HİNDİ ETLERİNDEN İZOLE EDİLEN KOAGULAZ POZİTİF STAFİLOKOKLARIN ENTEROTOKSİN OLUŞTURMA YETENEKLERİNİN EIA (ENZYME IMMUNO ASSAY) YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİNDİ ETLERİNDEN İZOLE EDİLEN KOAGULAZ POZİTİF STAFİLOKOKLARIN ENTEROTOKSİN OLUŞTURMA YETENEKLERİNİN EIA (ENZYME IMMUNO ASSAY) YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ Serhat KILIÇ BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ BÖLÜMÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ 2007 ANKARA

2 ii

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler Resimler Grafikler ii iii v vi vii viii ix x 1. GİRİŞ Tarihçe Stafilokokların Klasifikasyonu ve Genel Özellikleri Enterotoksijenik Stafilokokların Özellikleri Stafilokokların Virulens Faktörleri Virulens Faktörlerin Genetik Düzenlenmesi agr Lokusu sar Lokusu sae (S. aureus exoprotein expression) Lokusu ArlRS İki Komponentli Sistemi SrrA-SrrB İki Komponentli Sistemi Stafilokokların Doğada Bulunuşu ve Kontaminasyon Kaynakları Stafilokokların Doğada Bulunuşu Stafilokokların Kontaminasyon Kaynakları Stafilokokların Epidemiyolojisi İnsidensi Hindi Etlerinden Kaynaklanan Gıda Zehirlenmesi Olguları Kanatlı Eti ve Ürünlerinde Stafilokokların Bulunuşu Stafilokokal Enterotoksinler Stafilokokal Enterotoksinlerin Genel Özellikleri Stafilokokal Enterotoksinlerin Oluşumuna Etki Eden Faktörler Kontaminasyon Düzeyi ph ve NaCl Su Aktivitesi Sıcaklık Rekabetçi Özellik Atmosferik Koşullar Stafilokokal Enterotoksinleri Saptama Yöntemleri İlk İmmunolojik Yöntemler Son Zamanlarda Geliştirilen İmmunolojik Yöntemler Stafilokokal İntoksikasyonların İnsanlarda Oluşturduğu Semptomlar 35

4 iv 2. GEREÇ ve YÖNTEM Gereç Koagulaz Pozitif Stafilokokların İzolasyonunda Kullanılan 37 Besiyerleri ve Test Malzemeleri Koagulaz Pozitif Stafilokokların Toksin Oluşturma 40 Yeteneğinin Belirlenmesi Amacıyla Kullanılan EIA Malzemeleri 2.2. Yöntem Mikrokok/Stafilokokların İzolasyonu Katı Besiyerine Ekim ve Kolonilerin Değerlendirilmesi Koagulaz Pozitif Stafilokokların Belirlenmesi Koagulaz Pozitif Stafilokokların Enterotoksin Oluşturma 44 Yeteneklerinin Belirlenmesi 3. BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 52 ÖZET 54 SUMMARY 55 KAYNAKLAR 56 ÖZGEÇMİŞ 64

5 v ÖNSÖZ Hindi eti ve ürünleri toplum beslenmesinde içerdiği yüksek düzeyde protein ve esansiyel aminoasitler, düşük kalori düzeyi, ekonomik oluşu, hazırlama kolaylığı ve lezzetli oluşu nedeniyle büyük bir öneme sahiptir. Kanatlı etlerindeki tüketimin hızla artması nedeniyle, bu ürünlerin tüketiminden kaynaklanan halk sağlığı riskleride artmaktadır. Gıda kaynaklı infeksiyon ve intoksikasyonların önlenmesi, çiftlikten sofraya gıda güvenliği konsepti içerisinde değerlendirilmelidir. Stafilokokal gıda intoksikasyonları tüm dünyada en önemli gıda kaynaklı intoksikasyonlar arasında yer almaktadır. Enterotoksijenik stafilokokların oluşturduğu toksinlere bağlı olarak gelişen intoksikasyonlar büyük ekonomik ve işgücü kayıplarına neden olmakta, ayrıca risk grubunu oluşturan çocuklar ve yaşlılarda ölümle sonuçlanan zehirlenmelere rastlanmaktadır. Kesim işleminin değişik aşamalarında ve gıdaların işleme, muhafaza ve satışı esnasında ürünler stafilokoklarla kontamine olabilmektedir. Stafilokokal enterotoksinlerin ısı işlemi ile tam olarak elimine edilememesi, etkenin ubiquiter olması ve düşük su aktivitesi gibi çeşitli ortamlarda canlılığını ve üremesini sürdürebilmesi risk faktörlerini artıran unsurlardır. Bu riskler dikkate alınarak, hijyen kurallarına ve personel eğitimine büyük önem verilmelidir. Bu nedenlerle, bu çalışmada, uygun olmayan kesim, işleme ve muhafaza koşulları ile yetersiz personel hijyeni ve çapraz kontaminasyon gibi nedenlerle kontamine olmuş hindi etlerinde enterotoksijenik stafilokokların varlığı ve toksin oluşturma yetenekleri halk sağlığı açısından incelenmiştir. Tez çalışmamın seçilmesi ve yürütülmesinde ilgi ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen başta danışman hocam Sayın Prof. Dr. Özlem KÜPLÜLÜ ve bölüm başkanımız Prof. Dr. İrfan EROL olmak üzere tüm değerli öğretim üyelerine, araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve bölümde görevli tüm personele, beraber eğitim aldığımız ve eğitimimize katkıda bulunan subay arkadaşlarım ve komutanlarıma, eğitimim ve tez çalışmalarım esnasında manevi desteklerini ve yardımlarını esirgemeyen sevgili eşim Özlem KILIÇ ve kızım Melike KILIÇ a ve bu günlere ulaşmamda büyük emekleri bulunan aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

6 vi SİMGELER ve KISALTMALAR a w Su aktivitesi C Celcius (Santigrat derece) SE Stafilokokal Enterotoksin kda Kilo Dalton kob Koloni Oluşturan Birim mg Miligram MIC Minimal Inhibitory Consantration ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EIA Enzyme Immuno Assay RIA Radio Immuno Assay RPLA Reversed Passive Latex Agglutination TNase Thermonuclease TSST Toxic Shock Syndrom Toxin SAK Stafilokinaz agr Accessory gene regulator sar Staphylococcal accessory regulator sae S. aureus exoprotein expression PV Panton Valenin PFGE Puls Field Gel Electrophoresis PCR Polymerized Chain Reaction µg Mikrogram ng Nanogram ml Mililitre

7 vii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Stafilokokal agr lokusu 13 Şekil 2.1. Ridascreen ticari test kitinin düzeneği 40

8 viii ÇİZELGELER Çizelge1.1. S.aureus un üreme ve toksin oluşturması için genel koşullar 5 Çizelge 1.2. Çeşitli izolasyon ortamlarında stafilokokların koloni morfolojisi 6 Çizelge 1.3. S. aureus ve toksin yıkımlanması üzerine etkili faktörler 7 Çizelge 1.4. S.aureus virulens faktörleri ve bu faktörlerin patogenetik 9 mekanizmaları Çizelge 1.5. Stafilokokal aksesor virulens faktörler 16 Çizelge 1.6. Stafilokok türlerinin hayvanlarda kolonizasyonu 18 ve hastalık oluşturma prosesleri Çizelge 1.7. SEB ve ısıya dirençli nükleaz enzimi için D değerleri 26 Çizelge1.8. S. aureus ile antagonistik etki oluşturduğu gösterilen 30 cins veya türler Çizelge 1.9. S. aureus un üreme ve toksin formasyonu oluşturmasına etki eden intrinsik ve ekstrinsik parametrelerin limitasyon değerleri 31 Çizelge Stafilokokal enterotoksinlerin saptanması amacıyla 34 kullanılan diagnostik kitler Çizelge 3.1. Hindi eti örneklerinden izole edilen stafilokokların dağılımı 46 Çizelge 3.2. Firmalara göre kontaminasyon düzeyi ve toksin 48 oluşturabilme yeteneğindeki örnek sayıları

9 ix RESİMLER Resim 2.1. Stafilokok kolonilerinin Baird-Parker Agar daki görünümü 42 Resim 2.2. Tüpte Koagulaz Test 43 Resim olarak değerlendirilen bir test tüpünün görünümü 43 Resim 2.4. Ridascreen ticari test kiti görünümü 45

10 x GRAFİKLER Grafik 3.1. Enterotoksin oluşturabilme yeteneğindeki izolatların dağılımı 47

11 1 1. GİRİŞ Stafilokoklar, insan ve hayvanlarda birçok infeksiyonun ve insanlarda oluşabilen stafilokokal intoksikasyonların etkenidirler. Stafilokokal infeksiyonlar, koagulaz pozitif ve koagulaz negatif stafilokoklar tarafından oluşturulabilmektedir. Bununla beraber, stafilokokal gıda intoksikasyonunun predominant etkeni Staphylococcus aureus tur. Gıda zehirlenmesi olgularına stafilokoklar tarafından sentezlenen bir grup toksin neden olur ve enterotoksinler olarak isimlendirilirler (Bergdoll, 1989). Dünyada son 20 yıl içinde hayvansal gıda üretiminde kanatlı eti üretiminin payı dünya nüfusunun hızla artması, sağlıklı beslenme, yeni tüketim alışkanlıkları ve ekonomik olmasına bağlı olarak hızla artmaktadır (Bryan ve Doyle, 1995). FAO nun 2004 yılı verilerine göre dünya tavuk eti üretimi ton, hindi eti üretimi ise tondur. Ülkemizdeki kanatlı eti üretimi de dünyadaki bu gelişmelere paralel olarak hızla artarak tavuk eti üretimi yaklaşık ton, hindi eti üretimi ise yaklaşık tona ulaşmıştır (Anon, 2001; 2004). Hindi etinin, yüksek oranda protein içermesi, esansiyel aminoasitlerin oranının uygun olması, kolesterol ve kalori düzeyinin düşük olması gibi nedenlerle, beslenmede sağlıklı bir hayvansal gıda olarak değerlendirilmesi sonucu tüketimi ülkemizde de artmıştır (Anon, 2001). Kanatlı hayvanlarda, sürü içerisinde zoonotik karakterde ve patojen etkenlerin yaygın olarak bulunması ile kesim, hazırlama, pişirme ve muhafaza proseslerinde oluşabilecek çapraz kontaminasyon riskinin yüksek olması nedeniyle, insanlarda kanatlı eti tüketiminden kaynaklanan gıda infeksiyon ve intoksikasyonlarına sıklıkla rastlanmaktadır (Bryan ve Doyle, 1995). ABD de yılları arasında gerçekleşen ve etyolojisi saptanabilen 1869 gıda zehirlenmesi olgusunun 367 sinden (% 13) Staphylococcus aureus sorumlu

12 2 tutulmuş ve 7248 kişi etkilenmiştir. 367 gıda zehirlenmesi olgusunun 20 tanesi hindi etlerinden kaynaklanmıştır (Bean ve Griffin, 1990). Aynı şekilde ABD Hastalık Kontrol Merkezi CDC (Center for Disease Control) tarafından yılları arasında rapor edilen olguların % 4 ünün hindi eti tüketiminden kaynaklandığı bildirilmiştir (Bean ve ark., 1996). Epidemiyolojik araştırmalar genel gıda zehirlenmesi olguları içerisinde en önemlilerinden birisinin, stafilokok türleri ve çoğunlukla Staphylococcus aureus tarafından oluşturulan intoksikasyonlar olduğunu göstermiştir (Evenson ve ark.,1988; Wieneke ve ark., 1993). İspanya da, stafilokoklar gıda kaynaklı hastalıklarda gözlenen ikinci en yaygın ajandır ve yanlış ısı uygulaması ile gıda işleyenlerin hijyen kurallarına riayet etmemeleri bu olguların en önemli sebepleri arasındadır (Hernandez ve ark., 1995). ABD de yılları arasında CDC tarafından rapor edilen, etkeni stafilokoklar olarak belirlenmiş 131 zehirlenme olgusu şekillenmiş ve 7126 kişi etkilenmiştir. Yıl başına ortalama olarak 26 zehirlenme olgusu ve bu olgulardan etkilenen 1425 kişi düşmektedir. Bu yıllar arasında ABD de rapor edilen gıda kaynaklı zehirlenme olgularında stafilokoklar ikinci sırada yer almaktadır (Holmberg ve Blake 1984). Bu çalışmada, hindi etlerinde gıda intoksikasyonlarına yol açabilecek koagulaz pozitif stafilokokların varlığının ve enterotoksin oluşturma yeteneklerinin belirlenmesi ile buna bağlı olarak oluşabilecek halk sağlığı risklerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

13 Tarihçe Hücre düzenlerine göre Billroth tarafından koklar şeklinde insan dokularında çeşitli tip hastalıklara yol açan bakteriler monococcus, diplococcus, streptococcus ve gliacoccus olarak adlandırılmıştır. Koch ve Pasteur bu morfolojiyi gösteren mikroorganizmaları irin materyalinde gözlemlemişlerdir (Bergdoll, 1989). Bununla beraber, 1880 yılında İskoçyalı bir cerrah olan Alexander Ogston, insanlarda çeşitli piyojenik hastalıkların etkeni olarak tespit ettiği salkım şeklindeki kokları göstermiştir. Bunu takiben 1882 de Ogston bu mikroorganizmayı Staphylococcus olarak isimlendirmiştir. Yunanca staphyle üzüm salkımı, coccus tane, zerre anlamına gelmektedir. Ogston irinli yaralardan elde ettiği stafilokokları farelere enjekte etmiş ve irinli yaraların oluşması da dahil olmak üzere bazı semptomların geliştiğini gözlemlemiştir. Enjeksiyon öncesi ısı işlemi uygulanan veya fenol ile muamele edilen irinden elde edilen kültürün, hastalık oluşturmadığını gözlemlemiştir. Rosenbach 1884 de stafilokokları saf kültür olarak ilk üreten ve onların karakteristikleri üzerinde ilk laboratuar çalışmalarını yapan kişidir. Stafilokokları bir soy olarak düşünmüş ve katı ortamlarda beyaz ve portakal renkli kolonilerin ürediğini gözlemlemiştir. Bu soyun alt türleri olarak pigmentasyona dayalı bir şekilde iki tip stafilokok tanımlamıştır. Portakal renkli koloni oluşturan mikroorganizmaları Staphylococcus pyogenes aureus, beyaz koloni oluşturanları ise Staphylococcus pyogenes albus olarak adlandırmıştır. Sonradan limon renkli koloni pigmentasyonu veren Staphylococcus pyogenes citreus eklenmiştir. Winslow 1920 yılında, stafilokokları Micrococcacea familyasına dahil etmiştir. Evans ın glikozu anaerobik fermente edebilme yeteneklerini 1957 yılında belirlemesi ile Staphylococcus isminde ayrı bir soy olarak sınıflandırılmıştır. Daha sonraları Winslow ve Winslow tarafından ikinci tür olan Staphylococcus epidermidis öne sürülmüştür. S. aureus 1972 ye kadar bilinen tek türdür ve Staphylococcus epidermidis ile arasındaki temel fark, koagulaz üretimine dayanmaktadır. Üçüncü tür olan S. saprophyticus 1974 te stafilokoklara eklenmiştir. Tür sayısı 1980 de 13 ve

14 de ise 20 olmuştur. S. intermedius ve S. hyicus hariç yeni türlerin tamamı koagulaz negatiftir. DNA homolojisi, immunokimyasal ve biyokimyasal çalışmalarla tür sayısı 25 e ulaşmıştır (Bergdoll, 1989; Baird-Parker, 1990) Stafilokokların Klasifikasyonu ve Genel Özellikleri Stafilokoklar Bergey s Manual of Systematic Bacteriology nin son baskısında Staphylococcaceae familyasında yer alırlar (Garrity ve Holt, 2000). Stafilokoklar Gram pozitif, katalaz pozitif koklardır. Morfolojik olarak benzer yapıda olan Micrococcus soyunun üyelerinden anaerobik olarak üremesi ve obligat aerobik mikrokoklardan farklı fermentasyon ve solunum metabolizmasına sahip olmaları sebebiyle ayrılırlar. Kimyasal ve biyokimyasal karakteristikleri açısından da iki soy oldukça farklıdır. DNA Guanin ve Sitozin içerikleri ve hücre duvarı yapısı geniş oranda farklıdır (Baird-Parker, 1990). Stafilokokal DNA düşük oranda Guanin ve Sitozin (G+C) içerir. G+C içeriği % mol arasındadır. Bununla beraber Micrococcus soyu üyeleri % mol arasında G+C içerirler. Stafilokokal hücre duvarı yapısı tipik Gram pozitif mikroorganizma yapısında olup kalındır (30-60 nm). S. aureus un hücre duvarı kalınlığı 120 nm nin üzerine de çıkabilir. Hücre duvarı peptidoglikan, teikoik asit ve proteinlerden oluşmuştur. Bu komponentlerden proteinler ökaryotik hücrelere bağlanma ve adezyon için önemli fibronektin, fibrinojen, laminin ve kolagen içerirler. Adezyon proteinlerinin bağlanması ile dokulara bakteriyel tutunma mekanizması gerçekleşmiş olur. Antijenik proteinlerden en iyi çalışılmış olanı Protein A dır ve S. aureus suşlarının % inde mevcuttur (Schleifer ve Kroppenstedt, 1990). Stafilokoklar mezofil mikroorganizmalardır (Baird-Parker, 1990). S. aureus µm çapında, sferik veya oval şekilde, Gram pozitif, hareketsiz, sporsuz, genellikle kapsülsüz, fakültatif anaerob, 37 o C çevresinde optimal olarak üreyebilen, katalaz pozitif, oksidaz negatif bir mikroorganizmadır (Adams ve Moss, 1995;

15 5 Hayes, 1995). Hücreler tek veya çiftler halinde veya üzüm benzeri salkımlar halinde form oluştururlar (Loir ve ark., 2003). Koyunların apse etkeni olan S. aureus ssp. anaerobius ve S. saccharolyticus diğer stafilokoklardan farklı bir şekilde, anaerob koşullarda aerob koşullardan daha iyi ürerler (De La Funte ve ark., 1985). Glikozun fermentasyonu ile oluşan laktik asit formu major son üründür (Schleifer ve Kroppenstedt, 1990). Stafilokokların optimum üreme sıcaklığı 37 o C olup, 7-48 o C arasında üreyebilirler ve o C arasında toksin oluşturabilirler. Nispeten düşük su aktivitesi değerleri olan a w 0.83 üreme ve a w 0.85 toksin oluşturma yetenekleri için limit değerlerdir (Baird-Parker, 1990). S. aureus un üreme ve toksin oluşturması için gerekli genel koşullar çizelge 1.1. de verilmiştir. Birçok stafilokok türü aerobik şartlarda üreyebilmek için organik nitrojen kaynağına ve bir veya daha fazla B grubu vitamine ihtiyaç duyarlar. İlave olarak bazı türler anaerobik üremeyebilmek için urasil ve/veya fermente edilebilir karbonhidrata gereksinim duyarlar (Baird-Parker, 1990). Çizelge1.1. S.aureus un üreme ve toksin oluşturması için genel koşullar (Baird-Parker, 1990). Üreme Toksin Oluşturma Optimum Spektrum Optimum Spektrum Sıcaklık ( o C) ph Su aktivitesi (a w ) >0.99* >0.99 E H +200 MV <-200MV- > +200 MV?? Atmosfer aerobik aerobik-anaerobik aerobik (%5-20 çözünmüş O 2 ) anaerobik-aerobik * Aerobik (anaerobik 0.90->0.99). Aerobik (anaerobik 0.92->0.99). S. aureus, plaklarda düzgün, yuvarlak ve konveks yapıda koloni formu oluşturur. Genellikle koagulaz enzimi üretir, mannitol ve değişik şekerleri fermente

16 6 ederek gaz oluşturmaksızın asit oluşturur (Baird-Parker, 1965). Çeşitli kültür ortamlarında stafilokokların oluşturduğu koloni morfolojisi çizelge 1.2. de gösterilmiştir. Genellikle % 15 NaCl içeren ortamlarda üreyebilirler. Stafilokoklar relatif olarak ısıya ve düşük su aktivitesine dirençlidirler (Halphin-Donhalek ve Marth, 1989). Çizelge 1.2. Çeşitli izolasyon ortamlarında stafilokokların koloni morfolojisi (Baird ve Lee, 1995). Üreme Ortamı Koloni Morfolojisi BP (Baird-Parker agar) BPP (Baird-Parker with pig plasma) BPF (Baird-Parker with fibrinogen) BP+PP (Baird-Parker with phenol phthalein) KRANEP (Potassium thiocyanate actidione sodium azide egg yolk pyruvate agar) LSM (Lipovitellin salt mannitol agar) MSA (Mannitol salt agar) VJ (Vogel Johnson agar) PCVJ (modified Vogel Johnson with phosphatidyl choline) Siyah, parlak, konveks, mm çapında koloni ve dar beyaz sınırları düzgün ve çepeçevre 2-5 mm opak medyum içinde berrak zon. Siyah, parlak, konveks koloni ile beraber çepeçevre presipite fibrin halesi. Siyah, parlak, konveks koloni ile beraber çepeçevre presipite fibrin halesi. BP ye benzeyen fakat 4mm çapında donuk koyu pembe zon. Altın sarısı koloni çevresinde bulanık zon. Koloni ile beraber opak zon. Koloni etrafında parlak sarı zon. Siyah, konveks, parlak koloni etrafında sarı zon. Siyah, konveks, parlak koloni etrafında sarı berrak zon. Koagulaz üretimi, patojen S. aureus suşlarının önemli bir kriteridir, fakat kesin belirleyici bir faktör değildir. S. aureus un diğer önemli kültürel karakteristikleri ise genellikle altın sarısı renkte olan koloni pigmentasyonu ile kanlı agarda beta-hemoliz oluşturmasıdır. S. aureus ısıya dirençli nükleaz enzimine sahiptir (Halpin-Donhalek ve Marth, 1989; Adams ve Moss, 1995). Isıya dayanıklı TNase enzimi üretimi, genellikle gıda zehirlenmesine neden olan stafilokoklarda görülmektedir ve bu türlerin diğer önemli bir karakteristiğidir (Bergdoll, 1989).

17 7 S. aureus ve toksinlerin ısı işlemi uygulanması ve irradyasyona olan dirençliliklerinde büyük farklılıkların bulunması önemli bir noktadır (Baird-Parker, 1990). S. aureus ve enterotoksinlerin yıkımlanması üzerine etkili faktörler çizelge 1.3 de verilmiştir. Stafilokokların sınıflandırmasında koagulaz üretimi en önemli biyokimyasal özelliklerdendir. Koagulaz pozitif olanlar S. aureus, S. intermedius, S. hyicus, S. aureus subsp. anaerobius, S. delphini ve S. schleiferi subsp. coagulans tır. Gıdalar için önemli olan grup koagulaz pozitif olan ve stafilokokal gıda zehirlenmelerine neden olan enterotoksijenik stafilokokların yer aldığı gruptur (Jay, 1996). Çizelge 1.3. S. aureus ve toksin yıkımlanması üzerine etkili faktörler (Baird-Parker, 1990). FAKTÖR ORGANİZMA TOKSİN Isı işlemi * 3-8 İrradyasyon (D-kGy) >30 Kurutma, Soğutma, Dondurma Dirençli Dirençli Alkol (MIC-MBC) 20-40% U.D. Klorin (MBC) 0.1 µg/l U.D. QAC (MIC-MBC) µg/l U.D.. * D60 o C x dakika Isı işlemi 121 o C x dakika U.D., uygulanabilir değil

18 Enterotoksijenik Stafilokokların Özellikleri Gıda zehirlenmeleri olgularında koagulaz ve TNase pozitif stafilokokların izole edilebildiği bu iki özelliğin önemli olduğu ve bunların yanısıra koagulaz negatif stafilokokların da toksin oluşturabileceği ve gıda zehirlenmelerine neden olabileceği bildirilmiştir (Bergdoll, 1989; Jay, 1996). Olsvik ve ark. (1982), ELISA tekniği kullanarak yaptıkları bir çalışmada, enterotoksin A, B ve C den bir veya birkaçını üretebilen koagulaz negatif olarak belirledikleri suşları S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis, M. luteus olarak identifiye etmişlerdir. Danimarka da çeşitli gıdaların S. aureus ile kontaminasyonu üzerine yapılan bir çalışmada, izolatlardan 20 tanesinin koagulaz negatif olduğu, bunlardan S. haemolyticus olarak identifiye edilen bir tanesinin C ve D tipi enterotoksinleri beraber oluşturabildiği bildirmiştir. S. aureus olarak identifiye edilen 150 izolatın 38 tanesinin enterotoksijenik olduğu ve A, B, C, D, E tipi toksinlerin birini ve/veya birkaçını oluşturabildiği ve C tipi toksinin en çok oluşturulan toksin olduğu bildirilmiştir (Ewald, 1987). Bautista ve ark. (1988), koyun sütlerinde yapmış oldukları bir çalışmada, koagulaz negatif stafilokoklar olan S. cohnii, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. xylosus un A, B, C, D tipi toksinlerinden bir veya birkaçını üretebildiklerini bildirmişlerdir. Adesiyun ve ark., (1984), S. hyicus tarafından oluşturulan toksinlerin maymunlarda emetik reaksiyon oluşturduğunu, Fukuda ve ark. (1984), köpeklerden izole ettikleri S. intermedius suşlarının A, B ve C toksinlerinden bir veya birkaçını oluşturabildiklerini, Crass ve Bergdoll (1986), koagulaz ve TNase negatif stafilokoklar ve S. epidermidis tarafından A ve C tipi toksinlerin oluşturulabildiğini bildirmişlerdir.

19 Stafilokokların Virulens Faktörleri S. aureus suşları, etkenin konakçı hücrelerinde kolonize olmasına katkıda bulunabilen hemolizinler, nükleazlar, proteazlar, lipazlar, hiyaluronidaz ve kolajenaz ı da içeren enzimler ve sitotoksinleri üretebilirler. Bu komponentlerin ana görevi; lokal konakçı dokularını mikroorganizmanın üreyebilmesi için uygun hale getirmektir. Bazı şuşlar ilave olarak Toksik Şok Sendrom Toksini (TSST) ve enterotoksinleri içeren bir veya daha fazla ekzoproteini üretebilirler (Dinges ve ark., 2000). S. aureus un virulens faktörleri ve bu faktörlerin patogenetik mekanizmaları çizelge 1.4 te gösterilmiştir. Çizelge 1.4. S.aureus virulens faktörleri ve bu faktörlerin patogenetik mekanizmaları (Gordon, 1998). KONAKÇI SAVUNMASININ ENGELLENMESİ Mikrokapsül Protein A Koagulaz Yağ Asidi Metabolize Edici Enzim Lökosidin ve/veya γ Toksin DOKUYA YERLEŞME Proteazlar Nükleazlar Lipazlar Hyalorinidaz Stafilokinaz SEPSİS SENDROMUNUN OLUŞMASI Toksik Şok Sendrom Toksini Enterotoksinler Sitolitik toksinler (α,β,γ ve δ) SPESİFİK TOKSİNOSİS İN İNDÜKLENMESİ Toksik Şok Sendrom Toksini Enterotoksinler Eksfoliatif Toksin ENDOTELYAL HÜCRELERE VE BAZAL MEMBRANLARA TUTUNMA Fibrinojene Bağlanma Proteinleri Fibronektin Laminin Kollajen Trombospondin

20 10 Stafilokokların hücre duvarı yapısında bulunan peptidoglikan endotoksin benzeri bir aktivite gösterebilir. Makrofajlardan sitokinlerin salınımı, komplement aktivasyonu ve trombositlerin agregasyonunu stimüle edebilir (Kessler ve ark. 1991). Ribitol teikoik asit peptidoglikana kovalent olarak bağlıdır ve hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Lipoteikoik asit ise hücre duvarı yapısının başka bir bileşeni olup sitoplazmik membranla bağlantılıdır (Lowy, 1998). Birçok stafilokok türünün mikrokapsül üretebildiği saptanmıştır. Serolojik olarak 11 tip mikrokapsül belirlenmiştir. Tip 5 ve tip 8 en sıklıkla belirlenen tiplerdir. Antifagositik bir etkiye sahip olduğu bildirilmiştir (Lee, 1996). Protein A mikroorganizmanın peptidoglikandan oluşan komponentidir. Membrana bağlı ve salgılanmış formda olabilir. Üreme boyunca ortama salınabilir. Mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber, konakçı polimorfnükleer hücreleri tarafından patojenin eliminasyonunun antifagositik bir etkiyle inhibe edilmesini sağladığı ileri sürülmüştür. Bu etkinin Immunglobulinlerin Fc porsiyonuna bağlanma aktivitesi ile oluşabileceği bildirilmiştir (Graille ve ark., 2000; Sardel ve McKillip, 2004) Serbest veya bağlı (Clumping faktör, Fibrinojene Bağlanma Proteini) koagulaz diğer önemli virülens faktörleridir. Mikroorganizmanın fibrin ile kaplanması sonucu opsonizasyondan ve fagositozdan korunabildiği bildirilmiştir (Halphin-Donhalek ve Marth, 1989). Termonükleaz (Stafilokokal nükleaz), endo ve ekzonükleolitik özellikleri olan fosfodiesteraz yapısında bir enzimdir. Konakçı hücrelerin DNA ve RNA sını hidrolize edebilir ısıya dirençlidir. Hiyaluronidaz, hücreler arası mukopolisakkaritleri parçalayarak konakçı dokularında stafilokokların yayılmasına ve gelişmesine katkıda bulunur. Lipaz ekstrasellüler bir enzim olup logaritmik üreme fazı boyunca sentezlenir. Birçok stafilokokal suşun virulensinin artışında önemli rol oynar. Plazma ve yağ dokularına etki ederek vücut yüzeyinde etkenin akümüle olmasını sağlar (Sardel ve McKillip, 2004; Halphin-Donhalek ve Marth, 1989).

21 11 Fibrinolizin (Stafilokinaz (SAK)), birçok S. aureus suşu tarafından sentezlenir. Plazminojen aktivatörüdür ve fibrin pıhtısının çözülmesine neden olur, ayrıca fagositoz için önemli komponentler olan IgG ve C5 gibi opsoninlerin parçalanmasını sağlayarak antiopsonik bir etki gösterdiği ve bakteriyi fagositozdan koruduğu bildirilmiştir (Rooijakkers ve ark, 2005). Alfa (α) hemolizin, birçok suş tarafından yüksek oranda sentezlenir. Tavşan eritrositlerine karşı etkilidir ayrıca dermonekrotik ve nörotoksiktir. Bu toksinin salınımı agr (accessory gene regulator) kontrolü altında olup hla geni tarafından kodlanır. Ökaryötik hücrelere özellikle de eritrositlere karşı lize edici etkisi vardır. Geç eksponensiyal faz boyunca üretilir, maksimum ekspresyonu 42 o C de gerçekleşir (Dinges ve ark., 2000). Alfa toksin birçok hücre tipine zarar verebilir. Düz ve iskelet kasları paralizisi ve sentral sinir sistemine toksik etki yapabilir (Arbuthnott ve ark., 1990). Beta (β) hemolizin (Sfingomiyelinaz C), kromozomal olarak yerleşmiş hlb geni tarafından kodlanır. Beta hemolizin, koyun eritrositlerini lize edici ancak tavşan eritrositleri için hemolitik değildir. Hastalıklardaki rolü açık değildir. Gama hemolizin (γ) ve Panton-Valenine (PV) Lökosidin S. aureus tarafından sentezlenebilen toksinlerdir. Gama hemolizin hemen tüm S. aureus suşlarınca sentezlenirken, PV-Lökosidin S. aureus suşlarının % 2-3 ü tarafından sentezlenebilmektedir. Nötrofil ve makrofajlar üzerine etkirler. Gama hemolizin ayrıca memeli eritrositlerini lize edebilir. Delta (δ) hemolizinin memelilerin eritrositleri ve diger hücreleri üzerine lize edici etkisi vardır ilave olarak dermonekrotik etkiside saptanmıştır (Dinges ve ark., 2000). Epidermolitik toksin (Eksfoliatif Toksin), deri yüzeyinde, genellikle çocuklarda değişik lezyonlara neden olur. İnsanlarda oluşturduğu hastalık SSSS (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome) olarak adlandırılmıştır. Epidermisin stratum granulasum tabakasında çeşitli oranlarda çatlaklarla karakterizedir. ETA (Eksfoliyatif Toksin A) ve ETB olarak iki serotipi vardır. ETA kromozomal, ETB plazmid tarafından kodlanır (Arbuthnott ve ark., 1990).

22 12 Bazı suşlar stafilokokal pirojenik ekzotoksin C ve stafilokokal enterotoksin F olarak da adlandırılan TSST ni salgılarlar. Süperantijenik yapıda olup stafilokokal pirojenik toksin super antijenler ailesinde yer alır. Ani çocuk ölümlerine, artritise neden olabilmektedir. Çocuklarda sonradan oluşan bir kalp hastalığı olan Kawasaki sendromu gösteren hastaların % 60 ından TSST-1 üreten S. aureus izole edilmiştir. Toksik şok sendrom; geniş bir spektrumda klinik ve histopatolojik bulgularla karakterize akut ve potansiyel ölümcül bir hastalıktır. Diğer endotoksin aracılı şoklarda olduğu gibi kapillar sendroma bağlı hipotansiyon, hipoalbüminemi ve generalize ödem görülür. Ölümcül vakalarda hipovolemik şok en önemli etkendir. Yüksek ateş, diffuz macular eritroderma, deride desukuamasyon, diyare, kusma, renal disfonksiyon, intrahepatik kolestazis, trombositopeni ve hipokalsemi hastalarda tespit edilen diğer bulgulardır. Ayrıca akut solunum sendromu ve intravasküler koagülopati potansiyel hayatı tehdit edici komplikasyonlardır (Dinges ve ark., 2000) Virulens Faktörlerin Genetik Düzenlenmesi Stafilokoklar tarafından üretilen birçok virulens faktörün regülasyonunda agr (Accessory Gene Regulator) ve sar (Staphylococcal Accessory Regulator) gibi en az iki global regülatör lokus tanımlanmıştır. Bunların dışında, arl, sae, srr ve rot gibi global regülatör gen lokusları da gösterilmiştir. Bu lokuslar çeşitli virulens faktörlerin düzenlenmesine kompleks bir biçimde etki ederler (Çizelge 1.4.) (Cheung ve ark., 1992; Cheung ve ark.; 1997, Giraudo ve ark., 1997; Tegmark ve ark., 2000; Fournier ve ark., 2001; Novick, 2003). Bu kompleks ağ içerisindeki regülatörlerden dört tanesi (agr, sae, srr, arl) tipik iki unsurlu sinyal aktarım sistemini içerirler (Novick, 2003) agr Lokusu Stafilokokal agr sistemi hücre yoğunluğuna bağlı olarak otoindükleyici peptidlerin (Auto Inducing Peptides (AIP)) algılanması esasına dayanan, iki komponentli quorum sensing (QS) sistemdir. Protein A ve FBP (Fibronectin Binding Protein) gibi bazı hücre yüzeyi proteinlerini negatif ve alfa hemolizin gibi birçok virulens

23 13 faktörünü pozitif regüle ettiği bildirilmiştir (şekil 1.1) (Novick, 1993; Saravia-Otten ve ark. 1997; Novick, 2003; Yarwood ve Schlievert, 2003; Voung ve ark, 2000). agr lokusu P2 ve P3 promoter tarafından ekpresse edilen iki ayrı operondan oluşur. P2 operon iki komponentli sistem ve otoindükleyici peptidlerin üretimini kodlayan agrd, agrb, agrc ve agra genlerinin transkripsiyonuna katılır. agrd otoindükleyici peptid sentez ünitesidir. AgrB nin bu peptidleri posttranslasyonal modifikasyona uğratması ile olgunlaşmış thiolakton halkasına sahip otoindükleyici peptidler oluşur. Ekstrasellüler ortamda kritik seviyeyi aşan otoindükleyici peptidler membrana yerleşik AgrC histidin protein kinaz reseptörünce algılanır. Fosforilizasyon akışı şeklinde iletilen sinyal ile AgrA cevap düzenleyici protein tarafından aktarılan sinyal sonucu, aktif etki edici molekül olan ve P3 promotor tarafından transkripsiyonu gerçekleştirilen RNAIII molekülünün sentezi gerçekleşir. RNAIII, agr regulator molekülüdür ve gen transkripsiyonunu modüle eder (Ji ve ark., 1995; Novick, 1993; Balaban ve Novick, 1995; Novick, 1995; Jarraud ve ark., 2000; Otto, 2001). Şekil 1.1. Stafilokokal agr lokusu (Dufour ve ark., 2002).

24 sar Lokusu Sar ailesi sara (Cheung ve aek., 1992), sarh1 (Tegmark ve ark., 2000) ve sarr (Mana ve Cheung, 2001) den oluşmaktadır. DNA ya bağlanma aktivitesi göstererek hedef genlere transkripsiyonel safhada etki ettikleri bildirilmiştir (Tegmark ve ark., 2000). sar lokusunun agr den farklı olarak alfa hemolizin ve beta hemolizin gibi toksinlerin ve fibronektin bağlanma proteini gibi yüzey proteinlerinin üretimini beraber stimule edebildigi bildirilmiştir (Cheung ve ark., 1992). SarA proteininin agr, hla, spa (Protein A geni), fnba (fibronektin bağlanma proteini A geni) genlerinin promotorlarına bağlanarak hedef gen transkripsiyonunu agr ye bağlı ve agr den bağımsız bir şekilde regüle edebileceği bildirilmiştir. agr sisteminden bağımsız bir şekilde hla transkripsiyonunu situmule, protein A ve serin proteaz trankripsiyonunu represe edebileceği bildirilmiştir (Cheung ve ark., 1997; Chien ve ark., 1999; Cheung ve ark., 1999) sae (S. aureus exoprotein expression) Lokusu SaeRS, iki komponentli sinyal aktarım sistemidir. sae mutantlarında δ-hemolizinler, β-hemolizinler, DNaz, koagulaz ve protein A seviyelerinde azalma gözlemlenmiştir. Delta-hemolizin, proteazlar ve lipaz seviyeleri değişmemiştir. (Giraudo ve ark., 1999). sae ekspressiyonunun çevresel stimuluslardan etkilenebileceği yüksek tuz konsantrasyonu, düşük ph, glukoz ve subinhibitör antibiyotiklerin transkripsiyon paternine etki edebişleceği bildirilmiştir. 1M NaCI veya subinhibitör dozda klindamisinin sae transkripsiyonunu azalttığı, subinhibitör beta-laktam antibiyotiklerin ise sae yi yukarı düzenlediği bildirilmiştir. sae lokusunun hücre yoğunluğu ve çevresel sinyaller ile etkileşimde olabileceği bildirilmiştir (Novick, 2003) ArlRS İki Komponentli Sistemi ArlS-ArlR iki komponentli sistemdir ve ekstrasellüler serin proteaz (Ssp) aktivitesini ve bazı virulens faktörlerin regülasyonunu modifiye edebildiği bildirilmiştir. arlr

25 15 veya arls de ouşturulan mutasyonlar ile alfa-toksin, beta-hemolizin, lipaz, koagulaz, serin protez ve protein A gibi sekrete edilen proteinlerin üretiminde azalma tespit edilmiştir. Araştırmalar arl operonun bu virulens faktörlerin transkripsiyonunu aşağı düzenlediğini göstermiştir. arl mutasyonunun tek başına spa üzerine etkili olmadığı, agr ve sar lokuslarıyla etkileşimli olarak etki gösterdiği bildirilmiştir. Ayrıca arl mutasyonu ile RNAII ve RNAIII moleküllerinin sentezinde artma, sara transkripsiyonunda azalma gözlemlenmiştir. Sonuç olarak arl nin agr ve sara tarafından stimule edildiği, Arl sisteminin agr ve sara regulatör lokusları ile ilişkide olduğu ve virulens regulasyon ağını module edebildiği bildirilmiştir (Fournier ve ark., 2001) SrrA-SrrB İki Komponentli Sistemi SrrA-SrrB iki komponentli sistemi, çevresel oksijen seviyesine bağlı olarak TSST-1 gibi bir ekzotksinin ve protein A gibi bir yüzey proteininin üretimini regüle edebildiği bildirilmiştir. Stafilokokal virulens faktörlerin anaerobik baskılanmasına etki edebileceği ileri sürülmüştür. SrrAB mutantlarında oksijen varlığında üreme defektleri oluştuğu bildirilmiştir. Ayrıca agr aktivasyonunu inhibe edebileceği ve oksidatif solunum sistemine aracılık eden menaquinonları veya derivatlarını aktive edebildiği bildirilmiştir (Yarwood ve ark., 2001).

26 16 Çizelge 1.5. Stafilokokal aksesor virulens faktörler (Novick, 2003). Etki Eden Regülatör Genler Gen Lokasyon Ürün Aktivite/ Fonksiyon Zaman agr saers rot sara sars sart tst Süperantijenler sea Faj Enterotoxin A Gıda zeh.,tss Xp a 0 0 seb SaPI3 Enterotoxin B Gıda zeh.,tss pxp + b - sec SaPI4 Enterotoxin C Gıda zeh.,tss pxp + sed Plazmid Enterotoxin D Gıda zeh.,tss pxp + eta ETA faj Eksfoliatin A SSS pxp + atb Plasmid Eksfoliatin B SSS pxp + tst SapI1,2 TSST-1 Toksik Şok Send. pxp + b - Sitotoksinler hla Kromozom α-hemolizin Hemolizin,sitotoksin pxp b hbl Kromozom β- Hemolizin Hemolizin,sitotoksin pxp b hld Kromozom δ- Hemolizin Hemolizin,sitotoksin xp hlg Kromozom γ- Hemolizin Hemolizin,sitotoksin pxp + - b luksf PVL faj P-V Lökosidin Lökolizin pxp Enzimler SpIF Kromozom Serin proteaz Proteaz + - ssp Kromozom V8 proteaz Yayılma faktörü pxp aur Aureolizin Metalloproteaz Proses enzimi? pxp + - sspb Sistein proteaz Proses enzimi? + - scp Staphopain Yayılma, Beslenme pxp + - geh Kromozom Gliserol ester hidrolaz Yayılma, Beslenme pxp b - Iip Lipaz Yayılma, Beslenme pxp + 0 b fme Kromozom FAME Yağ asiti met. pxp + b plc Fosfolipaz C pxp + nuc Kromozom Nükleaz Beslenme pxp + + hys Kromozom Hyalorinidaz Yayılma faktörü xp B coa Kromozom Koagulaz Pıhtı, Pıhtı çözümü exp sak Faj Stafilokinaz Plazminojen aktivatörü pxp + 0 Yüzey Proteinleri spa Kromozom Protein A Anti immun, anti-pmn exp b + + cna PT islet Kollajen BP Kollajene bağlanma pxp 0 fnba Kromozom Fibronektin Fibronektine BPA bağlanma exp + fnbb Kromozom Fibronektin Fibronektine BPB bağlanma exp + clfa Kromozom Klamping A Fibrinojene bağlanma exp 0 clfb Kromozom Klamping B Fibrinojene bağlanma exp Kapsüler Polisakkaritler cap5 Kromozom Polisak.Tip5 Antifagositoz? pxp + + cap8 Kromozom Polisak.Tip8 Antifagositoz? pxp + a. xp: Eksponansiyel faz boyunca, exp: Erken eksponansiyel faz, pxp: Post eksponensiyel faz, 0: Gen ekspressiyonuna etkisiz, +: Yukarı düzenleme, -: Aşağı düzenleme. b. Tartışmalı.

27 Stafilokokların Doğada Bulunuşu ve Kontaminasyon Kaynakları Stafilokokların Doğada Bulunuşu Stafilokoklar doğada yaygın olarak bulunurlar. Temel habitatları memelilerin ve kanatlıların deri, ter bezleri ve müköz membranlarıdır. Vücudun farenks, burun mukozası, meme dokusu, intestinal ve üriner kanallarında da bulunabilirler. Sporadik olarak toprak, kum, deniz ve içme suları, lağım, bitki yüzeyleri ve ürünleri, yiyecekler, kırmızı etler, kanatlı etleri ve süt ürünleri ile toz ve havadan izole edilmişlerdir (Kloos, 1990; Adams ve Moss, 1995). Bazı türler hayvan türüne spesifiktir ve genel olarak bu hayvanlarda bulunurlar. S. caprae-keçilerde, S. gallinarum-tavuklarda, S. sciuri-sincaplarda ve S. hyicus-domuzlarda sıklıkla saptanmıştır. S. aureus ise ekstrem olarak deniz ve kara hayvanlarında geniş bir yayılım gösterir (Baird-Parker, 1990). Bunlara ilaveten S. aureus un temel doğal konakçılarının primatlar olduğu öne sürülmüştür. Çünkü bu suşlar primat derisinde yaygın olarak bulunur. İnsanlarda özellikle erginlerde en uygun yerleşim yeri olarak anteriör burun mukozasının tercih edildiği bildirilmiştir. S. intermedius karnivorlarda ana türdür, bunlardan başka atlarda ve güvercinlerde de saptanmıştır. S. epidermidis insan derisinde en yaygın bulunan etkendir (Kloos, 1990). İnsan orjinli S. aureus suşlarının tavşan ve insan plazmasını koagüle edebildiği, sıklıkla Clumping faktörü üretebildiği, ısıya dayanıklı nükleazlar ve protein A ya sahip olabildiği bildirilmiştir (Noble, 1990). S. hyicus tavukların derilerinde ve burun mukozasında bulunabilir, S. intermedius bu hayvanlarda bulunmaz ancak güvercinlerde bulunabilir. S. aureus un meme ucuna kolonizasyonunun meme infeksiyonları ve mastitis olguları için ilk adım olduğu bildirilmiştir (Devriese, 1990). Çeşitli hayvanlarda kolonize olabilen stafilokok türleri ve oluşturdukları patojenik etkiler çizelge 1.6. da verilmiştir. Kanatlılarda oluşan S. aureus infeksiyonları genellikle bacak tendo kılıfları, eklemlerde lezyonlar, ayak apseleri, deride dermatitis lezyonları gibi çeşitli bölgelerde lokalize olmuştur. Sporadik septisemi vakaları da gözlenebilir. S. aureus ve S. hyicus un hindilerde pnömoni ve osteomyelit etkeni olduğu bildirilmiştir (Mead ve Dodd, 1990; Tate ve ark., 1993; Linares ve Wigle, 2001).

28 18 S. aureus sağlıklı insanların burun mukozalarında % oranında bulunabilmektedir (Genigeorgis, 1989; Adams ve Moss, 1995). Ayrıca hastanelerdeki hastalarda ve hastane personelinde bu oran % olarak belirlenmiştir. Gıda işleyen personelde ise % 2-80 oranında saptanmıştır. Sağlıklı insanların % 5-40 ı dışkılarında düşük oranda (<500/g) stafilokokları taşırlar (Genigeorgis, 1989). Çizelge 1.6. Stafilokok türlerinin hayvanlarda kolonizasyonu ve hastalık oluşturma prosesleri (Devriese, 1990). KONAKÇI TÜR TEMEL PATOJENİK ETKİ S. aureus S. hyicus mastitis (klinik ve subklinik), sekonder deri infeksiyonu S. epidermidis SIĞIRLAR DOMUZLAR TAVUKLAR S. warneri S. chromogenes S. hyicus S. simulans mastitis (subklinik) S. hyicus dermatitis, sporadik eklem infeksiyonları S. ureus sporadik septisemi S. aureus synovitis, arthritis, osteomyelitis, dermatitis S. hyicus Spondilitis HİNDİLER S. aureus synovitis, arthritis, osteomyelitis ÖRDEKLER S. aureus septisemi, arthritis S. intermedius Septisemi GÜVERCİNLER S. intermedius sporadik septisemi TAVŞANLAR S. aureus mastitis, eksudatif dermatitis, apse, pododermatitis MİNKLER S. intermedius dermatitis, ürolithiasis mastitis, dermatitis, kuzu piyemisi apseleri S. aureus ssp. Anaerobius KOYUNLAR (morel hastalığı) S. epidermidis Mastitis KEÇİLER ATLAR S. aureus S. epidermidis S. caprae S. sciuri S. aureus S. intermedius S. hyicus Mastitis dermatitis, sellülitis

29 Stafilokokların Kontaminasyon Kaynakları Stafilokoklar ubiquiter mikroorganizmalardır, bununla beraber ana rezervuarları insanlar ve hayvanlardır. Gıdalarda enterotoksin üretimi için gerekli kontaminasyon kaynakları çok çeşitli olabilir. Gıda işleyen personelin öksürük, hapşırıkları ile burun ve boğaz bölgesinde mevcut olabilen enterotoksijenik stafilokoklar ile kontaminasyon gerçekleşebilir. Ayrıca personelin ellerinde olabilecek stafilokoklarla infekte kesik ve yaralar da kontaminasyona sebep olabilir. Düşük düzeyde kontaminasyon sonrasında bir problemle karşılaşılması için gıdanın uzun süre sıcak ısı derecelerinde kalması gerekir. Hayvanlarda çeşitli stafilokok infeksiyonları ve burun mukozalarında bulunabilen etkenler dolayısı ile kontaminasyon kaynağı olabilirler. Bununla beraber stafilokokal gıda zehirlenmesi olgusu açısından insanlar tarafından kontaminasyon hayvansal kontaminasyondan daha büyük önem taşır çünkü, önemli gıda zehirlenmesi vakaları gıda hazırlayan personelin kontaminasyonu ile oluşmuştur. Özellikle ısı işlemi gördükten sonra gıdada üreyen stafilokoklar tarafından önemli zehirlenme vakaları oluşmuştur (Bergdoll, 1989). Tayvan da 356 okul çocuğunun etkilendiği bir gıda zehirlenmesi vakasında, enterotoksijenik stafilokoklar etken olarak gösterilmiş ve enterotoksin A ve B yi üretebildikleri saptanmıştır. Puls Field Gel Electrophoresis (PFGE) ve Polimerize Zincir Reaksiyonu (PCR) ile yapılan araştırmalarda salata ve tavuk etinden oluşan yemeklerin gıda işleyenler tarafından kontamine edildiği bildirilmiştir (Wei ve Chiou, 2002). Brezilya da Minas peyniri ve çiğ süt tüketiminden sonra oluşan iki gıda zehirlenmesi olgusunda, toplam 378 kişi etkilenmiş ve minas peynirinin gıda işleyenlerce ve çiğ sütün ise mastitisli hayvanlar tarafından kontamine edildiği bildirilmiştir (Simeao do Carmo ve ark., 2002). Fueyo ve ark. (2005), tarafından İspanya da yapılan bir çalışmada, sağlıklı çalışanların burun mukozalarından ve peynir, krema, dondurma, kek, çiğ et ile ısı işlemi görmüş elle hazırlanmış gıdalardan izole ettikleri 269 S. aureus suşunu enterotoksin oluşturma yetenekleri yönünden incelemişlerdir. Bunlardan 57 izolatın

30 20 SEA, SEB, SEC, SED den bir veya daha fazlasını üretebildikleri, 10 izolatın sadece TSST-1 i, 10 izolatın ise hem toksinleri hem de TSST-1 i beraber üretebildiği saptanmıştır. SEA ve SEC nin en sıklıkla gözlenen toksinler olduğu bildirilmiştir. Burun mukozasından elde edilen izolatların % 23.9 u ve elle hazırlanmış gıdalardan elde edilenlerin % 26 sının stafilokokal enterotoksin oluşturabildiği saptanmıştır. Hayvansal kaynaklı olarak gıdalarda stafilokokal enterotoksin üretimi temel olarak mastitisli hayvanların süt ürünleridir. Çiğ etler de genel olarak stafilokoklarla kontaminedir. Ancak bu gıdalar yenmeden önce işlendiği ve ısı işlemi gördüğü için bu mikroorganizmalar genellikle yıkımlanır. Çiğ süt ve etlerde bulunabilecek diğer mikroorganizmalar stafilokokların üremesini baskılayabilir çünkü stafilokokların rekabetçi özellikleri zayıftır (Bergdoll, 1989). İnsektler, rodentler ve diğer haşerelerin ve mutfaklarda kullanılan kaplar, alet ve ekipmanın da kontaminasyon kaynağı olabileceği, haşerelere karşı doğru ve kararlı bir mücadele programının uygulanması ve mutfaklardaki alet ve ekipmanın hijyenine azami özen gösterilmesi gerektiği bildirilmiştir (Soriano, 2002). Kanatlılarda, yumurtadan çıktıktan hemen sonra etkenin kolonize olabildiği ve kesime kadar stafilokok populasyonunun arttığı, çok az miktarda da normal olarak sindirim kanalında bulunabildiği bildirilmiştir (Notermans ve ark., 1982). S. aureus un kanatlıların eksternal yüzeylerindeki insidensine, stafilokolal hastalığın bulunması ve antibiyotik uygulaması gibi faktörler etkiyebilir. Kanatlılar mezbahalara ulaştıklarında sıklıkla S. aureus u taşırlar, bu mikroorganizma çoğunlukla değişen oranlarda karkaslarda bulunur (Mead ve Dodd, 1990). Kanatlıların mezbahalardaki kesim ve işleme prosesleri esnasında S. aureus ile kontaminasyonun artabileceği özellikle tüy yolma işleminin önemli kontaminasyon kaynağı olduğu bildirilmiştir. (Mead ve Dodd, 1990; Notermans ve ark. 1982; Adams ve Mead, 1983; Thompson ve Patterson, 1983; Dodd ve ark., 1988). Ayrıca iç organ çıkarma ve su ile sogutma esnasında da S. aureus ile kontaminasyon artmaktadır (Notermans, 1982).

31 21 Kanatlıların tüy yolma işleminde kullanılan makinelerdeki kauçuk parmakçıklar S. aureus kolonizasyonuna çok uygundur ve kanatlı karkasının tüm yüzeyi ile temas halindedir. Etken bu makinelerde aylarca hatta yıllarca kalabilir. İlave olarak kauçuk parmakların işleme peryodunun sonunda efektif olarak temizlenmesi ve sanitasyonu doğal olarak oldukça güçtür. Kauçuk parmaklar aşınmış ve hatta kendi kendilerine çatlamış olabilir, sıklıkla yenilenmeleri gerekir. Bununla beraber parmakların bozulma derecesine bağlı olarak içlerinde S. aureus un da bulunduğu mikroorganizmalar hızla kauçuk yüzeyden penetre olurlar ve sanitasyon ajanlarına karşı korunurlar (Mead ve Dodd, 1990) Stafilokokların Epidemiyolojisi İnsidensi Süt ve krema, kanatlı eti ürünleri, kırmızı etler, ısı işlemi görmüş gıdalar, salatalar, mayonez ve deniz ürünleri gibi birçok gıda türü stafilokokların üremesi için uygun ortamlardır. Birçok ülkede stafilokokal gıda zehirlenmesi olguları gıda zehirlenmelerinin önemli bir bölümünü oluşturur (Bergdoll, 1989; Genigeorgis, 1989). ABD de yılları arasında gerçekleşen ve etyolojisi saptanabilen 1869 gıda zehirlenmesi olgusunun 367 sinden (% 13) Staphylococcus aureus sorumlu tutulmuş ve zehirlenme olgularından 7248 kişi etkilenmiştir. 4 vaka ölümle sonuçlanmıştır (Bean ve Griffin, 1990). İspanya da, stafilokoklar gıda kaynaklı hastalıklarda gözlenen ikinci en yaygın etken olarak belirlenmiştir (Hernandez ve ark., 1995). Tayvan da yılları arasında oluşan gıda zehirlenmesi olgularının % 30 unun etkeninin stafilokoklar olduğu bildirilmiştir (Pan ve ark., 1997). ABD de yılları arasında CDC tarafından rapor edilen, etkeni stafilokoklar olarak belirlenmiş 131 zehirlenme olgusu şekillenmiş ve 7126 kişi

32 22 etkilenmiştir. Yıl başına ortalama olarak 26 zehirlenme olgusu ve bu olgulardan etkilenen 1425 kişi düşmektedir. Bu yıllar arasında Amerika birleşik devletlerinde rapor edilen gıda kaynaklı zehirlenme olgularında stafilokoklar ikinci sırada yer almaktadır (Holmberg ve Blake 1984). İngiltere de yılları arasında 359 stafilokokal gıda zehirlenmesi olgusu gerçekleşmiş, bunların % 22 sinin kanatlı etleri ve ürünlerinden ileri geldiği bildirilmiştir (Wieneke ve ark., 1993). Bu zehirlenme olgularına neden olan gıdaların genellikle pişirilmiş, yüksek protein içerikli, gıda hazırlayanlarca kontamine edilmiş ve oda sıcaklığında birkaç saat veya bir gece bırakılmış gıdalar olduğu bildirilmiştir (Genigeorgis, 1989) Hindi Etlerinden Kaynaklanan Gıda Zehirlenmesi Olguları ABD de yılları arasında meydana gelen 367 gıda zehirlenmesi olgusunun 20 tanesi hindi etlerinden kaynaklanmıştır (Bean ve Griffin, 1990). Yine ABD de yılları arasında okul çocuklarında meydana gelen 604 gıda kaynaklı hastalığın 60 tanesinin (% 9.9) etkeni S.aureus olarak belirlenmiş olup, 6591 kişi etkilenmiş ve 319 kişi hospitalize edilmiştir. Bu olguların 38 adedinin hindi ürünlerinden kaynaklandığı ve 4432 kişinin etkilendiği bildirilmiştir (Daniels ve ark., 2002). ABD de New Mexico şehir kulubünde, 30 Mart 1986 tarihinde bir davette akut gastroenteritis vakaları oluşmuştur. Davette bulunan 855 kişiden 162 si etkilenmiş, bunların 67 sinde (% 35) mide bulantısı, kusma ve diyare görülmüştür. İnkübasyon peryodu saattir. 24 kişi hospitalizasyona gerek duymuştur. Davette sununlan gıdaların mikrobiyolojik analizleri sonucu, hindi etinde SEC saptanmıştır. S. aureus, hindi, hindi sosu ve gıdayı hazırlayan personelin burun boşluğu ve dışkılarından izole edilmiştir. Hindi etinin pişirildikten sonra kontamine edilerek oda ısısında 3 saat bekletilmesinin toksin üretimi için yeterli olduğu ve gıda zehirlenmesine neden olduğu bildirilmiştir (Anon, 1986).

33 yılında, ABD nin Florida eyaletindeki bir hapishanede bulunan 474 kişiden 215 kişi kusma ve diyare semptomları göstermiştir. Yapılan araştırmada hindi eti ve sosundan şüphelenilerek etken araştırmasına gidilmiş, S. aureus ve S. Infantis den şüphelenilmiştir. Laboratuvar analizleri sonucunda, hindi etlerinde 31x10 6 /g düzeyinde A tipi toksin oluşturabilen S. aureus saptanmıştır. 10 gıda hazırlayan personelde deri lezyonları görülmüş ve 1 inde S. aureus a rastlanmıştır. Zehirlenme olgusu çoklu etkenin neden olduğu bir olgu olarak değerlendirilmiştir (Meehan ve ark., 1992) Kanatlı Eti ve Ürünlerinde Stafilokokların Bulunuşu Kesim aşamalarında karkaslar S. aureus ile değişik düzeylerde kontamine olmaktadır. Kanatlı etlerinin S. aureus ile kontaminasyonunda en önemli faktörler, kanatlı derilerinde mevcut mikroflora, işletmelerdeki alet ekipman ve gıda ünitelerinde çalışanların oluşturduğu kontaminasyondur. (Halphin Donhalek ve Marth, 1989; Mead ve ark., 1989; Mead ve Dood, 1990). Kıtai ve ark. (2005), Japonya da 145 değişik markette şatışa sunulan 444 piliç parça etinde S. aureus ların varlığı ve enterotoksijenitesi üzerine yaptıkları bir çalışmada, 292 örnekten S. aureus izole etmişlerdir. İzolatların % 57.1 inin kanatlı, % 22.1 inin ise insan orjinli olduğunu ve 360 izolatın 78 inin enterotoksijenik olduğunu bildirmişlerdir. 50 izolatın B tipi, 14 izolatın A tipi, 8 izolatın C tipi, 2 izolatın D tipi, toksin oluşturduğu ayrıca, 2 izolatın A ve B tiplerini beraber ve 2 izolatın ise A ve C tiplerini beraber oluşturduğu bildirilmiştir. Erol ve Usca (1996), 50 adet dondurulmuş piliç karkas örneğinde, koagulaz pozitif stafilokokların varlığı ve kontaminasyon düzeyi ile enterotoksin oluşturabilme yeteneklerinin belirlenmesi üzerine yaptıkları bir çalışmada, 33 örnekten ortalama 1,3x10 3 kob/g düzeyinde koagulaz pozitif stafilokok saptamışlardır. Örneklerin 49 undan ortalama 5,8x10 4 kob/g düzeyinde mikrokok/stafilokok izole etmişlerdir. Koagulaz pozitif izolatlardan 7 sinin enterotoksijenik olduğunu ve A, B, C, D tipi toksinlerin birini veya birkaçını beraber oluşturabildiklerini bildirmişlerdir.

34 24 Adams ve Mead (1983), hindi kesimhanelerinde yaptıkları çalışmalarda, karkasların ortalama 10 3 kob/g seviyesinde S. aureus ile kontmine olduğunu bildirmişlerdir. Bystron ve ark. (2005), marketlerde satışa sunulan 23 hindi kıyması örneğinin 11 inden koagulaz pozitif stafilokokları izole etmiş ve bu izolatlarının 4 ünün (% 36.3) PCR analizleri sonucunda toksin genleri yönünden pozitif olduğunu saptamışlardır Stafilokokal Enterotoksinler Stafilokokal enterotoksinler (SE), emetik toksinlerdir ve insanlardaki stafilokokal gıda zehirlenmeleri olgularının etkenidirler. SE ler biyolojik aktiviteleri ve yapısal ilişkileri bakımından pirojenik toksin süperantijen ailesinin üyeleri olarak klasifiye edilmişlerdir. SE ler antijenisite bazında temel olarak beş serolojik tipe ayrılırlar (SEA SEE). Son yıllarda yeni tip SE lerin mevcudiyeti rapor edilmiştir (SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO) (Omoe ve ark., 2002). Ayrıca yeni tanımlanan gen sekansları ile sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq, ser, seu genlerinin yapıları belirlenmiştir (Leterle ve ark., 2003, Omoe ve ark., 2003, Orwin ve ark., 2003). Yeni tespit edilen bu genlerle ilgili yapılardan, tam olarak test edilememekle birlikte bazılarının emetik aktivitesinin olmadığı belirtilmiştir (Omoe ve ark, 2003) Stafilokokal Enterotoksinlerin Genel Özellikleri Stafilokokal enterotoksinler, tek zincirli, düşük moleküler ağırlığa sahip ( kda), bütün üreme fazları boyunca üretilebilen ancak temel olarak eksponensiyel fazın ortasında veya sonunda üretilebilen proteinlerdir. Pepsin, Tripsin, Kimotripsin, Rennin ve Papain gibi proteolitik enzimlere dirençli ve relatif olarak ısıya dayanıklıdırlar (Genigeorgis, 1989; Jay, 1996; Balaban ve Rasooly, 2000).

35 25 Enterotoksinlerin tümü basit proteinler olup hidroliz üzerinden 18 aminoasit verirler. Aspartik asit, glutamik asit, lizin ve tirozin en yoğun bulunanlardır (Jay, 1996). Tek zincirli polipeptid yapıda molekül merkezinin yanında tek disülfid bağı içerirler sonuç olarak kompakt bir yapı sergilerler ve proteazlara dayanıklı, ısı uygulaması ile relatif stabil bir özellik kazanırlar (Adams ve Moss, 1995). Enterotoksinler higroskopik yapıda olup kolayca suda ve tuz solüsyonunda çözünebilir özelliktedirler. İzoelektrik noktaları arasında değişmektedir. İzoelektrik nokta determinasyonu ile saf toksinin farklı formlarda ve farklı izoelektrik noktalara sahip değişik formları olduğu ortaya çıkmıştır. Farklı formlar, farkı amid gruplarının sayısı ile orantılı olup, bir amid grubunun kaybedilmesi ile 0.4 ph ünitesi kayıpla düşük izoelektirik noktaya sahip form oluşur (Bergdol, 1989). İlk identifiye edilen enterotoksin SEB dir. İkinci identifiye edilen enterotoksin ise SEA dır. SEA, SED, SEE nin aminoasit kompozisyonları ile SEB ve SEC nin aminoasit kompozisyonları benzerlik göstermektedir. İki set enterotoksin arasında aminoasit içerikleri ve antijenik özellikleri açısından farklılıklar mevcuttur. Ayrıca SEA, SEB ve SEC 1 de mevcut bulunan bir alandaki homoloji önem arz etmektedir. Bu alanın enterotoksin molekülünün aktif bir sitesi olabileceği bildirilmiştir. Ayrıca SEB ve SEC 1 in spesifik antikorlara karşı çapraz reaksiyon verebildiği de belirtilmiştir (Bergdoll, 1989). Pepsin ph 2 de SEB üzerine yıkımlayıcı bir etkiye sahiptir fakat yüksek oranda efektif değildir. Mide ph sı genellikle açlıktan sonra düşük seviyelere ulaşmaktadır ancak gıda sindirildikten sonra ph 2 den yüksek olmaktadır (Bergdoll, 1989). Bazı bakteriler (Laktik asit bakterileri) tarafından üretilen proteazlar stafilokokal enterotoksinleri yıkımlayabilmektedir. Toksinler dehidratasyona dirençlidirler ve gıdalarda yıllarca aktif olarak kalabilmektedirler (Genigeorgis, 1989). Stafilokokal enterotoksinler ısıya oldukça dirençlidirler (Bergdoll, 1989, Jay, 1996). Termal rezistanslık olgusuna toksinin saflığı, serolojik tipi, ph, toksin miktarı ve saptama metodu etki etmektedir. SEB için D dk. ve

36 26 Z değeri o C dir (Genigeorgis, 1989). SEB 60 o C de ph 7,3 de 16 saat biyolojik aktivitesini yitirmemektedir. SEC için, 60 o C de 30 dk. da serolojik reaksiyonlarda değişim görülmemiştir. 80 o C de 3 dk. veya 100 o C de 1 dk. da SEA nın serolojik reaksiyon kapasitesini yitirmediği bildirilmiştir. SEA nın termal inaktivasyonu o C de 11 dk. dır (Jay, 1996). İşlenmemiş (Crude) stafilokokal enterotoksin solusyonlarının 30 dk. kaynatma işleminden sonra, gönüllü insanlara yedirme veya maymunlara intravenöz olarak uygulaması şeklindeki çalışmalarda, emetik aktivitelerini tam olarak kaybetmedikleri bildirilmiştir. 121 o C de SEA için mitojenik aktivitenin serolojik aktiviteye oranla daha hızlı kaybolduğu ve enterotoksinlerin biyolojik aktivitelerini serolojik aktivitelerinden daha önce kaybedilebileceği bildirilmiştir. Gıdada mevcut toksinin, laboratuardaki buffer solüsyonlarına nazaran daha yüksek ısı stabilitesine sahip olduğu rapor edilmiştir (Bergdoll, 1989). Önemli stafilokokal gıda zehirlenmeleri vakaları gıdalarda enterotoksin oluşumunu takiben gıdanın pişirilmesi veya ısı işlemine tabi tutulması sonucunda oluşmuştur. Bununla beraber bazı zehirlenme vakaları ise, ısı işleminden sonra gıdalarda enterotoksin oluşumunu takiben yenilen gıdalar sonucunda oluşmuştur. Bu durum gıda endüstrisinde pastörize sütler gibi işlenmiş gıdalar açısından büyük önem arz etmektedir (Bergdoll, 1989). Stafilokokal enterotoksin B ve ısıya dayanıklı nükleaz enzimi için bazı D değerleri çizelge 1.6 da verilmiştir. Çizelge 1.7. SEB ve ısıya dirençli nükleaz enzimi için D değerleri (Jay, 1996). Üreme medyumu D değeri ( o C) Veronal buffer D 110 = 29.7 a Veronal buffer D 110 = 23.5 b Veronal buffer D 121 = 11.4 a Veronal buffer D 121 = 9.9 b Veronal buffer, ph 7.4 D 110 = 18 Beef broth, ph 7.4 D 110 = 60 Stafilokokal Nükleaz D 130 = 16.5 a İşlenmemiş (Crude) toksin b Saf toksin %99+

37 27 Stafilokokal enterotoksinler gamma radyasyonuna ekstrem olarak direnç gösterirler. SEB nin tampon çözeltide ve sütte bir desimal indirgenebilmesi için sırasıyla 2,7 ve 9,7 Mrad ın üzerinde ışın uygulanması gerektiği bildirilmiştir (Genigeorgis, 1989). Farkas ve ark., (2005) tarafından yapılan bir çalışmada, peynir, salam, hindi büfteği ve pasta gibi gıdalarda yapılan radyasyon uygulamaları sonucunda, 3 kgy düzeyindeki ışımanın S. aureus redüksiyonuna neden olduğu ve saptama limiti altında gıdaların depolanabildiği bildirilmiştir. Bununla beraber 8 kgy gama ışını kullanılarak SEA nın yıkımlanabildiği bildirilmiştir (Rose ve ark., 1988) Stafilokokal Enterotoksinlerin Oluşumuna Etki Eden Faktörler Kontaminasyon Düzeyi Laboratuar koşullarında 10 6 düzeyindeki inokulum ile ph aralığında enterotoksin üretimi gerçekleşmektedir. Değişik datalardan elde edilen sonuçlar ile birçok ticari işlenmiş gıdanın çok iyi substratlar olduğu ve gramında <100 S. aureus kontaminasyonunun üreme ve enterotoksin oluşumuna izin verebildiği bildirilmiştir. Çeşitli sütlere inoküle edilen mililitrede 10 3 düzeyindeki S. aureus un 37 o C deki inkübasyonu ile üreme ve SEA oluşumunun gözlendiği bildirilmiştir (Genigeorgis, 1989) ph ve NaCl Stafilokokların üreme ve enterotoksin C oluşturmasına NaCl ve ph nın etki ettiği, 10 8 kob/ml düzeyinde broth da bulunan inokulumun NaCl düzeyi yavaş yavaş % 12 konsantrasyonuna ulaştığında üreme oranının azaldığı bildirilmiştir. S. aureus 137 suşunun optimum üremesi için ph aralığının olduğu, % 10 NaCl bulunan ortamda ph aralığında enterotoksin C üretiminin gerçekleştiği bildirilmiştir. SEC için bu çalışmada optimum ph aralığının olduğu rapor edilmiştir (Genigeorgis ve ark., 1971).

38 28 Yapılan diğer bir çalışmada ise, üreme ve SEB üretiminin ph limiti azaldığında ve NaCl konsantrasyonu yükseldiğinde en iyi gerçekleştiği ve enterotoksin üretiminin bu iki faktör arasındaki interaksiyonlara bağlı olduğu gösterilmiştir. % 16 tuz konsantasyonu ve ph 6.9 da stafilokokların iyi ürediği ve bu ph da %10 tuz konsantrasyonlarının üzerinde SEB saptanabildiği belirtilmiştir (Genigeorgis ve Sadler, 1966). S. aureus % konsantrasyonundaki salamurada aerobik olarak ve % oranındaki konsantrasyonda ise anaerobik olarak üreyebilmektedir. Enterotoksin üretimi artan NaCl konsantrasyonu ile azalmakta ve ph ve sıcaklık bu olguya etki etmektedir (Genigeorgis, 1989). Pereira ve ark., (1982) tarafından yapılan bir çalışmada, broth ortamında oluşturulan % 10 NaCl konsantrasyonunda SEA üretimin gerçekleştiği ve 39.4 o C de ve ph 7.0 da SEA ve SEB üretiminin maksimum düzeyde olduğu bildirilmiştir. Değişik kültür ortamlarında enterotoksin üretiminin araştırıldığı bir çalışmada, başlangıç ph sının düşük olduğu durumlarda SEA üretiminin zayıf oranda etkilendiği bunun asiditesi yüksek gıdalar için önem arz edebileceği bildirilmiştir (Reiser ve Weiss, 1969) Su Aktivitesi Enterotoksin D oluşturabilen 4 farklı S. aureus suşunun, 37 o C de NaCl ile oluşturulan değişik su aktivitesi değerlerinde, Brain Hearth Infusion Brothda 6 günlük inkübasyondan sonra 0.86 ve daha düşük değerlerde SED oluşturabildiği bildirilmiştir (Ewald ve Notermans, 1988). Notermans ve Heuvelman (1983), Brain Hearth Infusion Brothda a w ( ), ph ( ) ve Sıcaklık (8-30 o C) parametrelerini kullanarak yaptıkları çalışmada, a w 0.85 değerinde ph 4.3 veya 8 o C de bakteriyel üreme saptanamadığını, 12 o C de a w 0.90 veya 0.93 değerinde, ph <5.5 ile kombine edildiğindede üreme

39 29 saptayamadıklarını bildirmişlerdir. SEA üretiminin üremeye müsade eden tüm koşullar altında gerçekleştiği, SEB üretiminin ise a w 0.96 değerinde üremeye müsade eden tüm sıcaklık değerlerinde gerçekleştiği bildirilmiştir a w değerinde ise SEB üretiminin güçleştiği, SEC ve SEF üretimine ise a w ve sıcaklığın etkili olduğu bildirilmiştir. SEC ve SEF üretiminin 0.93 a w değerinde nadiren gözlendiği bildirilmiştir. Qi ve Miller (2000), düşük su aktivitesinin SEA ve SEB biyosentezi üzerine etkisini araştırdıkları bir çalışmada, A, B tipi ve A+B toksinlerini oluşturabilen suşlar kullanmışlardır. SEB oluşumunun SEA oluşumuna oranla düşük a w değerine daha duyarlı olduğu, ortamda prolin varlığının düşük a w değerlerinde SEB oluşumunu stimüle ettiği, glisin, betain ve carnitin gibi substratların varlığında bu stimulasyonun gözlemlenmediği bildirilmiştir Sıcaklık Sıcaklık, sekonder metabolitlerin ekspressiyonu veya baskılanması açısından önemli bir rol oynar. Stafilokoklar sıcaklığın uygun olmaması gibi iyi olmayan çevre koşullarına, önemli spor oluşturmayan etkenlere nazaran daha dirençlidirler (Halphin-Donhalek ve Marth, 1989). Dietrich ve ark., (1972), SEB oluşumu için optimal sıcaklığın 37 o C olduğunu, sıcaklığın 40 o C ye yükselmesi ile S. aureus üremesinde ve saptanabilir enterotoxin oluşumunda azalma tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Buna karşın Scheusner ve ark. (1973), A, C ve D tipi enterotoksinlerin oluşabilmesi için maksimum sıcaklığın 45 o C ye yakın olduğunu, minimum sıcaklığın ise 19 o C olduğunu bildirmişlerdir. 13 ila 39 o C ler arasında SEB oluşumunun saptandığı da araştırıcılar tarafından bildirilmiştir. Ayrıca Vandenbosch ve ark. (1973), SEB ve SEC oluşumu için optimum sıcaklığın 40 o C olduğunu, o C ler arasında sıvı ortamlarda toksin oluşumunun saptandığını bildirmişlerdir.

40 30 Tatini (1973), S. aureus suşlarının üremesi için optimal sıcaklığın 37 o C olduğunu enterotoksin üretiminin o C ler arasında gerçekleştiğini ve en yüksek seviyede enterotoksin oluşumunun o C ler arasında üreyen S. aureus kültürleinde saptandığını bildirmiştir. Schmitt ve ark. (1990), gıdalardan izole ettikleri 77 S. aureus şuşunu 5-50 o C ler arasında 7 gün süre ile Brain Heart Infusion Brothda inkübe etmişler ve SEA, SEB ve SEE oluşumu için minimum sıcaklık derecelerinin o C, maksimum sıcaklık derecelerinin ise o C olduğunu saptadıklarını bildirmişlerdir Rekabetçi Özellik S. aureus gıdalarda bozulmaya neden olan pseudomonadlar ve laktobasiller gibi ajanların geneli ile rekabete duyarlıdır. Diğer mikroorganizmaların varlığı stafilokokların üremelerini ve toksin oluşturmalarını inhibe edebilir (Çizelge 1.7) (Halphin-Donhalek ve Marth, 1989; Mossel ve Van Netten, 1990). Çizelge1.8. S. aureus ile antagonistik etki oluşturduğu gösterilen cins veya türler (Mossel ve Van Netten, 1990). Acinetobacter Aeromonas Bacillus Enterobacteriaceae Enterococcus Lactobacillaceae Pseudomonas Staphylococcus epidermidis Streptococcus Saprofitik flora (İdentifiye edilmemiş) Stafilokokların mikrobiyel inhibisyonunda temel olarak asidik ürünler ve düşük ph, H 2 O 2 üretimi, antibiyotikler gibi diğer inhibitör maddeler, volatil maddeler veya esansiyel besin maddelerine karşı yarışma gibi faktörler etkilidir. Ayrıca gıdaya ait ph, a w, E h gibi intirinsik karakterler, S. aureus ve yarışmacı bakterilerin oranı, sıcaklık ve atmosfer gibi depolama koşulları ve floranın inhibitör

41 31 veya stimulatör ürünleri oluşturabilme yeteneği gibi faktörler de rol oynamaktadır (Genigeorgis, 1989) Atmosferik Koşullar Stafilokoklar fakültatif anaerobik mikroorganizmalardır (Adams ve Moss, 1995). Aerobik ortamdaki kültürlerin % 95 nitrojen, % 5 CO 2 içeren ortama göre 10 kat daha fazla SEB oluşturabildiği bildirilmiştir (Carpenter ve Silverman, 1974). Aerobik ve anaerobik koşullar altında, S. aureus un üreme ve enterotoksin oluşturmasına etki eden değişik intrinsik ve ekstrinsik parametrelerin limitasyon değerleri çizelge 1.7 de verilmiştir. Çizelge 1.9. S. aureus un üreme ve toksin formasyonu oluşturmasına etki eden intrinsik ve ekstrinsik parametrelerin limitasyon değerleri (Mossel ve Van Netten, 1990). Atmosfer i Aerobik Anaerobik o C a w ph o C a w ph Üreme Enterotoksin Formasyonu 1.9. Stafilokokal Enterotoksinleri Saptama Yöntemleri Gıdalarda enterotoksinlerin saptanması, insanlarda hastalık oluşumunu gerektirecek enterotoksin miktarı ile orantılıdır. Bu doz ng dır. Bu yöntemlerin gıdanın mililitresinde veya gramında 1 ng düzeyinin altında toksin saptaması gereklidir Bergdoll, 1989; Mossel ve Van Netten, 1990). Stafilokokal enterotoksinlerin saptanması üzerine immunolojik ve serolojik birçok analiz yöntemi geliştirilmiştir. İmmunolojik analiz yöntemleri duyarlı ve spesifik olup enterotoksinlerin serolojik olarak identifiye edilmesi esasına dayanır. Bununla beraber karakterize edilememiş bazı stafilokokal enterotoksinlerin saptanması sadece maymunlardaki emetik aktivitelerinin oluşturulması temeline

42 32 dayanır. Genç Rhesus maymunlarının % 50 sinde 5-20 µg emetik reaksiyon oluşturabilir (Su ve Wong, 1997). miktarındaki toksin İlk İmmunolojik Yöntemler Stafilokokal enterotoksinler protein yapıda olup antijenisite özellikleri iyidir. Birçok hayvan türünde homologları olan antikorlar oluşturulabilir. Birçok serolojik test antijenisitik özelliğe dayanır ve biyolojik aktiviteleri ile ilgili değildir. Tekli jel veya radyal immunodifüzyon testleri, enterotoksinin jel içerisinde diffüze olması, homoloğu antikor ile reaksiyona girerek görünür presipitat oluşturması esasına dayanır. Çiftli jel immunodifüzyon tekniği, şüpheli örneklerde toksin saptanması amacıyla kullanılmıştır. Yarı kantitatif bir metot olup, 5-10 µg/ml enterotoksini bir gece içinde saptayabilir (Tranter ve ark., 1990). Bu tekniklerin modifikasyonu sonrası kültürlerin enterotoksijenisitesini saptamak amacıyla Optimum Sensivity Plate (Robbins ve ark., 1974) ve genellikle stafilokokal toksin analizleri için kullanılan, Microslide tekniği geliştirilmiştir (Casman ve ark., 1969). Bu tekniklerin dışında Hemaglütünasyon ve Elektroimmunodifüzyon gibi teknikler de geliştirilmiştir (Tranter ve ark., 1990) Son Zamanlarda Geliştirilen İmmunolojik Yöntemler Bu yöntemlerin ilk geliştirilenlere oranla farklı avantajları mevcuttur, toksinlerin ekstraksiyou konsantrasyonu gibi zaman alıcı işlemleri gerektirmezler (Tranter ve ark., 1990). RIA (Raddioimmunoassay), kültür filtratları ve gıda ekstratlarında enterotoksinlerin saptanması için geniş oranda kullanılmıştır. Bu metot antikor moleküllerinin üzerindeki bağlanma bölümlerine, örneklerde işaretlenmemiş toksin ile standart radyoaktif işaretlenmiş toksinin yarışması esasına dayanır. Genel olarak

43 33 hızlı (3-4 saat), ve 1-10 ng/g düzeyinin altında toksinleri saptayabilen bir yöntemdir. Dezavantajları ise non-spesifik reaksiyonlar, yüksek oranda purifiye enterotoksin gerektirmesi, antijenik epitopların işaretlenmesi esnasında mümkün olabilecek advers etkiler, radyoizotopların kısa yarılanma ömrü, radyonüklidlerin insan sağlığına zararları ve pahalı saptama cihazlarına gereksinim olmasıdır (Tranter ve ark., 1990). ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) veya EIA (Enzyme Immuno Assay) uzun zamanlardan beri antijen ve ankikorların saptanmasında kullanılmıştır. ELISA, RIA ya benzer olarak duyarlı ve hızlıdır. Enzim aracılığı ile kromojenik substratların katalizlenmesi ve visuel olarak değerlendirilmesi esasına dayanır. ELISA testi için gerekli ekipman birçok laboratuvarda bulunabilir ve enzim-antikor konjugatları aktivitelerini kaybetmeden -20 o C de uzun bir periyotta saklanabilir (Tranter ve ark., 1990). Kompetetif ELISA (Kauffman, 1980) ve kompetetif olmayan iki antikorlu sandwich ELISA (Notermans ve ark., 1982b) gibi çeşitli tiplerde ELISA teknikleri geliştirilmiştir (Su ve Wong, 1997). Sandwich ELISA, SE lerin saptanmasında iyi bir metot olarak gösterilmiş ancak protein A varlığında yanlış pozitif sonuçlar elde edilmiştir. Protein A nın angellenmesi için koyun IgG leri kulanılmış ve uygun sonuçlar alınmıştır (Notermans ve ark., 1982b). Gilbert ve Wieneke (1987), SE lerin saptanmasına yönelik 4 farklı metotu karşılaştırdıkları bir çalışmada, RPLA (Reversed Passive Latex Agglutination) ticari test kitini kolay uygulanabilir, sandwich ELISA ticari test kitini ise çok duyarlı bulduklarını bildirmişlerdir. Ancak ELISA kitinin çok sayıda numuneyi işleme açısından pratik olmadığı belirtilmiştir. RPLA kitinin daha az numunede pozitif sonuç verdiği ve bazen non-spesifik aglütinasyonların oluşabildiği bildirilmiştir. Ayrıca ELISA kiti ile SED varlığında bazı gıda ekstratlarında kontrol tüplerinde yüksek absorbans değerleri ile karşılasıldığı ve yanlış negatif sonuç alınabildiği bildirilmiştir.

44 34 Son zamanlarda enterotoksinlerin saptanması için ticari test kitleri üretilmiştir. RIDASCREEN, TECRA, TRANSIA, VIDAS, SET-EIA ve RPLA gibi ticeri kitleri çeşitli gıdaların analizlerinde kullanılmaktadır. Bu diagnostik kitlerin özellikleri Çizelge 1.8 de verilmiştir (Su ve Wong, 1997). Çizelge Stafilokokal enterotoksinlerin saptanması amacıyla kullanılan diagnostik kitler (Su ve Wong, 1997). Toksin Analiz Örnek Kit Tespit Saptanabilen Tiplerini Duyarlılık Süresi * Özel Başına Yöntemi Enterotoksinler Ayırma (ng/ml) (Saat) Ekipman Maliyet RIDASCREEN ELISA A-E Evet Evet $ SET-EIA ELISA A-D Evet Evet $ TECRA ELISA A-E Hayır Hayır $ TRANSIA ELISA A-E Hayır Evet $ RPLA RPLA A-D Evet Hayır $ VIDAS ELFA A-E Hayır Evet $ 8.00 * Örnek hazırlığı süresi dahil edilmemiştir Vernozy-Rozand ve ark., (2004), VIDAS SET, VIDAS SET2 ve TRANSIA kitlerini karşılaştırdıkları bir çalışmada, SEA, SEB, SEC 2, SED ve SEE ilave ettikleri gıdaları analiz etmişler ve VIDAS SET2 nin VIDAS ve TRANSIA ya oranla daha yüksek oranda spesifik ve duyarlı olduğunu saptamışlardır. Park ve ark. (1994), içerisinde hindi etlerininde bulunduğu gıdalarda RIDASCREEN ticari test kitinin duyarlılığını araştırmışlardır. Kitin basit, hızlı, rahat kullanışlı yüksek oranda spesifik ve duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Rekombinant DNA teknolojisi ve PCR gibi nükleik asit bazlı tespit yöntemleride son yıllarda geliştirilmiştir (Tranter ve ark., 1990; Su ve Wong, 1997).

45 Stafilokokal İntoksikasyonların İnsanlarda Oluşturduğu Semptomlar Stafilokokal gıda zehirlenmesi olgularıında semptomlar genellikle çabuk gelişir. 1-6 saatlik bir zaman dilimi söz konusudur. Ortalama olarak semptomlar 3 saat içinde gelişir. Predominant ve ciddi semptom kusmadır ve mide bulantısı hissini takiben oluşur. Diger semptomlar ise abdominal kramplar ve diyaredir. Semptomlar 1-2 gün içerisinde kaybolur, ölüm ekstrem olarak düşük seviyededir ancak ölümle sonuçlanmış vakalar bildirilmiştir (Hayes, 1995). Stafilokokal toksin içeren gıdaların alınması ile zehirlenme tablosunun oluşabilmesi için genellikle 100 g gıdada 1µg toksinin bulunması gerektiği bildirilirken (Reiser ve ark., 1974), okul çocuklarında çikolatalı sütlerden ileri gelen bir stafilokokal gıda zehirlenmesi olayında 0.2 µg düzeyindeki SEA nın zehirlenme tablosu oluşturduğu bildirilmiştir (Evenson ve ark., 1988). İntoksikasyona çocuklar ve yaşlılar daha duyarlıdır. Ayrıca yenilen gıdanın miktarı, kişinin durumu ve toksin tipi de önemlidir. SEB nin SEA dan daha şiddetli semptomlar oluşturduğu bildirilmiştir (Bergdoll, 1989). İntoksikasyon tablosu görülen kişilerde tedavi genellikle sıvı dengesinin korunmasına yöneliktir (Jay, 1996). Kusma sıklıkla görülen bir reaksiyondur ve maymunlarda enterotoksijenik stafilokokların emetik aktivitesi saptanabilir. Maymunlar insanlara benzer şekilde cevap oluşturmaktadır. Maymunlarda emetik aksiyon bölgesi abdominal visera dır. Vagus ve semptomatik sinirler yolu ile beyindeki kusma merkezi uyarılır (Bergdoll, 1989). Enteritis, enterotoksinlerin oral yola alımını müteakip görülen diğer bir semptomdur. Ateş genellikle gözlenmez (Bergdoll, 1989) kişinin etkilendiği çeşitli stafilokokal gıda intoksikasyonları olgularında, kişilerin % 64 ünde abdominal ağrı, % 73 ünde mide bulantısı, takiben % 82 sinde

46 36 kusma ve % 68 inde diyare gözlenmiştir. Diğer komplikasyonlar olarak, % 11 inde baş ağrısı, % 8 inde güçsüzlük ve % 4 ünde baş dönmesi tespit edilmiştir. Vakalardaki ölüm oranı % 0.03 ila % 4 arasında değişmektedir. Bir zehirlenme olgusunda 80 yaş üzeri iki ölüm vakası gerçekleşmiştir (Holmberg ve Blake, 1984).

47 37 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Bu çalışma kapsamında değişik firmalar tarafından Ankara da paketlenmiş olarak tüketime sunulan, 39 but ve 13 dondurulmuş kanat olmak üzere 52 hindi eti örneği materyal olarak kullanılmıştır Koagulaz Pozitif Stafilokokların İzolasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Test Malzemeleri Peptone Water (Oxoid CM0009) Bileşimi Peptone 10.0 g Sodium chloride 5.0 g Distile su 1000 ml ph 7.2 ± 0.2 Hazırlanışı Bu hazır besi yerinden 15 g tartılarak 1000 ml distile su içerisinde çözündürüldükten sonra ph değeri 7.2 ± 0.2 ye ayarlandı. Bir kısmı 16x150 mm dilusyon tüplerine bir kısmı ise Erlen-Mayer lere konularak 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra soğutuldu. Egg Yolk Tellurite Emulsion (Oxoid SR0054) Yumurta sarısı emülsiyonu Potasyum tellürit içermektedir. Kullanıma hazır sıvı şekilde 100 ml lik formdadır.

48 38 Baird-Parker (BP) Agar Base (Oxoid CM0275) Bileşimi Trptone 10.0 g Lab-Lemco powder 5.0 g Yeast extract 1.0 g Sodium pyruvate 10.0 g Glycine 12.0 g Lithium chloride 5.0 g Agar 20.0 g ph 6.8 ± 0.2 Hazırlanışı Bu hazır besi yerinden 63 g alınarak 1000 ml distile suda çözündürüldü, ph değeri 6.8 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra 50 o C kadar soğutuldu ve üzerine 50 ml Egg-Yolk Tellürit Emülsiyon (Oxoid SR 0054) ilave edilerek karıştırıldı. Besi yeri steril petrilere ml miktarında dökülerek hazırlandı. Tryptone Soya Agar (TSA) (Oxoid CM0131) Bileşimi Trptone 15. g Soya peptone 5.0 g Sodium chloride 5.0 g Agar 15.0 g ph 7.3 ± 0.2

49 39 Hazırlanışı Bu hazır besi yerinden 40 g alınarak 1000 ml distile suda çözündürüldü, ph değeri 7.3 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra sıcak su banyosunda tamamen eritildi. 16x150 mm lik tüplere aktarılarak 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildikten sonra yatık şekilde hazırlandı. Brain Hearth Infusion (BHI) Broth (Oxoid CM0225) Bileşimi Calf brain infusion solids 12.5 g Beef heart infusion solids 5.0 g Proteose peptone 10.0 g Glucose 2.0 g Sodium chloride 5.0 g Di-sodium phosphate 2.5 g ph 7.4 ± 0.2 Hazırlanışı Bu hazır besi yerinden 37 g alınarak 1000 ml distile suda çözündürüldü, ph değeri 7.4 ± 0.2 ye ayarlandıktan sonra 16x150 mm lik tüplere aktarılarak 121 o C de 15 dakika otoklavda sterilize edildi. Tüp Koagulaz Test Liyofilize Bactident Coagulase Rabbit Plasma with EDTA (MERCK ) tavşan plazması koagulaz testi için kullanıldı. 6 vial den oluşan setin her viali 3 ml steril distile su ile sulandırılarak çözündürüldü. Rehidratize edilen bu plazmalar ile kültür süspansiyonu karıştırılarak kullanıldı.

50 40 Test Suşu Petrilere ekimlerde ve tüpte koagulaz testlerinde koagülasyonun tespiti amacıyla, belirleyici mikroorganizma olarak S. aureus ATCC kontrol test suşu kullanıldı Koagulaz Pozitif Stafilokokların Toksin Oluşturma Yeteneğinin Belirlenmesi Amacıyla Kullanılan EIA Malzemeleri Bu amaçla Ridascreen SET A,B,C,D,E (R-Biopharm AG, Darmstadt Germany. Art. No.: R4101) ticari test kiti düzeneği kullanılmıştır. Test Kitinin Yapısı SEA SEB SEC SED Stafilokokal Enterotoksinler A-E ye karşı spesifik antikorla kaplı mikrotiter stripler SEE koyun-igg koyun-igg anti-se Negatif kontrol Negatif kontrol Pozitif kontrol Şekil 2.1. Ridascreen ticari test kitinin düzeneği.

51 Yöntem Ankara da değişik marketlerde orjinal paketlerinde satışa sunulan hindi eti (but, kanat) örnekleri, aseptik koşullarda alınarak, soğuk zincir altında laboratuvara getirildi. But örnekleri mikrokok/stafilokoklar yönünden 10 ar g (deri+et) tartılarak hemen analize alınırken, kanat örnekleri buzdolabı ısısında (+4 o C) 24 saat bekletilerek çözündürüldükten sonra analize alındı. Daha sonra örneklerin ph değeri belirlendi. Plaklarda üreyen kolonilerden elde edilen izolatlar Tryptone Soya Agar (Oxoid CM0131) yatık besiyerlerine alındı. Bu izolatlardan koagulaz pozitif reaksiyon verenler koagulaz pozitif stafilokok olarak değerlendirilerek toksin üretme kabiliyetlerinin belirlenmesi amacıyla EIA (Enzyme Immuno Assay) testi uygulandı Mikrokok/Stafilokokların İzolasyonu Alınan hindi eti örneklerindeki mikrokok/stafilokokların varlığı, Baumgart (1997), tarafından önerilen yönteme göre yapıldı. Yöntem gereğince örnekler katı besiyerlerine geçilerek üreyen kolonilerin değerlendirmesi yapıldıktan sonra tüpte koagulaz test yapılarak, koagulaz pozitif izolatlar belirlendi Katı Besiyerine Ekim ve Kolonilerin Değerlendirilmesi Hindi eti örneklerinden bütünü temsil edecek şekilde alınan 10 ar g örnek (deri+et) steril stomacher poşetlerine konulup, üzerine 90 ar ml % 0.1 lik steril peptonlu su (Oxoid, CM0009) ilave edildikten sonra en az 3 dakika olmak üzere stomacher da homojenize edildi. Bu homojenat ve 16x150 mm lik steril tüplerde 9 ar ml hazırlanan peptonlu su kullanılarak 10-6 ya kadar desimal dilüsyonlar hazırlandı. Her dilüsyondan yayma plak tekniği kullanılarak 0.1 ml Baird-Parker agara (Oxoid CM0275, Egg Yolk Tellürite Emulsion Oxoid SR0054) ekimler yapıldı ve plaklar 37 o C de saat süre ile aerob ortamda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrasında üreme saptanan plaklarda toplam mikrokok/stafilokok düzeyi belirlendikten sonra, plaklarda üreyen şüpheli tipik (siyah, koyu kahverengi, konveks, kenarları düzgün ve lesitinaz pozitif) ve/veya atipik kolonilerden örnekleme

52 42 yoluyla 5 adete kadar koloni seçildi (Resim 2.1). Daha sonra seçilen koloniler 16x150 mm lik tüplerde Tryptone Soya Agar (Oxoid CM0131) yatık besiyerlerine alınarak 37 o C de 24 saat aerob ortamda inkübe edildikten sonra buzdolabına kaldırıldı. Resim 2.1. Stafilokok kolonilerinin Baird-Parker Agar daki görünümü Koagulaz Pozitif Stafilokokların Belirlenmesi Koagulaz pozitif stafilokokların saptanması, Lancette ve Tatini (1992) tarafından önerilen yönteme göre yapıldı. Bu amaçla besi yerlerindeki izolatlar Brain Hearth Infusion Broth lara (Oxoid, CM0225) geçilerek 24 saat 37 o C de aerob ortamda inkübasyona bırakıldı. Liyofilize EDTA lı tavşan plazması (Bactident Coagulase Rabbit Plasma with EDTA MERCK, ) 3 ml steril distile su ile rehidratize edildikten sonra, steril koagulasyon tüplerine plazma konularak üzerine Brain Heart Infusion Broth da üremiş olan kültür süspansiyonundan ilave edildi. Tüpler 37 o C de inkübasyona bırakılarak ilk 6 saat boyunca her saat koagulasyonun

53 43 saptanması amacıyla kontrol edildi. Koagulasyon saptanmayan tüpler 24 saat inkubasyonda tutuldu. Test sonucunda 3+ ve 4+ reaksiyon veren izolatlar koagulaz pozitif stafilokoklar olarak değerlendirildi (Resim2.2, Resim 2.3). Resim 2.2. Tüpte Koagulaz Test. Resim olarak değerlendirilen bir test tüpünün görünümü.

54 Koagulaz Pozitif Stafilokokların Enterotoksin Oluşturma Yeteneklerinin Belirlenmesi Koagulaz pozitif olarak saptanan ve Tryptone Soya Agar (Oxoid CM0131) yatık besiyerinde bulunan izolatlar, Brain Heart Infusıon Broth a (Oxoid CM0225) geçilerek 37 o C ve 42 o C lerde 28 ve 52 saatlik inkubasyona bırakıldı (Scheusner ve ark., 1973; Tatini, 1973; Vandenbosch ve ark., 1973; Jay, 1996). Daha sonra ticari bir test kiti olan, Ridascreen SET A,B,C,D,E (R-Biopharm AG, Darmstadt Germany. Art. No.: R4101) kullanılarak izolatların toksin oluşturabilme yetenekleri saptandı (Resim 2.4). Bu amaçla ticari test kiti üretici yönergesi uyarınca aşağıda belirtilen işlemler uygulandı. Brain Heart Infusion Broth da üreyen kültür süspansiyonları 15 o C de 3500 g de 5 dakika süre ile santrifüje edildikten sonra, 0.20 µm por çapındaki filtreden (Sartorius, Minisart) süzülerek filtratlar elde edildi. Her mikrotiter stripi bir izolat için kullanılan pleytin stafilokokal enterotoksinler A, B, C, D, E ye karşı spesifik antikorlarla kaplı A-E ve koyun IgG leri ile kaplı F-G negatif kontrol kuyucuklarına 100 er µl filtrat ve A, B, C, D, E toskinlerine karşı spesifik antikorlarla kaplı H kuyucuğuna her toksinden 2 ng/ml içeren 100 µl pozitif kontrol solüsyonu konuldu özenli hareketlerle karıştırılarak oda sıcaklığında (20-25 o C) 1 saat inkubasyona bırakıldı. Pleyt içerisindeki sıvılar tekniğine uygun olarak lavaboya boşaltıldıktan sonra her kuyucuk 250 µl yıkama solüsyonu ile yıkandı. Kuyucukların solüsyon ile yıkanması işlemi 4 defa tekrar edildi. Bütün striplere 100 µl enzim konjugat ilave edilerek özenli hareketlerle karıştırıldı ve 1 saat oda ısısında inkübe edildi. Yukarıda açıklanan yıkama işlemi tekrar edildi.

55 45 Daha sonra pleytlerdeki tüm kuyucuklara 50 µl substrat ve 50 µl kromojen ilave edilerek özenli hareketlerle karıştırıldı ve karanlık ortamda 30 dakika inkübe edildi. Bütün kuyucuklara 100 µl stop solüsyonu ilave edilerek özenli hareketlerle karıştırıldı ve 60 dk içerisinde 450 nm absorbans değerinde ELISA cihazında (Organon Teknika Reader 230S) ölçümler yapıldı. Negatif kontrollerin ortalamasına 0.15 değeri eklenerek Cut-off değeri hesaplandı ve bu değere eşit veya yüksek olan örnekler pozitif kabul edildi. Resim 2.4. Ridascreen ticari test kiti görünümü