Staphylococcus aureus Analiz Yöntemleri (Kaynak 1)

Transkript

1 Staphylococcus aureus Analiz Yöntemleri (Kaynak 1) 01. Standart Analiz Yöntemi Sayım ve İzolasyon Standart Kültürel Yöntemlerle İdentifikasyon Lateks Testi ile Hızlı İdentifikasyon 02. Gelişmiş ve Hızlı Analiz Yöntemleri 03. Toksin Testleri 01. Standart Analiz Yöntemi S. aureus amaca göre gıdalarda var/yok testi ile belirlenebileceği gibi yaygın olarak uygulandığı şekli ile sayılır. Sayım selektif katı besiyerinde veya EMS yöntemi ile yapılabilir Sayım ve İzolasyon Katı örnekler standart şekilde homojenize edilir. Sıvı örneklerden direk ekim yapılabilir. Eğer gıdadaki S. aureus sayısının yüksek olduğu tahmin ediliyorsa daha ileri seyreltilerden ekim yapılmaktadır. Selektif izolasyonda ve dolayısı ile selektif sayımda ISO, FDA, AOAC, IDF gibi uluslararası kuruluşlar Baird-Parker agar besiyeri kullanılmasını önermektedir. Dolayısı ile S. aureus izolasyonu veya sayımı gerektiğinde bütün dünyada en yaygın kullanılan besiyeri Baird- Parker agar'dır. Diğer gıda kaynaklı patojenler için bu düzeyde uluslararası tüm kuruluşlar tarafından anlaşmaya varılmış ve her türlü gıdanın analizinde kullanılan başka bir besiyeri bulunmamaktadır. S. aureus analizlerinde Brolacin agar, Kranep agar, mannitol salt phenol red agar, Vogel-Johnson agar ve staphylococcus medium 110 (Chapman agar) besiyerleri de kullanılabilir. Baird-Parker agar, yumurta sarısı emülsiyonu ve potasyum tellurit içeren selektif bir besiyeridir. Bu katkı maddeleri sterilizasyon sonrası besiyeri 45 C 'a soğutulduktan sonra ilave edilmektedir. Yumurta sarısı lesitinaz aktivitesinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. Potasyum telluritin kullanılma nedeni ise Staphylococcus 'ların telluriti telluriuma indirgemesi ve potasyum telluritin Gram negatif mikroorganizmalar üzerinde inhibisyon etkisine sahip olmasıdır. Bu besiyeri yumurta sarısı yerine kan ilavesi ile de kullanılabilmekte ve böylece hemoliz reaksiyonu değerlendirilmektedir. S. aureus 'un gıdalardaki varlığı önemli olduğu için standart yayma yönteminin vereceği duyarlıktaki sonuç yeterli değildir. Bu yöntemde katı gıdadan homojenizasyon için gerekli 10-1 seyreltiden 0,1 ml ekileceğine göre yöntemin duyarlığı 100 kob/g olmaktadır. Bu durumda dökme yöntemi ile petri kutusuna 1 ml aktarılması gerekmektedir. Dökme yönteminin dezavantajları dikkate alındığında yayma yöntemi ile S. aureus sayımı için ya standart boyutta (9-10 cm) 3 petri kutusuna 1 ml eşit hacimlerde yayılır ve bu 3 petri kutusundaki sayı 1 ml ekim yapılmış tek petri kutusu olarak değerlendirilir ya da daha pratik olarak 14 cm çaplı büyük petri kutusuna doğrudan 1 ml ekim yapılır. Ekimi tamamlanan petriler saat süreyle inkübatörde C 'da inkübe edilir. Ekimler paralelli olarak yapılır. 1

2 S. aureus, koagulaz, termonukleaz, lesitinaz pozitif ve telluriti telluriuma indirgeyen tek Staphylococcus türüdür. Baird-Parker agar besiyerinde mikrokoklar ve diğer stafilokoklar da hafif siyah renkli koloniler oluşturarak gelişirlerse de, bu kültürlerin S. aureus 'dan ayrımı kolaydır. Katı besiyerinde koloni etrafında yumurta sarısının parçalanmasına neden olan lesitinaz enzim aktivitesi ile berrak bir zon oluşur. Pek çok koagulaz pozitif S. aureus aynı zamanda lesitinaz pozitif iken Baird-Parker agar besiyerinde gelişen diğer koloniler lesitinaz negatiftir. Atipik S. aureus suşları lesitinaz üretmezler. Süt ürünlerinde atipik S. aureus suşlarına sıklıkla rastlanmaktadır. Baird-Parker agarda tipik S. aureus kolonileri siyah veya gri, parlak, düzgün ve 24 saat inkübasyondan sonra 1-1,5 mm, 48 saat sonra 1,5-2,5 mm çapında konveks bir görünümdedir. Kolonilerin çevresinde berrak bir zon bulunur. Tipik koloni gözlenen petrilerde S. aureus kolonileri işaretlenir ve sayım yapılır. İnkübe edilen petri kutularında S. aureus olması muhtemel olan birkaç tip koloni gözleniyor ise koloniler gruplanarak sayıları ayrı olarak hesaplanır. Gruplandırılan kolonilerden birden fazla sayıda seçilerek doğrulama testleri yapılır. Analiz edilecek gıda örneğinde S. aureus sayısının katı besiyeri kullanılarak sayılamayacak kadar az olduğu tahmin ediliyor ise EMS yöntemi ya da membran filitrasyon yöntemi kullanılabilir. EMS yöntemi ile S. aureus aranmasında ise Giolitti-Cantoni broth veya staphylococcus enrichment broth Base acc. to Baird Parker besiyerleri kullanılır. İnkübasyon sonunda siyah renkli tüplerden selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak, burada oluşan şüpheli kolonilerin doğrulanması gerekmektedir. Giolitti-Cantoni broth ve Staphylococcus enrichment broth besiyerlerinde 37 C 'da saat inkübasyon sonunda oluşan siyah renk S. aureus 'u gösterir. Membran filitrasyonda doğrudan Baird-Parker besiyeri kullanılır Standart Kültürel Yöntemle İdentifikasyon Rutin uygulamada Baird-Parker agar besiyerinde yukarıda verilen tanımlamaya uygun koloniler doğrudan S. aureus olarak sayılıp analiz bitirilir. Ancak, doğru olan tipik kolonilerin şüpheli S. aureus olarak kabul edilmesi ve bunların standart örnekleme yöntemi ile tanımlanması ve buradan orantı kurarak örnekteki S. aureus sayısını hesaplamaktır. Bu amaçla önce tipik ya da şüpheli kolonilerden doğrulama testlerinde kullanılmak üzere nutrient broth besiyerine inokülasyon ve yatık nutrient agar besiyerine sürme yapılır C 'da saat inkübe edilerek izolatın saflığı kontrol edilir ve bakteri aktif halde elde edilir. Seçilen tipik veya atipik kolonilerin öncelikle gram pozitif koklar olup olmadığı belirlenmelidir. Mikroskobik incelemede gram boyama yapılan preparatın viyole renkli üzüm salkımı şeklinde izlenmesi gerekmektedir. Sonraki aşamada bölüm 36 'da verilen şekilde katalaz ve hemoliz reaksiyonları incelenir. Daha sonra ise koagulaz, termostabil nukleaz üretimi, glikoz ve mannitolün anaerob kullanım testleri uygulanır. Koagulaz, kan plazmasını koagule edebilen bir enzimdir. S. aureus suşları için koagulaz ve enterotoksin oluşumu arasında yakın ilişki söz konusudur. Koagulaz ve termostabil nukleaz testleri S. aureus suşlarının patojenliğini belirlemede önemli indikatörlerdir. Yukarıda da belirtildiği gibi S. aureus suşlarının tümü stafilokokal gıda zehirlenmelerine neden olan toksinler üretmemektedir. Dolayısı ile bu suşların diğerlerinden ayrılması ve bunların "toplam 2

3 mezofilik aerobik bakteri" gibi değerlendirilmesi, tersine olarak bu toksinleri üreten suşları içeren gıdaların tüketiminin engellenmesi gerekmektedir. S. aureus iki tip koagulaz enzimi içermektedir. Serbest koagulaz ekstraselüler bir enzimdir, prototrombin ve derivatları ile reaksiyona girer. Diğeri ise bağlı koagulazdır, hücre duvarının yüzeyine lokalize olmuştur. Bağlı koagulaz plazma fibrinojenlerinin α ve β zincirleri ile reaksiyona girer. Koagülaz testi, her iki koagulaz formunu da belirlemektedir. Koagülaz testinde ideal olarak brain heart infusion broth kültürü kullanılmalıdır. Brain heart agar kültürü kullanılacak ise koloni 1 ml steril destile su içerisinde süspanse edilerek kullanılabilir. Liyofilize tavşan plazması 3 ml steril destile su ile sulandırılıp steril küçük tüplere 0,3 ml olacak şekilde dağıtılır ve üzerine 0,1 ml kültür ilave edilip 37 C 'da inkübasyona bırakılır. Her saat tüpte pıhtılaşma olup olmadığı tüpü yavaşça eğerek kontrol edilir ancak bu kontrol sırasında tüpün fazla eğilmemesine ve karıştırılmamasına özen gösterilmelidir. Tüpte belirgin pıhtı oluşumu (%75 pıhtı) pozitif olarak değerlendirilir. Kontrol amacı ile de 0,1 ml steril brain-heart infusion broth besiyeri önerilen miktarda tavşan plazmasına ilave edilir ve inokülasyon yapmadan inkübe edilir. Testin geçerliği kontrol plazmasının pıhtılaşma göstermemesine bağlıdır. Termostabil nukleaz testi koagulaz testi kadar spesifik ancak maviden parlak pembeye renk dönüşümü nedeni ile daha fazla objektif olarak değerlendirilen bir testtir. Koagulaz testi yerine geçmez ancak, özellikle koagulaz testinde 2+ şüpheli sonuçlar için uygulanması gereken destekleyici bir testtir. Bu testin uygulanışında standart bir mikroskop lamı üzerine 3 ml toluidin-blue DNA agar ilave edilir, agar katılaştıktan sonra 2 mm çaplı kuyucuklar açılır. Bu şekilde açılan kuyucuğa kaynar su banyosunda 15 dakika tutulmuş örneklerden 0,01 ml ilave edilip nemli bir ortamda 35 o C 'da 4 saat inkübe edilir. Bu sürenin sonunda kuyucuk duvarı etrafında 1 mm kalınlığında parlak pembe bir hale oluşması pozitif sonuç olarak değerlendirilir. Bu test eğer doğrudan gıda örneği kullanılarak yapılacak ise öncelikle termonukleazın gıdadan ekstrakte edilmesi gerekmektedir. Ancak doğrudan gıda örneği ile çalışılması sahte negatif sonuçlara neden olabilmektedir. Bu nedenle izolat ile çalışılması önerilmektedir. Termonukleaz belirlenmesinde alternatif bir yöntem DNase agar kullanılmasıdır. DNase test agar besiyerinde 37 C 'da saat inkübasyon sonunda oluşan kolonilerin üzeri 1 N HCl ile kaplandığında koloni etrafında berrak zonların oluşumu DNase (termonukleaz) pozitif olarak değerlendirilir. Bu yöntem daha uzun sürmesine ve DNAse test sonucunun dolaylı olarak termonukleaz test sonucunu vermesine rağmen, bu testte kullanılan besiyerinin dehidre formda sağlanabilmesi ve başta Enterobacteriaceae familyası üyelerinin identifikasyonunda da kullanılması olmak üzere laboratuvarda zaten kullanılan ve alışılmış bir test olması nedenleri ile tercih edilebilmektedir. Toluidin-blue DNA agar besiyerinin bileşimi DNA 0,3 g, agar 10 g, susuz CaCl 2 1,1 mg, NaCl 10g, toludin blue O 0,083 g, tris (hydroxmethyl) aminomethane 6,1 g, destile su 1 l şeklindedir. Tris (hydroxyl) aminomethane l destile su içinde çözülüp, ph 9 'a ayarlanır ve toludine blue O dışındaki bileşenler ilave edilir. Kaynama noktasına kadar ısıtılıp toluidine blue O ilave edilir, iyice karıştırılır ve lastik tıpalı şişelere dağıtılır. Besiyeri hemen kullanılacak ise sterilizasyon gerekli değildir. Glikozun anaerobik kullanım testi için brain-heart infusion kültüründen %0,5 glikoz içeren karbohidrat fermentasyon ortamına bir öze ile aşılama yapılır. Besiyerinin yüzeyi en az 25 mm kalınlığında olacak şekilde steril sıvı parafin ile kaplanır ve 5 gün süre ile 37 C 'da 3

4 inkübasyona bırakılır. S. aureus varlığı inkübasyon süresi sonunda tüpte anaerobik koşullarda asit üretimine bağlı olarak sarı renk oluşumu ile gösterilir. Besiyerinin orijinal rengi kırmızıdır. Glikozun anaerobik kullanımını tespit etmek için uygulanan test karbohidrat olarak mannitolün besiyerinde kullanımı ile tekrar edilir. S. aureus suşlarının büyük çoğunluğu mannitolü anaerobik koşullarda kullanmaktadır. Gıda mikrobiyolojisini doğrudan ve dolaylı olarak ilgilendiren 2 tür stafilokok ile mikrokokların tipik reaksiyonları çizelge 1' de verilmiştir. Çizelge 1. S. aureus, S. epidermidis ve Mikrokokların Biyokimyasal Karakterleri Biyokimyasal Test S. aureus S. epidermidis Micrococci Katalaz aktivitesi Koagülaz Üretimi Termonükleaz Üretimi Glikozun anaerobik kullanımı Mannitolün anaerobik kullanımı Lateks Testi ile Hızlı İdentifikasyon S. aureus 'un standart yöntemle tanımlanmasında sadece glikoz testinin 5 gün sürmesi, bu testin yapılabilmesi için nutrient broth, brain hearth infusion aşamalarından geçmesi de dahil edildiğinde toplam identifikasyon süresinin 7 gün olması bu yöntemin rutin gıda kontrolleri ve özellikle uluslararası ticarette kullanılma olanağını tümüyle ortadan kaldırmaktadır. Diğer gıda patojenlerinde olduğu gibi S. aureus 'ta da identifikasyon amacı ile pek çok hızlı yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler giderek standart olarak uluslararası kontrol kuruluşları tarafından da benimsenmeye başlamıştır. Bu gibi hızlı testler bu tip kuruluşlar tarafından benimsense dahi standartların ve/veya resmi analiz yöntemlerinin sık olarak yenilenmemesi ve yayımlanmaması nedenleri ile özellikle uluslararası ticarette anlaşmazlık olduğunda geçerli olarak kabul edilmemekte ya da mahkemeler çok uzun sürelerde sonuçlanmaktadır. Bununla beraber, bu gibi hızlı analiz yöntemleri en azından işletme içi rutin gıda kontrollerinde ve önceden yöntem üzerinde anlaşma yapmak kaydı ile ulusal ve uluslararası ticarette yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu çerçevede aşağıda koagulaz pozitif S. aureus 'un lateks testi ile hızlı tanımlaması için örnek verilmiştir. Bu test farklı ticari firmalar tarafından hazır preparat olarak pazarlanmaktadır. Bu gibi hızlı testlere geçmeden önce S. aureus olduğu tahmin edilen koloniye Gram boyama ve katalaz testleri uygulanması önerilmektedir. Koloninin 4 'e bölünerek sırası ile Gram boyama, katalaz testi, kontrol ve test çözeltilerine karşı lateks koagulaz testi uygulanması oldukça yüksek deneyim ve disiplin isteyen bir uygulamadır. Bu testler için şüpheli koloninin izole edilmesi, 1 ml steril serum fizyolojik gibi uygun bir ortamda çözülmesi ve bunun nutrient agar gibi selektif olmayan basit veya Baird-Parker agar gibi S. aureus için selektif bir besiyerine sürülüp o C 'da 24 saat inkübasyon sonunda saf olduğu kontrol edilen kültüre ait kolonilerin ayrı olarak söz konusu testlere alınması daha doğru olmakla beraber bu uygulama şekli hızlı test kavramı ile bağdaşmamaktadır. Bu durumda Baird-Parker (ya da diğer selektif katı) besiyerlerinde gelişebilen tipik kolonilerin selektif inhibitörler nedeni ile zaten Gram pozitif ve katalaz pozitif olacağı kabul edilerek lateks 4

5 testinde doğrudan koloniyi ikiye bölerek, aynı koloniyi hem kontrol hem de test çözeltileri ile denemek yaygın olarak kullanılan ve oldukça yüksek düzeyde doğru olarak kabul edilen bir uygulamadır. Hızlı test kiti ile S. aureus 'un belirlenmesi amacıyla test kartının ilgili bölmelerine oda sıcaklığında olmak kaydı ile 1 'er damla test çözeltisi ve kontrol çözeltisi damlatılır. Damlatma işleminden önce çözeltiler iyice çalkalanmalıdır. Şüpheli koloninin yarısı test alanında, diğer yarısı kontrol alanında olmak üzere damlanın kenarından başlayarak iyice süspanse edilir. Test kartı sağa sola ve öne arkaya eğilerek aglütinasyon izlenir. Birkaç saniye içinde test alanında aglütinasyon gözleniyor, kontrol alanında aglütinasyon gözlenmiyor ise sonuç şüpheli koloninin S. aureus olduğunu gösterir. Her iki alanda aglütinasyon yok ise koloni S. aureus değildir. Test alanındaki sonuç ne olursa olsun, kontrol alanında aglütinasyon var ise sonuç geçersizdir, test tekrarlanmalıdır. 02. Gelişmiş ve Hızlı Analiz Yöntemleri S. aureus, RiboPrinter (Qualicon) mikrobiyel karakterizasyon sistemi ile saat içinde belirlenebilmektedir. Bu sistem temel olarak genetik parmak izi yöntemini kullanmaktadır. EcoRI restriksiyon enzimi ile kesilen kromozomal DNA fragmentleri boyutlarına göre ayrılıp, işaretli rrna operon probları ile hibridize olur. S. aureus 'un bilgisayar ortamında kayıtlı 252 referans marker fragmenti izolattan elde edilen fragment ile karşılaştırılarak izolatın S. aureus olup olmadığı belirlenir. 03. Toksin Testleri Gıdalarda koagulaz ve/veya termonukleaz pozitif S. aureus varlığı veya tehlikeli olabilecek düzeyde sayısı belirlense dahi bu bulgu gıdanın mutlaka tehlikeli olduğu anlamına gelememektedir. Bakteri varlığı ile toksin salgılama arasındaki ilişki en azından gıdanın bileşimi ve başta sıcaklık olmak üzere korunduğu ortam koşullarına bağlılık nedeni ile tam olarak belirsizdir. Tersine ve çok daha önemli olarak analiz edilen gıdada koagulaz ve/veya termonukleaz pozitif S. aureus 'a rastlanmamış olması da analiz edilen gıdanın stafilokokal toksinler açısından tehlikeli olmadığını göstermez. Yukarıda belirtildiği gibi S. aureus gıdaların işlenmesi sırasında uygulanan başta ısıl işlem olmak üzere pek çok temel işlem ile ortadan kaldırılmaktadır ancak en azından oluşturduğu toksinler 100 o C 'da 30 dakika ısıl işlem uygulamasında tümüyle tahrip olmamaktadır. Bu durumda örneğin, mastitisli bir hayvanın sütünde bol miktarda bulunan ya da sağım sırasında sağıcıdan bulaşan ve toksin oluşturma yeteneğindeki S. aureus suşları yetersiz soğutma nedeni ile stafilokokal toksinleri oluşturduktan sonra bu süt pastörize edilse bile S. aureus hücreleri ölecek ancak daha önce oluşturdukları toksin biyolojik stabilitesini koruyacaktır. Bu durumda enterotoksin oluşturan mikroorganizmaların enfeksiyon tipi gıda zehirlenmesine neden olanlar gibi gıdalarda aranmasının/sayılmasının pratik bir önemi yoktur. Dolayısı ile, gıdanın stafilokokal toksinler açısından güvenliği bu toksinleri oluşturan bakterilerin varlığı ve/veya sayısı ile değil, doğrudan bu toksinlerin analizi ile mümkündür. Benzer şekilde gıdalarda mikotoksin oluşturan küflerin, Clostridium botulinum 'un varlığı/sayısı önemli değildir. Nitekim yaygın analiz şekli ile gıdalarda mikotoksijenik küfler ve Cl. botulinum ile S. aureus aranması yerine doğrudan toksin testleri daha anlamlı olmak üzere giderek daha fazla önem kazanmaktadır. 5

6 S. aureus toksinleri immunolojik analiz yöntemleri ile belirlenmektedir. Bu yöntemlerde tüm toksinler değil, gıdalarda en yaygın bulunan A, B, C, D, E tipleri analiz edilir. Bununla birlikte E tipinin analiz edilmediği sistemler de vardır. Gıdalarda immunolojik yöntemlerle stafilokokal toksinlerin analizinde analiz duyarlığı genel olarak 1 ng/ml düzeyinde ve oldukça hassas görülmekle beraber, sahte negatif ve sahte pozitif sonuçlar da alınabilmektedir. Enstrümantal analizler bugün için istenilen duyarlığa erişememektedir. Bununla beraber bu analiz yöntemlerinin tam otomatize edilmesi ve aflatoksin analizinde olduğu gibi enstrümantal analiz cihazlarının da desteği ile yakın gelecekte daha sağlıklı sonuçlar alınması beklenmektedir. Gıdalarda bulunan düşük miktarlardaki stafilokok enterotoksinlerinin belirlenmesi için öncelikle toksin ekstraktı elde edilir. Bu ekstraksiyon işlemi santrifüj ve/veya filitrasyon ile yapılabildiği gibi, iyon değiştirici reçinelerde toksinin selektif adsorbsiyonu yöntemi de kullanılmaktadır. Ekstrakt daha sonra farklı immunolojik yöntemlerle analiz edilir. Bu amaçla ters pasif lateks aglutinasyon, enzimle bağlı immunofloresan analiz ve sandwich ELISA yöntemleri kullanılmaktadır. 6