MATERNAL PLAZMADAN SERBEST FETAL DNA ANALİZLERİ İLE ANÖPLOİDİLERİN PRENATAL TANISI

Transkript

1 MATERNAL PLAZMADAN SERBEST FETAL DNA ANALİZLERİ İLE ANÖPLOİDİLERİN PRENATAL TANISI Prof. Dr. Seher Başaran İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik ABD

2 Trizomi 21 Live born infants in relation to maternal age in Switzerland Trizomi 18 Trizomi 13 Turner s Triploidi s Trizomi 21 Turner s Trizomi 18 Trizomi 13 Triploidi s KH Nicolaides, NJ Sebire, RJM Snijders BEVNAT, BFS

3 Fetal kromozom anomalilerinin prenatal tanısı TARAMA Testleri; 1. USG; NT ve diğer markerler 2. MS-Tarama Testleri; Üçlü test, Dörtlü test hafta testi Bunların kombinasyonları 3. MS- fetal DNA/RNA analizleri ile anöploidi -Kantitatif yöntemler- TANI Testleri; 1. İnvaziv Girişim (AS,CVS, KS) sonrası fetal kromozom analizi FISH/QF-PCR (anöploidi) mikroarray/a-cgh (2. Non-invaziv Yöntem MS- fetal DNA/RNA analizleri ile fetal cinsiyet ve paternal mutasyonun araştırılması - Kalitatif yöntemler-)

4 Tarama testleri ve duyarlılıkları İAY ile DS Yakalama Oranı ÜT ile DS Yakalama Oranı < 35 yaş 70% > 35 yaş 30% ÜT riski <1:250 40% ÜT riski >1:250 60% NT ile DS Yakalama Oranı 1. TTT ile DS Yakalama Oranı NT normal 25% 1. TTT <1:300 18% NT 75% 1. TTT >1:300 82%

5 Tri 21 prevalansı 1: Tri 21 doğumu için gebelik Anne yaşı (>35)% AS 30x Tri DS lu doğacak Üçlü test % AS 60x Tri DS lu doğacak NT % AS 75x Tri DS lu doğacak 1.Tri tarama % AS >90x Tri 21 <10 DS lu doğacak + USG diğer biokimyasal ve ultrasonografik (burun kökü hipoplazisi, vd) parametrelerin kullanımı ile duyarlılık artmakta Amaç, daha az girişim yaparak daha geniş bir populasyona ulaşmak ve daha fazla anomali yakalamak.

6 80 ler ve 90 lar anne dolaşımından fetal hücre avı ile geçti. Anne kan dolaşımında fetal hücreler (T21) 1: yıl 2012 ve Anne karaciğerinde fetal erkek hücreler Anne beyninde fetal erkek hücreler

7 PLAZMADA EKSTRASELLÜLER DNA larda insanda plazmada ekstraselluler DNA bildirildi, larda kanser hastalarının plazmalarından elde edilen serbest DNA da tümör kökenli genetik markerler saptandı, de erkek çocuğa gebe olan kadınların plazmalarında fetusun Y kromozomuna ait markerler gösterildi (Lo et al., 1997).

8

9 Maternal Plazmada Dolaşan Fetal DNA nın Biyolojik Özellikleri -Serbest dolaşımdaki fdna nın % 80 i <200 bp küçük parçalar halinde bulunur ve plazmadaki tüm DNA nın % 3-10 unu oluşturur, -Implantasyonu takip eden 18 inci günden itibaren maternal serumda saptanmaya başlanır ve gebelik ilerledikçe miktarı artar, -Gebelik bittikten sonra, yarı ömrü 16 dakikadır, -Genel görüş, fdna nın maternal plazmada kalıcı olmadığıdır; ancak bir yayın fetal DNA nın uzun süre (27 yıl) maternal kanda saptanabildiğini öngörmekte ve bu durum bazı fetal hücrelerin maternal yapıda uzun yaşadığı ve plazma ayrıştırması esnasında tüm nükleuslu hücrelerin iyi uzaklaştırılamaması ile açıklanmaktadır, -fdna, ağırlıklı olarak plasenta kaynaklı olduğundan, plasentaya ait özellikleri (plasenta ile sınırlı mozaisizm, plasental epigenetik özellikler, vs) de yansıtacaktır.

10 KLİNİK UYGULAMALAR Maternal kandan alınan plazma örneğinde tüm hücre yapılarının uzaklaştırılması DNA nın ekstraksiyonu (Minör oranda fetal DNA+Major oranda maternal DNA) Kalitatif Yöntemler; Maternal ve fetal DNA polimorfizm/değişimlerini tanır TANI Kantitatif Yöntemler; Normal ile karşılaştırma esasına göre tanır TARAMA

11 Kalitatif yöntemle PATERNAL mutasyonun fetusta TANISI;

12 Kantitatif Yöntem; ÖPLOİD FETUSTA BULGULAR Başlangıçtaki DNA Havuzu Kromozom Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom Anne ye ait DNA fragmanları Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon 1 : 1 : 1 Fetusa ait DNA fragmanları İncelenen tüm AMPLİKONLARIN oranı eşit

13 Kantitatif Yöntem; ANÖPLOİD FETUSTA BULGULAR Başlangıçtaki DNA Havuzu Kromozom Amplifikasyon sonrası DNA Havuzu Kromozom Anne ye ait DNA fragmanları Yeni nesil dizileme ile amplifikasyon Fetusa ait DNA fragmanları 1 : 1 : 1,1 21. Kromozom AMPLİKONLARINDA artış

14

15 Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States Ashwin Agarwal, Lauren C. Sayres, Mildred K. Cho, Robert Cook-Deegan, and Subhashini Chandrasekharan Prenatal Diagnosis 2013, 33,

16 Noninvasive prenatal testing for aneuploidy ready for prime time? Lyn S. Chitty, Melissa Hill, Helen White, David Wright, Stephen Morris, American Journal of Obstetrics & Gynecology, APRIL 2012

17

18 Firma Son yayın Test adı Sequenom Palomaki, 2011 ve 2012 Materni21 Materni21plus Verinata Bianchi, 2012 Ariosa Norton, 2012 Nicolaides, 2012 Teknik MP shotgun S MPSS DANSRtargeted Hedef Anomaliler 21, 18, 13, X, Y Plus +DGS,5p-, 1p36 -, PW/AS Natera Zimmermann, 2012 Nicolaides, 2013 BGI Jiang, 2012 Verifi Harmony Panorama NIFTY 21, 18, 13, X, Y 21, 18, 13 X,Y NGS -SNP basedtargeted 21, 18, 13, X, Y, triploidi MPSS 21, 18, 13, X, Y Olgu sayısı Duyarlılığı T21 %99,1 T18 >%99,9 T13 %91,7 X/Y %96,2 T21 %100 T18 %97,2 T13 %78,6 X, Y %93,8-100 T21 %100 T18 %97,4 T13 %80 T21 >%99 T18 >%99 T13 >%99 45,X %91,7 T21 %100 T18 %100 T13 %100 45,X %75 Yanlış negatif T21 3/212 T13 1/12 X/Y 25/26 T18 1/36 T13 3/14 XX 232/233 T21 0/81 T18 1/38 T13 2/10 45,X 1/12 45,X 1/4 Özgüllüğü T21 %99,9 T18 >%99,6 T13 %99,7 X/Y %99,7 T21 %100 T18 %100 T13 %100 X,Y %99,6-100 T21 %99,97 T18 %99,93 T13 >%99 Tümü %100 T21 %100 T18 %99,7 T13 %100 Yanlış pozitif T21, T18, T13 24/1688 ( %1,4) T21, T18, T13 %0 T21 1/2888 T18 2/2888 T13 1/ T18 1/891

19 Cell Free Fetal DNA Uygulama Endikasyonları; İleri anne yaşı (>35) Fetal USG de anöploidi riskini arttıran bulgu varsa Trizomili gebelik öyküsü MS- tarama testlerinde trizomi için artmış risk 21 ve 13. kromozomlarının katıldığı Robertson tipi translokasyon için taşıyıcı ebeveynlerin gebelikleri

20 1. Artmış anöploidi (21, 18, 13 için) riski taşıyan gebeliklerde cff-dna test önerilebilir. Bu teknolojinin <0,5% yanlış pozitiflik ile Down sendromlu fetusların ~ %98 ini yakalaması beklenmektedir. 2. cff-dna testi rutin prenatal laboratuvar uygulamalarının bir parçası olmamalıdır, ancak test hasta seçimine bırakılmalıdır. 3. cff-dna testi yeterli deneyim olmadığından düşük risk grubuna veya çoğul gebeliklere önerilmemelidir. 4. Ön danışmada, cff-dna testinin tanı testi olmamasına rağmen yüksek duyarlılıkta olduğu, sadece sık görülen 5 kromozom anöploidisine yönelik uygulandığı ve diğer genetik hastalıklar için bilgi vermeyeceği belirtilmelidir. 5. Test öncesi aile öyküsü alınmalı ve gebelikte prenatal tanısı mümkün diğer genetik hastalıklar için risk olup olmadığı belirlenmelidir. 6. Eğer fetal USG de anomali saptanırsa invaziv prenatal tanı önerilmelidir. 7. Negativ cff-dna testi sağlıklı fetusun garantisi değildir. 8. Pozitiv cff-dna test sonucu alındığında genetik danışmaya yönlendirilmeli ve konfirmasyon amacı ile invaziv prenatal tanı önerilmelidir. 9. cff-dna testi, CVS veya amniosentezin tanısının güvenilirliğini ve doğruluğunu karşılayamaz.

21

22 PRETAM+PREMED serilerinde ( CVS ve Amniosentez) saptanan anomaliler içinde sık görülen 5 anöploidinin oranı ve cff-dna testinin hassasiyeti %100 kabul edildiğinde hipotetik yakalama/yakalayama oranı İnvaziv yöntemlere göre endikasyon grublarında saptanan kromozom anomalileri ve % leri cff-dna testi ile yakalanabilir anomaliler n % cff-dna testi ile yakalanamayan anomaliler n % Endikasyon grublarındaki rezidual risk CVS-ileri anne yaşı 335 de 15 anomali %4, ,8 3 33,2 %0,9 1:111 CVS- Tarama testi de 53 anomali %18, , ,4 %5 1:20 CVS- Patolojik USG 824 de 244 anomali %29, , ,4 %5,5 1:18 AS- ileri anne yaşı da 233 anomali %2, , ,1 %0,9 1:111 AS- Tarama testi da 185 anomali %2, , ,1 %1 1:100 AS- Patolojik USG 4442 de 378 anomali %8, , ,2 %1,8 1:56 %

23 cff-dna Testi Öncesi Genetik Danışma Tarama testleri, hedefe yönelik testlerdir cff-dna testlerinin PPV ve NPV değeri? Prenatal tanı = Down s. tanısı değildir Testin ( ) olmasının bir garanti olmadığı, FN ve FP olasılıkları testin saptayamadığı anomali olasılıkları (rezidual risk) anlatılmalı Gebeye NIPD ve IPD farkları anlatılmalı

24 Ayrıca Türkiye özelinde; Bugüne kadarki uygulamalar nasıl yürütüldü? Genetik danışma veriliyor mu? Sonuçlar nasıl ve bunlar kayıt altında mı? cff-dna testinin izlemde yeri nerededir? Ekstra bir ücret ile yapılan bu testte sorumluluk kimde? Cinsiyet tanısının kötüye kullanımı nasıl kontrol edilecek? Genetik materyalin topluca yurtdışına gönderilmesi için Sağlık Bakanlığının izni gerek bu konuların tartışılması gerekmiyor mu?

25 Sorular; 1. Down sendromu için tanı mı yoksa tarama mı? 2. Tarama testi + ise, NIPD invaziv prenatal tanının yerini alabilir mi? 3. Fetal kromozom analizinde (CVS ve AS) saptanan diğer anöploidileri saptayabilir mi? 4. FISH veya mikroarray teknikleri ile saptanan mikrodelesyon/duplikasyon sendromları? 5. Klasik tarama testlerinin yerini alır mı? Evet ise biokimyasal ve USG nin konjenital malformasyonların erken gebeliklerdeki potansiyel faydalarını kaybeder miyiz? Cevaplar; 1. Tanı testi, %100 duyarlılığı ve özgüllüğü olmalı, NIPD çok yüksek duyarlığı olan tarama testidir, tanı testi değildir, 2. Eğer tarama testi + ise ve NIPD + ise Down sendromu riski 290 kez artmıştır, NIPD ise risk 110 kez azalmıştır ancak çok az da olsa rezidual risk önemli ve ciddidir, 3. T21 anomalilerin yarısını oluşturur, tarama testleri ile diğer anöploidi ve triploidi için risk hesaplanabilir, ancak NIPD çalışmalarında klinik süreç tamamlanmadı, 4. NIPD ile mikrodelesyon/duplikasyon tanısının yakın gelecekte gerçekleşmesi beklenmiyor, 5. USG nin yerini alamaz. cff-dna özellikle non-viable trofoblast kökenli olduğundan CPM riskini taşır. NIPD testleri yüksek riskli gruplarda yapılmış ve yapılmaktadır. NIPD nin düşük ve orta risk grubunda performansı daha düşüktür, buna karşın maliyeti artıracaktır.

26 Tarama testi > 1:150 ise ->NIPD + ise ->CVS 1:380 Down s. Prevalansı gebelikte Down s. Taramada >1:150 ise NIPD %99 DR ve %1 FPR CVS 13 düşük ve Down s. NIPD 200 ise tarama+tanı 29,7 milyon

27 Duyarlılık %100 Özgüllük %99 ( 100 de 1 yanlış pozitif) Prevelans Down sendromu %10 ise 1000 olguda; Pozitif prediktif değer %91 Prevelans Down sendromu %0,1 ise 1000 olguda; Pozitif prediktif değer %9

28

29

30 coming soon.

31 Bugün 10 Kasım ATAMIZI sevgi ve saygıyla anıyoruz

32

33

34 KALİTATİF YÖNTEM Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama Fetal DNA da genetik hastalığın dışlanması Y kromozom arama RHD Fetal cinsiyet (%100 güvenilir) Fetal RHD (rhesus blood group D-antigen) (%100 güvenilir) X-e bağlı hastalıklar Rh- kadınlarda, RHD immunoglobin uygulama kararı için (kafkas ırkında Rh- anne oranı % 15) Paternale özgün hastalıkla ilişkili allel tarama (real time, fluorescence, konvansiyonel PCR, kütle spektrofotometresi/tek alleli çoğaltma) Fetal HLA (human lökosit antijenleri) haplotiplemesi Paternal mutasyonlar Konjenital Adrenal Hiperplazi gibi HLA ya bağlı hastalıklar (erkek fetuslar için) B-talasemi, hemoglobin E-hastalığı, kistik fibroz, konjenital adrenal hiperplazi, myotonik distrofi, Huntington hastalığı (fetal DNA yı maternal DNA dan ayırmak için allel spesifik PCR yapmak gerekiyor) KANTİTATİF YÖNTEM Yaklaşım Analitik prensip Marker Klinik Uygulama Gebelikle ilişkili hastalıkların takibi için fetal DNA analizi Real-time PCR ve benzeri kantifikasyon yöntemleri ile aynı gebelik yaşındaki normaller ile karşılaştırma yapmak Fetal durum, Diğer gebelik komplikasyonları Fetal aneuploidiler, intrauterin büyüme geriliği, fetomaternal kanamalar Pre-eklamsi, pre-term labour, ektopik gebelik, invazif plasentasyon, hiperemesis gravidatum, polihidramnios Plasental RNA analizi Real-time RT- PCR ile plasentaya ait transkriptlerin kuantifikasyonu CGB (chorionic gonadotropin, beta polipeptidi) CRH (Corticotropin releasing hormone) Gestasyonal trofoblastik hastalıklar Pre-eklampsi Epigenetik analizler Transkriptlerin quantifikasyonu; RNA-SNP allelik oranların saptanması 21. kromzomun kodladığı transkripitler Fetal trisomi 21 Real-time metilasyon spesifik PCR; epigenetik allelik oranlar Hipometile SERPINB5 Pre-eklampsi, fetal trisomi 18

35 Sequenom LifeCodexx Materni21 plus Trizomiler; 21, 18, 13, X and Y ve 16 ve 22 Mikrodeletions; del 22q11.2 (DiGeorge s.), 5p- (Cri-du-chat s.), del 15q11.2 (Prader- Willi/Angelman s., del 1p36

36 Verinata - Verifi

37 ARIOSA Harmony test

38 HARMONY 400 kan örneği 300 öploid 3 örnekte risk skoru belirlenememiş. 297 örnekte risk değeri < 0,01% specificity % T21 50/50 risk değeri > 99% sensitivity % T18 47/50 risk değeri > 99% 1/50 risk değeri > 98,8% 1/50 risk değeri > 88,5% 1/50 risk değeri 0,11% Toplam 49/50 sensitivity %98 FNR %2

39 2002 örnekten 53 ünde sonuç alınamamış, 1949 örnekte risk skoru alınmış. 10 T13 risk skoru > 99% 8/10 sensitivity 80.0% FNR 20% 1939 öploid risk skoru < 0.01% 1937/1939 specificity 99.9% 0.79% 1/1939 > 99% 1/1939 FPR 0.05% (95% CI, %)

40 From prenatal genomic diagnosis to fetal personalized medicine: progress and challenges Diana W Bianchi, Nature Medicine, 2012

41

42 Table 4a: The number of chromosome anomalies detected in different indication groups of CVS series (385 anomalies detected in CVS) Chromosome anomalies (including mosaics) CVS n CBCR NIR LR AMA ST P-USG 45,X and variants Polysomy X/Y Tri somy a Trisomy a Trisomy Uncommon trisomies Poliploidies Balanced structural Unbalanced structural Total

43 Table 4b: The number of chromosome abnormalities detected in different indication groups of AC series (890 anomalies detected in AC) Chromosome anomalies (including mosaics) AC n CBCR NIR LR AMA ST P-USG 45,X and variants b 18 bbb 33 Polysomy X/Y Trisomy aa Trisomy a a 7 66 Trisomy Uncommon trisomies Polyploidies Balanced structural Unbalanced structural