genellikle daha iyi gözlenir. 2) Morfolojik ayrıntılar düşük güçlü mercekle kolaylıkla görülebilir. 3) Prob sinyalleri hızlı solmazlar.

42

43 GISH (Genomik in situ Hibridizasyon) Türler arası hibritlerde, parental genomların ayrılmasına olanak tanıyan genomik boyama tekniğidir. Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir. Başarılı çaprazların belirlenmesi açısından çok önemlidir.

44 L. multiflorum ve F. pratensis

45 Genomic in situ-hybridization : on the left hand parental genome components of D. viminea (green) in the genome of D. muralis (blue); on the right hand parental genome components of D. tenuifolia (pink) in the genome of D. muralis (blue