YAYMA TEKNİKLER. KLERİ VE DEĞERLEND Ziehl-Neelsen. Boyaması

Transkript

1 YAYMA TEKNİKLER KLERİ VE DEĞERLEND ERLENDİRİLMESİ Ziehl-Neelsen Boyaması DR. NEVİN N SARIGÜZEL SAR

2 Aside dirençli boyama, mikobakterilerin lipitten zengin hücre h duvarlarının boyanması ve renk giderici ajan asit alkolle boyayı bırakmaması esasına dayanır. Direk mikroskobi ile görülebilmesi g için i in balgamın n her ml de 5 bin ile 10 bin basil bulunması gereklidir.

3 Aside dirençli boyama : 1) Erken tanıda, 2) KültK ltürden elde edilen mikroorganizmanın aside dirençli yapısını doğrulamada, 3) Tedavinin etkinliğini ini izlemede ve 4) Direk duyarlılık k testinde, örneğin uygun dilüsyonunun hazırlanmas rlanmasında. nda.

4 TB tanısında nda ARB Mikroskopi Esas değeri; eri; Hızı Özgüllüğü oldukça a yüksek y Ana dezavantajı; Duyarlılığı ığı değişken Oldukça a yüksek y oranda doğru tanı; Paramedikal personel yapabilir Basit ve mevcut ekipman kullanımı

5 ARB özgüllüğü % 99 un üzerindedir.

6 TB da ARB pozitif yaymaların özgüllüğü Referans,ülke HIV+ ARB pozitif, TB değil Long, Haiti, % 4/199 hasta (2/2 HIV+/-) Githui,, Kenya, % 0/320 hasta Warndorff, Malawi, 1997 >50%? 2/904 hasta (1/1 HIV+/-) Van Deun, Bangladesh, 2001 <1% 3/1065 hasta

7 ARB duyarlılığı ığı %22-80 arasında değişmektedir.

8 Duyarlılığı ığı etkileyen faktörler; Örneğin tipi, Enfekte eden mikobakteri türü, Dekontaminasyon ve konsantrasyon işleminin etkisi, Boyama tipi, Yaymanın n kalınl nlığı,

9 Duyarlılığı ığı etkileyen faktörler; Hastalığı ığın prevalansı ve ağıa ğırlığı, Toplanan materyalin kalitesi, Örnekte mevcut mikobakterinin miktarı, Direk veya konsantre hazırlan rlanıp hazırlanmad rlanmadığı, Yaymayı inceleyen laboratuvar personelinin deneyimi.

10 2630 balgam örneğinde yapılan çalışmada, her 100 alanda en az 10 basil varsa Z-N Z ve florokrom boyamanın n duyarlılıklar klarının benzer, her 100 alanda 10 dan daha az basil varsa florokrom boyama duyarlılığı ığının daha yüksek y olduğu; u;

11 bir yaymayı negatif olarak raporlamadan önce gerekli ortalama zaman Ziehl- Neelsen boyama ile 7 dakika 44 saniye, aynı büyütmede florokrom mikroskobi ile 3 dakika 34 saniye olduğu u gösterilmig sterilmiştir. tir. Ba F ve ark.int J Tuberc Lung Dis, 1999; 3(12):

12 Tek başı şına akut inflamatuar eksuda veya seyrek granülom gibi bakteri yükünün n yüksek y olduğu u durumlarda Ziehl-Neelsen boyama ile ARB pozitifliğinin inin florokrom boyama kadar iyi olduğu u gösterilmig sterilmiştir. tir. Kumar N ve ark. Cytopathology,, 1998; 9(3):

13 Doku örneklerinde Real time PCR ile karşı şılaştırmalı yapılan çalışmada, formalin ve ksilenin ve ayrıca tek başı şına % 10 formalinle yapılan muamelenin de mikobakterilerin aside dirençli boyanmalarını azalttığı gösterilmiştir. tir. Fukunaga H ve ark. Am J Respir Crit Care Med,, 2002;166:

14 Saceanu ve ark. sitosantrifüj kullanılarak larak Kinyoun boyama ile ARB duyarlılığı ığının n % 100 e e ulaştığı ığını bildirmişlerdir. lerdir. Saceanu CA ve ark.j Clin Microbiol 1993; 31:

15 Woods sadece ARB boyama için i in sitosantrifüjü tavsiye etmemekte; ancak sitosantrifüj mevcutsa, konsantre örneklerden yayma hazırlanmas rlanması istenmişse se sitosantrifüj kullanımını önermektedir. Woods GL. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. Infect Dis Clin North Am,, 2002; 16(1):

16 3486 balgam örneğinde, Tüm örnekler volüm m dikkate alınmadan yapılan muayenede duyarlılık k % 72.5; >= 5 ml balgam miktarı ile yapılan incelemede ARB duyarlılığı ığı % 92 saptanmış ıştır. Warren J ve ark. Am J Respir. Crit Care Med. Volume 161, 5. May 2000,

17 Kinyoun s karbol fuksin metodunun ZN metoduna göre g duyarlılığı ığının n düşük d olduğu u saptanmış ıştır. Duyarlılığı ığın karbol fuksin konsantrasyonu, boyama ve zıt z t boyama zamanı ve asid alkol konsantrasyonu ile anlamlı olarak etkilendiği i gösterilmig sterilmiştir. tir.

18 Standart prosedürler rler uygulanırsa ZN ve florokrom metodlarının duyarlılık k ve özgüllüğünün n yakın n olduğu u gösterilmig sterilmiştir. tir. Somoskövi ve ark. Chest 2001;120:

19 Cetylpyridiniumchloride de saklanan balgam örneklerinde ZN metodu ile ARB tayininin anlamlı olarak azaldığı gösterilmiştir. tir. Selvakumar N ve ark. Int J Tuberc Lung Dis Feb;8(2):248 ;8(2):

20 Seri yayma incelemelerinde, ilk yaymada % ikinci yaymada % 10-14, 14, üçünc ncü yaymada % 5-85 artan oranlarda ARB pozitifliği i saptanacaktır.

21 Seri yayma örneklerinde pozitiflik yüzdesiy Referans/ülke 1.yaymada 2. yaymada 3. yaymada pozitiflik % artma % artma % Andrews, Hind % 18 % 3 % Blair,, ABD % 10 % 9 % Urbanczik,, % % % Ipuge,, Tanzanya % 9 % 3 % Harries, Malawi % 13 % 4 % Finch,, ABD 1997 HIV - 89 % 10 % 1 % HIV + 79 % 21 % - Nelson, ABD % 15 % 8 % Salim, Bangladeş % 14 % 1 % Van Deun, Bangl % 4 % 1 %

22 Mikobakterilerin aside dirençli yapısı birkaç metotla tayin edilir: Karbolfuksin metodu ( Ziehl-Neelsen Neelsen, Kinyoun) Florokrom metodu (auramine( O, auramine- rhodamine)

23

24 Herhangi tip klinik materyal veya mikobakteri kültüründen elde edilen mikroorganizmalar inceleme örneği i olabilir. Tüm örneklere biolojik güvenlik kabininde işlem i uygulanmalıdır. Her örnekten birkaç yayma hazırlamak en iyisidir.

25 Yoğunla unlaştırılmış örneklerde çökünt ntüden, yoğunla unlaştırılmamış örneklerde kanlı veya nekrotik materyalden yayma hazırlan rlanır. r.

26 Yoğunla unlaştırılmış örneklerde çökünt ntüden, yoğunla unlaştırılmamış örneklerde kanlı veya nekrotik materyalden yayma hazırlan rlanır. r. Örnek lam üzerine bir para boyutunda (1.5 x 1.5 cm boyutlarında ) yayılır.

27 Yaymanın n kalınl nlığının n kontrol edilmesi

28 Çok kalın n yayma Doğru yayma Çok ince yayma

29 Yaymanın n boyutu Çok b ok büyük Çok küçük üçük k Birden fazla Doğru

30 Lam üzerine birden fazla yayma yapılmamal lmamalı. Yayma biolojik güvenlik kabininde havada kurutulur.

31 Yayılm lmış materyal şu u yöntemlerden y biri ile lama tesbit edilir: 1) Elektrikli lam ısıtıcısında, 2) Bek in mavi alevinde, 3) Saf metanol içeren bir kavanozda. * Isı ile tesbit etme tüm t mikobakterileri öldürmeyebilir.

32 Her boyamada kontrol lamı bulunmalıdır. * Negatif kontrol; Nocardia asteriodes ATCC 3308 * Pozitif kontrol; Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC E. coli ve M. kansasii gibi daha az patojenik organizmalar da kullanılabilir. labilir.

33 Karbolfuksin boyamada, Mycobacterium türleri kırmk rmızı veya morumsu kırmk rmızı renkte; N. asteriodes veya E.coli mavi veya yeşil renkte görülür. g r.

34 Kabul edilemez kontrol lamları şunlardır: r: Karbolfuksin boyamada, 1- Pozitif kontrol kırmk rmızı boyalı değil ise, 2- Negatif kontrol renk giderme işleminden i sonra kırmk rmızı kalmakta ise, 3- Zeminin rengi yeterince giderilememiş ise,

35 Kontrol lamlarında, Problem görüldg ldüğü zaman hasta lamları ve bir kontrol lam yeniden boyanmalıdır.

36 Boyama Teknikleri: A. Ziehl-Neelsen (sıcak karbolfuksin) ) boyama:. Lam Ziehl-Neelsen karbolfuksin ile kaplanır.. Lam alttan 3-53 dakika ısıtılır.

37 Ziehl-Neelsen (sıcak karbolfuksin) boyama:. Lam soğuduktan sonra sudan geçirilir.. % 3 asit alkolle renk giderilir.. Lam suyla yıkany kanır.. Metilen mavisi ile saniye boyanır.

38 Ziehl-Neelsen (sıcak karbolfuksin) boyama:. Lam suyla yıkany kanır.. Havada kurutulur.

39 B. Kinyoun karbolfuksin(so (soğuk karbolfuksin) boyama: Ziehl-Neelsen boyamadan tek farkı lamın ısıtılmamasıdır.

40 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri

41 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri Lam yağlı ise Lam çizik ise

42 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri Yayma kaynatılırsa Islak yayma fikse edilirse

43 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri Fazla ısıtılırsa Doğru yayma

44 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri Renk giderme işlemi i Zıt Z t boyama süresi s yetersiz olduğu u zaman aştığıa zaman

45 Boyalı iyi yayma ve kötük yayma örnekleri Uygun yayma

46 Karbolfuksin boyalı yaymalar 100x lük immersiyonlu objektif ile (1000x büyütme) b incelenir.

47 Yaymayı negatif olarak raporlamadan önce minimum 300 alan incelenmeli (Yaymanın n uzun kenarı boyunca 3, kısa k kenarı boyunca 9 paralel alan incelenmesi ile)

48 Aside dirençli artefaklar yaymada olabildiğinden inden hücre morfolojisini dikkatli izlemek gereklidir. Karbolfuksin boyamada, kırmk rmızı renkte, μm m uzunluğunda unda μm m genişli liğinde inde ince, çubuk şeklinde görülür, g r, eğik e veya kıvrk vrık k olabilir.

49

50

51

52 Artefaklar Fenol kristalleri Doku lifleri Debris

53 Boyama sonuçlar ları 24 saat içinde i inde bildirilmelidir. Tüm m yaymada sadece basil görülürse g rse raporlanmamalıdır. r. Başka yaymaları,m,mümkünse yeni bir örnekten hazırlanan yaymaları inceleyerek doğrulanmal rulanmalıdır. r.

54 Raporda boyanma yöntemi y belirtilir ve pozitiflik niceliksel olarak bildirilir.

55 RAPOR Görülen ARB miktarı Fuksin boya 1000 X Florokrom boya 250 X 450 X Negatif Şüpheli, tekrar 1-2/300 alan 1-2/30 alan 1-2/70 alan /100 alan 1-9/10 alan 2-18/50 alan /10 alan 1-9/1 alan 4-36/10 alan /1 alan 10-90/1 alan 4-36/1 alan 4+ >9/1 alan >90/1 alan >36/1 alan

56 ARB nin okunduğu ARB nin pozitif bulunduğu u yayma oranı,, niceliksel alan miktarı gruplandırarak rarak IUATLD/WHO <1 ARB/ ARB/ pozitif 100 alan 100 alan n (enaz( 1/10 alan) n=64 n=512 2 n= alan 48.4 % 83.2 % 99.6 % 200 alan 68.7 % 94.1 % 99.9 % 300 alan 89.1 % 99.2 % 100 % >300 alan 100 % 100 %

57 Yanlış pozitif yayma nedenleri: 1- Su ve su depoları, 2- Boyama kavanozları veya tabakları, 3- İmmersiyon yağı ile.

58 ÜLKEMİZDE TÜBERKT BERKÜLOZ LABORATUVARLARININ DURUMU ( 2000, 2002,, 2005 ve 2007 ANKET SONUÇLARI LARININ KARŞILA ILAŞTIRILMASI) Türk Klinik Mikrobiyoloji Derneği Tüberküloz Çalışma Grubu

59 ANKET FORMUNA YANIT VEREN KURUMLAR Üniversite Hastaneleri Mik.. ve Kl. Mik.. ABD/ Merkez Laboratuvarı GHH Lab S.B. EAH Lab BTL TOPLAM

60 2000 % 2002% 2005% 2007 % Mikroskobik inceleme EZN boyama yöntemi y Kinyoun boyama yöntemi y 6 7 EZN+ Kinyoun / Florokrom Kantitatif sonuç bildirimi Poz-neg neg.. sonuç bildirimi 41 32