ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Murat YILMAZTEKİN BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Murat YILMAZTEKİN DOKTORA TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 11/02/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ile Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Prof.Dr. Ahmet CANBAŞ I. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE İmza... Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK ÜYE İmza Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ve TÜBİTAK-TOVAG Tarafından Desteklenmiştir. Proje Numaraları: ZF2004D34, ZF2004BAP13, ZF2004BAP20 ve TÜBİTAK-TOVAG Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Murat YILMAZTEKİN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI I. Danışman : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU II. Danişman : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yıl: 2009, Sayfa: 103 Jüri : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Bu çalışmada, Williopsis saturnus mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla ve melas ortamında fuzel yağı ilavesiyle biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretimi; Pichia mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla etil asetat üretimi ele alınmıştır. Araştırmada 3 farklı Williopsis saturnus maya ırkının (HUT 7087, IAM ve NCYC 22), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) izoamil asetat üretimine etkisi saptanmış ve daha sonra belirlenen en uygun koşullarda ortama ilave edilen fuzel yağının biyodönüşümü ile izoamil asetat üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Etil asetat üretiminde ise Pichia cinsine ait 2 farklı mayanın (Pichia anomala NCYC 432 ve Pichia subpelliculosa NCYC 436), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) etkileri araştırılmıştır. Fermantasyon denemeleri kontrollü koşullar altında fermentörlerde, biyodönüşüm denemeleri ise orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Aroma maddelerinin belirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı içerisinde Williopsis saturnus HUT 7087 nin en yüksek miktarda izoamil asetat üreten ırk olduğu ve bu maya ırkı ile 25 ºC de 15 ºC ye göre, yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla izoamil asetat üretildiği belirlenmiştir. Saptanan en uygun koşullarda ortama ilave edilen % 1 oranında fuzel yağı izoamil asetat üretiminde 3 kat artışa neden olmuş ve üretilen izoamil asetat miktarı 354 mg/l olarak belirlenmiştir. Pichia cinsine ait mayalardan ise Pichia anomala NCYC 432 melastan en fazla etil asetat üreten maya olmuştur. 25 ºC de 15 ºC ye göre ve yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla etil asetat üretilmiş ve belirlenen en uygun fermantasyon koşullarında ulaşılan en yüksek etil asetat miktarı yaklaşık 6.7 g/l olmuştur. Anahtar Kelimeler: Doğal aroma, Williopsis saturnus, Pichia, fermantasyon, biyodönüşüm I

4 ABSTRACT PhD THESIS INVESTIGATIONS ON THE BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF NATURAL ISOAMYL ACETATE AND ETHYL ACETATE Murat YILMAZTEKİN DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA I. Supervisor : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU II. Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN Year: 2009, Pages: 103 Jury : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN In this study, the production of isoamyl acetate using Williopsis saturnus from sugarbeet molasses by fermentation and from fusel oil in a molasses based medium by bioconversin; and the production of ethyl acetate using Pichia yeasts by fermentation were studied. For isoamyl acetate production the effects of 3 different strains of Williopsis saturnus (HUT 7087, IAM and NCYC 22), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) on the production of isoamyl acetate were determined and enhancement of isoamyl acetate production by bioconversion with addition of fusel oil at the most suitable conditions was aimed. For ethyl acetate production, the influence of 2 different yeasts (Pichia anomala NCYC 432 and Pichia subpelliculosa NCYC 436), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) were examined. Fermentation and bioconversion trials were performed with batch fermentors at controlled conditions and with orbital shaker in flasks, respectively. Flavour compunds were determined with gas chromatography-flame ionization detector. According to the results obtained, Williopsis saturnus HUT 7087 was the highest isoamyl acetate producer among Williopsis saturnus strains, and that strain formed higher amount of ester at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums. The addition of 1% of fusel oil into medium caused a 3 fold increase in isoamyl acetate production and the maximum amount of isoamyl acetate produced was 354 mg/l. Pichia anomala NCYC 432 produced higher level of ethyl acetate than that of Pichia subpelliculosa NCYC 436 from molasses. The highest amount of ethyl acetate was determined at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums, and the maximum amount was found about 6.7 g/l. Keywords: Natural flavour, Williopsis saturnus, Pichia, fermentation, bioconversion II

5 TEŞEKKÜR Doktora tez çalışmam sırasında araştırma konusunun belirlenmesi, araştırmanın planlanması ve sonuçların değerlendirilmesinde tecrübelerinden faydalandığım başta birinci danışmanım sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU olmak üzere, ikinci danışmanım sayın Doç. Dr. Hüseyin ERTEN e, tezin yürütülmesi sırasında yapmış oldukları katkılardan dolayı Tez İzleme Komitesi üyeleri sayın Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ ve sayın Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY a ve tez jürisinde yer alarak tezimi değerlendiren sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında maddi ve manevi desteğini gördüğüm başta değerli arkadaşım Arş. Gör. Adnan BOZDOĞAN a, bölüm hocalarıma, acı ve tatlı pek çok anıyı paylaştığım çalışma arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına minnet duyduğumu belirtmek isterim. Araştırmam sırasında kullanılan melası sağlayan Özmaya A.Ş. (Ceyhan, ADANA) ne, fuzel yağının temin edilmesinde yardımcı olan Malatya Şeker Fabrikası na, maya suşlarını sağlayan HUT, IAM ve NCYC kültür koleksiyonlarına, tez çalışmamı maddi olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Destekleme Birimi ne ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Kurumu na teşekkür ederim. Son olarak, bu günlere gelmemde sonsuz emekleri olan ve maddi manevi desteklerini esirgemeyen anneme, babama ve kardeşlerime, son beş yıldır hayatımı renklendiren sevdiğim insana minnettarlığımı ifade etmek isterim. III

6 Sonsuz sevgi, ilgi ve destekleri ile her zaman yanımda olan anneme ve babama IV

7 İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖZ... I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER....V ÇİZELGELER DİZİNİ... IX ŞEKİLLER DİZİNİ...X RESİMLER DİZİNİ...XIII SİMGELER VE KISALTMALAR...XIV 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri Mikrobiyal Yolla Üretim Fermantayon Yoluyla Üretim Biyodönüşüm Yoluyla Üretim Enzimatik Yolla Üretim Esterler Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi Esterlerin Oluşum Mekanizması Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler Maya Cinsi Ortam Bileşimi Sıcaklık Havalandırma Substrat Miktarı Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının Kullanımı Melas Fuzel Yağı...26 V

8 3. MATERYAL ve METOT Materyal Mayalar Besiyerleri ve Kimyasallar Melas Fuzel Yağı Fermentör Metot Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin Hazırlanması Aşılama Kültürünün Hazırlanması Fermantasyon Koşulları Havalandırmalı Fermantasyon Havalandırmasız Fermantasyon Yarı-Havalandırmalı Fermantasyon Biyodönüşüm Koşulları Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi Örneklerin Alınması Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler Maya Sayımı ve Canlılık Oranı Yoğunluk ph Etil Alkol Aroma Maddelerinin Analizi (1). Cevap Faktörünün Hesaplanması (2). Miktar Tayini İstatistiksel Değerlendirme ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus Mayası ile İzoamil Asetat Üretimi Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...38 VI

9 Fermantasyonun Gidişi ph Etil Alkol Üretimi Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı (2). Fermantasyonun Gidişi (3). ph (4). Etil Alkol Üretimi (5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi (6). İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı (2). Fermantasyonun Gidişi (3). ph (4). Etil Alkol Üretimi (5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi (6). İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi...72 VII

10 4.2. Etil Asetat Üretimi P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretimi P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı (2). Fermantasyonun Gidişi (3). ph (4). Etil Alkol Üretimi (5). Etil Asetat Üretimi P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı (2). Fermantasyonun Gidişi (3). ph (4). Etil Alkol Üretimi (5). Etil Asetat Üretimi SONUÇ ve ÖNERİLER...88 KAYNAKLAR...91 ÖZGEÇMİŞ VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyal biyodönüşümlerin genel özellikleri... 6 Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri... 9 Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler...15 Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler...17 Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları...21 Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları...21 Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları...24 Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi...25 Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri...28 Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimi...28 Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri...35 Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamil asetat/amil alkol oranı Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...46 Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...55 Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...65 Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerine etkisi...72 Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...73 Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları...79 Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları...86 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi... 8 Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler...12 Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram...34 Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram...36 Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi...39 Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunluk değerleri...40 Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait ph değerleri...41 Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi...42 Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1- butanol üretimi...43 Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1- butanol üretimi...44 Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamil asetat üretimi...46 Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...48 Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değişimi...49 Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki ph değişimi...50 Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda etil alkol üretimi...51 Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi...53 X

13 Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi...53 Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda izoamil asetat üretimi...55 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...57 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yoğunluk değişimi...59 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında ph değişimi...60 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etil alkol üretimi...61 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2- metil-1-butanol üretimi...62 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3- metil-1-butanol üretimi...63 Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında izoamil asetat üretimi...64 Şekil Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı...67 Şekil Biyodönüşüm süresince canlılık oranı...67 Şekil Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri...68 Şekil Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi...69 Şekil Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim...70 Şekil Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim...71 Şekil Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim 73 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki maya gelişimi...75 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri...76 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki ph değerleri...77 XI

14 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları...78 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları...79 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...81 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri...82 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki ph değerleri...83 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi...84 Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi...85 XII

15 RESİMLER DİZİNİ Sayfa No Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler.29 XIII

16 SİMGELER VE KISALTMALAR W : Williopsis P : Pichia S : Saccharomyces AATaz : Alkol asetiltransferaz ATF1 ve ATF2 : Alkol asetiltransferaz I ve Alkol asetiltransferaz II enzimlerini kodlayan genler NCYC : National Collection of Yeast Cultures (Ulusal Maya Kültür Koleksiyonu, İngiltere) IAM : Institute of Applied Microbiology Culture Collection (Uygulamalı Mikrobiyoloji Enstitüsü Kültür Koleksiyonu, Japonya) HUT : Hiroshima University Culture Collection (Hiroşima Üniversitesi Kültür Koleksiyonu, Japonya) MEA : Malt Ekstrakt Agar MEB : Malt Ekstrakt Broth GC : Gas Chromatography (Gaz Kromatografisi) FID : Flame Ionization Detector (Alev İyonlaşma Dedektörü) XIV

17 1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN 1. GİRİŞ Aroma maddeleri burun yoluyla ve ürün ağızdayken geniz yoluyla algılanan uçucu ve koku veren özellikteki alifatik ve aromatik yapılı kimyasal bileşiklerdir. Gıdanın tüketici tarafından tercih edilmesinde birinci derecede rol oynayan aroma maddeleri, gıdanın en önemli kalite kriterlerinden birini oluşturmaktadır. Bu bileşikler gıdalarda çok sayıda ve nanogram ile miligram gibi düşük miktarlarda bulunmalarına rağmen gıdanın kendine özgü duyusal özelliğini belirler. Gıdaların aroması aldehitler, alkoller, ketonlar, esterler, laktonlar, terpenler, pirazinler, uçucu fenoller ve kükürtlü bileşikler gibi çeşitli kompleks gruplardan oluşmaktadır (Reineccius, 2006). Bir gıdanın aroması hammaddenin doğal yapısından, ürünün işlenmesi sırasında uygulanan kesme, sıkma, ezme, haşlama, pişirme, kızartma, kavurma, fermantasyon, tütsüleme vb. çeşitli işlemlerden veya ürüne dışarıdan ilave edilen aroma bileşiklerinden ileri gelir. Gıdalarda arzu edilen aromanın yeterli olmaması, üretim sırasında ortaya çıkan kayıpları geri kazandırmak, gıdada doğal olarak bulunan bir kokuyu maskelemek, aromasız gıdalara başka bir aroma kazandırmak veya ürünü farklılaştırmak gibi çeşitli nedenlerle ürünlere aroma maddesi ilavesi yapılmaktadır (Elmacı, 2001; Reineccius, 2006; Bayrak, 2006). Aroma maddeleri özellikle gıda sanayinde sıkça kullanılan katkı maddeleri arasında gelmektedir. Uzun zamandan beri bitkiler aroma maddelerinin esas kaynağı olmuşlardır. Ancak bunların düşük miktarlarda bulunmaları, saflaştırılmalarının zor olması ve pahalı olmaları nedeniyle günümüzde kimyasal yolla sentezlenen aroma maddeleri daha çok kullanılmaktadır. Bugün piyasada kullanılan aroma maddelerinin yaklaşık % 80 den fazlasını sentetik aroma maddeleri oluşturmaktadır (Krings ve Berger, 1998). Ancak son zamanlarda müşteri taleplerinin doğal ürünlere kayması, kimyasal ürünlerin insan sağlığını ve çevreyi tehdit etmesi ve uluslararası mevzuatlarda kimyasal yollarla elde edilen ürünlere getirilen kısıtlamalar alternatif yolların ortaya çıkmasına neden olmuştur. Aroma maddelerinin üretiminde son dönemlerde oldukça ilgi gören yöntemlerden biri de biyoteknolojik işlemlerin kullanılmasıdır. Modern 1

18 1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN biyoteknolojide yaşanan gelişmeler sonucunda doğal aroma maddelerinin mikroorganizmalar, izole edilmiş enzimler ve bitki hücre kültürlerinden yararlanılarak üretilmesi mümkün olmuştur. Günümüzde yaklaşık 100 kadar doğal aroma bileşiği biyoteknolojik yöntemlerle üretilmektedir (Reineccius, 2006). Prensipte biyoteknolojik yolla aroma maddesi üretiminde iki yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincisi mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon yoluyla üretim (de novo sentezi), ikincisi ise mikroorganizmaların veya enzimlerin kullanıldığı biyodönüşüm yoluyla üretimdir (Janssens ve ark., 1992). Biyoteknolojik yöntemlerin sağladığı en önemli avantajlar, tarımsal üretimde karşılaşılan sorunlardan (iklim, bitkisel hastalıklar, pestisit kullanımı, pazar arayışı, tarım politikaları vb.) bağımsız olması ve endüstriyel ölçekte uygulanabilir olmasıdır (Krings ve Berger, 1998). Biyoteknolojik üretimin kimyasal yolla üretime göre avantajları ise, daha esnek reaksiyon koşullarına, yüksek ürün ve substrat spesifikliğine sahip olması ve çevreyi daha az kirletmesidir (Xu ve ark., 2007). Kısa zincirli yağ asitleriyle alkoller arasında meydana gelen esterler, aroma maddeleri arasında önemli bir grup olup meyve aroması veren bileşikler olarak tanınırlar. İzoamil asetat ve etil asetat gıdalara meyvemsi tat ve koku verdiklerinden gıda endüstrisinde sıklıkla kullanılan aroma maddeleridir. Bunların doğal kaynaklardan elde edilen formları hem pahalı olmakta, hem de miktar olarak yetersiz kalmaktadır. Bu yüzden aroma maddelerinin üretiminde son yıllarda oldukça ilgi gören biyoteknolojik yollarla üretim, doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde de alternatif yöntemlerden biri olarak görülmektedir. Ülkemizde gıda sanayi artıklarının yeterince değerlendirilememesi hem çevre sorunlarına hem de ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Biyoteknolojik yöntemlerle aroma maddelerinin üretiminde, gıda sanayi artıkları karbon ve azot kaynağı olarak fermantasyon işlemlerinde kullanılabilmektedir. Bu şekilde gıda artıklarının değerlendirilmesiyle hem doğal aroma maddelerinin üretiminde maliyetin düşürülmesi, hem de ülke ekonomisine katkı sağlanması düşünülmektedir. Değerlendirilebilecek gıda artıkları arasında melas hem içerik bakımından, hem de ucuz temin edilebilmesi açısından potansiyel oluşturabilecek niteliktedir. 2

19 1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN Tarımsal hammaddelerden etil alkol üretiminde yan ürünlerden biri de damıtma işlemi sonrasında ortaya çıkan damıtma artıklarıdır. Damıtma işleminden sonra geride kalan kuyruk (son kısım) fuzel yağları olarak da adlandırılan yüksek alkolleri ve özellikle amil alkolleri içerir. Mayalar özellikle izoamil asetatı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda, ucuz bir yan ürün olan damıtma artıkları izoamil asetat üretimi için önemli bir kaynak olarak görünmektedir. Bu çalışmada karbon kaynağı olarak melas kullanarak W. saturnus mayası ile izoamil asetat ve P. anomala ve P. subpelliculosa mayaları ile etil asetat üretimi ele alınmış ve, W. saturnus mayası ile izoamil asetat üretiminde; - En uygun maya ırkının belirlenmesi - Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız) etkisi ve - Biyodönüşüm yoluyla üretim sırasında ortama farklı konsantrasyonlarda (% 1, 2 ve 3) fuzel yağı ilavesinin etkisi, P. anomala ve P. subpelliculosa ile etil asetat üretiminde ise; - Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız) etkisi araştırılmıştır. 3

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması Aroma maddeleri genel olarak doğal ve yapay aroma maddeleri olarak gruplandırılır. Aroma maddelerinin elde edildikleri kaynakların çok farklı ve çok çeşitli olması, uluslararası mevzuatlarda kesin tanımlarının yapılmasına neden olmuştur. Amerika Birleşik Devletleri nde aroma maddeleri doğal ve yapay olmak üzere iki gruba ayrılmış ve doğal aroma maddeleri, esansiyel yağlar; yağlı reçineler; esanslar; protein hidrolizatları; baharat, meyve suyu, sebze veya sebze suyu, maya ekstraktları, bitki tomurcuk, kabuk, kök ve yaprakları, et, deniz ürünleri, kümes hayvanları, yumurta ve süt ürünlerinin kızartılması, ısıtılması ve enzimle muamele edilmesinden sonra elde edilen destilatları veya esas işlevi aroma vermek olan fermantasyon ürünleri şeklinde tanımlanmıştır. Avrupa Birliği Aroma Yönergesi nde ise doğal aroma maddeleri, bitkisel veya hayvansal kaynaklardan fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla elde edilen aroma verici madde veya madde karışımları olarak ifade edilmiştir (Vandamme ve Soetaert, 2002). Her iki tanımdan da anlaşıldığı gibi aroma maddelerinin doğal olarak adlandırılabilmesi için elde edildiği hammaddenin de (substrat veya ön bileşik) doğal olması gerekmektedir. Doğal bir aroma maddesinin adı Doğal Çilek Aroması ifadesinde olduğu gibi bir gıda maddesine veya bir aroma kaynağına referans oluşturuyorsa, bu aromanın tamamının uygun fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla bu gıdadan veya kaynaktan elde edilmesi zorunludur. Aksi durumda doğal ifadesi kullanılamaz (Anonim, 1997a). Birçok Avrupa ülkesinde doğal ve yapay aroma maddelerinin yanında doğala özdeş aroma maddeleri ayrı bir sınıf olarak kabul edilmektedir. Kimyasal yollarla sentezlenen bu bileşikler, doğal formlarıyla aynı özellikleri gösterirler (Janssens ve ark., 1992; Vandamme ve Soetaert, 2002). Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre aroma maddeleri, doğal aroma maddeleri, doğala özdeş aroma maddeleri ve yapay aroma maddeleri olarak sınıflandırılmaktadır (Anonim, 1997a). 4

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN 2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri Mikrobiyal Yolla Üretim İnsanoğlu yüzyıllardan beri farklı teknikler kullanarak hoş kokulu ve aromalı gıdalar üretmiş, fakat aroma oluşumunda mikroorganizmaların rol oynadığını ancak geçtiğimiz yüzyılda mikrobiyoloji ve biyokimyada yaşanan gelişmeler sayesinde öğrenebilmiştir. Yapılan araştırmalar sonucunda mikroorganizmaların, birçoğu önemli aroma bileşiği olan ikincil ürünleri ürettiği belirlenmiştir (Vanderhaegen ve ark., 2003). Biyoteknolojik yolla doğal aroma maddesi üretim yöntemlerinden birisi de mikroorganizmaların kullanılmasıdır. Mikroorganizmaların kullanıldığı üretim tekniklerinde fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşüm olmak üzere temel olarak iki yöntemden yararlanılmaktadır; Birinci yöntemde, ortamda bulunan karbonhidrat, yağ ve protein gibi maddeler fermantasyona uğramakta ve yıkıma uğrayan bileşiklerden aroma maddeleri üretilmektedir (de novo sentezi). İkinci yöntemde ise, ortama ilave edilen ve reaksiyonu başlatan ön bileşiklerden (prekursör) az basamaklı reaksiyonlarla aroma maddeleri üretilmektedir (Janssens ve ark., 1992). Fermantasyonla üretimde karbon ve azot kaynaklarına ihtiyaç duyulurken, mikrobiyel biyodönüşümde uygun bir substrat yeterli olmaktadır. Her iki yöntemin genel özellikleri karşılaştırılarak Çizelge 2.1 de verilmiştir. 5

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşümlerin genel özellikleri (Winterhalter ve Schreier, 1993) Özellik Fermantasyon Mikrobiyal biyodönüşüm Mikroorganizmalar Çoğalan hücreler Çoğalma evresindeki ve durgun evredeki hücreler Reaksiyon Birden fazla reaksiyon Basit (tek veya birkaç basamaklı) katalitik reaksiyonlar Reaksiyon süresi Uzun Kısa Substrat Ucuz karbon ve azot kaynakları Spesifik (bazen pahalı) Ürün Doğal Doğal veya yapay Ürün miktarı Az Yüksek Ürünün saflaştırılması Zor Kolay Fermantasyon Yoluyla Üretim Fermantasyon, çok eski zamanlardan beri gıda biliminde sürekli kullanılan bir yöntemdir. Biyokimyasal yönden fermantasyon, mikroorganizmalar tarafından salgılanan enzimlerin organik maddelerde oluşturduğu parçalanma veya kimyasal değişiklikler olarak tanımlanır (Canbaş, 1988). Biyoteknolojide ise, bir ürünün mikroorganizma kültürleri vasıtasıyla uygun koşullarda üretilmesidir. Oluşan ürün biyokütle, enzimler ve metabolitler olabildiği gibi, bazı bileşiklerin modifikasyonu da gerçekleştirilebilmektedir (Stanbury ve ark., 1995). Aynı zamanda organik asitlerin, antibiyotiklerin, amino asitlerin ve nükleik asit türevlerinin üretimi için de uygun bir yöntemdir. Bu teknikte ucuz karbon ve azot kaynakları kullanılmakta ve amaçlanan ürün, mikroorganizmaların karmaşık metabolik etkinlikleri sonucu meydana gelmektedir (Korukluoğlu, 1998). Mikroorganizmaların bazı aroma maddelerini sentezleyebilme yeteneğinde oldukları uzun zamandan beri bilinmektedir. Üretiminde fermantasyonun temel rol oynadığı şarap, bira, yoğurt, ekmek gibi birçok geleneksel gıdanın karakteristik 6

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN özelliğini ve aromasını mikroorganizmaların faaliyeti sonucunda oluşmaktadır (Janssens ve ark., 1992). Mikroorganizmalar karbonhidrat, alkol, protein, yağ gibi çeşitli maddeleri kullanarak aroma maddelerini üretebilmektedir. Fermantasyon yoluyla aroma maddelerinin üretiminde yüzey kültür ve derin kültür yöntemleri olmak üzere başlıca iki yöntem kullanılmaktadır (Berger, 1995). Yüzey kültür yönteminde mikroorganizmalar sıvı, yarı katı veya katı substratların yüzeylerinde gelişir. Bu sistemde metabolizma ürünü, mikroorganizma türüne göre hücre içinde kaldığı gibi hücre dışına da salgılanabilir veya her iki halde de bulunabilir. Üretim sırasında yüzey alanı arttırıldıkça havadan oksijen sağlanması ve mikroorganizmanın substrat içerisinde homojen bir şekilde dağılımı daha kolay olmakta ve verimde artış sağlanmaktadır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Bu amaçla son yıllarda döner tamburlu ve daldırmalı biyoreaktörler geliştirilmiştir (Longo ve Sanromán, 2006). Derin kültür yönteminde ise mikroorganizmalar substratın içerisinde gelişir. Gereken hava/gaz karışımı çoğunlukla uygun bir havalandırma düzeneği ile fermantasyon ortamına verilir. Bu amaçla karıştırma ve havalandırma özelliğine sahip fermentörler kullanılır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Aroma üretiminde yüzey kültür yöntemi daha yaygın kullanılır ve özellikle ucuz tarımsal atıklardan aroma eldesinde tercih edilir. Kullanılan bu iki yöntem kıyaslanacak olursa, yüzey kültür yöntemi derin kültür yöntemine göre düşük maliyetle daha yüksek verimde ve daha iyi özellikte ürün elde edilmesini sağlamaktadır (Couto ve Sanromán, 2006). Fermantasyon yoluyla aroma maddesi üretiminde izlenecek yol sırasıyla aşağıda verilmiştir (Şekil 2.1) (Stanbury ve ark., 1995). -Fermantasyon ortamının formülasyonu veya bileşiminin belirlenmesi, -Fermantasyon ortamının, fermentörün ve kullanılacak ekipmanların sterilizasyonu, -Üretim fermentörünün aşılanması için yeterli miktarda aktif saf kültürün üretilmesi, -Ürün oluşumu için fermentördeki mikroorganizmaların en uygun şartlarda gelişmesi, -Ürünün fermantasyon ortamından ekstraksiyonu ve saflaştırılması -İşlem sonrası oluşan atıkların arıtılması. 7

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Mikroorganizmaların fermantasyon sırasında oluşturdukları başlıca aroma maddeleri yüksek alkoller, esterler, uçucu asitler, karbonil bileşikleri, terpenler, laktonlar, pirazinler ve kükürtlü bileşiklerdir (Reineccius, 2006). Biyokütle Fermantasyon sıvısı Hücre ayırma Stok kültür Orbital karıştırıcı Aşılama fermentörü Sıvı kısım Ortamın sterilizasyonu Üretim fermentörü Ürün ekstraksiyonu Ortamın formülasyonu Ürünün saflaştırılması Atıkların arıtılması Ortam ham maddesi Ürünün paketlenmesi Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi (Stanbury ve ark., 1995) Biyodönüşüm Yoluyla Üretim Mikroorganizmaların bir bileşiği yapısal yönden kendisine benzer başka bir bileşiğe dönüştürmesi olayına mikrobiyel biyodönüşüm denir (Crueger ve Crueger, 1990). Bir başka deyişle, mikroorganizmalar tarafından katalizlenen kimyasal dönüşümlerdir. (Telefoncu, 1995). Biyodönüşüm olayına en klasik örnek olarak asetik asit bakterileri tarafından etil alkolden asetik asit üretimi gösterilebilir. Günümüzde mikrobiyel biyodönüşümle üretilen birçok aroma maddesi olmasına karşın bunların halen büyük çoğunluğu araştırma düzeyindedir. Bunlardan önemli bulunanlar ve endüstriyel düzeyde üretilenler Çizelge 2.2 de verilmiştir. 8

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri Bileşik Mikroorganizma Substrat Oluşan koku Vanilin Serratia Ferulik asit Vanilya Amycolatopsis Pseudomonas Öjenol İzoöjenol γ-dekalakton Candida Risinoleik asit Şeftali Yarrowia Sporobolomyces Benzaldehit Ischnoderma L-Fenilalanin Badem İzoamil asetat W. saturnus Amil alkol Muz 2-Feniletanol Saccharomyces L-Fenilalanin Gül benzeri Kluyveromyces Mikrobiyel biyodönüşüm sırasında gerçekleşen bazı reaksiyon türleri arasında oksidasyon, hidroliz, esterleşme, dehidrasyon, fosforilasyon, C-C bağlarının koparılması, indirgenme reaksiyonları gelmektedir. Biyodönüşümde genellikle verim çok yüksektir. Verimi etkileyen faktörler arasında mikroorganizma türü, ph, sıcaklık, hücre zarı geçirgenliği, ürün inhibisyonu, substratların ortamda çözünürlük derecesi gibi özellikler sayılabilir. Birçok mikrobiyal biyodönüşüm olayında iki substrat gereklidir. Bunlardan biri mikroorganizmaların gelişmesi için gereklidir. Diğeri ise, dönüşüme uğrayacak substrattır. Mikroorganizma gelişimi için gerekli substrat doğal kaynaklardan ucuz olarak karşılanabileceğinden maliyet düşürülmüş olur (Crueger ve Crueger, 1990). Biyoteknolojide kullanılan farklı mikrobiyal biyodönüşüm teknikleri vardır. Bunlar; Çoğalan hücreler ile biyodönüşüm: Hücreler ideal besi ortamında üretilir ve yapılan testlerle belirlenen şekilde biyodönüşüme uğratılacak substrat ortama katılır, 9

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Durgun evredeki hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizma ideal besiyerinde üretilir, filtrasyon veya santrifüj ile ayrıldıktan sonra biyodönüşüm ortamına ilave edilir, Sporlar ile biyodönüşüm: Küfler spor oluşumu için ideal koşullarda üretilir ve sporlar misellerden ayrılıp soğukta saklanır. Biyodönüşüm yapılacağı zaman bu sporlardan yararlanılır, İmmobilize hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizmalar ürün ve substratın geçişine izin veren bir polimer matrikste (poliakrilamid, kapa-karragenan, alginat, selüloz, nişasta vb.) tutuklanır veya bir polimere bağlanır. İmmobilize hücreler istenildiği anda ortamdan uzaklaştırılabilir, yeniden kullanılabilir, kesikli ve kesiksiz fermantasyonlara uygundur (Telefoncu, 1995). Mikrobiyel biyodönüşüm yüksek substrat seçiciliği, az miktarda yan ürün oluşumu ve asıl ürünün kolay izole edilmesi ve saflaştırılması gibi önemli avantajlara sahip olması nedeniyle daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntem aroma maddelerinin yanında bazı katkı maddelerinin endüstriyel ölçekli üretimlerinde de sıklıkla kullanılmaktadır (Xu ve ark., 2007) Enzimatik Yolla Üretim Enzimler mikrobiyel hücrelere nazaran substratların ürüne dönüşümünde yüksek stereo- ve enantio-seçiciliğe sahip oldukları için aroma maddeleri üretiminde etkin bir biçimde kullanım alanı bulmuşlardır (Berger, 1995). Lipazlar, esterazlar, proteazlar, nükleazlar ve farklı glukozidazlar aroma bileşiklerinin ekstraksiyonu işlemlerinde kullanılan enzimlerden bazılarıdır. Kofaktörden bağımsız olarak çalışan bu enzimler hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonlarıyla optikçe saf alifatik ve aromatik esterlerin ve laktonların üretiminde potansiyel oluşturmaktadırlar (Krings ve Berger, 1998). Enzimatik biyodönüşüm aroma üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem yaygın olarak ester üretiminde kullanılmaktadır. Lipaz enzimi kullanılarak asit ve alkolden ester sentezlenebilmektedir (Abbas ve Comeau, 2003). 10

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Enzim katalizli reaksiyonların kimyasal katalizli reaksiyonlara göre bazı önemli üstünlükleri vardır (Telefoncu, 1995). Bunlar; Spesifiklik: Enzimatik reaksiyonlarda prensip olarak yan ürün oluşmaz (etki spesifikliği) ve çoğu enzimler yalnız belirli bir substrat ile oluşan reaksiyonu katalizlerler (substrat spesifikliği), Reaksiyon Koşullarının Ilımlılığı: Enzimatik reaksiyonlar sulu ortamda nötral ph dolayında ve genellikle 40 º C den daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşir, Aktivasyon Enerjisinin Düşürülmesi: Enzimatik reaksiyonlarda ara madde katalizi mekanizması sonucu aktivasyon enerjisi çok düşmekte ve reaksiyon yüksek hızla gerçekleşmektedir. Bu üstünlükler kimyasal olarak çok karmaşık yollardan gerçekleştirilebilen veya hiç gerçekleştirilemeyen birçok reaksiyonun enzimler yardımıyla kolayca yürümesine olanak sağlar Esterler Aroma maddeleri arasında esterler ayrı bir öneme sahiptir. Organik bileşiklerin önemli bir sınıfını oluşturan esterler farklı yollarla sentezlenirler. Alkol ve karboksilik asitlerin reaksiyonu sonucu (esterifikasyon); açil gruplarının esterlerle asitler arasında (asidiolizis), esterle alkoller arasında (alkolizis) ve esterlerin kendi aralarında (transesterifikasyon) karşılıklı değişimi sonucu meydana gelebilmektedirler. Uzun zincirli asitlerle alkoller arasında meydana gelen reaksiyonlar sonucu oluşan esterler gıda, deterjan, kozmetik ve farmakoloji endüstrilerinde katkı maddesi olarak kullanılmakta, kısa zincirli asitlerle alkollerin ürünleri ise önemli aroma maddelerini oluşturmaktadır. Fermente içeceklerde en büyük ve en önemli aroma maddeleri grubunu uçucu esterler oluştururlar. Uçucu esterler kendi aralarında iki grupta toplanırlar. Birinci grup asetat esterleridir. En önemlileri etil asetat, izoamil asetat ve feniletil asetat tır. İkinci grup esterleri ise orta zincirli yağ asidi etil esterleri oluşturur. Etil hekzanoat, etil oktanoat ve etil dekanoat yağ asidi etil esterlerine örnek olarak verilebilirler (Verstrepen ve ark., 2003a). Birçok alkol asetatları ticari olarak önemli bileşikler olup bunlardan etil asetat ve 11

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN izoamil asetat aroma sanayinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 2.2). Özellikle izoamil asetat keskin muz aroması vermesi nedeniyle gıda sanayinde tüketimi oldukça fazladır ve yıllık üretimi 74 ton civarındadır (Krishna ve ark., 2001; Güvenç ve ark., 2002; Buzzini ve ark., 2003). O O O O O O Etil asetat İzoamil asetat Feniletil asetat O O İzobütil asetat Etil kaproat Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler (Verstrepen ve ark., 2003a). O O Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi Esterlerin doğal formları oldukça pahalı ve zor temin edilirler. Kimyasal olarak sentezlenenler ise ucuz ama doğal olmadıkları için tercih edilmemektedir (Vadali ve ark., 2004). Bu nedenle son dönemlerde bu aroma maddelerinin doğal formlarının enzim ve mikroorganizmalar yardımıyla üretimi üzerine yapılan çalışmalar artmıştır. Özellikle esterazlar ve lipazlarla üretimleri üzerine yapılmış çalışmalar fazladır (Horton ve ark., 2003). Genellikle farklı kaynaklardan elde edilen serbest ve immobilize lipazlarla organik çözücülerde üretimleri üzerine çalışmalar yapılmıştır. Güvenç ve ark. (2002), Mucor miehei den elde ettikleri serbest lipazları kullanarak heptan içerisinde esterifikasyonla 37 C de 24 saat içerisinde 26 g/l (% 80 verimle) izoamil asetat elde edildiğini ve Candida cylindraccea dan elde edilen 12

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN immobilize lipazlarla hekzan içerisinde, 30 C de 24 saatlik bir süre sonunda % 100 verimle (17 g/l) izoamil asetat üretiminin gerçekleştirildiğini bildirmişlerdir Esterlerin Oluşum Mekanizması Esterler, kimyasal veya biyokimyasal yolla sentezlenirler (Şekil 2.3). Kimyasal yol, yani alkol ve asit arasındaki basit ve kondensasyon reaksiyonu ile oluşum oldukça yavaştır. Bu nedenle, esterler mikroorganizmalar tarafından genellikle biyokimyasal yolla üretilir (Şekil 2.4). - Kimyasal sentez (kondensasyon reaksiyonu): R -OH + R-COOH R-COO-R + H 2 O - Biyokimyasal sentez (alkol asetiltransferaz reaksiyonu): R -OH + R-CO ~ SCoA R-COO-R + CoASH Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi (Mason ve Dufour, 2000). Maya hücresi esterleri, alkol ve asetil koenzim A arasında meydana gelen ve çeşitli enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonlar sonucunda oluşturur (Peddie, 1990; Mason ve Dufour, 2000; Quilter ve ark., 2003; Verstrepen ve ark., 2003a). Ester üretiminde etkili olan en önemli enzimler ATF1 ve ATF2 genleri ile kodlanan alkol asetiltransferazlardır (AATaz I ve AATaz II; EC ). Ester üretiminden sorumlu olan enzimlerle esterleri hidroliz eden esterazlar arasındaki denge, oluşan net ester miktarı açısından önemlidir. Bu yüzden, esteraz aktivitesindeki artış oluşan ester miktarında düşüşlere neden olabilmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). S. cerevisiae ile izoamil asetat ve etil asetat gibi asetat esterlerinin üretiminde alkol asetiltransferaz, etanol asetiltransferaz ve izoamil alkol asetiltransferaz olmak üzere 13

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN üç farklı enzimin rol oynadığı bildirilmektedir (Peddie, 1990; Erten ve Canbaş, 2003). Oksijen Doymamış yağ asitleri Fermente edilebilir şeker Azot Azot metabolizması Yüksek alkol Asetil koenzim A AATaz genleri (ATF 1, ATF 2) Ester sintaz Ester Şeker ve lipid metabolizması Ester Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası (Verstrepen ve ark., 2003a). Mayaların esterleri neden oluşturduğu konusunda kesin bir bilgi bulunmamaktadır. Ancak bu konuda çeşitli varsayımlar ileri sürülmüştür (Peddie, 1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Bu varsayımlara göre; 1. Esterler, alkol fermantasyonu sırasında şekerlerin metabolizmasından ortaya çıkan bileşikler olabilir ve hücre için önemli değillerdir, 2. Ester oluşumu asetil yükünün kontrolü açısından önemli olabilir, çünkü asetil koenzim A ve serbest-koenzim A miktarları ara reaksiyonlar için önemlidir, 3. Ester üretimi, toksik maddeleri uzaklaştırma mekanizması ile ilgili olabilir; özellikle C8-C14 arasındaki yağ asitleri maya için toksiktir; ester oluşumu ile bu yağ asitlerinin maya hücresine olumsuz etkileri ortadan kaldırılır. Fermantasyonun başlangıcında yani logaritmik çoğalma evresinde esterlerin sentezi oldukça düşüktür. Bunun sebebi, maya gelişimi için asetil koenzim A ya duyulan metabolik ihtiyaçtır. Oksijen ve asetil koenzim A doymamış yağ asitlerinin 14

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN ve sterollerin üretiminde hızla tüketilir. Daha sonra, doymamış yağ asitleri ve sterollerin üretimi ile ester üretimi için kullanılan asetil koenzim A miktarı dengelenir. Bu evre ester üretiminin ilk aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ilk sekiz saatinde gerçekleşir. Yağ asitlerinin ve sterollerin sentezi sona erdiğinde ortamdaki asetil koenzim A miktarı (ve asetil yükü) artar ve en yüksek seviyesine ulaşır. Kısa süren bu evre ise, ester oluşumun ikinci aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ortalarında (yirminci ve otuzuncu saatler arası) yani durgun evrede görülür. Ancak, esterlerin büyük bir kısmı bu aşamada oluşturulur (Peddie, 1990) Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler Fermantasyon işlemlerinde esterlerin oluşumuna etki eden birçok teknolojik parametre vardır. Bu parametreler Çizelge 2.3 te verilmiştir. Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler (Dufour ve Malcorps, 1995) Maya Karakteristiği Ortam bileşimi Fermantasyon koşulları Maya türü Lipidler Sıcaklık Fizyolojik durum Oksijen Basınç Aşılama oranı Şeker içeriği Karıştırma Kullanılabilir azot Çinko Fermentör dizaynı Fermantasyon yöntemi Maya cinsi Maya ester üretimini etkileyen önemli faktörler arasındadır. Her mayanın kendine has karakteristik ester profili vardır ve bazı esterleri diğerlerinden fazla üretebilmektedirler (Peddie, 1990). Mayalar arasındaki ester üretim farklılıkları ise büyük ölçüde mayalardaki AATaz aktiviteleri ile ilişkilendirilmektedir. Bu yüzden mayalar arasındaki bu tip genetik farklılıklar ester üretiminin optimizasyonunda bir 15

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN kriter olarak kullanılmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a). Ortama aşılanan maya miktarının artması üretilen ester miktarını azaltmaktadır. Peddie (1990), aşılanan maya miktarının normal miktarın iki katı olması durumunda sadece etil asetat miktarında önemsiz artışlara neden olduğunu bildirmiştir. Quilter ve ark. (2003) ise, ortama aşılanan maya miktarında 12 g/l lik bir artışın sadece izoamil asetat ve amil alkol miktarlarında çok az bir artışa neden olduğunu belirlemiştir. Pichia ve Hanseniaspora cinsine ait mayaların etil alkol, jeraniol, izoamil alkol ve 2- feniletanol gibi alkollerin esterifikasyonunu sağlayarak meyvemsi aromaya sahip esterleri üretirken (Mingorance-Cazorla ve ark., 2003), benzer şekilde, Williopsis, Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora ve Issatchenkia cinslerine ait mayaların kullanıldığı fermantasyonlarda izoamil alkol ve izoamil asetat ın uçucu bileşikler arasında en yüksek konsantrasyona sahip bileşikler olduğu belirlenmiştir (Buzzini ve ark., 2003). Kluyveromyces marxianus un ise elma posası, melas, ayçiçeği kepeği ve hurma kepeği gibi farklı ortamlarda fermantasyonla aroma bileşiklerini ürettiği belirlenmiş ve üretilen bileşikler arasında en fazla etil asetat, etanol ve asetaldehite rastlanmıştır (Medeiros ve ark., 2000). Farklı maya türleri tarafından üretilen çeşitli esterler Çizelge 2.4 te verilmiştir. 16

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler (mg/l) (Fleet ve Heard, 1993; Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001; Zöhre ve Erten, 2003) Maya türleri Etil İzobütil Etil İzoamil Etil Etil asetat asetat bütirat asetat hekzanoat oktanoat S. cerevisiae Kloeckera apiculata Hansenula (Pichia*) anomala P. fermentans P. membranefaciens Hansenula (Pichia*) subpelliculosa Hansenula (Williopsis*) saturnus *KURTZMAN, 1998 a göre Ortam bileşimi Fermantasyon ortamında bulunan lipitler ester oluşumunu etkileyen faktörler arasında yer alır. Oleik, linoleik ve linolenik gibi doymamış yağ asitlerini fazla miktarda içeren fermantasyon ortamlarında sentezlenen ester miktarı düşük olmaktadır ve bu durumun birkaç nedeninin olduğu tahmin edilmektedir. Bunlar; doymamış yağ asitlerinin hücreye alınması sırasında hücre membranının geçirgenliğinin değişmesi, ATTaz enziminin aktivitesinde azalma ve doymamış yağ asitlerinin hücre gelişimini teşvik ederek ortamda ester sentezi için yeterli miktarda asetil koenzim A nın bulunmamasına yol açmasıdır (Peddie, 1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Dufour ve Malcorps (1995), bira şırasına 178 μm linoleik asit 17

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN ilavesinden sonra oluşan etil asetat miktarında yaklaşık % 80 oranında bir düşüş olduğunu belirlemişlerdir. Fermantasyon ortamında bulunan toplam şeker miktarının yanında, fermente olabilir şeker içeriği de ester oluşumunu etkiler. Genellikle yüksek glukoz ve fruktoz içeriğine sahip ortamlarda yüksek maltoz içeren ortamlara nazaran daha fazla ester oluşumu gözlenmiştir. Bunun sebebi henüz açığa kavuşturulmuş değildir. Fakat, glukoz metabolizmasında yüksek seviyelerde asetil koenzim A üretiminin gerçekleştiği ve böylece ester üretiminde artış olduğu tahmin edilmektedir. Diğer varsayımlar ise, glukoz içeren ortamda gelişen hücrelerin daha fazla yüksek alkol ürettikleri veya glukozun AATaz ı kodlayan ATF1 ve ATF2 genlerini daha fazla açığa çıkardığı doğrultusundadır (Younis ve Stewart, 1998; Verstrepen ve ark., 2003b). Plata ve ark. (2003), farklı kaynaklardan elde edilen P. subpelliculosa, Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii ve S. cerevisiae türlerine ait mayalarla, fermente edilebilir şeker olarak 250 g/l glukoz içeren sentetik şırada gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde en yüksek izoamil asetat ve etil asetat üretiminin fermantasyonun ilk 72 saatinde gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Ester üretiminin fermantasyonun ilk safhasında gerçekleşmesinin muhtemel nedeni olarak AATaz enziminin aktivitesinden kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Diğer bir çalışmada ise, melasta S. cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda, ortam yoğunluğu yani şeker içeriği arttıkça izoamil asetat miktarının 4.2 mg/l den 17.4 mg/l ye yükseldiği belirlenmiştir (Quilter ve ark., 2003) Sıcaklık Sıcaklık ester oluşumunu etkileyen önemli faktörlerden biridir. Genellikle ºC aralığında artan ortam sıcaklığı üretilen ester miktarını arttırmıştır. 12 ºC de üretilen ester miktarının 10 ºC de üretilen ester miktarından % 75 oranında daha fazla olduğu bildirilmiştir. Aynı şekilde, ortam sıcaklığı 10 ºC den 16 ºC ye çıkarıldığında üretilen ester miktarındaki artış % olarak bulunmuştur (Peddie, 1990; Verstrepen ve ark., 2003a). Fakat mayalar, farklı ester türleri göz önüne 18

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN alındığında farklı sıcaklık profilleri gösterirler. Etil asetat ve 2-feniletil asetat 20 ºC de en fazla üretilirken, izoamil asetat ve etil kaprilat 15 ºC de en yüksek verimle üretilmektedir. Ancak, elde edilen bu bulgular bütün mayalar için söz konusu değildir. Ester üretimindeki bu değişim, muhtemelen farklı sıcaklıklarda değişen AATaz aktivitesine bağlıdır (Verstrepen ve ark., 2003a). Peddie (1990) ise bu durumu sıcaklıkla beraber hücre membranı geçirgenliğinin artması ve dolayısıyla hücre dışına salınan ester miktarın artması olarak açıklamaktadır. Sıcaklığın artması ile ester üretimindeki artışa, ortamda fazla miktarda oluşan yüksek alkolün neden olabileceği de bir diğer görüştür. Yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda ise, buharlaşmaya bağlı olarak uçucu özellikteki esterlerin miktarlarında azalma olabilmektedir. Ancak bu olay, fermantasyon sonuna doğru yani, ester konsantrasyonunun yüksek olduğu durumlarda söz konusu olabilmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a) Havalandırma Fermantasyon ortamında bulunan çözünmüş oksijen uçucu esterlerin oluşumunu baskılamaktadır. Oksijen maya gelişimini ve dolayısıyla asetil koenzim A nın kullanılabilirliğini etkilemektedir. AATaz enzimini kodlayan ATF1 ve ATF2 genleri oksijen tarafından baskılanmakta, dolayısıyla düşen AATaz miktarı ile paralel olarak ester üretiminde düşüşler meydana gelmektedir. Diğer taraftan, oksijen miktarı düşük olduğu zaman (<1 mg/l) maya gelişimi yetersiz olmakta ve buna bağlı olarak ester üretiminde azalmalar görülmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). Çünkü, oksijen maya gelişimi için gerekli olan doymamış yağ asitlerinin ve sterollerin sentezi için gereklidir. Havalandırma sonucu maya hücresi lipidlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin sentezi için daha fazla asetil koenzim A ya ihtiyaç duyar ve dolayısıyla ortamda ester oluşumu için yeterli asetil koenzim A bulunmadığından ester üretimi azalır (Peddie, 1990; Erten, 1997). Ester üretiminde maksimum verime ancak belirli oksijen seviyelerinde ulaşılır (Verstrepen ve ark., 2003a). Pichia ve Williopsis cinsine ait mayalarla düşük alkollü şarap üretimi üzerine yapılan bir 19

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN çalışmada, P. anomala, P. subpelliculosa ve W. saturnus türlerinin havalandırmasız fermantasyon koşullarında yüksek miktarlarda etil asetat ürettikleri, buna karşın havalandırmalı koşullarda üretilen etil asetat miktarının daha az olduğu belirlenmiştir. Aynı sonuca izoamil asetat için de varılmıştır. Elde edilen bulgular Çizelge 2.5 ve Çizelge 2.6 da verilmiştir (Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001). Bu çalışmada W. saturnus türü ile elde edilen sonuçlarda, etil asetat ın aksine izoamil asetat üretimi karıştırmalı fermantasyonlarda statik fermantasyonlara göre daha fazla bulunmuştur. Ester oluşumunda önemli rol oynayan asetil koenzim A farklı fermantasyon koşullarında farklı şekillerde kullanılabilmektedir. W. saturnus izoamil asetat sentezinde rol alan izoamil alkolü yüksek miktarlarda üretmiştir. Karıştırmalı fermantasyon koşullarında izoamil asetat miktarının artması muhtemelen fazla miktarda üretilen izoamil alkolden kaynaklanmaktadır. Etil asetat ve izoamil asetat miktarları fermantasyonun belirli evrelerinde maksimuma ulaşmış ve daha sonra düşmeye başlamıştır. Üretilen ester miktarındaki düşüşün ise, ortamda bulunan ester sentezinden sorumlu enzimlerin ters çalışarak oluşan esterleri metabolize etmelerinden kaynaklandığı bildirilmiştir (Dufuor ve Malcorps, 1995; Erten, 1997). Yapılan diğer bir çalışmada ise, P. anomala türü havalandırmalı şartlarda 48 saat sonunda 4143 mg/l etil asetat ve 1.93 mg/l izoamil asetat üretirken, havalandırmanın kısıtlı olduğu şartlarda etil asetat üretimi mg/l ile sınırlı kalmış, izoamil asetat ise belirlenememiştir (Rojas ve ark., 2001). Valero ve ark. (2002), yaptıkları çalışmada şarap fermantasyonundan önce cibreyi havalandırmanın fermantasyon sırasında yüksek alkol ve ester üretimine etkisini araştırmışlardır. Elde edilen sonuçlara göre, fermantasyondan önce havalandırılan cibrelerden elde edilen şaraplardaki yüksek alkol ve ester miktarı, kontrol şarabındaki yüksek alkol ve ester miktarından daha fazla bulunmuştur. 20

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001) Fermantasyon Üretilen etil asetat miktarı (mg/l) Koşulları W P 1 P 2 P 3 S GJ ºC S GJ ºC S GJ 20 A GJ 20 F GJ 15 F GJ 10 F GJ 6 F GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S: Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2: P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae. Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları (Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001) Fermantasyon Üretilen izoamil asetat miktarı (mg/l) Koşulları W P 1 P 2 P 3 S GJ ºC S n.d. 0.5 GJ ºC S n.d. 0.4 GJ 20 A n.d. - GJ 20 F n.d. 0.8 GJ 15 F n.d. 0.6 GJ 10 F n.d. 0.2 GJ 6 F n.d. 0.1 GJ 6, 10, 15, 20: % 6, 10, 15 ve 20 (w/w) şeker içeriğine sahip şıralar. F: Statik fermantasyon, S: Karıştırmalı fermantasyon, A: Havalandırmalı ve karıştırmalı fermantasyon. P1: P. subpelliculosa, P2: P. anomala, P3: P. membranaefaciens, W: W. saturnus, S: S. cerevisiae. 21

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Substrat Miktarı Ester oluşumunda substrat olarak rol oynayan asetil koenzim A ile yüksek alkollerin konsantrasyonları ve ester oluşumunda ve yıkımında etkili olan enzimlerin toplam aktiviteleri ester oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, substrat konsantrasyonunu ve enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester üretimini etkilemektedir. Sıcaklık, doymamış yağ asidi miktarı, azot ve oksijen seviyeleri ortamdaki asetil koenzim A miktarını etkilemektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). Bazı araştırmacılar ortamdaki oksijenin, katı maddelerin ve lipitlerin maya gelişimini ve dolayısıyla asetil koenzim A kullanımını arttıracağından ester üretimi için gerekli asetil koenzim A miktarında da azalmaya yol açabileceğini bildirmişlerdir (Thurston ve ark., 1982). Yoshioka ve Hashimoto (1984) ise, fermantasyon koşullarının asetil koenzim A miktarı üzerinde etkili olmadığını savunmuşlardır. Ortamdaki diğer bir sınırlayıcı faktör olan yüksek alkollerin konsantrasyonları ester üretiminde etkili olabilmektedir. Fermantasyon ortamına 3-metil bütanol ilavesinin izoamil asetat üretimini arttırdığı belirlenmiştir. Fakat, ester oluşumunu sadece ortamdaki yüksek alkol miktarıyla ilişkilendirmek doğru değildir. Örneğin, yüksek oksijen ve doymamış yağ asidi miktarları, yüksek alkol miktarını arttırırken ester üretimini azaltmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a). Mayalarda yüksek alkol üretimi ile amino asit metabolizması arasındaki ilişki birçok çalışmaya konu olmuştur. Mayalar özellikle izoamil asetat ı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Valin, lösin ve izolösin amino asitleri bu asetatların doğal ön bileşikleri olup mayalar tarafından sırasıyla izobütanol, 2- metil-1-bütanol ve 3-metil-1-bütanol gibi yüksek alkollere metabolize edilmekte ve yüksek alkoller de AATaz lar tarafından katalizlenerek sırasıyla izobütil asetat, 2- metilbütil asetat ve 3-metilbütil asetat üretilmektedir. (Janssens ve ark., 1989; Gent ve Slaughter, 1994; Verstrepen ve ark., 2003a). Geotrichum klebahnii mayasının, hoş kokulu meyve aromasına sahip dallanmış karboksilik asitlerin etil esterlerini ürettiği, özellikle izolösin ilavesi ile etil-2-metilbütirat ın esas ürün olarak elde edildiği; Geotrichum fragrans mayasının ise, L-lösin i oksidatif deaminasyon yoluyla 22

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN metabolize ederek etil alkol varlığında etilizovalerat ürettiği belirlenmiştir (Vandamme ve Soetaert, 2002; Vandamme, 2003) Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının Kullanımı Biyoteknolojik işlemlerde önemli hususlardan biri üretimin endüstriyel boyutta uygulanıp uygulanamayacağıdır. Endüstriyel ölçekte bir üretimin yapılabilmesi için de göz önüne alınması gereken en önemli konu üretim maliyetleridir. Karşılaşılan en önemli sorunlar arasında genellikle hammadde maliyetinin yüksek oluşu, düşük ürün konsantrasyonu ve ürün saflaştırma maliyeti gelmektedir. Endüstriyel boyutta gerçekleştirilen fermantasyonlarda toplam üretim maliyetinin yaklaşık % 30 unu hammadde teşkil eder (Rivas ve ark., 2004; Lee, 2005). Özellikle büyük çaplı üretimlerde kullanılacak hamaddenin çok ucuz olması istenir. Bu tip proseslerde karbon ve azot kaynağı olarak genellikle tarım, orman ve kimya endüstrisi yan ürünleri kullanılmaktadır (Miller ve Churchill, 1986). Kullanılan karbon kaynakları arasında ise şeker pancarı ve şeker kamışından elde edilen melas ilk sırayı almaktadır (Hahn-Hagerdal ve ark., 2005). Dünyada üretilen gıdaların yaklaşık % 30 u daha tüketiciye ulaşmadan bozulmaktadır. Gıda üretim işlemlerinde oluşan artıklar da göz önüne alındığında büyük bir ekonomik kayıp ve çevre kirliliği tehlikesi karşımıza bir sorun olarak çıkmaktadır. Bu artıkların yok edilmesi ise büyük maliyet gerektirmektedir (Stanbury ve ark., 1995). Gıda artıklarının çoğunu meyve ve sebzelerin kabukları ve çekirdekleri, hayvan ve balık artıkları, karbonhidratça zengin hububat artıkları, tarımsal artıklar (buğday, mısır, şeker kamışı, melas, peynir altı suyu, patates v.b.) ve fermantasyon endüstrisi artıkları oluşturmaktadır. Bu artıklar içerik bakımından büyük bir enerji potansiyeli oluşturmaktadır (Lee, 1996). Biyoteknolojik işlemlerde hammadde olarak kullanılan en elverişli substratlardan biri gıda artıklarıdır. Bu nedenle, gıda artıklarının özellikle aroma maddelerinin üretimi için substrat olarak 23

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN kullanılması son dönemlerde yoğunluk kazanmıştır. Çizelge 2.7 de aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları verilmiştir (Laufanberg ve ark., 2003). Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda sanayi artıkları (Laufanberg ve ark., 2003) Substrat Aroma maddesi (karakteristiği) Mikroorganizma Elma posası, küspe, Etil bütirat (ananas), Etil Ceratocystis fimbriata havuç posası pentaonat (elma), İzoamil asetat (muz) Şeker pancarı pulpu Vanilin Pycnoporus cinnabarinus, Aspergillus niger Risin yağı keki γ Dekalakton (şeftali) Yarrowia lipolytica Pycnoporus pulmonarius Hint yağı keki 6-Pentil-α-piron Trichoderma harzanium (Hindistan cevizi) Zeytin presi keki δ Dekalakton Ceratocystis moniliformis Soya fasulyesi kepeği Pirazin (kızartma kokusu) Bacillus subtilis Melas Biyoteknolojik işlemlerde, özellikle ekmek mayası üretiminde substrat olarak kullanılabilecek hammaddelerden biri, şeker pancarı ve şeker kamışından şeker üretiminde kristalizasyon aşamasından sonra yan ürün olarak elde edilen melastır. Diğer şekerli hammaddelerden daha ucuz olan melas koyu renkli ve kıvamlı bir şurup olup; içeriğinde su, % oranında toplam şeker (sakkaroz), protein, vitamin, amino asitler, organik asitler ve demir, bakır, çinko, manganez, magnezyum, ve kalsiyum gibi ağır metaller vardır (Canbaş, 1995; Roukas, 1998; Waites ve ark., 2001; Kalogiannis ve ark., 2003; Göksungur ve ark., 2004). Şeker pancarından elde edilen melasın kimyasal bileşimi Çizelge 2.8 de verilmiştir. Bileşimi yıllara ve şeker 24

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN fabrikalarına göre değişmektedir. Özellikle içerdiği pantotenik asit, inositol, bazı elementler ve az miktarda biotinden dolayı fermantasyon işlemlerinde kullanımı oldukça yaygındır (Kalogiannis ve ark., 2003). Son yıllarda, proteince zengin hayvan yemi, enzim, amino asit, organik asit, farmakolojik ürünler ve özellikle aroma maddeleri melasın substrat olarak kullanıldığı biyoteknolojik yöntemlerle üretilmekte ve bu alanda yapılan çalışmalar giderek artmaktadır (Pandey ve ark., 2000). Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi (Curtin, 1983; Keshk ve ark., 2006) Parametre Bileşim Briks (Toplam çözünmüş madde) (%) İndirgen şeker (%) Toplam şeker (%) Toplam kurumadde (%) Kül (%) 8-10 Kalsiyum (%) Fosfor (%) Potasyum (%) 3-5 Sodyum (%) 1 Sülfür (%) 0.5 Protein (%) Özgül ağırlık 1.40 ph 5-7 Fermente edilebilir şeker kaynağı olarak kullanılan melasın fermantasyonu sırasında, içerisinde doğal olarak bulunan amino asitlerin deaminasyonu sonucu fuzel yağı olarak ta bilinen yüksek alkoller oluşur. Aroma endüstrisi için önemli doğal hammaddeleri oluşturan bu yüksek alkoller arasında 2-metil-1-butanol, 3-metil-1- butanol, 1-propanol ve feniletanol gelir. Bu yüksek alkoller kısmi distilasyonla ayrılabildiği gibi, fermantasyon sırasında kendi asitlerine de dönüşebilmektedir. Örnek olarak 2-metil-1-butanolun, aynı zamanda önemli bir aroma maddesi olan, 2-25

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN metil-1-butirik asite dönüşümü verilebilir. Bu dönüşümler sırasında meydana gelen ara ürünlerden biride aldehitlerdir ve bu bileşikler de yine önemli aroma maddelerini oluştururlar. Meydana gelen asitlerin yüksek alkollerle esterifikasyonu sonucu ise aroma aktif esterler oluşur (Gatfield ve ark., 2003) Fuzel Yağı Fermantasyonla etil alkol üretiminde damıtma işlemi son derece önemli bir aşamadır. Damıtma işleminin sonunda elde edilen yan ürünlerden biri de, fuzel yağı olarak da adlandırılan ve amil alkolleri fazla miktarda içeren kısımdır. Bileşiminde yaklaşık olarak 390 g/l izoamil alkol, 158 g/l izobütil alkol, 28.4 g/l etil alkol, 16.6 g/l metil alkol, 11.9 g/l propil alkol bulunmakta ve bu bileşikler toplam ağırlığın % 77 sini oluşturmaktadır (Perez ve ark., 2001). Fuzel yağı bu zengin bileşiminden dolayı bazı kimyasal bileşiklerin üretilmesi için kullanılabilen ve çok ucuz temin edilebilen bir hammadde olarak değerlendirilmektedir. Mayalar özellikle izoamil asetatı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda, ucuz bir yan ürün olan fuzel yağı izoamil asetat üretimi için önemli bir hammadde olabilecek niteliktedir. Ortama substrat olarak ilave edilen yüksek alkollerin W. saturnus mayası tarafından biyodönüşüm yoluyla asetatlara dönüştürüldüğü ve 3-metilbütanol ün en hızlı ve en yüksek verimle esterleştirildiği belirlenmiştir. İzoamil asetat, üretilen esterler arasında en yüksek verime (% 91) sahiptir. Üretilen ester miktarının biyodönüşümde kullanılan karbon ve azot kaynaklarına ve ortama ilave edilen spesifik ön bileşiklerin özelliklerine bağlı olduğu ve aynı zamanda biyodönüşümün kontrollü şartlarda (sıcaklık ve havalandırma gibi) gerçekleştirilmesinin önemli olduğu belirlenmiştir (Janssens ve ark., 1987; Janssens ve ark., 1989). Quilter ve ark. (2003) tarafından S. cerevisiae ile yapılan çalışmada, melas içeren fermantasyon ortamına fuzel yağı (% 54.5 amil alkol, % metil bütanol, % 11.2 izobütanol, % 9.6 propanol) ilavesinin ester üretimine etkisi araştırılmıştır. Ortama ilave edilen fuzel yağının izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğu tespit edilmiştir. 26

43 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN 3. MATERYAL ve METOT 3.1. Materyal Mayalar İzoamil asetat üretim denemelerinde W. saturnus HUT 7087 (Japonya), W. saturnus IAM (Japonya), W. saturnus NCYC 22 (İngiltere), etil asetat denemelerinde P. anomala NCYC 432 (İngiltere) ve P. subpelliculosa NCYC 436 (İngiltere) mayaları kullanılmıştır. Kültür koleksiyonlarından liyofilize halde temin edilen mayalar MEB içeren sıvı besiyerinde aktif hale getirilmiş ve MEA içeren katı besiyerinde çoğaltılmıştır. Kültürler aynı besiyerini içeren yatık agarlarda + 4 ºC de muhafaza edilmiş ve her altı ayda bir yenilenmiştir Besiyerleri ve Kimyasallar Mayaların aktif hale getirilmesinde, çoğaltılmasında ve saklanmasında MEB (Merck) ve MEA (Merck) kullanılmıştır. Fermantasyon ortamının hazırlanmasında kullanılan H 2 SO 4, NaOH ve örneklerin etil alkol ve aroma maddeleri analizlerinde kullanılan etil alkol, 1-butanol, 3-pentanol, 2-metil-1-butanol (aktif amil alkol), 3- metil-1-butanol (izoamil alkol), izoamil asetat ve etil asetat Merck firmasından temin edilmiştir Melas Fermantasyon ortamı olarak kullanılan melas Özmaya A.Ş. (Ceyhan, Adana) dan temin edilmiştir. Denemelerde kullanılan melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. 27

44 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri Özellik Değer Briks 80 Kurumadde % 78 Nem % 22 ph 7 İndirgen Şeker % 2 Toplam Şeker % Fuzel Yağı Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağı Malatya Şeker Fabrikası ndan temin edilmiştir. Fuzel yağı 5000 devir/dakika (d/d) da santrifüj edilerek yabancı maddeler uzaklaştırılmış, daha sonra 0.45 µm gözenek çaplı steril filtreden süzülmüş ve biyodönüşüm ortamına ilave edilmiştir. Kullanılan fuzel yağının bileşimi Çizelge 3.2 de verilmiştir. Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimi Bileşen Miktar (g/l) Bileşim (%) 1-propanol metil-1-propanol butanol metil-1-butanol metil-1-butanol Etil alkol Su

45 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Fermentör Fermantasyon denemelerinde 3 litre hacimli kesikli, karıştırmalı, sıcaklık ve havalandırma kontrollü fermentörler (BioFlo110, New Brunswick, ABD) kullanılmıştır. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler Resim 3.1 de verilmiştir. Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler Metot Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin Hazırlanması Fermantasyon ve biyodönüşüm ortamı olarak kullanılan melas 10 ºBriks olacak şekilde saf suyla seyreltilmiştir. Melasın içerisinde mayalar için toksik etki 29

46 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN yapabilecek ağır metal iyonlarının ve yabancı maddelerin uzaklaştırılması amacıyla melas çözeltisinin ph sı 10 N sülfürik asit kullanılarak 3 e ayarlanmış ve 24 saat bekletilmiştir. Bekletilen melas çözeltisi kaba filtre kağıdı ile süzülmüş ve yabancı maddeler uzaklaştırılmıştır (Çalık ve ark., 2001). Daha sonra elde edilen melas çözeltisinin ph sı 10 N NaOH ile 5 e ayarlanmış ve fermantasyon ve biyodönüşüm denemelerinde kullanılmıştır Aşılama Kültürünün Hazırlanması MEA da geliştirilen mayalar 250 ml lik steril erlenmayerler içerisinde bulunan 100 ml 10 ºBriks fermantasyon ortamına aşılanmış ve daha sonra erlenmayerler orbital karıştırıcıya yerleştirilerek 25 ºC de, 160 d/d da, 48 saat süreyle çoğaltılmıştır. 48 saatlik süre sonunda erlenmayerdeki kültür sıvısı steril tüpler içerisinde +4 ºC de, 4000 d/d da, 10 dk. santrifüj edilmiş ve mayalar +4 ºC deki steril suyla 2 defa yıkanmıştır. Maya hücrelerinin oluşturduğu pellet 5 ml steril fermantasyon ortamına aktarılmış, mikroskop altında sayılmış ve daha sonra 1x10 7 hücre/ml olacak şekilde fermantasyon veya biyodönüşüm ortamına aşılanmıştır Fermantasyon Koşulları Fermantasyon denemeleri farklı havalandırma (havalandırmalı, yarıhavalandırmalı ve havalandırmasız) ve sıcaklık (15 ve 25 C) koşullarında gerçekleştirilmiştir. Fermentörlerde paralelli olarak gerçekleştirilen denemelerde her bir fermentöre 2 L fermantasyon ortamı konulmuş, otoklavda 121 ºC de 15 dk. steril edilmiş ve daha sonra soğutulmuştur. Ortama çoğaltılan kültürden aşılanmış ve karıştırma 100 d/d olacak şekilde ayarlanmıştır. 30

47 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Havalandırmalı Fermantasyon Havalandırmalı fermantasyon denemeleri fermentörlerde gerçekleştirilmiştir. Havalandırma kompresör yardımıyla yapılmış ve ortama verilen steril hava miktarı 200 ml/l/dk olacak şekilde ayarlanmıştır Havalandırmasız Fermantasyon Havalandırmasız fermantasyon denemeleri aynı şekilde fermentörlerde gerçekleştirilmiştir. Fermantasyondan önce fermentörlere azot gazı verilerek ortamdaki oksijen uzaklaştırılmıştır Yarı-havalandırmalı Fermantasyon Yarı-havalandırmalı fermantasyon denemeleri orbital karıştırıcıda ağızları steril pamukla kapatılmış erlenmayerlerde gerçekleştirilmiştir Biyodönüşüm Koşulları Biyodönöşüm denemeleri W. saturnus HUT 7087 mayası ile fermantasyon denemelerinde belirlenen en uygun sıcaklık ve havalandırma koşullarında gerçekleştirilmiştir. İçerisinde 200 ml melas çözeltisi bulunan ağızları pamukla kapatılmış 1 L lik erlenlere 1x10 7 hücre/ml olacak şekilde maya kültürü aşılanmıştır. Orbital karıştırıcıya paralelli olarak yerleştirilen 4 erlen içerisindeki melas çözeltileri 25 C ve 100 d/d da mayalar durgun faza girinceye kadar fermente edilmiş, daha sonra bir örnek tanık olarak alınmış ve diğer örneklerde ortama, sırasıyla, % 1, % 2 ve % 3 oranlarında fuzel yağı ilave edilerek diğer koşullar aynı kalmak şartıyla biyodönüşüm gerçekleştirilmiştir. 31

48 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi Biyodönüşüm denemelerinde kullanılacak olan fuzel yağının mayalar üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla maya aşılanmış melas çözeltilerine farklı oranlarda fuzel yağı ilave edilmiştir. Fuzel yağı ilavesini takip eden her 24 saatte bir maya sayımı yapılarak canlılık oranları belirlenmiştir Örneklerin Alınması Fermantasyon ve biyodönüşüm süresince 24 saat aralıklarla ortamdan 25 ml lik örnek alınmıştır. Alınan örnekten 1 ml maya sayımı için kullanılmış ve geriye kalan kısım mayaları uzaklaştırmak amacıyla +4 ºC de, 4000 d/d da 10 dk. santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant yoğunluk ve ph ölçümlerinden sonra aroma maddelerinin analizleri için 18 ºC de muhafaza edilmiştir Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler verilmiştir. Tüm analizler iki kez tekrarlanarak yapılmış ve sonuçlar ortalama olarak Maya Sayımı ve Canlılık Oranı Maya sayımı ve canlılık oranı için örnekler aseptik koşullarda alınmış ve sayımlar metilen mavisi kullanılarak Thoma lamı ile mikroskop altında gerçekleştirilmiştir (Anonim, 1997b). 32

49 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Yoğunluk Tayini Yoğunluk tayini Mettler Toledo Densito 30PX (İsviçre) marka dijital yoğunluk ölçer ile 20 ºC de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyon ve biyodönüşüm denemeleri yoğunluk değerindeki düşüş ile izlenmiştir (Erten, 1997) ph ph ölçümünde ortamdan örnek alımı sırasında fermentör kontrol panelinde okunan ph değerleri ve örnek alındıktan sonra ph metre ile ölçülen değerler dikkate alınmıştır Etil Alkol Miktarının Belirlenmesi Etil alkol miktarı Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka GC-FID kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekler % 1 in altında etil alkol içerecek şekilde saf suyla seyreltildikten sonra iç standart ilave edilerek gaz kromatografisine direkt enjekte edilmiştir. Standart olarak % 1 lik (h/h) etil alkol (mutlak, % 99.9) ve iç standart olarak % 1 lik (h/h) 1-butanol kullanılmıştır (Erten ve Campbell, 2001). Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.1 de verilmiştir. GC koşulları aşağıdaki gibidir; Enjeksiyon : Split (1:70) Dedektör : FID Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25 mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler kolon Enjeksiyon Sıcaklığı : 180 ºC Dedektör Sıcaklığı : 200 ºC 33

50 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Fırın Sıcaklığı : 70 ºC izotermal Taşıyıcı Gaz : Helyum (3 ml/dk.) Diğer Gazlar : Kuru hava (350 ml/dk.) ve Hidrojen (35 ml/dk.) Enjeksiyon Miktarı : 1 µl Maddelerin Alıkonma Zamanları: Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika) Etil Alkol n-butanol (iç standart) Norm. ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\ D) ETIL ALKOL N-BUTANOL min Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Aroma Maddelerinin Analizi Örneklerdeki izoamil asetat, etil asetat, 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1- butanol miktarları iç standart yöntemiyle belirlenmiştir (Kelly ve ark., 1999). Analizlerde Shimadzu GC-14B (Kyoto, Japonya) marka alev iyonlaşma dedektörlü GC kullanılmıştır. Alıkonma zamanları standart maddelerin tek tek GC ne enjekte edilmesi ile belirlenmiştir. 5 farklı konsantrasyondaki kalibrasyon çözeltileri gaz kromotografisine 3 kez tekrarlanarak enjekte edilmiş ve elde edilen piklerin alanları temel alınarak her bir bileşik için cevap faktörü hesaplanmıştır. Aroma maddelerinin 34

51 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN miktarı cevap faktörleri kullanılarak hesaplanmıştır (Anonim, 2002). Kalibrasyon grafiklerinin değerlendirilmesiyle elde edilen veriler Çizelge 3.3 te verilmiştir. Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri Bileşikler Korelasyon Standart (R 2 ) Sapma Etil Asetat İzoamil Asetat metil-1-bütanol metil-1-bütanol Doğrusal Kalibrasyon Denklemi y = x y = x y = x y = x İç standart olarak 58.4 mg/l konsantrasyonunda 3-pentanol kullanılmıştır. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram Şekil 3.2 de verilmiştir. GC koşulları aşağıdaki gibidir (Erten ve Campbell, 2001); Enjeksiyon : Split (1:50) Dedektör : FID Kolon : CP-WAX 57-CB (Chrompack, Hollanda) 60 m uzunluk, 0.25 mm iç çap ve 0.4 µm film kalınlığında fused silika kapiler kolon Enjeksiyon Sıcaklığı : 160 ºC Dedektör Sıcaklığı : 180 ºC Fırın Sıcaklığı : 40 ºC de 4 dk. izotermal 40 ºC den à 94 ºC ye 1.8 ºC/dk. artış 94 ºC den à 180 ºC ye 30 ºC/dk. artış 180 ºC de 4 dk. izotermal Taşıyıcı Gaz : Helyum (1.3 ml/dk.) Diğer Gazlar : Kuru hava (350 ml/dk.) ve Hidrojen (35 ml/dk.) Enjeksiyon Miktarı : 1 µl 35

52 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN Maddelerin Alıkonma Zamanları: Bileşen Alıkonma Zamanı (dakika) Etil Asetat İzoamil Asetat pentanol (iç standart) metil-1-butanol metil-1-butanol ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (MURAT\ D) mau ETIL ASETAT IZOAMIL ASETAT PENTANOL METIL-1-BUTANOL METIL-1-BUTANOL min Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram (1). Cevap Faktörünün Hesaplanması Her bir aroma maddesi için cevap faktörü aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmıştır (Anonim, 2002). RF= (A st / A i ) x (C i / C st ) C i : Bileşiğin konsantrasyonu (mg/l) A i : Bileşiğin pik alanı A st : İç standardın pik alanı C st : İç standardın konsantrasyonu (mg/l) RF : Cevap faktörü. 36

53 3. MATERYAL ve METOT Murat YILMAZTEKİN (2). Miktar Tayini Örneklerdeki aroma maddelerinin konsantrasyonları aşağıdaki formül yardımıyla hesaplanmış, sonuçlar mg/l cinsinden verilmiştir (Kelly ve ark., 1999). C i = (A i / A st ) x C st x RF İstatistiksel Değerlendirme İki kez tekrarlanarak yürütülen denemelerden elde edilen sonuçlar SPSS 10.0 (Özdamar, 1999) istatistik yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla elde edilen araştırma bulguları tek yönlü varyans analizine tabi tutulmuştur. Önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar Duncan çoklu karşılaştırma testi ile % 5 önem düzeyinde belirlenmiştir. İkili karşılaştırmalarda ise Student-t testi kullanılmıştır. 37

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. İzoamil Asetat Üretimi Farklı W. saturnus Mayaları ile İzoamil Asetat Üretimi Farklı kültür koleksiyonlarından temin edilen W. saturnus HUT 7087 (Japonya), W. saturnus IAM (Japonya) ve W. saturnus NCYC 22 (İngiltere) mayaları ile melas ortamında fermantasyon denemeleri kurulmuş ve en iyi izoamil asetat üreten maya belirlenmiştir. Fermantasyon denemelerinden elde edilen sonuçlar aşağıda verilmiştir Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir. Fermantasyon süresince canlılık oranı bütün maya ırkları için % 100 bulunmuştur. Maya gelişim grafiği Şekil 4.1 de verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları durgun faza 48. saatte sırasıyla 9.7x10 7 hücre/ml ve 9.0x10 7 hücre/ml canlı maya sayısı ile girerken, W. saturnus IAM mayası yine 48. saatte 5.1x10 7 hücre/ml canlı maya sayısı ile girmiştir. Fermantasyon sonunda ise canlı maya sayıları W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları için sırasıyla 5.8x10 7, 3.7x10 7 ve 5.5x10 7 hücre/ml olarak saptanmıştır. 38

55 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN HUT 7087 IAM NCYC 22 Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi Fermantasyonun Gidişi Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir ve yoğunluk değerlerindeki düşüşler Şekil 4.2 de verilmiştir. Fermantasyon sonunda yoğunluk değerleri tüm maya ırkları için g/cm 3 değerine kadar düşmüştür. Fermantasyonlar son 36 saat yoğunlukta değişme olmayınca sonlandırılmıştır. W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlar sırasıyla 228., 192. ve 204. saatlerde son bulmuştur. 39

56 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN HUT 7087 IAM NCYC 22 Yoğunluk (g/cm 3 ) Fermantayon süresi (saat) Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunluk değerleri ph Fermantasyonlar süresince ph da meydana gelen değişimler Şekil 4.3 te verilmiştir. W. saturnus HUT 7087 mayası ile gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde ph 4.84 e kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda 4.90 olarak belirlenmiştir. W. saturnus NCYC 22 mayası ile yürütülen fermantasyon denmesinde benzer şekilde 4.83 değerine kadar düşmüş ve fermantasyon sonunda bu değer 5.01 olarak saptanmıştır. W. saturnus IAM mayası ile yürütülen fermantasyon denemesinde ise ph diğer denemelerin aksine fermantasyon süresince düşmeye devam etmiş ve fermantasyon sonunda 4.80 olarak belirlenmiştir. Mayalar genellikle asidofilik mikroorganizmalar olarak kabul edilirler ve asidik ortamlarda daha iyi gelişirler. Mayaların gelişimi için en uygun ph aralığı 4-6 arasında olup, optimum ph 4.5 civarındadır ki bu ortam sıcaklığına, ortamda bulunan oksijene ve maya cinsine göre değişebilmektedir. Fermantasyon başlangıcında maya gelişimi ile birlikte fermantasyon ortamının ph sında genellikle bir düşüş gözlenir. 40

57 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN ph daki bu düşüşün farklı bir kaç mekanizma sonucu oluşabileceği tahmin edilmektedir. Fermantasyon sırasında ortamda H + iyonları ve CO 2 oluşması ve daha sonra oluşan CO 2 su ile reaksiyona girerek daha fazla H + iyonları oluşturarak ortamın ph sını düşürmesi bunlardan biridir. Maya hücresi fermantasyon sırasında hücre içerisinde meydana gelen biyokimyasal olayları devam ettirebilmek için hücre içi ph sını içeriye veya dışarıya H + iyonu pompalayarak optimum bir değerde tutmaya çalışır (Chang, 2000). HUT 7087 IAM NCYC ph Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait ph değerleri Etil Alkol Üretimi Şekil 4.4 te W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince etil alkol üretimindeki değişim verilmiştir. Bütün maya ırklarıyla yürütülen fermantasyon denemelerinde üretilen etil alkol miktarı fermantasyon sonuna kadar sürekli artış göstermiştir. En yüksek etil alkol üretimi hacim olarak % 3.3 ile W. saturnus HUT 41

58 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 7087 mayası ile gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda belirlenen etil alkol miktarları ise W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları için sırasıyla hacim olarak % 3.3, 3.2 ve 3.0 olarak tespit edilmiştir. Mayalar etil alkolü hücre içerisinde metabolik yolla üretilen asetaldehitten oluşturur. Asetaldehidin etil alkole dönüşümü sırasında reaksiyon alkol dehidrogenaz enzimi tarafından katalizlenir. Etil alkol hücre içerisinde sentezlenmeye başladıktan sonra hücre membranından ortama geçer ve ortamda biriken etil alkol, glukoz azaldığı zaman karbon kaynağı olarak CO 2 in ve suyun glioksilat yolu ile oksidasyonu için kullanılabilmektedir (Fredlund, 2004). HUT 7087 IAM NCYC Etil alkol (%, h/h) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile fermantasyonlar süresince üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1- butanol ün miktarlarındaki değişimler, sırasıyla, Şekil 4.5 ve 4.6 da verilmiştir. Kullanılan bütün maya ırklarında fermantasyon süresince üretilen 2-metil-1-butanol 42

59 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN ve 3-metil-1-butanol miktarları sürekli bir artış göstermiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan 2-metil-1-butanol miktarı W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları için sırasıyla 24.7, 22.4 ve 21.7 mg/l dır. 3-Metil-1-butanol için belirlenen miktar ise yine, sırasıyla, 24.3, 19.6 ve 22.2 mg/l dir. 30 HUT 7087 IAM NCYC 22 2-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1- butanol üretimi. 43

60 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 30 HUT 7087 IAM NCYC 22 3-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1- butanol üretimi İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde saptanan izoamil asetat/amil alkol oranları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamil asetat/amil alkol oranı Maya ırkı İzoamil asetat/amil alkol oranı x HUT ay ±0.029 IAM b ±0.099 NCYC a ±0.019 Önem düzeyi * x : İzoamil asetat/amil alkol oranı denemeler sırasında en yüksek izoamil asetat miktarına ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM 12217: W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22 44

61 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Ester/yüksek alkol oranı fermente içkilerde duyusal özellikler üzerinde etkili bir parametre olarak görülmektedir. Üretilen ester miktarının yüksek ve yüksek alkol miktarının düşük olduğu durumlarda hoşa giden meyve aromalarının daha çok hissedildiği belirtilmiştir (Iwase, 1995; Valero ve ark., 2002). Kullanılan maya ırkları arasında izoamil asetat/amil alkol oranları açısından W. saturnus HUT 7087 ve W. saturnus NCYC 22 mayaları arasında istatistiksel açıdan fark bulunmazken (p>0.05), W. saturnus IAM mayası ile diğer iki maya arasındaki fark önemli bulunmuştur (p<0.05). Inoue ve ark. (1997), Hansenula mrakii ve S. cerevisiae kültürlerinde izoamil asetat/izoamil alkol oranını sırasıyla 1.33 ve olarak bulmuşlardır. Farklı W. saturnus ırkları ile gerçekleştirilen bu araştırmada ise en yüksek izoamil asetat/amil alkol oranı 4.66 ile W. saturnus HUT 7087 mayası ile gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde saptanmıştır İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087, W. saturnus IAM ve W. saturnus NCYC 22 mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyon denemeleri süresince izoamil asetat üretimindeki değişim Şekil 4.7 de, bu mayalar tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları ise Çizelge 4.2 de verilmiştir. 45

62 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 25 HUT 7087 IAM NCYC 22 İzoamil asetat (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamil asetat üretimi. Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları İzoamil asetat miktarı İzoamil asetat üretim hızı x Maya Irkı (mg/l) (mg/l/saat) HUT ± ay ± IAM ± a ± NCYC ± b ± Önem düzeyi ö.d. * x : İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). *: p<0.05, ö.d.: önemli değil, HUT 7087: W. saturnus HUT 7087; IAM 12217: W. saturnus IAM 12217; NCYC 22: W. saturnus NCYC 22 Denemelerde kullanılan maya ırkları arasında izoamil asetat üretim miktarı bakımından istatistiksel olarak fark bulunmazken (p>0.05), izoamil asetat üretim hızları açısından önemli farklılık gözlenmiştir (p<0.05). Yapılan Duncan çoklu karşılaştırma testine göre izoamil asetat üretim hızları açısından W. saturnus HUT 7087 ve W. saturnus IAM mayaları arasındaki farklılık önemsiz bulunurken, 46

63 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN bu mayalar ile W. saturnus NCYC 22 mayası arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.05). Ancak, W. saturnus HUT 7087 mayasının izoamil asetat üretim hızı diğer mayalardan yüksek olduğu için araştırmanın ileri safhalarında bu maya ırkı kullanılmıştır W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde sıcaklığın ve havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla melas kullanılarak önce havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC de fermantasyon denemeleri kurulmuştur. Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla ise yine melas ortamında ve belirlenen en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200 ml/l/dakika), havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. Havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyon denemeleri havanın kontrollü olarak verildiği fermentörlerde gerçekleştirilirken, yarı havalandırmalı fermantasyon denemeleri orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu denemelerden elde edilen bulgular aşağıda verilmiştir W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı W. saturnus HUT 7087 ile izoamil asetat üretiminde fermantasyon süresince her iki sıcaklıkta da canlılık oranı % 100 bulunmuştur ve maya gelişimi Şekil 4.8 de verilmiştir. 47

64 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 15 C 25 C Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı. 25 ºC de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar logaritmik çoğalma evresini 15 ºC de yürütülen fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı ve daha fazla sayıda maya ile tamamlamıştır. 25 ºC de gerçekleştirilen denemede durgun faza 48. saatte girilirken, 15 ºC de 84. saatte girilmiştir. 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyonda maya sayısı 72. saatte 1.1x10 8 hücre/ml ile en yüksek değerine ulaşmıştır. 15 ºC de yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 180. saatinde 7.2x10 7 hücre/ml ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda ise maya sayısı 25 ºC de ve 15 ºC de, sırasıyla, 5.6x10 7 ve 5.1x10 7 hücre/ml bulunmuştur. Alkol fermantasyonunda maya popülasyonunu ve mayalar tarafından gerçekleştirilen biyokimyasal olayları etkileyen en önemli faktörlerden biri de sıcaklıktır (Fleet ve Heard, 1993). Literatürde alkol fermantasyonu sırasında sıcaklığın S. cerevisiae (Epifanio ve ark., 1999) ve farklı mayaların (Sharf ve Margalith, 1983; Heard ve Fleet, 1988; Mateo ve ark., 1991) gelişimleri üzerine etkisini konu alan farklı çalışmalar yapılmıştır. 20 ve 30 ºC de gerçekleştirilen fermantasyonlarda, genellikle kısa lag, logaritmik, durgun ve ölüm evrelerini içeren 48

65 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN alışılmış mikroorganizma gelişme eğrisi gözlenirken, 35 ºC gibi yüksek sıcaklıklarda büyük miktarda maya canlı kalmamaktadır (Torija ve ark., 2003). Literatürdeki diğer bulgular da sıcaklıktaki artışla beraber maya canlılık oranında düşüşlerin meydana geldiğini bildirmektedir (Ough, 1966; Nagodawithana ve ark, 1974; Casey ve ark., 1984). Erten (1997) yaptığı çalışmada, W. saturnus mayasının 20 ºC de 13 ºC den 1.2 kat daha fazla geliştiğini bildirmiştir. Torija ve ark. (2003) tarafından yapılan araştırmada ise, 15 ºC de ulaşılan maksimum maya sayısı 1.2x10 8 hücre/ml bulunurken, 25 ºC de bu değer 1.7x10 8 hücre/ml olarak saptanmıştır. Casellas (2005), 25 ºC de maya gelişiminin ve fermantasyon hızının 13 ºC den daha yüksek olduğunu bildirmiştir (2). Fermantasyonun Gidişi Fermantasyonun gidişi yoğunluk düşüşü ile izlenmiştir. Yoğunluk değerindeki düşüşler Şekil 4.9 da verilmiştir. 15 C 25 C Yoğunluk (g/cm 3 ) Fermantasyon süresi (saat) Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değişimi. 49

66 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 210 saatte tamamlanırken, 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 540 saatte tamamlanmıştır. 15 ºC de yürütülen fermantasyonda yoğunluk değerindeki düşüş, 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş ve daha az olmuştur. Fermantasyon sonunda 25 ºC de yürütülen denemede yoğunluk g/cm 3 ten g/cm 3 e düşmüştür. 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon sonunda ise yoğunluk g/cm 3 değerine kadar düşmüştür. Fermantasyon sıcaklığındaki düşüşe paralel olarak ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da düşüşler yaşanmıştır. Her iki sıcaklıkta yürütülen fermantasyonda ortamda mayalar tarafından tüketilemeyen şeker kalmış, ancak 15 ºC de fermente edilemeyen şeker miktarı daha fazla olmuştur. Sıcaklık maya gelişimi ve fermantasyon hızı üzerine etkilidir. Düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda fermantasyon hızı düşük, fermantasyon süresi ise uzundur (Fleet ve Heard, 1993; Ribereau-Gayon ve ark., 2000) (3). ph Fermantasyon süresince ph değişimi Şekil 4.10 da verilmiştir. 15 C 25 C ph Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki ph değişimi. 50

67 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde ph logaritmik fazda hızlı bir düşüş ile 4.81 değerine gerilerken, 15 ºC de gerçekleştirilen denemede ph 5 civarında bulunmuştur. 25 ºC de gerçekleştirilen denemede ph durgun fazda tekrar yükselmeye başlamış ve fermantasyon sonunda 4.85 değerine ulaşmıştır. 15 ºC de yürütülen denemede ise ph 5.15 olarak ölçülmüştür. Benzer sonuçlar Janssens ve ark. (1987) tarafından da bulunmuştur. Fermantasyon başlangıcında ph, ortamda oluşan yağ asitleri, amino asitler ve organik asitlerden dolayı düşmektedir. Oluşan bu asitler daha sonra maya tarafından metabolik olaylarda kullanılmakta, dolayısıyla miktarları azaldığından ortam ph sı tekrar yükselmektedir (Boulton ve Quain, 2001) (4). Etil Alkol Üretimi Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarı Şekil 4.11 de verilmiştir C 25 C Etil alkol (%, h/h) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda etil alkol üretimi. 51

68 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Fermantasyon süresince hacim olarak % 3.2 ile en fazla etil alkol 25 ºC de üretilirken, 15 ºC de gerçekleştirilen denemede bu değer % 2.8 bulunmuştur. 25 ºC de etil alkol miktarı fermantasyonun sonunda % 3.2, 15 ºC de ise en yüksek etil alkol miktarı fermantasyonun 444. saatinde hacim olarak % 2.8 bulunmuş ve bu değer fermantasyon sonunda % 2.3 e düşmüştür. Etil alkol üretimini etkileyen önemli faktörlerden biri maya cinsidir. Saccharomyces cinsi mayalar ile karşılaştırıldığında Pichia, Williopsis gibi aerobik mayalar düşük alkol üretme yeteneğine sahiptir (Erten, 1997). Bunun yanında, maya gelişimini etkileyen tüm faktörler aynı zamanda etil alkol üretimini de etkilemektedir. Sıcaklığın maya gelişiminde çok önemli bir etken olduğu, dolayısıyla etil alkol üretimini de etkilediği belirtilmiştir. Genel görüşe göre, sıcaklıktaki artış fermantasyon hızında da artışı beraberinde getirmekte, ancak etil alkol veriminde düşüşe yol açmaktadır (Ribereau Gayon ve ark., 1975; Llaurado ve ark., 2002; Torija ve ark., 2003). Ancak, farklı sıcaklıklarda üretilen etil alkol miktarı maya cinsi ile yakından ilgilidir. Heard ve Fleet e (1988) göre, üzüm suyunda 10 ve 25 ºC de Candida stelleta, sırasıyla, hacimce % 6.1 ve 6.3, Candida krusei % 6.6 ve 6.3, Candida pulcherrima % 4 ve 2.5, Hansenula anomala % 3.5 ve 4.3 ve S. cerevisiae % 9.5 ve 13.9 etil alkol üretirken, Klockera apiculata her iki sıcaklıkta hacimce % 2.7 etil alkol üretmiştir (5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi Fermantasyon süresince 15 ºC de ve 25 ºC de üretilen 2-metil-1-butanol ve 3- metil-1-butanol ün miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.12 ve Şekil 4.13 te verilmiştir. Her iki sıcaklıkta amil alkol miktarları fermantasyon sonunda kadar artmıştır. 25 ºC de gerçekleştirilen denemede en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3- metil-1-butanol değerleri fermantasyonun sonunda, sırasıyla, 24.8 ve 24.9 mg/l olarak tespit edilmiştir. 15 ºC de ise en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1- butanol miktarları yine fermantasyonun 444. saatinde, sırasıyla, 19.2 ve 12.4 mg/l değerleriyle elde edilmiş ve fermantasyonun sonunda 15.9 ve 11.1 mg/l değerlerine düşmüştür. 52

69 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN C 25 C 2-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi. 15 C 25 C 3-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi. 53

70 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Yüksek alkoller fermantasyon sırasında iki farklı metabolik yolla sentezlenirler. Birincisi, ortamdaki karbohidratların kullanıldığı pirüvat yolu (anabolik yol), ikincisi ise amino asit asimilasyonu (katabolik veya Ehrlich yolu) dur (Ouchi ve ark., 1980; Berry, 1995; Oshita ve ark., 1995). Her iki yolda da ön bileşik olarak 2-okso (α-keto) asitler oluşur. Bu asitler bir aldehit oluşturmak üzere dekarboksile edilir ve daha sonra ilgili alkollere indirgenirler. Anabolik yolda 2-okso asit, amino asit sentezinde kullanılan biyokimyasal yollarda pirüvattan veya asetil-coa dan elde edilir. Katabolik yolda ise, 2-okso asit bir amino asidin transaminasyonu ile oluşur (Boulton ve Quain, 2001). Ancak, mayalarda yüksek alkollerin üretiminde daha çok Ehrlich yolunun kullanıldığı ileri sürülmektedir (Erten, 1997). Fermantasyon sırasında yüksek alkollerin oluşumunu kontrol eden üç etken vardır. Bunlar maya cinsi, fermantasyon ortamının bileşimi (özellikle azot miktarı) ve sıcaklık, havalandırma gibi fermantasyon koşullarıdır. Maya cinsi yüksek alkollerin üretiminde en önemli faktör olarak göze çarparken, maya gelişimini teşvik eden havalandırma, ortamdaki doymamış yağ asidi ve steroller de yüksek alkol üretimini arttırmaktadır. Yüksek sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda maya gelişiminde düşük sıcaklıklara nazaran artış gözlendiği ve buna paralel olarak sıcaklığın yüksek alkollerin miktarında da artışa neden olduğu belirtilmektedir (Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001). Landaud ve ark. (2001), 16 ºC de 10 ºC ye nazaran iki kat fazla yüksek alkol üretildiğini bildirmişlerdir. Araştırmacılara göre, fermantasyon sıcaklığındaki artış ortamdaki amino asit ve şekerlerin kullanımını teşvik etmekte ve dolayısıyla bu besin maddelerinin metabolizması sonucu oluşan yüksek alkollerin miktarında da artışlar gözlenmektedir. Ough ve Amerine (1967), 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol ün daha çok ºC arasında oluştuğunu, Calderbank ve Hammond (1994) ise sıcaklıktaki artışa paralel olarak oluşan izoamil alkol miktarında da artışlar meydana geldiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada da sıcaklıktaki artışa paralel olarak 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarlarında da artışlar gözlenmiştir. 54

71 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (6). İzoamil Asetat Üretimi Fermantasyon süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişim Şekil 4.14 te, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.3 te verilmiştir C 25 C İzoamil asetat (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda izoamil asetat üretimi. Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları Sıcaklık İzoamil asetat miktarı İzoamil asetat üretim hızı x (mg/l) (mg/l/saat) 15 C 29.43± ± C 20.72± ± Önem düzeyi *** *** x : İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. ***: p<

72 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları bakımından 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ile 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). 25 ºC de üretilen izoamil asetat miktarı fermantasyonun 48. saatinde 20.7 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC de üretilen izoamil asetat miktarı ise fermantasyonun 216. saatinde 29.4 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. 15 ºC de üretilen izoamil asetat miktarı 25 ºC de üretilen izoamil asetat miktarından fazla bulunurken, izoamil asetat üretim hızlarında aksine bir durum söz konusudur. Calderbank ve Hammond (1994), artan sıcaklığa paralel olarak ester üretim hızında da artış olduğunu bildirmişlerdir. Fermantasyon sonunda üretilen izoamil asetat miktarları 25 ºC ve 15 ºC için, sırasıyla, 14 ve 20 mg/l dir. Üretim verimliliği açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne alındığında, 25 ºC de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir. Fermantasyon sırasında mayalar tarafından üretilen ester miktarı başta maya cinsi olmak üzere, ester oluşumu için gerekli substratların (asetil koenzim A ve yüksek alkoller) konsantrasyonuna ve ester oluşumunda ve yıkımında rol alan enzimlerin toplam aktivitelerine bağlıdır. Dolayısıyla substrat konsantrasyonunu ve enzim aktivitesini etkileyen tüm faktörler ester oluşumunu etkilemektedir (Peddie, 1990; Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Verstrepen ve ark., 2003a; Verstrepen ve ark., 2003b; Dufour ve ark., 2003). Genellikle, ºC arasında sıcaklık artışına paralel olarak oluşan ester miktarı da artmaktadır. Bazı çalışmalarda, 12 ºC de 10 ºC den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10 ºC den 16 ºC ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % civarında arttığı belirtilmiştir. Daudt ve Ough (1973) e göre esterler farklı sıcaklık profilleri gösterebilmektedirler. Örneğin, etil asetat ve feniletil asetat en fazla 20 ºC de üretilirken, izoamil asetat ve etil oktanoat 15 ºC de daha fazla üretilmektedir. Fakat, bu durum bütün mayalar için geçerli değildir. Sıcaklığın oluşan ester miktarını neden etkilediği henüz tam olarak netlik kazanmamıştır. Ancak, sıcaklığın AATaz aktivitesini etkilediği tahmin edilmektedir. Bazı araştırmacılar, sıcaklığın mayalarda hücre içi yağ asidi bileşimini değiştirdiğini, dolayısıyla doymamış yağ asitlerinden etkilenen AATaz enziminin aktivitesinde değişimlere yol açarak ester üretimini 56

73 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN etkilediğini belirtmişlerdir (Fujii ve ark., 1997; Kajiwara ve ark., 1997). Bunun yanında, sıcaklıkta meydana gelen değişimlerin ester oluşumu için gerekli olan yüksek alkollerin miktarında da değişime neden olduğu bilinmektedir (Hammond, 1993; Dufour ve ark., 2003; Cole ve Noble, 2003; Verstrepen ve ark., 2003b) W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı Fermantasyon süresince mayalar havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve daha fazla gelişmişlerdir. Bütün denemelerde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Maya gelişimi Şekil 4.15 te verilmiştir. Havalı Havasız Yarı havalı Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı. 57

74 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Mayalar durgun faza, havalandırmalı ve yarı havalandırmalı fermantasyonlarda 24. saatte girerken, havalandırmasız fermantasyonda 48. saatte girmişlerdir. Yarı havalandırmalı fermantasyonda 24. saatte 2.8x10 8 hücre/ml ile en yüksek maya sayısına ulaşılırken, havalandırmalı ve havalandırmasız gerçekleştirilen fermantasyonlarda maya sayıları sırasıyla 78. ve 150. saatlerde 2.2x10 8 ve 1.1x10 8 hücre/ml ile en yüksek maya sayısına ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda yarı havalandırmalı fermantasyonda maya sayısında bir değişiklik olmazken, havalandırmalı ve havalandırmasız fermantasyonlardaki maya sayılarında azalma olmuştur. Havalandırmanın maya gelişimini teşvik ettiği yapılan farklı çalışmalarla ortaya konulmuştur. Kuriyama ve Kobayashi (1993) ve Erten (1997) yaptıkları çalışmalarda havalandırma ve karıştırmanın fermantasyon sırasında maya gelişim hızı ve miktarını arttırdığını bildirmişlerdir. Mauricio ve ark. (1997) ise havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen fermantasyonun maya gelişimini inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Nitekim oksijen maya gelişimi için gerekli olan sterollerin ve doymamış yağ asitlerinin üretimi için gereklidir (Peddie, 1990) (2). Fermantasyonun Gidişi Fermantasyonun gidişi yoğunluktaki düşüş ile izlenmiştir. Yoğunluk değerindeki düşüşler Şekil 4.16 da verilmiştir. 58

75 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Havalı Havasız Yarı havalı Yoğunluk (g/cm 3 ) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yoğunluk değişimi. Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede fermantasyon 168. saatte, havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemede 210. saatte ve yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede ise 126. saatte tamamlanmıştır. Havalandırmalı ortamda 48. saatten sonra şeker tüketimi oldukça yavaşlamıştır. Fermantasyon sonunda, havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede yoğunluk g/cm 3 e düşerken, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemelerde bu değer g/cm 3 olarak ölçülmüştür. Mayalar logaritmik fazda ortamdaki fermente edilebilir şekeri kullanarak gelişirler. Havalandırmalı fermantasyonlarda, ortamda bulunan şeker miktarı azalınca maya hücresi oksijeni kullanarak solunum metabolizması ile enerji üretmeye devam eder. Dioksik shift (değişim) adı verilen bu geçiş noktasından sonra maya ortamda bulunan etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanarak daha yavaş bir gelişme sürecine girer (Erten, 1997; Herman, 2002). Havalandırma yapılan denemede mayanın 48. saatte diauxic shift (değişim) safhasına girerek ortamda bulunan şekeri daha fazla tüketemediği ve bu saatten sonra etil alkolü kullanmaya başladığı düşünülmektedir (Şekil 4.16). 59

76 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (3). ph Fermantasyon süresince ph da meydana gelen değişim Şekil 4.17 de verilmiştir. Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde ph başlangıç değerine göre artış gösterirken, havalandırmasız ortamda düşüş göstermiştir. Fermantasyon sonunda ph değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 5.74, 5.70 ve 4.85 olarak bulunmuştur Havalı Havasız Yarı havalı 5.50 ph Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında ph değişimi (4). Etil Alkol Üretimi Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.18 de verilmiştir. Fermantasyon süresince en fazla etil alkol yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen denemede hacim olarak % 4.15 ile fermantasyonun 48. saatinde gözlemlenirken, en düşük etil alkol üretimi havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen 60

77 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN denemede 24. saatte kaydedilmiştir. Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda fermantasyonun ilerleyen saatlerinde etil alkol miktarlarında azalma görülürken, havalandırmasız ortamda yürütülen denemede fermantasyon sonuna kadar artış göstermiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde sırasıyla % 0.85, 0.90 ve 3.20 olarak belirlenmiştir. Birçok maya etil alkolü karbon kaynağı olarak kullanabilir. Havalandırma yapılan fermantasyonlarda glikoliz ve glukoneogenesis olmak üzere iki safha vardır. Glikoliz safhasında şekerler etil alkole fermente edilir. Ortamda şeker konsantrasyonunun azaldığı durumlarda ise glikoliz sırasında oluşan etil alkol hücre gelişimi için karbon kaynağı olarak kullanılır ki bu safha glukoneogenesis safhasıdır (Wales ve ark., 1980; Van Urk ve ark., 1989; Erten, 1997). Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde etil alkol miktarı sırasıyla 24. ve 72. saatten sonra düşmeye başlamıştır ki bu düşüşlerin glukoneogenesis safhasından kaynaklandığı ve oluşan etil alkolün daha sonra maya tarafından karbon kaynağı olarak kullanılmaya başlandığı düşünülmektedir. 5 Havalı Havasız Yarı havalı Etil alkol (%, h/h) h Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etil alkol üretimi. 61

78 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim, sırasıyla, Şekil 4.19 ve 4.20 de verilmiştir. 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol en fazla yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde üretilmiştir. Yarı havalandırmalı denemede üretilen 2- metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları fermantasyonun 72. saatinde sırasıyla 92.8 ve 43.8 mg/l ile gerçekleşmiştir. Havalandırmasız fermantasyon denemesinde üretilen en yüksek 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları sırasıyla 29.4 ve 6.3 mg/l bulunurken, havalandırmasız fermantasyon denemesinde bu değerler fermantasyon sonunda 24.8 ve 24.9 mg/l olarak belirlenmiştir. 100 Havalı Havasız Yarı havalı 2-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2- metil-1-butanol üretimi. 62

79 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 50 Havalı Havasız Yarı havalı 3-Metil-1-butanol (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3- metil-1-butanol üretimi. Maya cinsi, sabit ortam koşullarında oluşan yüksek alkol miktarını etkileyen en önemli parametredir. Farklı kaynaklarda, fermantasyon koşulları dikkate alındığında ise yüksek ph, yüksek sıcaklık ve havalandırmanın yüksek alkol üretimini arttırdığına dair bulgulara rastlanmıştır (Crowel ve Guymon, 1963; Berry, 1995; Mauricio ve ark., 1997; Bisson ve ark., 1998; Boulton ve Quain, 2001; Verstrepen ve ark., 2003b; Ribéreau-Gayon ve ark., 2006). Guymon ve ark. (1961), havalandırmanın fermantasyon sırasında oluşan yüksek alkollerin miktarında yaklaşık 5 kat artışa neden olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmada elde edilen verilere göre, yarı havalandırmalı koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde oluşan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol miktarları daha yüksek bulunmuştur (6). İzoamil Asetat Üretimi Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen izoamil asetat 63

80 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN miktarındaki değişimler Şekil 4.21 de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.4 te verilmiştir. 140 Havalı Havasız Yarı havalı İzoamil asetat (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında izoamil asetat üretimi. Fermantasyon sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde 90. saatte mg/l olarak saptanırken, en düşük izoamil asetat miktarına 8.8 mg/l ile havalandırmalı ortamda yürütülen denemede 108. saatte rastlanmıştır. İzoamil asetat hızları karşılaştırıldığında ise, en yüksek izoamil asetat üretim hızı mg/l/saat ile yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları ise havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 8.5, 14 ve 80 mg/l olarak belirlenmiştir. 64

81 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları Havalandırma koşulu İzoamil asetat miktarı (mg/l) İzoamil asetat üretim hızı x (mg/l/saat) Havalandırmalı 8.84 c ± cy ± Havalandırmasız b ± b ± Yarı havalandırmalı a ± a ± Önem düzeyi *** *** x : İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). ***: p< Mauricio ve ark. (1997) na göre, Bertrand ve Torres-Alegre (1984) fermantasyon ortamına oksijen ilavesinin etil asetat ve yağ asidi etil esterlerini arttırdığını bildirmişlerdir. Nykanen (1986) ise, havalandırmasız ortamda üretilen izoamil asetat miktarının havalandırmalı ortamda üretilenden sekiz kat fazla olduğunu bildirmiştir. Havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyonlarda oksijen maya gelişimini hızlandırmakta ve dolayısıyla ortamda bulunan asetil koenzim A nın büyük bir kısmı maya gelişimi için gerekli doymamış yağ asidi ve sterollerin üretiminde kullanılmakta ve ester üretimi için gerekli asetil koenzim A yeterince sağlanamadığından oluşan ester miktarı azalmaktadır (Peddie, 1990; Hammond, 1993; Boulton ve Quain, 2001; Lewis ve Young, 2002; Verstrepen ve ark., 2003b). Genellikle, havasız ortamlarda yarı havalandırmanın yapıldığı ortamlarla kıyaslandığında butil asetat, izoamil asetat, feniletil asetat ve hekzil asetat miktarlarında düşüşler gözlenmiştir (Mauricio ve ark., 1997). Yarı havalandırmalı koşullarda, ortamda oluşan ester miktarı artarak bir pik yapar ve daha sonra azalmaya başlar. Bunun nedeni, fermantasyon sonuna doğru aktivitelerinde artış gözlenen hücre içi esterazların oluşan esterleri hidroliz etmesidir (Mauricio ve ark., 1993). Bu çalışmada da yarı havalandırmalı koşullarda üretilen izoamil asetat miktarı, havalandırmalı ve havalandırmasız koşullarda üretilen izoamil asetat miktarlarından yaklaşık 6-15 kat fazla bulunmuştur. 65

82 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi Melas ortamında 25 C de yarı havalandırmalı koşullarda W. saturnus HUT 7087 mayası ile substrat olarak farklı oranlarda fuzel yağı kullanılarak biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretim denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fuzel yağı mayalar durgun faza girdiği anda ortama % 1, % 2 ve % 3 oranında ilave edilmiştir. Biyodönüşüm denemelerinde fuzel yağı ilavesinin maya gelişimi, maya canlılık oranı, ortam yoğunluğu, etil alkol üretimi, 2 ve 3-metil-1-butanol miktarı ve izoamil asetat miktarı üzerine etkisi aşağıda verilmiştir Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi Maya gelişimi, canlı maya sayısı ve canlılık oranı ile izlenmiştir. Denemelerde tespit edilen canlı maya sayısındaki değişim ve canlılık oranı sırasıyla Şekil 4.22 ve Şekil 4.23 te verilmiştir. Fuzel yağı maya gelişiminin 72. saatinde yani durgun faza girildiği anda ilave edilmiştir. Biyodönüşüm süresince kontrol denemesindeki mayalar fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki mayalardan daha fazla gelişmişlerdir. Kontrol denemesini % 1 ve % 2 fuzel yağı ilave edilen denemeler takip etmiştir. Ortama fuzel yağı ilave edildikten sonra tespit edilen en yüksek maya sayısı % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 2.1x10 8, 2x10 8 ve 1.4x10 8 hücre/ml olarak bulunmuştur. % 3 fuzel yağı ilave edilen denemedeki canlı maya sayısında düşüş % 1 ve 2 fuzel yağı ilave edilen denemelere nazaran fazla bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda tespit edilen canlılık oranı kontrol denemesi için % 97 olurken, % 1, 2 ve 3 oranında fuzel yağı ilave edilen denemelerde sırasıyla % 95, 89 ve 72 olarak bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir konsantrasyondan sonra maya gelişimini olumsuz etkilediği daha önce yapılan çalışmalarda da tespit edilmiştir (Quilter ve ark., 2003). 66

83 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Kontrol 1% 2% 3% Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir). 110 Kontrol 1% 2% 3% 100 Canlılık Oranı (%) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince canlılık oranı (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir). 67

84 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi Yoğunluk değerindeki düşüşler Şekil 4.24 de verilmiştir. Ortamdaki fermente edilebilir şeker miktarı yoğunluk düşüşü ile takip edilmiştir. Yoğunluk değerlerindeki düşüşler bütün denemelerde benzer bir seyir izlemiştir. Ortama ilave edilen fuzel yağının, mayaların ortamdaki şekerleri kullanabilme yeteneğine önemli bir etkisi olmamıştır Kontrol 1% 2% 3% 1.04 Yoğunluk (g/cm 3 ) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir) Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi Biyodönüşüm süresince üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.25 de verilmiştir. Fuzel yağı ilave edildikten sonra, kontrol hariç diğer denemelerde gözlenen etil alkol değerleri, fuzel yağında bulunan etil alkolden dolayı kontrol denemesine göre yükselmiştir. Etil alkol üretimi bütün denemelerde durgun faza girildikten sonra 68

85 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN azalma eğilimi göstermiştir. Biyodönüşüm sonunda belirlenen etil alkol miktarı kontrol, % 1, 2 ve 3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, hacmen % 0.9, 2.5, 2.5, ve 3.1 olarak bulunmuştur. 5 Kontrol 1% 2% 3% Etil alkol (%, h/h) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir) Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler Biyodönüşüm süresince ortamda bulunan 2 ve 3-metil-1-butanol miktarları Şekil 4.26 ve 4.27 de verilmiştir. Fuzel yağı ilave edildikten sonra, % 1, % 2 ve % 3 fuzel yağı ilave edilen denemelerdeki 2-metil-1-butanol miktarları, sırasıyla, 948.2, ve mg/l bulunurken, 3-metil-1-butanol ün miktarları ise, sırasıyla, 989.2, 1889 ve mg/l bulunmuştur. Biyodönüşüm sonunda 2-metil-1-butanol miktarları, sırasıyla, 344.7, ve mg/l, 3-metil-1-butanol miktarları ise yine, sırasıyla, 188.4, ve mg/l olarak belirlenmiştir. Görüldüğü gibi 2- ve 3-metil-1-butanol ün miktarları fuzel yağı ilavesini takiben sadece % 1 fuzel 69

86 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN yağı ilave edilen denemede belirgin şekilde azalmıştır. Meydana gelen bu azalma 2- metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol ün, sırasıyla, 2-metil-1-butil asetat ve 3-metil- 1-butil asetat a yani izoamil asetat a dönüşmesinden dolayıdır Kontrol 1% 2% 3% 2-Metil-1-butanol (mg/l) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir). 70

87 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 3000 Kontrol 1% 2% 3% 3-Metil-1-butanol (mg/l) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir). Ortama ilave edilen fuzel yağının izoamil asetata dönüşüm oranları Çizelge 4.5 de verilmiştir. 2-Metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol ün biyodönüşüm verimleri kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen denemeler arasındaki farklılık istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek biyodönüşüm verimleri 2-metil-1- butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave edilen denemede belirlenmiştir. Ancak, 3-metil-1-butanol ün dönüşüm oranı 2-metil-1-butanol ün dönüşüm oranından yüksek bulunmuştur. Daha önce yapılmış çalışmalarda da benzer sonuçlar elde edilmiştir (Janssens ve ark., 1989; Quilter ve ark., 2003). Hammond ve Pye (1996), alkollerin esterlerine dönüşüm oranlarının, alkollerin zincir uzunluklarına ve yapılarına bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar, 2-metil-1-butanol ve 3- metil-1-butanol ün AATaz tarafından substrat olarak kullanılmaları durumunda K m değerlerinin birbirlerine yakın olduğunu, ancak 2-metil-1-butanol ün V max değerinin 3-metil-1-butanol ün sadece %60 ı kadar olduğunu belirtmişlerdir. Dolayısıyla bu iki yüksek alkolden izoamil asetat oluşum dereceleri farklı olmaktadır. 71

88 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerine etkisi Fuzel yağı 2-Metil-1-butanol 3-Metil-1-butanol konsantrasyonu (%) biyodönüşüm verimi x (%) biyodönüşüm verimi x (%) a ± ay ± b ± b ± c ± c ±1.3 Önem düzeyi ** ** x :Biyodönüşüm verimleri biyodönüşüm sonunda tüketilen amil alkol miktarları göz önüne alınarak hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). **: p< Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarındaki değişimler Şekil 4.28 de, üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.6 da verilmiştir. Biyodönüşüm sırasında üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları açısından ilave edilen fuzel yağı miktarları arasındaki farklılıklar istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). Fuzel yağı ilave edildikten sonra %1 ve %2 fuzel yağı ilave edilen denemelerde en yüksek izoamil asetat miktarları 144. saatte, sırasıyla, ve 71.2 mg/l olarak bulunmuştur. %3 fuzel yağı ilave edilen denemede ise izoamil asetat miktarında düşüş gözlenmiştir. Biyodönüşüm sonunda ortamda bulunan izoamil asetat miktarları kontrol ve %1, %2 ve %3 fuzel yağı ilave edilen denemeler için, sırasıyla, 80, 140, 24.1 ve 14.2 mg/l olarak bulunmuştur. İzoamil asetat miktarı en fazla %1 fuzel yağı ilave edilen denemede tespit edilmiştir. Fuzel yağı ilavesi izoamil asetat üretiminde yaklaşık 3 kat artışa neden olmuştur. 72

89 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Kontrol 1% 2% 3% İzoamil asetat (mg/l) Süre (saat) Şekil Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim (fuzel yağı ilave edilen saat okla gösterilmiştir). Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları Fuzel yağı İzoamil asetat miktarı İzoamil asetat üretim hızı x konsantrasyonu (mg/l) (mg/l/saat) (%) Kontrol b ± by ± % a ± a ± % c ± c ± % d ± b ± Önem düzeyi *** *** x : İzoamil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). ***: p< Fuzel yağının biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde substrat olarak kullanıldığı ilk çalışma Janssens ver ark. (1989) tarafından gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, Calderbank ve Hammond (1994), S. cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyonda ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol ün hem izoamil asetat oluşum 73

90 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN hızında hem de oluşan izoamil asetat miktarında artışlara neden olduğunu ve ilave edilen 400 mg/l 3-metil-1-butanol ün ise izoamil asetat üretimini 7 kat arttırdığını bildirmişlerdir. Ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol ün miktarı 800 mg/l ye çıkarıldığında ise izoamil asetat miktarında herhangi bir değişim olmadığı, bunun yanında fermantasyon hızında azalma gözlendiği belirlenmiştir. Araştırmacılar, ortama ilave edilen 3-metil-1-butanol miktarının 400 mg/l nin üzerinde olduğu durumda AATaz enziminin doymuş hale geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil asetat üretilmediğini ileri sürmüşlerdir. Quilter ve ark. (2003) ise, S. cerevisiae ile melas ortamında gerçekleştirdikleri çalışmada ortama ilave edilen fuzel yağının izoamil asetat üretiminde 4.4 kat artışa neden olduğunu ve ilave edilen fuzel yağı konsantrasyonunun 1 g/l üzerinde olduğu durumda izoamil asetat miktarında daha fazla artış gözlenmediğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada, En yüksek izoamil asetat miktarı mg/l ile % 1 fuzel yağı ilave edilen denemede bulunmuştur Etil Asetat Üretimi P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi NCYC kültür koleksiyonundan elde edilen P. anomala NCYC 432 ve P. subpelliculosa NCYC 436 mayalarının etil asetat üretimlerini karşılaştırmak amacıyla 25 ºC de melas içeren erlenmayerlerde orbital karıştırıcı kullanılarak fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. P. anomala NCYC 432 mayası fermantasyon sonunda yaklaşık 1400 mg/l etil asetat üretirken, P. subpelliculosa NCYC 436 mayası 850 mg/l etil asetat üretebilmiştir. P. anomala NCYC 432 mayası daha fazla etil asetat ürettiği için sıcaklığın ve havalandırmanın etil asetat üretimine etkisini görmek amacıyla yürütülen denemelerde bu maya kullanılmıştır. P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde sıcaklığın etkisini araştırmak amacıyla melas kullanılarak önce havalandırmasız ortamda, 15 ºC ve 25 ºC de 74

91 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN fermantasyon denemeleri kurulmuştur. Havalandırmanın etkisini araştırmak amacıyla ise yine melas ortamında ve belirlenen en uygun sıcaklıkta, havalandırmalı (200 ml/l/dakika), havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretimi P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı P. anomala NCYC 432 ile etil asetat üretiminde her iki sıcaklıkta yürütülen fermantasyon denemelerinde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Fermantasyonlar süresince maya gelişimi Şekil 4.29 da verilmiştir. 15 C 25 C Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki maya gelişimi. 75

92 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 25 ºC de yürütülen fermantasyon denemesinde mayalar, 15 ºC de yürütülen fermantasyon denemesine nazaran daha hızlı gelişmişlerdir. 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesinde mayalar durgun faza 60. saatte girerken, 15 ºC de yürütülen denemede 120. saatte girmiştir. 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyonda maya sayısı 60. saatte 8.2x10 7 hücre/ml ile en yüksek değerine ulaşmıştır. 15 ºC de yürütülen fermantasyonda ise maya sayısı fermantasyonun 120. saatinde 7.9x10 7 hücre/ml ile en yüksek değere ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda ise maya sayısı her iki sıcaklıkta yürütülen denemeler için 6x10 7 hücre/ml bulunmuştur (2). Fermantasyonun Gidişi Fermantasyon süresince her iki sıcaklıkta tespit edilen yoğunluk değerleri Şekil 4.30 da verilmiştir C 25 C Yoğunluk (g/cm 3 ) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri. 76

93 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi 192. saatte tamamlanırken, 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ise 348. saatte tamamlanmıştır. Yoğunluk değerlerindeki azalmaya bakıldığında, 15 ºC de yürütülen fermantasyonda yoğunluk değerindeki azalma, 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyondan daha yavaş ve daha az olmuştur. Fermantasyon sonunda 25 ºC de yürütülen denemede yoğunluk g/cm 3 ten g/cm 3 e düşerken, 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon sonunda ise yoğunluk g/cm 3 olarak belirlenmiştir. Fermantasyon sıcaklığındaki düşüşe paralel olarak ortamdaki fermente edilebilir şekerlerin tüketim hızında da düşüşler yaşanmıştır (3). ph Fermantasyon süresince takip edilen ph değerleri Şekil 4.31 de verilmiştir. 15 C 25 C ph Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki ph değerleri. Her iki sıcaklıkta gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde ph, maya gelişiminin ilk evresinde yani logaritmik fazda hızlı bir düşüş sergilemiştir. 25 ºC de 77

94 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN gerçekleştirilen denemede ph 4.73 değerine kadar düşerken, 15 ºC de bu düşüş 4.76 ya kadar olmuştur. Fermantasyon sonunda her iki sıcaklık için ph değerlerinde artışlar kaydedilmiştir. 25 ºC de son ph 4.77 olurken, bu değer 15 ºC için 4.83 olarak kaydedilmiştir (4). Etil Alkol Üretimi Fermantasyon sırasında üretilen etil alkol miktarları Şekil 4.32 de verilmiştir. 15 C 25 C Etil alkol (%, h/h) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları. Fermantasyon süresince her iki sıcaklıktaki etil alkol üretimlerinde iniş ve çıkışlar gözlenmiştir. Her iki sıcaklıkta yürütülen denemelerde en fazla etil alkol üretimi % 3.5 olarak saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları 25 ºC ve 15 ºC de yürütülen denemeler için, sırasıyla, % 3 ve % 1.7 olarak bulunmuştur. 78

95 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (5). Etil Asetat Üretimi Fermantasyon süresince üretilen etil asetat miktarındaki değişimler Şekil 4.33 de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.7 de verilmiştir Etil asetat (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları. Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları Sıcaklık Etil asetat miktarı (mg/l) Etil asetat üretim hızı x (mg/l/saat) 15 C 102.9± ± C 319± ± Önem düzeyi ** ** x : Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. **: p<0.01. Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları bakımından sıcaklıklar arasındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC de üretilen etil asetat miktarı fermantasyonun

96 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN saatinde 319 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC de üretilen etil asetat miktarı ise fermantasyonun 276. saatinde mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Fermantasyon sonunda üretilen etil asetat miktarları 25 ºC ve 15 ºC için, sırasıyla, ve 65.2 mg/l dir. Etil asetat üretim hızlarına bakıldığında, 25 ºC de gerçekleştirilen denemede üretim hızı mg/l/saat olarak bulunurken, bu değer 15 ºC için mg/l/saat olmuştur. Genellikle ºC arasında sıcaklık arttıkça oluşan ester miktarı da artmaktadır. Sıcaklığın ester üretimine etkisi üzerine yapılan çalışmalarda, 12 ºC de 10 ºC den % 75 daha fazla ester oluştuğu, fermantasyon sıcaklığının 10 ºC den 16 ºC ye yükseltildiğinde oluşan ester miktarının % civarında arttığı belirtilmiştir. Ancak, ester üretimi farklı sıcaklık profilleri gösterebilmektedirler (Peddie, 1990). Saerens ve ark. (2008), S. cerevisiae ile C arasında gerçekleştirdikleri denemelerde artan sıcaklıkla beraber oluşan etil asetat miktarının da arttığını ve en çok artışın 20 ile 26 C aralığında gerçekleştiğini bildirmişlerdir P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi (1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı Fermantasyon süresince havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde mayalar, havalandırmasız ortama göre daha hızlı ve daha fazla gelişmişlerdir. Denemelerin tümünde canlılık oranı % 100 bulunmuştur. Maya gelişimi Şekil 4.34 te verilmiştir. 80

97 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Havalı Havasız Yarı havalı Canlı maya sayısı (x10 7 hücre/ml) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı. Havalandırmalı ve yarı havalandırmalı ortamda yürütülen denemelerde maya durgun faza 24. saatte girerken, havasız denemede 60. saatte girmiştir. Fermantasyon süresince ulaşılan en yüksek canlı maya sayıları havalandırmalı ve yarı havalandırmalı denemeler için 3.6x10 8 hücre/ml olurken, havalandırmasız denemede 8.1x10 7 hücre/ml bulunmuştur. Fermantasyon sununda ortamda bulunan canlı maya sayıları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.8x10 8, 2.6x10 8 ve 6x10 7 hücre/ml olarak saptanmıştır. Fredlund ve ark. (2004a), P. anomala nın havalandırmalı koşullarda oksijensiz ortama nazaran daha hızlı ve daha çok geliştiğini bildirmişlerdir. Diğer bir çalışmada ise ortama verilen kısıtlı oksijenin P. anomala nın gelişimini de kısıtladığını bildirilmiştir (Fredlund ve ark., 2004b). 81

98 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (2). Fermantasyonun Gidişi Fermantasyon gidişi yoğunluktaki azalma ile takip edilmiştir. Fermantasyon süresince kaydedilen yoğunluk düşüşleri Şekil 4.35 de verilmiştir. Havalı Havasız Yarı havalı Yoğunluk (g/cm 3 ) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri. Yarı havalandırmalı ortamda gerçekleştirilen fermantasyon denemesindeki yoğunluk düşüşü diğer denemelerden daha hızlı olmuştur. Fermantasyon sonunda ölçülen yoğunluk değerleri ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamlarda yürütülen denemeler için, sırasıyla, 1.017, ve g/cm 3 dir (3). ph verilmiştir. Fermantasyon süresince ph da meydana gelen değişim Şekil 4.36 da 82

99 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Havalı Havasız Yarı havalı ph Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki ph değerleri. Fermantasyon süresince tüm denemelerde ph değerinde düşüşler yaşanmıştır. Fermantasyon sonunda ph değerleri havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda gerçekleştirilen denemeler için, sırasıyla, 4.67, 4.57 ve 4.77 olarak bulunmuştur (4). Etil Alkol Üretimi Fermantasyon süresince oluşan etil alkol miktarları Şekil 4.37 de verilmiştir. 83

100 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN Havalı Havasız Yarı havalı Etil alkol (%, h/h) Fermantasyon süresi (saat) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi. Fermantasyon süresince yarı havalandırmalı ortamda etil alkol üretimi 24. saate kadar artış göstermiş ve daha sonra düşmeye başlamıştır. Havalandırmalı ve havalandırmasız ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde ise etil alkol üretimi fermantasyon sonuna kadar genel olarak artarak devam etmiştir. En fazla etil alkol üretimi fermantasyonun 180. saatinde % 3.48 ile havalandırmasız ortamda gerçekleşmiştir. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil alkol miktarları havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız denemelerde, sırasıyla, % 1.80, 3.01 ve 0.40 olarak belirlenmiştir. Fredlund (2004), P. anomala nın havalandırmalı ve havalandırmasız ortamda etil alkol oluşturduğunu, ancak havalandırmalı ortamda üretilen etil alkolün tekrar hücre tarafından kullanılırken, havalandırmasız ortamda fermantasyon bitene kadar ortamda birikmeye devam ettiğini bildirmiştir. Bu çalışmada, havalandırmanın yapıldığı denemelerde oluşan etil alkolün tekrar maya tarafından kullanıldığı, havalandırmasız ortamda ise fermantasyon süresince sürekli ortamda birikmeye devam ettiği gözlenmiştir. 84

101 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN (5). Etil Asetat Üretimi Fermantasyon süresince havalandırmalı, havalandırmasız ve yarı havalandırmalı ortamlarda gerçekleştirilen denemelerde üretilen etil asetat miktarındaki değişimler Şekil 4.38 de, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları ise Çizelge 4.8 de verilmiştir. Havalı Havasız Yarı havalı Havalı ve Havasız Etil asetat (mg/l) Fermantasyon süresi (saat) Yarı havalı Etil asetat (mg/l) Şekil P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi. Fermantasyon sırasında üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). Denemeler sırasında üretilen en yüksek etil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda fermantasyonun 144. saatinde mg/l olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarına 146 mg/l ile havalandırmalı ortamda fermantasyonun 96. saatinde rastlanmıştır. Etil asetat üretim hızları karşılaştırıldığında, en yüksek değer mg/l/saat ile yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Fermantasyon sonunda ortamda bulunan etil asetat miktarları ise havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız 85

102 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN ortamlarda gerçekleştirilen denemeler için sırasıyla 91, 1920 ve mg/l olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları Havalandırma Etil asetat miktarı Etil asetat üretim hızı x koşulu (mg/l) (mg/l/saat) Havalandırmalı c ± by ± Havalandırmasız 319 b ± c ± Yarı havalandırmalı a ± a ± Önem düzeyi *** *** x : Etil asetat üretim hızları denemeler sırasında en yüksek değere ulaşılan saatlerde hesaplanmıştır. y : Aynı sütunda değişik harflerle gösterilen değerler arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p<0.05). ***: p< Mayalarda etil asetat, ya AATaz aktivitesi ile etil alkol ve asetil koenzim A dan veya ters esteraz aktivitesi ile etil alkol ve asetat tan üretilir. Bu iki enzimin etil asetat üretimine katkısı maya cinsine göre farklılık gösterir. Etil asetat üretimine neden olarak iki farklı mekanizmanın olduğu düşünülmektedir. Bunlardan biri maya için toksik etki yapabilecek asetat ve etil alkolün hücreden uzaklaştırılması, diğeri ise serbest koenzim A sirkülasyonunun sağlanmasıdır (Fredlund, 2004; Fredlund ve ark., 2004a ). P. anomala nın glukoz içeren ve havalandırmanın yapıldığı ortamda etil asetat ürettiği ve oksijen miktarının arttırıldığı zaman üretilen etil asetat miktarında düşüş olduğu farklı kaynaklarda bildirilmiştir (Gray, 1949; Davies ve ark., 1951; Tabachnick ve Joslyn, 1953; Fredlund ve ark., 2004a). Passoth ve ark. (2004), ortama verilen oksijen miktarının kısıtlandığı durumlarda etil asetat miktarında 10 kat artışın meydana geldiğini bildirmişlerdir. Rojas ve ark. (2001) ise bu görüşün aksine oksijenin kısıtlandığı koşullarda üretilen etil asetat miktarının oksijenli ortam koşullarına nazaran daha az olduğunu belirtmişlerdir. Bu araştırmada, havalandırmasız ortamda üretilen etil asetat miktarı havalandırmalı ortamda üretilenin yaklaşık iki katı bulunmuştur. Yarı havalandırmalı ortamda ise havalandırmalı ortamda üretilen etil asetat miktarının 45 katına ulaşılmıştır. Havalandırmanın kısıtlı yapıldığı durumda ortamda oluşan etil asetat 86

103 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Murat YILMAZTEKİN miktarının arttığı gözlenmiştir. Benzer sonuçlar Passoth ve ark. (2004) tarafından da belirlenmiştir. 87

104 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Bu çalışmada, W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkı ile melastan fermantasyon yoluyla izoamil asetat üretimi gerçekleştirilmiş; en iyi verime sahip W. saturnus ırkı kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve havalandırma koşullarında fermantasyon denemeleri kurularak sıcaklığın ve havalandırmanın izoamil asetat üretimine etkisi araştırılmış; saptanan en uygun koşullarda melas ortamına farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilave edilerek biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Benzer şekilde Pichia cinsine ait iki farklı maya kullanılarak fermantasyon yoluyla melastan etil asetat üretimi gerçekleştirilmiş; en fazla etil asetat üreten maya kullanılarak farklı sıcaklıklarda ve havalandırma koşullarında fermantasyon gerçekleştirilerek sıcaklığın ve havalandırmanın etil asetat üretimine etkisi araştırılmıştır. İzoamil Asetat Üretiminde; W. saturnus türüne ait üç farklı maya ırkından en fazla izoamil asetat üretenin W. saturnus HUT 7087 olduğu tespit edilmiştir. İzoamil asetat üretim miktarı açısından yapılan karşılaştırmada bütün maya ırklarının birbirine yakın olduğu, ancak birim saatte üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı dikkate alındığında mayalar arasındaki farkın önemli olduğu bulunmuştur (p<0.05). W. saturnus HUT 7087 mayası ile üretilen izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları bakımından 25 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi ile 15 ºC de gerçekleştirilen fermantasyon denemesi arasındaki farklılık istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0.001). 25 ºC de üretilen izoamil asetat miktarı 20.7 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC de üretilen izoamil asetat miktarı 29.4 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşmıştır. Ancak, üretim verimliliği açısından birim zamanda üretilen izoamil asetat miktarı yani üretim hızı göz önüne alındığında, 25 ºC de daha fazla izoamil asetat üretilmiştir. Aynı maya ırkı kullanılarak farklı havalandırma koşullarında gerçekleştirilen denemelerde ise izoamil asetat miktarları ve izoamil asetat üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılıklar istatistiksel açıdan önemli 88

105 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN bulunmuştur (p<0.001). En yüksek izoamil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda mg/l olarak saptanmıştır. Fermantasyon denemeleri ile belirlenen en uygun koşullarda biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretiminin arttırılmasına yönelik gerçekleştirilen denemelerde ise, % 1 fuzel yağı ilavesiyle üretilen izoamil asetat miktarı 3 kat artmıştır (354 mg/l). Ortama ilave edilen fuzel yağının belirli bir konsantrasyondan sonra maya gelişimini olumsuz etkilediği belirlenmiştir. Fuzel yağında büyük oranda bulunan ve izoamil asetat üretiminde substrat olarak kullanılan 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1- butanol ün biyodönüşüm verimleri kıyaslandığında, fuzel yağı ilave edilen denemeler arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.01). En yüksek biyodönüşüm verimi 2-metil-1-butanol ve 3-metil-1-butanol için %1 fuzel yağı ilave edilen denemede saptanmıştır. Ancak, 3-metil-1-butanol ün dönüşüm oranı 2-metil- 1-butanol ün dönüşüm oranından yüksek bulunmuştur. Ortama ilave edilen fuzel yağı miktarının % 1 in üzerinde olduğu zaman AATaz enziminin doymuş hale geldiğini ve dolayısıyla daha fazla izoamil asetat üretilemediği sonucuna varılmıştır. Etil Asetat Üretiminde; Pichia cinsine ait mayalardan P. anomala NCYC 432 mayasının P. subpelliculosa NCYC 436 mayasına göre daha fazla etil asetat ürettiği saptanmıştır. P. anomala NCYC 432 mayası ile üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları bakımından uygulanan sıcaklıklar arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.01). 25 ºC de üretilen etil asetat miktarı 319 mg/l ile en yüksek seviyesine ulaşırken, 15 ºC de üretilen etil asetat miktarı ise mg/l ile sınırlı kalmıştır. Yine aynı şekilde, üretilen etil asetat miktarları ve etil asetat üretim hızları açısından uygulanan havalandırma koşulları arasındaki farklılık önemli bulunmuştur (p<0.001). Üretilen en yüksek etil asetat miktarı yarı havalandırmalı ortamda 6.7 g/l olarak saptanırken, en düşük etil asetat miktarı 146 mg/l olarak belirlenmiştir. Etil asetat üretim hızları karşılaştırıldığında, en yüksek değer mg/l/saat ile yarı havalandırmalı fermantasyon denemesinde saptanmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre dikkate değer bazı önemli hususlar ve öneriler aşağıda belirtilmiştir; Şeker endüstrisinin bir yan ürünü olan melas izoamil asetat ve etil asetat üretimi için uygun bir fermantasyon ortamı olarak kullanılabilir. Damıtma artığı olan 89

106 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Murat YILMAZTEKİN fuzel yağı ise biyodönüşümle izoamil asetat üretiminde uygun bir substrat olarak değerlendirilebilir. Araştırmada kullanılan fermentör, peristaltik pompa düzeneğine sahip olmadığı için ortam ph sının kontrolü sağlanamamıştır. Dolayısıyla ileriki çalışmalarda fermantasyon sırasında üretimde etkili olabilecek önemli bir parametre olan ph nın sürekli sabit tutularak farklı ph koşullarının denenmesi yararlı olacaktır. Fermantasyon başlangıcında ortama yeterli miktarda hava verilerek maya gelişiminin teşvik edilmesinin ve daha sonra, mayalar durgun faza girdiği zaman, verilen hava miktarı azaltılarak fermantasyona devam edilmesinin, üretilen izoamil asetat ve etil asetat miktarını arttırabileceği düşünülmektedir. Üretilen izoamil asetat miktarı şu ana kadar W. saturnus mayası ile elde edilen en yüksek miktar olmasına rağmen endüstriyel ölçekli üretim için düşüktür. Bu yüzden, izoamil asetat üretimini arttırmak için başta kullanılan maya türünün genetik olarak iyileştirilmesine olanak sağlayacak yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. P. anomala mayası ile üretilen etil asetat miktarının tatminkar olduğu düşünülmekte ve bundan sonraki aşamalarda üretilen aroma maddesinin ortamdan izole edilmesi ve saflaştırılması amacıyla yapılacak yeni çalışmalara gerek duyulmaktadır. Biyoteknolojik yolla doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde, bu alanda faaliyet gösteren kuruluşlar ve fabrikalar ile karşılıklı işbirliğine gidilerek yeni projeler geliştirilmesi ve bu projeler sonucunda üretim miktarının arttırılarak ekonomik açıdan endüstriyel ölçekte üretilebilir seviyelere taşınması, hem gıda sanayinde doğal aroma maddelerinin kullanılmasına olanak sağlayacak hem de ülke ekonomisine katkı sağlayacaktır. 90

107 KAYNAKLAR ABBAS, H. ve COMEAU, L., Aroma synthesis by immobilized lipase from Mucor sp. Enzyme and Microbial Technology, 32(5), ANONİM, 1997a. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği (16 Kasım 1997). Dünya Yayıncılık, İstanbul. ANONİM, 1997b. Methods of Analysis. The Institute of Brewing, London. ANONİM, Reference Methods fort he Analysis of Spirit Drinks. Official Journal of the European Communities, Council regulation (EEC) No: 2870/2000, 47s. BAYRAK, A Gıda Aromaları. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın No:32, s BERGER, R.G., Aroma Biotechnology. Springer, Berlin Heidelberg New York, s BERRY, D.R., Alcoholic Beverage Fermentations (Lea, A.G.H. ve Piggott, J.R editörler). Fermented Beverage Production, Blackie, London, s BERTRAND, A. ve TORRES-ALEGRE, V., Incidence de L action de L oxygene sur la formation des produits secondaires de la fermentation alcoolique du mout de raisin, Science des Aliments, 4, BISSON, L.F., KUNKEE, R.E. ve SINGLETON, V.L., Principles and Practices of Winemaking. Springer Verlag, New York. BOULTON, C. ve QUAIN, D., Brewing Yeast and Fermentation. Blackwell Science, Great Britain, 644s. BUZZINI, P., MARTINI, A., PAGNONI, U. M. ve DAVOLI, P., Production of flavoured organic compounds (VOCs) by Candida oleophia GK10 optimisation using factorial design and response surface analysis. Enzyme and Microbial Technology, 33, CALDERBANK, J. ve HAMMOND, J.R.M., Influence of Higher Alcohol Availability on Ester Formation by Yeast, Journal of American Society of Brewing and Chemistry, 52(2),

108 CANBAŞ, A., Gıda Bilimi ve Teknolojisi. Çukurova Üni. Ziraat Fak. ders kitabı, No:78, Çukurova Üni. Ziraat Fak. Ofset ve Teksir Atölyesi, Adana, 199s. CANBAŞ, A., Ekmek Mayacılığı. Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları, Yayın No: 22, Ankara, 44s. CASELLAS, G.B., Effect of low temperature fermentation and nitrogen content on wine yeast metabolism. Universitat Roviari Virgili, Facultat D Enologia, Doktora Tezi, Tarragona. CASEY, G.P., MAGNUS, C.A. ve INGLEDEW, W.M., High gravity brewing: effects of nutrition on yeast composition, fermentative ability and alcohol production. Applied and Environmental Microbiology, 48, 639. CHANG, R., Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences, 1st Edition, University Science Books, Sausalito, 1018s. COLE, V.C. ve NOBLE, A.C., Flavor Chemistry, (Lea, A.G.H. ve Piggott, J.R. editörler) Fermented Beverage Production, 2nd. ed., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 423s. COUTO, S.R., ve SANROMÁN, M.A, Application of solid-state fermentation to food industry-a review. Journal of Food Engineering, 76, CROWEL, E.A. ve GUYMON, J.F., Influence of aeration and suspended material on higher alcohols, acetoin, and diacetyl during fermentation. The Annual Meeting of the American Society of Enologist, Sacremento, California, CRUEGER, W. ve CRUEGER, A., Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiolory. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., USA, 357s. CURTIN, L.V., Molasses-General Consideration. Molasses in Animal Nutrition, National Feed Ingredients Association, West Des Moines, Iowa, 11s. ÇALIK, G., BERK, M., BOYACI, F.G., ÇALIK, P., TAKAÇ, S. ve ÖZDAMAR, T.H., Pretreatment Processes of Molasses for the Utilization in Fermentation Processes. Engineering and Manufacturaing for Biotechnology,

109 DAUDT, C.E. ve OUGH, C.S., Variations in some volatile acetate esters formed during grape juice fermentations: effects of fermentation temperature, SO 2, yeast strain and grape variety. American Journal of Enology and Viticulture, 24, DAVIES, R., FALKINER, E.A., WILKINSON, J.F. ve PEEL, J.L., Ester formation by yeast. 1. Ethyl acetate formation by Hansenula species. Biochemical Journal, 49, DUFOUR, J.-P., MALCORPS, P. ve SILCOCK, P., Control of Ester Synthesis During brewery Fermentation, (Smart K. editör), 2nd ed., Oxford Brookes University, Blackwell Science, Oxford, U.K., 308s. DUFOUR, J-P. ve MALCORPS, P., Ester synthesis during fermentation: enzyme characterization and modulation mechanism. Proceedings of the 4th Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, s ELMACI, Y., Lezzet Maddeleri. Gıda Katkı Maddeleri, (Altuğ, T. editör), Meta Basım, İzmir, s EPIFANIO, S.I., GUTIERREZ, A.R., SANTAMARI A, M.P. ve LO PEZ, R., The influence of enological practices on the selection of wild yeast strains in spontaneous fermentation. American Journal of Enology and Viticulture, 50 (2), ERTEN, H. ve CAMPBELL, I., The production of low-alcohol wines by aerobic yeasts. Journal of Institute of Brewing, 107 (4), ERTEN, H. ve CANBAŞ, A., Alkol fermantasyonu sırasında oluşan aroma maddeleri. Gıda, 28(6), ERTEN, H., The Production of Low Alcohol Wines by Aerobic Yeasts. Doktora Tezi, Department of Biological Sciences and Centre for Brewing and Distilling, Heriot-Watt University, Edinburgh, 201s. FLEET, G.H. ve HEARD, G.M., Yeasts-Growth during fermentation. Wine Microbiology and Biotechnology, (Fleet, G.H. editör), Harwood Academic Publishers, Switzerland, 510s. 93

110 FREDLUND, E., BLANK, L.M., SCHNURER, J., SAUER, U. ve PASSOTH, V., 2004a. Oxygen- and glucose-dependent regulation of central carbon metabolism in Pichia anomala. Applıed nnd Envıronmental Mıcrobıology, 70(10), FREDLUND, E., BROBERG, A., BOYSEN, M.E., KENNE, L. ve SCHNURER, J., 2004b. Metabolite profiles of the biocontrol yeast Pichia anomala J121 grown under oxygen limitation. Applied Microbiology and Biotechnology, 64, FREDLUND, E., Central carbom metabolism in the biocontrol yeast Pichia anomala: Influence of oxygen limitation. Doktora Tezi, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 54s. FUJII, T., KOBAYSHI, O., YOSHIMOTO, H., FURUKAWA, S. ve TAMAI, Y., Effect of aeration and unsaturated fatty acids on expression of the Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase gene. Applied and Environmental Microbiology, 63(3), GATFIELD, I.L., HILMER, J.M. ve BERTRAM, H.J., The alcohol fermentation process as a source of natural flavour materials. Intitute of Food Technologist Annual Meeting, Chicago. GENT, D.P. ve SLAUGHTER, J.C., Intracellular distribution of amino acids and higher alcohol production during fermentation. Proceedings of the 4th Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, (Cambell I. ve Priest, F.G. editörler), Institute of Brewing, London, GÖKSUNGUR, Y., UÇAN, A. ve GÜVENÇ, U., Production of pullulan from beet molasses and synthetic medium by Aureobasidium pullulans. Turkish Journal of Biology, 28, GRAY, D.W., Initial studies on the metabolism of Hensenula anomala (Hansen) Sydow. American Journal of Botany, 36, GUYMON, J.F., INGRAHAM, J.L. ve CROWELL, E.A., Influence of Aeration upon the formation of Higher Alcohols by Yeasts. American Journal of Enology and Viticulture, 12(2),

111 GÜVENÇ, A., KAPUCU, N. ve MEHMETOĞLU, Ü., The production of isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system. Process Biochemistry, 38, HAHN-HAGERDAL, B., KARHUMAA, K., LARSSON, C.U., GORWA- GRAUSLUND, M., GORGENS, J. ve H van ZYL, W., Role of Cultivation media in the development of yeast strains for large scale industrial use. Microbial Cell Factories, 4(31), HAMMOND, J. R. M. ve PYE, J., Acetate ester synthesis: The role of alcohol acetyl transferase. Brewing Technology, The Market and The Environment, Proceedings of the 6 th International Brewing Technology Conference, Harrogate, North Yorkshire, HAMMOND, J.R.M., Brewer s yeast, (Rose, H.A. ve Harrison, J.S. editörler), The Yeasts, Vol: 5, Academic Pres, London, s HEARD,G.M. ve FLEET, G.M.,1988. The effects of temperature and ph on the growth of yeast species during the fermentation of grape juice. Journal of Applied Bacteriology, 65, HERMAN, P.K., Stationary phase in yeast. Current Opinion in Microbiology, 5, HORTON, C.E., HUANG, K.-X., BENNETT, G.N. ve RUDOLPH, F.B., Heterologous expression of the Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase genes in Clostridium acetobutylicum and Escherichia coli for the production of isoamyl acetate. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 30, INOUE, Y., TREVANICHI, S., FUKUDA, K., IZAWA, S., WAKAI, Y. ve KIMURA, A., Roles of esterase and alcohol acetyltransferase on production of isoamyl acetate in Hansenula mrakii. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 45, IWASE, T., MORİKAWA, T., FUKUDA, H., SASAKİ, K. ve YOSHİTAKE, M., Production of Fruity Odor by Genus Williopsis. Journal of Brewery Society of Japan, 90(5),

112 JANSSENS, L., DE POOTER, H.L., SCHAMP, N.M. ve VANDAMME, E.J., Production of flavours by microorganisms. Process Biochemistry, 27, JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., VANDAMME, E.J. ve SCHAMP, N.M., Production of flavours by the yeast Hansenula mrakii. Med. Fac. Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4), JANSSENS, L., DE POORTER, H.L., DE MEY, L., VANDAMME, E.J. ve SCHAMP, N.M., Fusel oil as a precursor for the microbial production of fruity flavours. Med. Fac. Landbouwwet., Rijksuniv. Gent, 54 (4a), KAJIWARA, Y., OGAWA, K., TAKASHITA, H., OMORI, T., SHIMODA, M. ve WADA, H., Intracellular fatty acid formation and alcohol acetyl transferase gene expression in brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae) treated with heat shock. Journal of Fermentation and Bioengineering, 84(6), KALOGIANNIS, S., IAKOVIDOU, G., LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES, M., KYRIAKIDIS, D.A. ve SKARACIS G.N., Optimization of xanthan gum production by Xanthomonas campestris grown in molasses. Process Biochemistry, 39(2), KELLY, J., CHAPMAN, S. ve BRERETON, P., Gas Chromatographic Determination of Volatile Congeners in Spirit Drinks: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 82(6), KESHK, S.M.A.S., RAZEK, T.M.A. ve SAMESHIMA, K., Bacterial Cellulose Production from Beet Molasses. African Journal of Biotechnology, 5(17), KORUKLUOĞLU, M., Doğal aroma maddeleri üretiminde mikroorganizmalar. Gıda, 23(1), KRISHNA, S.H., DİVAKAR, S., PRAPULLA, S.G. ve KARANTH, N.G., Enzymatic synthesis of isoamyl acetate using immobilized lipaze from Rhizomucor miehei. Journal of Biotechnology, 87,

113 KRINGS, U. ve BERGER, R.G., Biotechnological production of flavours and fragrances. Applied Microbiology and Biotechnology, 49, 1-8. KURIYAMA, H. ve KOBAYASHI, H., Effects of oxygen supply on yeast growth and metabolism in continuous fermentation. Journal of Fermentation and Bioengineering, 75, KURTZMAN, C.P., Pichia E.C. Hansen emend. Kurtzman. (Kurtzman, C.P. ve. Fell, J.W. editörler) The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., Elsevier, Amsterdam, LANDAUD, S. KATRİLLE, E. ve CORRİEU, G., Top pressure and temperature control the fusel alcohol/ester ratio through yeast growth in beer fermentation. Journal of The Institute of Brewing, 107(2), LAUFENBERG, G., KUNZ, B. ve NYSTROEM, M., Transformation of vegetable waste into value added products: (A) the upgrading concept; (B) practical implementations. Bioresource Technology, 87, LEE, B.H., Fundamentals of Food Biotechnology. VCH Publishers Inc., USA, 431s. LEE, K., A media design program for lactic acid production coupled with extraction by electrodialysis, Bioresource Technology, 96, LEWIS, M.J. ve YOUNG, T.W., Brewing, 2nd ed., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 398s. LLAURADO, J., ROZES, N., BOBET, R., MAS, A. ve CONSTANTI, M., Low temperature alcoholic fermentations in high sugar concentration grape musts. Journal of Food Science, 67(1), LONGO, M.A. ve SANROMÁN, M.A, Production of Food Aroma Compounds. Food Technology and Biotechnology 44 (3), MASON, A.B. ve DUFOUR, J-P., Alcohol acetyltranferases and the significance of ester synthesis in yeast. Yeast, 16, MATEO, J.J., JIMENEZ, M., HUERTA, T. ve PASTOR, A., Contribution of different yeasts isolated from musts of monastrell grapes to the aroma of wine. International Journal of Food Microbiology, 14,

114 MAURICIO, J.C., MORENO, J., ZEA, L., ORTEGA, J.M. ve MEDINA, M., The Effect of Grape Must Fermentation Conditions on Volatile Alcohols and Esters Formed by Saccharomyces cerevisiae, Journal of Science of Food and Agriculture, 75, MAURICIO, J.C., MORENO, J.J., VALERO, E.M., ZEA, L., MEDINA, M. ve ORTEGA, J.M., Ester formation and specific activities of in vitro alcohol acetyltransferase and esterase by Saccharomyces cerevisiae during grape juice fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 41, MEDEIROS, A.B., PANDEY, A., FREİTAS, R.J.S., CHRİSTEN, P. ve SOCCOL, C.R., Optimization of the production of aroma compounds by Kluyveromyces marxianus in solid-state fermentation using factorial design and response surface methodology. Biochemical Engineering Journal, 6, MILLER, T.L. ve CHURCHILL, B.W., Substrates for large scale fermentations. (Demain, A.L. ve Solomon, N.A. editörler), Industrial Microbiology and Biotechnology, American Society for Microbiology, Washington, D.C., MINGORANCE-CAZORLA, L., CLEMENTE-JIMENEZ, J.M., MARTINEZ- RODRIGUEZ, S. ve LAS HERAS-VASQUEZ, F.J., Contribution of different natural yeasts to the aroma of two alcoholic beverages. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 19, NAGODAWITHANA, T.W., CASTELLANO, C. ve STEINKRAUS, K.H., Effect of dissolved oxygen, temperature, initial cell count and sugar concentration on the viability of Saccharomyces cerevisiae in rapid fermentations. Applied Microbiology, 28, 383. NAJAFPOUR, G.D., Biochemical Engineering and Biotechnology. Elsevier Press, Amsterdam. s NYKANEN, L., Formation and occurance of flavor compounds in wine and distilled alcoholic beverages. American Journal of Enology and Viticulture, 37(1),

115 OSHITA, K., KUBATO, M., UCHIDA, M. ve ONO, M., Clarification of the relationship between fusel alcohol formation and amino acid assimilation by brewing yeast using 13 C-labeled amino acid. Proceedings of the 25th European Brewery Congress, Brussels, IRL, Oxford, s OUCHI, K., YAMAMOTO, Y., TAKAGISHI, M. ve AKIYAMA, H., Regulation of isoamyl alcohol formation via Erlich pathway in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation Technology, 58, OUGH, C.S. ve AMERINE, M.A., Studies with controlled fermentation. X. Effect of fermentation temperature on some volatile compounds. American Journal of Enology and Viticulture,12, OUGH, C.S., Fermentation rates of grape juice. III. Effects of initial ethyl alcohol, ph and fermentation temperature. American Journal of Enology and Viticulture, 17, 74. ÖZDAMAR, K., Paket programlar ile istatistiksel veri analizi. Kaan Kitabevi, Eskişehir, 535s. PANDEY, A., SOCCOL, R.C., NIGAM, P. ve SOCCOL, V.T., Biotechnological potential agro-industrial residues. I. Sugarcane bagasse. Biosesource Technology, 74, PASSOTH, V., FREDLUND, E., DRUVEFORS, U.A. ve SCHNURER, J., Biotechnology, physiology and genetics of the yeast Pichia anomala. FEMS Yeast Research, 6, PEDDIE, A.B.H., Ester formation in brewery fermentations. Journal of Institute of Brewing, 96, PEKİN, B., Biyokimya Mühendisliği (Biyoteknoloji). Ege Üniversitesi Kimya Fakültesi Yayınları, No: 3, Mas Ambalaj, s PEREZ, E.R., CARDOSO, D.R. ve FRANCO, D.W., Análıse Dos Álcooıs, Ésteres E Compostos Carbonílıcos Em Amostras De Óleo Fúsel, Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, PLATA, C., MILLAN, C., MAURICIO, J.C. ve ORTEGA, J.M., Formation of ethyl acetate and isoamyl acetate by various spicies of wine yeasts. Food Microbiology, 20,

116 QUILTER, M.G., HURLEY, J.C., LYNCH, F.J. ve MURPHY, M.G., The production of isoamyl acetate from amyl alcohol by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Insitute of Brewing, 109 (1), REINECCIUS, G., Flavor Chemistry and Technology, CRC Press, Boca Raton. s RIBÉREAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONÈCHE, B. ve LONVAUD, A., Handbook of Enology, Vol. 1, 2nd edition, The Microbiology of Wine and Vinifications, Wiley, 512s. RIBE REAU-GAYON, J., PEYNAUD, E., RIBE REAU-GAYON, P. ve SUDRAUD, P., Sciences et Techniques du vintraite d Oenologie II. Dunod, Paris. RIBE REAU-GAYON, P., DUBOURDIEU, D., DONE`CHE, B. VE LONVAUD, A., Handbook of Enology. The Microbiology of Wine and Vinifications, vol. I. Wiley, West Sussex, England. RIVAS, B., MOLDES, A.B., DOMINGUEZ, J.M. ve PARAJO, J.C., Development of culture medium containing spent yeast cells of Debaromyces hansenii and corn step liquor for lactic acid production with Lactobacillus rhamnosus. International Journal of Food Microbiology, 97, ROJAS, V., GIL, J.V., PINAGA, F. ve MANZANARES, P., Studies on acetate ester production by non-saccharomyces wine yeasts. International journal of Food Microbiology, 70, ROUKAS, T., Pretreatment of beet molasses pullulan production to increase pollulan production. Process Biochemistry, 33(8), SAERENS, S.M.G., DELVAUX, F., VERSTREPEN, K.J., DIJCK, P.V., THEVELEIN, J.M. ve DELVAUX, F.R., Parameters affecting ethyl ester production by Saccharomyces cerevisiae during fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 74(2), SHARF, R. ve MARGALITH, P., The effect of temperature on spontaneous wine fermentation. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 17,

117 STANBURY, P. F., WHITAKER, A. ve HALL, S. J., Principles of Fermentation Technology, 2nd ed., Pergamon, U. K., 357s. TABACHNICK, J. ve JOSLYN, M.A., Formation of esters by yeast. I. The production ethyl acetate by standing surface cultures of Hansenula anomala. Journal of Bacteriology, 65, 1-9. TELEFONCU, A., Biyoteknoloji. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, No: 152, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir, 357s. THURSTON, P.A., QUAİN, D.E. ve TUBB, R.S., Lipid-Metabolism and The Regulation of Volatile Ester Synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of the Institute of Brewing, 88(2), TORIJA, M.J., ROZE`S, N., POBLET, M., GUILLAMO N, J.M. ve MAS, A., Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80, VAN URK, H., POSTMA, E., SCHEFFERS, W.A. ve VAN DIJKEN, J., Glucose transport in Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts. Journal of General Microbiology, 135, VADALI, R.V., HORTON, C.E., RUDOLPH, F.B., BENNETT, G.N. ve SAN, K. Y., Production of isoamyl acetate in acka-pta and/or ldh mutants of Ecsherichia coli with overexpression of yeast ATF2. Applied Microbiology and Biotechnology, 63(6), VALERO, E., MOYANO, L., MILLAN, M.C., MEDINA, M. ve ORTEGA, J.M., Higher alcohol and ester production by Saccharomyces cerevisiae. Influence of initial oxygenation of the grape must. Food Chemistry, 78, VANDAMME, E. J. ve SOETAERT, W., Bioflavours and fragrances via fermentation and biocatalysis. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 77, VANDAMME, E.J., Bioflavours and fragrances via fungi and their enzymes. Fungal Diversity, 13,

118 VANDERHAEGEN, B., NEVEN, H., COGHE, S., VERSTREPEN, K. J., DERDELINCKX, G. ve VERACHTERT, H., Bioflavouring and beer refermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 62, VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G., DUFOUR, J-P., WİNDERİCKX, J., THEVELEİN, J.M., PRETORİUS, I.S. ve DELVAUX, F.R., 2003a. Flavoractive esters: Adding fruitiness to beer. Journal of Bioscience and Bioengineering, 96 (2), VERSTREPEN, K.J., DERDELİNCKX, G. ve DELVAUX, F.R., 2003b. Esters in beer-part 2: Controlling ester levels during beer fermentation: a biochemical approach. Cerevisiae, 28 (4). WAITES, M. J., MERGAN, N. L., ROCKEY, J. S. ve HIGTON, G., Industrial Microbiology: An Introduction, Blackwell Science Ltd., USA, 288s. WALES, D.S., CARTLEDGE, T.G. ve LLOYD, D., Effect of Glucose and aerobiosis on the activities and subcellular distribution of Tricarboxylic acid cycle and associated enzymes in Saccharomyces carlsbergensis. Journal of General Microbiology, 116, WINTERHALTER, P. ve SCHREIER, P., Biotechnology: Challenge for the Flavor Industry. Flavor Science, American Chemical Society, XU, P., HUA, D. ve MA, C., Microbial transformation of propenylbenzenes for natural flavour production. Trends in Biotechnology 25, YOSHIOKA, K. ve HASHIMOTO, N., Ester Formation By Brewers-Yeast During Sugar Fermentation, Agricultural and Biological Chemistry, 48 (2): YOUNIS, S.O. ve STEWART, G.G., Sugar uptake and subsequent ester and higher alcohol production by Saccaharomyces cerevisiae. Journal of Institute of Brewing, 104, ZÖHRE, D. E. ve ERTEN, H., The influence of Kloeckera apiculata and Candida pulcherrima yeasts on wine fermentation. Process Biochemistry, 38 (3):

119 ÖZGEÇMİŞ 1975 yılında Şanlıurfa da doğdu. İlk öğrenimini Şanlıurfa da tamamladıktan sonra 1994 yılında İnönü Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü nde lisans öğrenimine başladı yılında bu bölümden mezun olduktan sonra aynı yıl Harran Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans öğrenimine başladı yılında İnönü Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü ne araştırma görevlisi olarak atandı yılında yüksek lisans öğrenimini tamamladıktan sonra 2003 yılında Yüksek Öğretim Kurulu Kanunu nun 35. maddesi gereğince Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü ne atanarak doktora öğrenimine başladı. Halen aynı bölümde araştırma görevlisi olarak akademik hayatına devam etmektedir. 103