NİPT DE TEKNİK PROBLEMLERE YAKLAŞIM (TEPECİK GHTM UYGULAMA DENEYİMİ)

Transkript

1 NİPT DE TEKNİK PROBLEMLERE YAKLAŞIM (TEPECİK GHTM UYGULAMA DENEYİMİ) Uzm. Dr. Özge ÖZER KAYA

2 TARİHÇE Maternal plazmada fetal DNA'nın varlığı ilk olarak 1997'de Y kromozomuna özgü DNA sekanslarını tanımlamak için konvansiyonel polimeraz zincir reaksiyon teknikleri kullanılarak bildirilmiştir Fetal DNA nın plasenta kaynaklı ve anne kanında parçalanmış şekilde bulunduğu anlaşıldı Fetal DNA, doğumu takip eden saatler içerisinde anne kanından kayboluyordu İlk rutine yönelik ticari uygulama 2011 Bu zamana kadar anöploidi için tarama testleri maternal serum ve USG ile sınırlı (%5 yanlış pozitiflik, %50-95 saptama)

3 GENEL BİLGİLER Plazmadaki serbest DNA nın çoğunluğu, hücre döngüsü sırasında DNA parçalarını serbest bırakan hematopoetik hücrelerden türetilmiştir (nadiren solid organlar) Gebe olmayan durumda, plazmadaki serbest DNA nın genomik profili, bireyin karyotipini yansıtır Hamilelik sırasında, plasentadan kaynaklanan hücre dışı fetal DNA da maternal plazmada bulunulur Bu DNA kromozomal veya genetik anormallikleri tespit etmek için kullanılabilir Fetal fraksiyon (yani, plasenta kaynaklı hücre dışı fetal DNA nın toplam plazma Dna sına oranı) gestasyonel yaşla birlikte artar, ancak 10 haftalık gebeliğin başlangıcında güvenilir bir şekilde% 10'dan daha büyüktür. Güvenilir analiz için özellikle% 4'ten büyük fetal fraksiyon gereklidir Kullanılan genel terim «Hücre Dışı Fetal DNA»; Plesantal genomu temsil ettiği unutulmamalı

4 KILAVUZLAR (ACOG-SMFM-ACMG) Doğumdaki yaşın 35 yaş ve üstü olduğu gebelikler Anöploidi riskinin arttığına işaret eden USG bulgusu Pozitif 1. ya da 2. trimester tarama testi bulgusu Önceki gebeliklerde trizomi öyküsü 21 ve 13. Kromozomları içeren parental translokasyon taşıyıcılığı!!! Ortak görüş ikiz gebeliklerde uygulanmaması

5 «NIPS ne yapmaz?» Tek gen hastalıklarını taramaz Geç gebelik komplikasyonlarını göstermez Nöral tüp defektlerini tespit edemez FAT yerine geçmez

6 Tarama testinden beklentiler Analitik geçerlilik (Analitik duyarlılık ve özgüllük) Klinik geçerlilik (saptama oranı) Klinik yarar (hasta, sağlayıcı ve sosyal kurumlar) (PPV, NPV) (mutlaka belirtilmeli)

7 PREDİKTİF DEĞER PPV: Pozitif verilen sonucun, gerçek pozitif olma ihtimalidir (yalnızca pozitif çıkan hastalarda belirtilir) NPV: Negatif verilen sonucun, gerçek negatif olma ihtimalidir PPV değeri hesaplanırken, anne adayının yaşındaki, 16. gebelik haftasındaki trizomi prevalansı ve kullanılan testin 1900 örneklik validasyon çalışmasında elde edilen aşağıdaki sensitivite ve spesifite değerlerinden yararlanılmıştır. Sensitivite (Duyarlılık) Spesifite (Özgüllük) Kromozom 21 %100 (54/54) %99.94 (1573/1574) Kromozom 18 %95 (19/20) %100 (1626/1626) Kromozom 13 %100 (4/4) %99.88 (1604/1606) PPV hesaplanırken

8 Diğer otozomal kromozomlar için tarama önerilmiyor Sonuç verilemediği durumlarda (uygun gebelik haftasında alındıysa) invaziv tanı önerilmeli Obez hastalarda invaziv tanı önerilmeli Fetal fraksiyon raporlarda yer almalı Sonuç verilemeyen durumlarda nedeni raporlarda belirtilmeli SNP ya da array temelli sistemlerde uzun homozigotluklarda UPD akla gelmeli

9 YÖNTEMLER-1 Masif paralel sekans Random veya shotgun Milyonlarca DNA molekülü analiz edilir Mikrodelesyon ve duplikasyonların tespiti Targeted sekans Daha önce seçilmiş fragmanların zenginleştirilmesi Daha uygun ve hızlı Okuma sayısı daha az

10 YÖNTEMLER-2 Her bir kromozomdan beklenen sayımın standart sapmasını hesaplar ve her bir kromozom için bir z-skoru belirlenir Hasta örneğindeki 21. kromozomdan alınan DNA fragmanlarının sayısı beklenenden 3 standart sapmadan daha fazla ise (yani, z-skoru> 3), bu durum trizomi 21 için yüksek riskli bir sonuç olarak kabul edilir

11 TEPECİK EAH İŞ AKIŞI Perinatoloji Kliniğinin belirlediği kriterlere göre hasta seçimi yapılarak tanı merkezimize istem formu ile hasta konsülte edilir Test öncesi danışmanlık ve aydınlatılmış onam formu 3 hafta raporlama süresi Test sonrası danışmanlık

12

13

14 ORTA RİSK GRUBU İLE ÇALIŞMAK İlk testlerin yapıldığı gebelerde invaziv tanı ile paralel gitmek, hastalarımızı korumak ve sistemi test etmek açısından önemli (ilk 100 hasta) Belirsiz sonuç verilen hastaları invaziv tanıya yönlendirmek gerekiyor İnvazivliğin artma riski! Yüksek riskli grupta SDT konvansiyonel tarama testlerine göre, daha verimli (cost effective), devlet ödemeleri yüksek risk grubunu hedefliyor

15 Ocak Nisan 2018 Toplam: 4989 hasta

16 İŞ AKIŞI Test (Targeted) Plazma izolasyonu, cfdna ekstraksiyonu 2 PCR, 2 Purifikasyon, 8-10 saat dizileme 4000 lokus/snp 2400: 13, 18, 21, X için 600 er bölge 1600: Referans 4 otozomal kromozom için 400 er bölge 12 hasta/koşum (MiSeq) (311 koşum) 60 hasta/koşum (NextSeq) (35 koşum)

17

18

19 RAPOR ÖRNEKLERİ

20

21 TEST BAŞARISIZLIĞI NİPT için alınan örneklerin bir kısmında sonuç elde edilemiyor Çok büyük çoğunlukla sebep düşük fetal fraksiyon Tekrar örnekleme ile hastaların yarısında başarılı sonuç elde ediliyor Test öncesi danışmanlık önemli

22 Trizomi 21 belirsiz 3% Trizomi 18 belirsiz 3% Trizomi 13 0% Trizomi 21 1% Trizomi 18 0% Trizomi 13 belirsiz 6% Rapor verilemeyen 11% Negatif 76% Trizomi 13 Trizomi 21 Trizomi 18 Negatif Rapor verilemeyen Trizomi 13 belirsiz Trizomi 21 belirsiz Trizomi 18 belirsiz

23 SONUÇLAR Hasta Rapor Sayısı: Normal (%76) oyalancı negatif T21: 1 oyalancı negatif T18: 1 Trizomik: 42 (%1) ot21: 23 (PPV %80) ot13: 12 ot18: 7 Sonuç Verilemeyen Hastalar: %11 23

24 MATERNAL BİYOLOJİNİN ETKİSİ Maternal obezite Obezite sistemik inflamatuar yanıta ve artmış hücre döngüsüne sebep olur Adipoz doku hücrelerinde apopitoz ve nekroz daha fazla Böylece maternal kökenli hücre dışı DNA artar Bizim hasta grubumuzda VKİ FF < %4 >35 %30,5 >30 %19,7 Genel %11,

25 MATERNAL BİYOLOJİNİN ETKİSİ FF arttıran durumlar FF azaltan durumlar FF etkilemeyen durumlar Gebelik haftası Maternal boy Maternal yaş CRL ölçümü Maternal VKİ Fetal cinsiyet PaPP-A Maternal kan hacmi NT ölçümü Beta-hCG Multiple gebelik Maternal diabetes mellitus Fetal Trizomi 21 Fetal mozaiklik Hipertroidizm Fetal trizomi 13,18 Triploid gebelik Maternal Hipertansiyon

26 TRIPLE X ANNE

27 TRİPLOİD FETUS

28 OLASI TEKNİK PROBLEMLER-1 Kan Alma Prosedürü: Streck tüplerin 9 ml in altında doldurulması. Kan alındıktan sonra tüplerin nazikçe çevrilmemesi. Kanların ve Streck tüplerin oda ısısında tutulmaması. (Uçak kargo ile gelen kanlar da buraya dahil)

29 OLASI TEKNİK PROBLEMLER-2 Plazma ve DNA izolasyonu: İzolasyonun 48 saat içinde yapılmaması Plazma-buffy coat ayrımının berrak olmaması (santrifüj- rotor) Hemoliz olan kanlar Aynı sete girecek hasta plazmalarının aynı DNA izolasyonu setinden çıkmaması cfdna consantrsyonunun 0,75 mg/ul den(0,9) fazla olması => genomik DNA kontaminasyonu (Hasta grubumuzda tekrarlarda başarı %53,2) cfdna nın degrade olması => rejected örnekler

30

31

32 OLASI TEKNİK PROBLEMLER-3 PCR basamakları: Aynı sete girecek hastaların aynı PCR setlerinden çıkmaması. Vortexleme işleminin iyi yapılmaması. PCR cihazının ısı dengesi tüm kuyucuklara aynı ısı gitmesi için PCR plate i tam ortaya gelecek şekilde yerleştiriyoruz. Plate kapaklarının tam kapanmaması buharlaşma ve ürün kaybı sorunu

33

34 OLASI TEKNİK PROBLEMLER-4 Kütüphane Hazırlama Basamakları: Agaroz jelde gözlenen çift bantlı örnekler => primer dimer? PCR amplifikasyonu? Qubit ölçümlerinin yanlış yapılması => bazı örneklerin 2M un altında kalması Aynı koşuma girecek örneklerin indeksleme basamaklarının birbiri ile aynı olacak şekilde yapılması

35

36 OLASI TEKNİK PROBLEMLER-5 Sekans basamağı: Final konsantrasyonun ayarlanamaması Overcluster problemi Reagent kit sorunları Cihaz problemleri

37

38

39 TEŞEKKÜRLER