1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİNİN ECZACILIKTAKİ UYGULAMALARI Hazırlayan Osman ŞAHİN Danışman Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Bitirme Ödevi MAYIS 2013 KAYSERİ
i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Osman ŞAHİN
ii YÖNERGEYE UYGUNLUK Rekombinant DNA Teknolojisinin Eczacılıktaki Uygulamaları adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Osman ŞAHİN Danışman Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI
iii Rekombinant DNA Teknolojisinin Eczacılıktaki Uygulamaları adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Osman ŞAHİN Danışman Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ONAY: Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan
iv TEŞEKKÜR Bitirme ödevimi hazırlarken çalışmalarımı yönlendirmesinde, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek akademik ortamda olduğu kadar insani ilişkilerinde de sonsuz desteğiyle gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK e ve yaşamımın her döneminde bana duydukları güven için aileme en derin duygularla teşekkür ederim. Osman ŞAHİN Kayseri, Mayıs 2013
v REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİSNİN ECZACILIKTAKİ UYGULAMALARI Osman ŞAHİN Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Doç. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ÖZET Rekombinant DNA ve Rekombinat DNA teknoloji, genetik rekombinansyon olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan ve arzu edilen herhangi bir gen ya da ürününün çoğaltılması mümkün kılan bir yöntemdir. Çoğaltılması istenen gen önce orjinal kromozomdan restriksiyon endonükleaz enzimi yardımıyla kesilerek alınır ve plazmid ya da faj gibi bir vektöre integre edilir. Sonra bu vektör transformasyon yoluyla bir bakteri ya da maya içine sokulur ve daha sonra bu mikroorganizmaların kültürü yapılarak istenen gen veya protein arzu edilen miktarda elde edilmesidir. Rekombinant DNA teknolojisi eczacılık alanında istenilen gen faktörünün istenilen miktarda ve saflıkta üretilmesine fırsat vermesiyle bir devrim niteliğinde görülmektedir. Bu araştırmada, Rekombinant DNA teknolojisini genel hatları ile tanıtıp eczacılık alanındaki kullanımları hakkında bilgi verilecektir. Anahtar sözcükler: Recombinant DNA teknolojisi, restriksiyon endonükleaz enzimi, rekombinasyon, rekombinant DNA
vi PHARMACEUTİCAL APPLİCATİONS OF RECOMBİNANT DNA TECHNOLOGY Osman ŞAHİN Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Pharmaceutical Biotechnology Graduation Project, May 2013 Advisor: Assoc. Prof. Dr. Gökçen YUVALI ÇELİK ABSTRACT Recombinant DNA and Recombinant DNA technology are a method depending on realization of genetic recombination events artificially. It became possible to obtain any ordered gene or its product with this method. Before production step, ordered gene is derived from original chromosome by endonuclease enzyme and integrated to a vector as a plasmid or a phage. After that this vector istransformed into a bacterium or ayeast. Then ordered gene or protein is produced in desired amounts by culturing these microorganisms. Recombinant DNA technology in the field of pharmacy and the purity of the desired amount of the desired gene factor is a revolutionary vermesiyle üretilmasine opportunity. In this study, the use of recombinant DNA technology in the field of pharmacy promote and provide information on the general lines. Keywords: Recombinant DNA technology, restriction endonuclease enzyme, recombination, recombinant DNA
vii İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i YÖNERGEYE UYGUNLUK... ii ONAY :... iii TEŞEKKÜR... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ... ix KISALTMALAR... x 1 GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2 GENEL TANIMLAR... 3 2.1 Rekombinant DNA Teknolojisinin Tarihçesi Ve Tanımı... 3 2.1.1 Tarihçe... 3 2.1.2 Tanımı... 5 2.2 Rekombinant DNA nın üretimi... 6 2.2.1 Gen taşıyan DNA (veya RNA )nın Elde Edilmesi... 8 2.2.2 Genin Yerinin Belirlenmesi... 9 2.2.3 Genin Çıkarılması... 11 2.2.4 Taşıyıcı (vektör) DNA nın Elde Edilmesi... 12 2.2.4.1 Klonlamada Kullanılan Vektörler... 13 2.2.5 Gen DNA sının vektör DNA sı ile birleştirilmesi... 13 2.2.6 Oluşan Rekombinant vektör DNA nın Alıcı Hücreye Aktarılması... 14 2.2.7 Seleksiyon... 15 2.2.8 Gen Ürünlerinin Kontrol Edilmesi... 16 2.3 Rekombinant DNA Teknolojisinin Eczacılıktaki Uygulamaları... 17 2.3.1 Rekombinant DNA Aşıları... 21 2.3.1.1 Rekombinant Antijen Aşılar... 22 2.3.1.2 Rekombinant Vektör Aşılar... 22 2.3.2 Hormonlar... 23 2.3.2.1 İnsülin Üretimi... 24 2.3.2.2 İnsan Büyüme Hormonu... 27 2.3.2.3 Eritropoetin... 28 2.3.3 Sitokinler... 28
viii 2.3.3.1 İnterferon... 29 2.3.3.2 İnterlökinler... 29 2.3.4 Enzimler... 29 2.3.4.1 Alteplaz... 29 2.3.4.2 Dornase α... 30 2.3.5 Hemofili A... 30 3 TARTIŞMA VE SONUÇ... 32 KAYNAKLAR... 35 ÖZGEÇMİŞ... 37
ix TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ Tablo 1. FDA Onayı Alarak Piyasaya Çıkmış Olan Biyoteknoloji Ürünü İlaçlar... 18 Şekil 1. Rekombinant DNA teknolojisinin genel şeması... 7 Şekil 2. Klonlanmak istenen genin plazmid vektöre integre edilmesi ve konak hücrede çoğaltılması... 14 Şekil 3. Bir insan geninin bakteri plazmidi içerisinde çoğaltılması ve seçilmesi... 16 Şekil 4. Rekombinant DNA Teknolojisi ile protein ilaç geliştirme sürecinin şematik gösterimi... 20 Şekil 5. İnsan İnsülinin bakteri hücresinin içinde klonlanması... 25 Şekil 6. Faktör VIII geninin ev sahibi hücre içerisine alınması.... 31
x KISALTMALAR DNA PCR rdna RNA cdna mrna RE E.coli S.cerevvisiae S.typhimurium Amp Tet EPO RNA CMV EBV CTL BCG hgh STH AIDS IL IFN CF RT :Deoksiriboznükleik asit :Polimeraz zincir tepkimesi :Rekombinant DNA :Ribonükleik asit :Komplementer-tamamlayıcı DNA :Messenger RNA :Restriksiyon endonükleaz :Escherichia coli :Saccharomyces cerevisiae :Salmonella typhimurium :Ampisilin :Tetrasiklin :Eritropoetin :Ribonükleik asit :Sitomegalovirüs :Epstein-Barr virüs :Sitotoksik T hücre :Tüberküloz :İnsan büyüme hormonu :Somatotrofik hormon : Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu :İnterlökin :İnterferon :Sistik fibrosis :Revers transkriptaz
xi EAPB HBsAg FDA GH MVA HIV :Avrupa Farmasötik Biyoteknoloji Derneği :Hepatit B virüsüne karşı hormon :Food and Drug Administration :Büyüme hormonu :Modifiye vaccinia virüs Ankara : İnsan bağışıklık yetmezliği virüsü
1 1 GİRİŞ VE AMAÇ 1980 li yılların başlarından itibaren, gelişen rekombinant DNA teknolojisi büyüme hormonunun üretimine olanak sağlamıştır. İlk olarak 1960 lı yıllarda ileri sürülen mikroorganizmalardan büyük çapta protein üretilmesi fikri ancak 20 yıl sonra gerçekleşmiştir. Bu metodla, memeli hayvanların büyüme hormonu sentezleme görevini yapan DNA parçası alınarak bakteri DNA sıyla birleştirilmiştir. Bu şekildeki biyoteknolojik metodla yoğun bir şekilde daha ucuz Rekombinant somatotropinlerin üretilmesi mümkün olabilmiştir (1). Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakterilerde çeşitlenme farklı işleyişlerle, transformasyon, konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji olmasına dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında var olan çeşitli düzeydeki eşleşme engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da rekombinasyona olanak sağlamamaktadır (2). Rekombinant DNA teknolojisi, bir genomdaki binlerce gen arasından tek bir genin ayrıştırılmasını, tanımlanmasını ve bu genin klonlanmış DNA molekülü olarak büyük miktarlarda üretilmesini mümkün kılmaktadır (3). Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve kapsamı çeşitli toplumlara ya da bilim insanlarına göre farklılıklar göstermektedir. Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren, oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir: Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalara ait tekniklerin toplamıdır (2).
2 1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNA lar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, Rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır (4). Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle, prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün olmaktadır (2). Eczacılıkta başlıca ilaç, aşı ve diagnostiklerin ve bunlarla ilgili taşıyıcı sistemlerin araştırılması ve üretimi amacıyla biyoteknolojiden yararlanılmakta ve biyoteknolojinin üretim amacıyla en fazla kullanıldığı iki alan tarım ve eczacılık olmaktadır (5). Bu çalışmamızdaki amacımız, Rekombinant DNA teknolojisin gelişim sürecini, işlem aşamaları, uygulamaları, kullanımı ve bu teknolojinin önemli elemanlarını inceleyip eczacılık alanındaki faydalarını araştırmaktır.
3 2 GENEL TANIMLAR 2.1 Rekombinant DNA Teknolojisinin Tarihçesi Ve Tanımı 2.1.1 Tarihçe Biyoteknolojinin, M.Ö. 6000 yıllarında Sümerlerin ve Babillerin fermantasyon tekniği kullanarak bira yapmaya başlaması ve M.Ö. 4000 yıllarında Mısırlıların ekmek mayası kullanmalarıyla ortaya çıktığı kabul edilmektedir. Bunu, teknolojinin diğer dallarındaki gelişmelere paralel olarak, yoğurt, ekmek, peynir, antibiyotikler, alkoller, organik asitler, gibi diğer ürünler izlemiştir. DNA nın yapısı ve taşıdığı genetik kodun çözülmesinden sonra birçok biyolojik sırrın DNA nın baz diziliminde saklı olduğu anlaşılmış ve moleküler düzeyde çalışmalar başlamıştır (6). Rekombinant DNA teknolojisi özellikle 1960'lı yılların sonlarına doğru DNA ile ilgili bazı enzimlerin etki mekanizmalarının anlaşılması sayesinde gerçekleştirilen bir dizi yöntemleri kapsamaktadır. Bununla birlikte bu süreç 1940'lardan 70'lere kadar moleküler biyolojinin gelişmesini sağlayan bilgi birikimi de rekombinant DNA teknolojisinin temelini oluşturmuştur (2). 1950 li yılların başında DNA molekülünün tanımlanması, gen teknolojisini başlatan ilk adım olmuştur. Organizmaların yapısal özelliklerinin ve işlevlerinin temelinde yer alan DNA nın tüm canlılarda aynı veya birbirine çok yakın olması, tür içi ve türler arası gen aktarımını olası hale getirmiştir (7). Genetik çeşitlenme olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan rekombinant DNA teknolojisine (rdna) ilişkin ilk çalışmalar, 1973 yılında başta Cohen olmak üzere bir araştırma grubunun önderliğinde in vitro koşullarda gerçekleşmiştir. Buna göre doğada eldesi imkânsız olan yeni gen düzenlemelerinin yapılması bu teknolojiyle sağlanabilmekte, bir canlının genotipi önceden belirlenebilmekte ve yönlendirilebilmektedir. In vitro koşullarda oluşturulan yeni DNA moleküllerine
4 önceleri "kimera" (aslan başlı, keçi gövdeli ve yılan kuyruklu mitolojik bir yaratık) adı verilmiştir. Bu kimeralar, birbirleriyle ilişkili olmayan ve farklı kökenler ait genleri içeren rekombinant DNA molekülleridir (2). Rekombinant DNA teknolojisi 1980'li yıllarda dev adımlarla ilerlemiş ve günümüzde adından en çok bahsedilen ve moleküler genetikte devrim yaratan bir bilim dalı olmuştur (2). Özellikle 1985'de ortaya atılan bir veya iki hücreden, elde edilen DNA'nın birkaç saat içerisinde çoğaltılarak 24 saatte genetik tanının konmasına olanak sağlayan Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) rdna teknolojisi için belki en büyük gelişmelerden biri olarak kabul edilebilir (2). Biyoteknoloji ve Rekombinant DNA Teknolojisinin Çok Kısa Tarihçesi 1960 Restriksiyon endonukleazların bulunması 1969 E. coli 'de EcoRI'in varlığının belirlenmesi 1970 Revers transkriptase enziminin saptanması İn vitro gen sentezi 1972 İlk rekombinant DNA molekülünün hazırlanması 1973 Plasmidlerin gen klonlamasında kullanılması 1975 Gen spesifik problarla parental DNA'nın saptanması 1977 DNA baz sıralarının belirlenmesi Somatostatinin rdna teknolojisi ile üretimi 1978 İnsan genomik kütüphanesinin hazırlanması 1979 rdna ile insülin hazırlanması 1979 Şap virusunun viral antijeninin E. coli 'de klonlanması 1982 İnsan insülinin E. coli 'de klonlanması ve ticarete sunulması
5 -İnsan kanser genin izolasyonu, klonlanması ve karakterizasyonu -Rat büyüme hormonunun fare embriyosuna transferi 1985 Tütün bitkisinin herbicide (glyphosate) dirençli hale getirilmesi -PCR tekniğinin geliştirilmesi 1987 Farelerdeki genetik hastalığın (shiverer mutasyon) fonksiyonel genin fare embriyolarına verilmesi ile tedavisi 1988 Genetik manipulasyonla elde edilen soya fasulyesinin üretimi -Gen tabancasının (gene gun) geliştirilmesi 1990 İlk fertil mısırın üretimi 1991 Transgenik domuz ve keçinin elde edilmesi (insan hemoglobini üreten) - İnsanlarda kanserin tedavisinde genlerin kullanılması (8). 2.1.2 Tanımı Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur. Rekombinasyon, farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda, ana-babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış-verişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri arasında parça alış-verişi oluşur. Sonuçta orjinal durumdaki DNA moleküllerine tam olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA molekülleri oluşur (2). Rekombinant DNA teknolojisi, bir genomdaki binlerce gen arasından tek bir genin ayrıştırılmasını, tanımlanmasını ve bu genin klonlanmış DNA molekülü olarak büyük miktarlarda üretilmesini mümkün kılmaktadır (3).
6 Bu teknoloji, bir genin potansiyel olarak sınırsız miktarda üretilmesi için güçlü bir araçtır (3). Bu teknoloji ile çeşitli amaçlar için adeta ısmarlama genler ve proteinlerin üretimi mümkün olmaktadır (9). Rekombinant DNA teknolojisi için istenen gen orjinal kromozomundan restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilip alınmakta ve sonra bir vektöre takılıp konak hücre içine sokularak çoğaltılmaktadır (10). Yerine göre ya doğrudan çoğaltılmış olan bu genler kullanılmakta ya da bunların ekspresyonu ile edilen proteinler kullanılmaktadır (11). 2.2 Rekombinant DNA nın üretimi Önemli bir ürünün (veya proteinin) sentezini kodlayan genin ait olduğu hücre (prokaryotik veya ökaryotik) genomundan (veya kromozomundan) özel yöntemlerle (genellikle, restriksiyon endonukleaz enzimleri ile) kesilerek çıkarılması, bunun bir taşıyıcı (vektör) DNA'sı ile birleştirilerek alıcı bir hücreye (prokaryotik veya ökaryotik) transfer edilmesi, bu alıcı hücrede genin ekspresyonunun sağlanmasıdır (8).
7 Şekil 1. Rekombinant DNA teknolojisinin genel şeması (8). Gen klonlamasında önemli olan aşamalar kısaca şöyledir (genel prensipler) (12). 1) Gen taşıyan DNA'nın (veya RNA) saf olarak elde edilmesi, 2) Genin yerinin belirlenmesi, 3) Genin çıkarılması,
8 4) Taşıyıcı (vektör) DNA'nın elde edilmesi, 5) Gen DNA'sının vektör DNA'sı ile birleştirilmesi, 6) Oluşan rekombinant vektör DNA'nın alıcı hücreye aktarılması, 7) Seleksiyon, 8) Gen ürününün kontrol edilmesi (12). Proteini kodlayan gen kaynağının seçimi için, hedef genin DNA ya da RNA olarak en fazla miktarda bulunduğu doku, hücre, bakteri ya da virüsü bilmek gereklidir (13). 2.2.1 Gen taşıyan DNA (veya RNA )nın Elde Edilmesi Gen yalıtımı veya izolasyonu, rekombinant DNA teknolojisinde, bir canlıya herhangi bir genin istenilen yön ve biçimde yeni bir düzenleme içine sokulmasındaki ilk aşamadır. Bu yöntemle ilgilenilen geni taşıyan DNA parçaları elde edilir (14). Ayrıca elde edilen rekombinant proteinlerin hastalıkların tanısında kullanılabilmesine olanak sağlaması, klonlamada gen seçiminde göz önünde bulundurulan durumlardan biridir (15). Hedef DNA elde edilirken kullanılacak primerlere, genin yerleştirileceği vektöre uygun enzim kesim bölgelerinin eklenmesi önemli noktalardan birini oluşturmaktadır (15). Bu yöntemle ilgilenilen geni taşıyan DNA parçaları elde edilir. İşlem için değişik yollar kullanılabilir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir (4): 1.Genellikle kullanılan yöntemlerden biri, bir canlıdan yalıtılan ve saflaştırılan DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan parçalamaktadır. Çoğaltılması istenilen gen parçaları bu parçalardan birinin içinde bulunur. DNA'nın parçalanması için bazı mekanik (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması gibi) yöntemlerden yararlanılmakta birlikte, günümüzde en başarılı sonuçlar kesme enzimleri (restriksiyon endonükleazlar) ile sağlanmaktadır (4).
9 2.Diğer bir yöntem ise DNA kopyasının (cdna) eldesidir. Bunun için hücrelerden klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren RNA yalıtılır. Daha sonra ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyaları çıkarılır. Meydana gelen RNA/DNA melezinin RNA kısmı enzimin ribonükleaz H aktivitesiyle hidroliz edilip yok edilir, daha sonra DNA polimeraz aktivitesiyle cdna çift zincirli hale getirilir. Bu yöntem özellikle fazla miktarda DNA içeren karmaşık gen yapısı gösteren ve çoğu geninde intron bulunan ökaryotik canlılardan gen yalıtımı için kullanılmaktadır. Elde edilen DNA parçalarının içinde bazıları çoğaltılmak istenilen gen parçasını taşırlar. Farklılaşmış ve çok az çeşitte proteinlerin sentez edildiği hücrelerde ise bu olasılık daha yüksek olur. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin prokaryotlara klonlanmasında kullanılmaktadır (4). 3.Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen yalıtımıdır. 1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNA lar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır (4). 2.2.2 Genin Yerinin Belirlenmesi Her ne kadar genin yerinin belirlenmesi mümkünse de, klonlamada genellikle, istenilen geni taşıyan DNA'nın (veya kısa segmentlerinin) saf bir süspansiyonunun hazırlanması, amacı gerçekleştirmede yeterli olabilmektedir (12). Genlerin elde edilmesinde ve yerlerinin saptanmasında bazı yöntemlerden yararlanılır. Bunlar da kısaca şöyledir (12): 1) İn vitro sentez: Eğer istenilen gen ürünü bir protein ise ve yapısı (amino asit sayısı, türü ve sırası) biliniyorsa, bu proteini kodlayan DNA sekanslarını belirleyerek in vitro
10 koşullarda sentezini sağlamak mümkündür. Bu tarzda elde edilen DNA segmenti, klonlamada başarı ile kullanılabilir. Örn., insülin ve somatostatin hormonlarını kodlayan genlerin in vitro sentezleri gibi (12). Bu yöntem başarılı olmasına karşın zaman alıcı ve masraflıdır. Çok miktarda amino asit sayısına sahip olan proteinleri kodlayan DNA segmentleri, ayrı ayrı sentezlendikten sonra birleştirilirler. Son yıllarda, özel aletler (DNA sentetizerler) yardımı ile istenilen uzunlukta DNA sekansları kolayca sentez edilebilmektedir (12). 2) Hibridizasyon yöntemleri: Bu teknikler daha ziyade gen taşıyan DNA sekanslarının yerlerini belirlemede kullanılmaktadırlar. En fazla yararlanılan yöntemler şunlardır (12): a) Southern blot hibridizasyonu: Bu teknikte, materyallerden elde edilen ve bir RE ile kesimi yapıldıktan sonra oluşan saf DNA segmentlerinin agarose jel elektroforezde seperasyonu yapılır. Agarose jelden sonra nitroselüloz filtresine transfer edilerek burada, işaretli (32P, biotin) problar kullanarak hibridizasyon sağlanır ve otoradiografik veya renk oluşumuna göre genin yeri belirlenir. Konu üzerinde ileriki bahislerde ayrıntılı bilgi verilmektedir (12). Yeri saptanan DNA segmenti, agarose jel üzerinden çıkarılarak klonlamada kullanılır. b) Northern blot hibridizasyon: Bu yöntemde, agarose jel üzerine RNA separe edilerek işlemler aynen Southern blotta olduğu gibi devam ettirilir. Hibrid molekülleri ortaya koymada da işaretli DNA veya RNA problarından yararlanılır (12). 3) İstenilen genler her zaman DNA üzerinde değildir. Genetik materyal olarak RNA taşıyan viruslarda, genler RNA da bulunurlar. Böyle durumlarda tek iplikçik viral RNA saf olarak elde edildikten sonra, buna revers transkriptaz (RT) enzimi ile tek iplikcikli komplementer DNA (cdna) sentezlenir. Bu RNA-DNA kompleksinden RNA çıkarıldıktan sonra, bu cdna iplikçiğine de Pol. I enzimi yardımı ile ikinci bir cdna sentezlenerek çift iplikçikli DNA molekülü haline çevrilir. İşlemler, Southern blot tekniğindeki gibi yürütülür (12). Bazı durumlarda, geni, DNA'dan değil de, bunun bir komplementeri olan ve hücre içinde sentezlenen mrna'dan yararlanılabilir. Bu durumda mrna'ya komplementeri olan çift iplikcikli DNA sentezlenir (12).
11 Yukarıda bahsedilen ve genin yerinin belirlenmesi ve izolasyonuna yönelik çalışmalar oldukça uzun, zaman alıcı ve bazen de başarısız olabilmektedir. Bu nedenle, pratikte daha etkin olan basit uygulamalar kullanılmaktadır. Şöyle ki, bir RE ile kesilerek çeşitli boylarda DNA segmentleri elde edildikten sonra klonlama işlemine geçirilir ve gen taşıyan bakteri kolonileri seleksiyonla seçilerek saf olarak üretilir ve genin ekspresyonu araştırılır (12). 2.2.3 Genin Çıkarılması DNA'larında istenen geni taşıyan bakteriler üretildikten ve DNA'ları çıkarıldıktan sonra saflaştırılır ve bir süspansiyon elde edilir. Bu DNA süspansiyonu bir (veya gerekirse iki) restriksiyon endonukleaz ile muamele edilerek DNA'lar değişik boylarda olmak üzere çok sayıda segmente bölünür. Doğaldır ki bu kadar çok sayıda segment (genomik DNA fragmenti) arasında istenilen (hedef) geni taşıyan sayısız sekans bulunacaktır. Elde edilen DNA fragmentleri, ayrı ayrı uygun vektörle bağlandıktan sonra klonlanır. Agar üzerinde oluşan koloniler, istenilen gen (hedef gen) yönünden teker teker incelenirler (8). Aracı moleküllerle (vektör DNA'sı ile) birleşecek olan segmentler, vektörlerin (plasmid, faj, fajmid, cosmid, vs.) bakteri içindeki üremesini engellemeyecek bir boyutta ve en önemlisi de iyi eksprese olması gereklidir. Bu nedenle, vektörle birleşen her DNA segmentinde istenen gen bulunmadığı gibi, gen içeren çok büyük veya küçük segmentler de vektörlerle birleşseler bile, bakteriye girmeyebilir veya girse bile eksprese olmayabilirler (8). Klonlamada yararlanılan bazı restriksiyon endonukleazlar bakteri genomunda kesme yaptıktan sonra oluşan segmentlerin uçları bir birinin komplementeri olup yapışkan bir özellik taşırlar (yapışkan uçlar, cohesive ends). Oluşan bu serbest uçlar tekrar birleşebilir ve sirküler bir durum alabilirler (resirkularizasyon). Bu özelliğe, vektör DNA'sında da rastlanır. Her RE'nin kesiş yeri farklı olduğu gibi oluşturduğu yapışkan uçların baz sıraları ve sayıları da değişiktir (8).
12 2.2.4 Taşıyıcı (vektör) DNA nın Elde Edilmesi Hazırlanan genomik DNA segmentleri ile vektör DNA'sı birleşecek duruma getirilir. Diğer bir ifade ile her iki DNA uçlarında karşılıklı birleşmeye elverişli yapışkan uçlar sağlanır. Eğer genomik DNA'da Hind III kullanılmışsa, vektör DNA'da da aynı RE, yani Hind III, kullanılmalıdır (8). RE'ler, büyük olan genomik DNA üzerinde çok sayıda kesim yerlerine sahiptir. Bu nedenle, değişik boylarda çok sayıda DNA segmentleri meydana gelebilir. Durum, vektör DNA'ları için de benzeridir. Ancak, bazı RE'lerin vektör DNA üzerinde hiçbir kesim yerine sahip olmamasına karşın, diğerlerinin 1, 2, 3... çok sayıda kesim yeri olabilir ve vektör DNA'da değişik boyda segmentler oluşabilir. Rekombinant DNA molekülü elde etmede, vektör DNA'da sadece bir kesim yerine sahip olan RE'ler (Örn., Hind III. Sal I, Pst I, vs.) tercih edilir. Bu enzimler vektör DNA'yı kestiklerinde hem yapışkan uçlar meydana getirirler ve hem de sirküler vektör DNA'sını sadece açarlar. Herhangi bir parça koparıp çıkarmazlar (8). Vektörlerde bulunan antibiyotik rezistenslik (amp, tet, vs.) genlerinden biri RE ile kesilerek ayrılır ve bunun içine yabancı gen aktarılarak gen inaktive edilir (8). Genomik DNA'da bir RE ile kesimde, çok sayıda kesim yeri olduğundan, değişik boylarda ve fazla miktarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Prokaryotik veya bir ökaryotik tek bir hücre genomunda istenilen gen veya klonlanması arzu edilen hedef gen, genellikle, bir tanedir. Bu da RE ile kesimde meydana gelen DNA segmentlerinden birinde bulunur. Ancak, klonlamada tek bir hücre genomu değil de milyarlarca hücre DNA'sı kullanıldığına göre, milyarlarca hedef gen taşıyan genomik DNA segmenti ve bunun da yüzlerce (hatta binlerce) katı sayıda istenilen geni taşımayan (ancak, diğer genleri taşıyan) fragmentler oluşacaktır. Bu nedenle, genomik DNA (gen DNA'sı) ile vektörün birleşmesini garantilemek için, birleşme işlemi aşamasında çok sayıda vektör kullanmak gerekecektir (8). Birleşme aşamasında kullanılacak vektörün amaca uygun olarak seçilmesi ve iyi yöntemlerin kullanılması uygun sayıda hibrid DNA'sı elde etmek için gereklidir. Vektörlerde bazı spesifik markerlerin (amp, tet, kanr, lac+, vs.) bulunması, istenilen
13 geni taşıyan kolonileri bulmada büyük yardımcı olurlar. Klonlamada doğal plasmidler yerine suni plasmidlerden daha çok yararlanılır (8). 2.2.4.1 Klonlamada Kullanılan Vektörler Normalde restriksiyon kesimleri ile oluşturulmuş DNA parçaları doğrudan bakteri hücresine giremez. Dolayısıyla, vektör adı verilen bakteri içinde bağımsız çoğalabilecek başka bir DNA molekülüne eklenmesi gerekir. Klonlamada kullanılacak vektörler bazı özelliklere sahip olmalıdır. İlk olarak, vektör molekülü küçük olmalı ve bakteriden izolasyonu kolay olmalıdır. Vektör molekülü konakçıya uygun bir replikasyon merkezi taşımalıdır. Aksi halde vektör bakteri içinde çoğalamaz. Vektör DNA sı üzerinde, ayrıca, vektörü taşıyan ve taşıyamayan konakçı hücreleri birbirinden ayırt etmeye yarayacak kolayca belirlenebilen bir seçici belirteç gen (genel antibiyotiğe direnç geni, ya da konakçı da bulunmayan bir enzim geni) olmalıdır. Rekombinant DNA moleküllerinin oluşturulmasında klonlanacak DNA nın büyüklüğüne ve çalışmanın amacına bağlı olarak çok farklı tiplerde klonlama vektörleri kullanılmaktadır (16). 1-Plazmidler: A)Konjugatif Plazmidler B)Konjugatif Olmayan Plazmidler C)Ti Plazmidi 2-Virüsler 3-Kozmid Vektörler 4-YAC Vektörler 2.2.5 Gen DNA sının vektör DNA sı ile birleştirilmesi Kesilmiş DNA parçalarından işaretleniş hedef gen seçilir. Aynı endonükleaz ile kesilmiş ve vektör ödevi görecek yabancı DNA parçası (çoğunlukla plazmid) ile birleştirilir. Oluşan yeni DNA ya rekombinant DNA, bu olaya ise rekombinasyon denir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan vektörler bakteri plazmidleri ve virüs DNA larıdır (17).
14 Şekil 2. Klonlanmak istenen genin plazmid vektöre integre edilmesi ve konak hücrede çoğaltılması (18). 2.2.6 Oluşan Rekombinant vektör DNA nın Alıcı Hücreye Aktarılması Vektör ve genomik DNA segmentleri birleşmesinden oluşan konjugat, yeteri miktarda konakçı E coli ile birlikte bulundurulduktan sonra, içinde uygun bir sıvı besi yeri ve Ca +2 iyonları bulunan erlenmayere transfer edilirler. E. coli 60-90 dakika kadar 37 C'de üretilir. Ortama katılan CaCI 2 E coli'nin yüzeyini, sirküler plasmid DNA'sı için geçirgen hale getirir ve rekombinant plasmid kolayca bakteriye transfekte olur (transfeksiyon) (12). Bu inkubasyon sırasında başlıca 4 durum meydana gelebilir (12). 1) Hiçbir plasmid içermeyen E coli'ler, 2) Resirkülarize olmuş plasmid içeren E coli'ler (bunlarda istenen gen sekansları yoktur. Ancak amp, tet genleri sağlam olarak bulunur),
15 3) İstenilen gen sekanslarını içermeyen plasmidli E coli'ler (bunlar diğer gen sekanslarını veya özel gen taşımayan sekansları içerirler), 4) İstenilen gen sekanslarını içeren plasmidli E coli'ler. E coli ile rekombinant plasmid DNA'sı (pbr322) uygun ısıda bırakılırsa yaklaşık 60 dakikalık bir inkubasyondan sonra erlenmayerde milyarlarca mikroorganizma meydana gelecektir. Ancak, yabancı genlerin E coli ye girme oranı 10-8 - 10-9 arasındadır. Bu bakımdan çok fazla mikroorganizma kullanılmalı ve çok iyi bir seleksiyon yapılmalıdır (12). Denemede kullanılan alıcı suş E coli de rezistenslik faktörleri taşıyan hiçbir plasmid bulunmamaktadır. Bu nedenle de amp ve tet e duyarlıdır ve bu nedenle de her iki antibiyotiği ayrı ayrı veya birlikte içeren besi yerinde üremezler (12). 2.2.7 Seleksiyon Klonlamada karşılaşılan sorunlardan biri de kolonilerden rekombinant plazmidlerin seçimidir. Çoğu zaman transformasyon sonrasında onlarca hatta yüzlerce koloni karşımıza çıkmaktadır. Bunlardan hangilerinin rekombinant plazmidleri içerdiğinin tespiti gerekmektedir. Bir çok plazmid, ampisilin, tetrasiklin gibi antibiyotik direnç genleri içermektedir. Bu direnç genleri sayesinde rekombinant plazmidlerin seçimi sağlanacaktır (19). Bu nedenle bakterileri ampisilin ve X-gal olarak adlandırılan bir şeker içeren besi üzerine ekeriz. Çoğalan her bakteri besi yeri üzerinde koloni olarak görülen bir hücre klonu oluşturulur. Rekombinant plazmidleri taşıyan hücre kolonilerini seçmede plazmidin kendi genlerinden yararlanılır. Besiyerinde ampisilin bulunuşu sadece plazmid bulunduran hücrelerin gelişmesine izin verir. Çünkü plazmid de ampisiline dirençlilik geni de aynı zamanda bulunur. Fakat çoğaltılması istenen gen plazmid içerisine aktarıldığı sırada laktozun parçalanmasını sağlayan gen bozulmuştur ve bu bölgeye kopyalanması istenen gen aktarılmıştır. Bu nedenle rekombinant DNA taşıyan plazmidler besi yerinde bulunan laktozu parçalayamazlar ve beyaz renkli kolonileri oluştururlar Mavi renkli koloniler ise laktozu parçalayan genleri taşıyan bakteri kolonileridir ama bu koloniler rekombinant plazmidi taşımazlar (20).
16 Şekil 3. Bir insan geninin bakteri plazmidi içerisinde çoğaltılması ve seçilmesi (20). 2.2.8 Gen Ürünlerinin Kontrol Edilmesi Bakteri içinde, veya aynı zamanda dışa salgılandığı durumlarda filtratlardan, gen ürünü saptandığı hallerde aktivite, saflık, zararsızlık, yan etkileri vs., etkinliklerinin dikkatlice incelenmesi gerekmektedir. Bakteri içinde veya filtratlarda bulunan gen ürünleri, bakterilere ait endo ve ekzo proteinlerle, toksin veya toksik substanslarla, enzimlerle, metabolitlerle, vs. yabancı ve zararlı maddelerle kontamine olabilirler. Bu nedenle gen ürününün bunlardan ayrılması ve saf olarak elde edilmesi (pürifikasyon) gereklidir. Bunun ilk aşamasını klonlamada kullanılan mikroorganizmaların iyi seçilmesi oluşturur. Ayrıca, bakteri içinde bulunan endoenzimler ve dışa salgılanan ekzoenzimler (hidrolitik
17 enzimler) sentezlenen gen ürünü proteinini hidrolize ederek ayrıştırabilir ve etkinliğini bozabilirler. Bazen de gen ürünü, bakteri için toksik olabilir (12). Elde edilen ürünlerin, kobay, fare veya tavşanlarda toksisite testleri, yan etkileri ve etkinliği de araştırılır. Ayrıca, antijenik yeteneği de çeşitli immunolojik yöntemlerle belirlenir ve gerekli diğer kontrolleri de yapılır. Sonra çeşitli metodlarla saflaştırılır ve dozu ayarlanır (12). 2.3 Rekombinant DNA Teknolojisinin Eczacılıktaki Uygulamaları Eczacılıkta başlıca ilaç, aşı ve diagnostiklerin ve bunlarla ilgili taşıyıcı sistemlerin araştırılması ve üretimi amacıyla biyoteknolojiden yararlanılmakta ve biyoteknolojinin üretim amacıyla en fazla kullanıldığı iki alan tarım ve eczacılık olmaktadır (5). Farmasötik Biyoteknoloji 1990 yılından beri tüm dünya ülkelerinde eczacılık fakültelerinde yapılandırılmaya başlanan, ülkemizde eczacılık fakültelerinin bazılarında 1993 den beri kurulmuş olan ve 2000 yılı nisan ayında Avrupa Farmasötik Biyoteknoloji Derneği (EAPB-European Association of Pharmaceutical Biootechnology) çatısı altında örgütlenen bir akademik endüstriyel dal olarak gelişmesini sürdürmektedir (5). Farmasötik Biyoteknoloji, biyoteknoloji ürünü ilaç, aşı ve tanı malzemelerinin süreç geliştirme, karakterizasyon, üretim ve ruhsatlandırma gibi yasal işlemleri ile ilgili tüm bilimsel ve teknik konuları kapsayan bir alandır (5). Rekombinat DNA teknolojisi en basit açıklaması ile bir canlının genlerini diğer bir canlıya aktararak istenilen gen ürününü in vitro koşullarda bakteri, maya ve hayvan hücrelerinde üretilmektedir (21). Bu yöntemle üretilmiş yüzlerce ilaç etkin maddesi uygun formülasyonlar içerisinde hastaya ulaştırılmayı beklemektedir. Amerika Birleşik Devletlerinde FDA (Food and Drug Administration) onayı alıp piyasaya çıkmış biyoteknoloji ürünü ilaçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir (5).
Tablo 1. FDA Onayı Alarak Piyasaya Çıkmış Olan Biyoteknoloji Ürünü İlaçlar (5). 18
19 Tablo 1. Devamı Biyoteknoloji ürünü ilaçların geliştirilme süreci geleneksel ilaçlardan çok farklı değildir, yalnız etkin maddenin üretimi biyoteknolojik yöntemlerle yapılmakta ve her aşamada çok ayrıntılı ve gelişmiş tekniklerle yapılan analitik işlemlere gereksinim olmaktadır (5).
20 Bu süreç aşağıdaki şekilde şematize edilmiştir. Şekil 4. Rekombinant DNA Teknolojisi ile protein ilaç geliştirme sürecinin şematik gösterimi (5).
21 Biyoteknoloji ürünlerinde de her ilaç gibi saflık, güvenilirlik ve etkinlik temel ölçütlerdir ve bunların ortaya konulmasında klasik yöntemlere ek olarak biyoteknolojiye özel yöntemler kullanılır (5). Biyoteknoloji ürünü peptid ve proteinlerin tümüne yakını parenteral olarak kullanılmakta, oral, nazal, bukkal, rektal ve vajinal yol gibi farklı uygulama yollarından verilebilmeleri üzerinde çalışmalar sürmektedir (22,23). 2.3.1 Rekombinant DNA Aşıları İmmünoloji ve yeni teknolojilerdeki gelişmeler aşı teknolojisine çok önemli katkılarda bulunmuştur. Aşılar, sadece enfeksiyonlara karşı koruyucu amaçla değil, aynı zamanda tedavi amacıyla da kullanılmaya başlanmıştır, bunun yanı sıra aşı uygulamada yeni alanlarla ilgili çalışmalar da yoğunlaşmıştır (24). Yeni yaklaşım, mikroorganizmanın tümü yerine, spesifik immün yanıt oluşturan yapının aşı olarak verilmesidir. Diğer taraftan alerji, otoimmün ve metabolik hastalıklara karşı da aşı geliştirme çalışmaları devam etmektedir (24). Enfeksiyon etkenlerinin genellikle immunojenik olan yüzey proteinlerini, antijenik determinantlarını, virulans faktörlerini, toksinlerini kodlayan genlerin hücre içinde veya konakçı bir hayvanda klonlanması ve genin ifadesi sonu elde edilen gen ürünlerinin aşı olarak kullanılması asasına dayanmaktadır (24). Bu yöntem yardımıyla DNA üzerinde bulunan önemli bir gen, özel restriksiyon enzimleri ile (Eco RI, Hind III vs.) buradan çıkarılıp taşıyıcı (vektör) bir DNA ile birleştirildikten sonra oluşan bu rekombinant plasmid özel yöntemlerle alıcı bir hücreye (bakteri, maya, hücre) aktarılarak burada ifadesi sağlanır. Rekombinant DNAteknolojisinde kullanılan vektörler arasında plasmidler (pbr3220, pbr325, puc8/9 vs.), bakteriyofajlar (lambda, M13, vs.), virüsler (vaksinia, SV40, adenovirüs, retrovirus, vs.) ve bakteriler (BCG, S.typhimurium) fazlaca kullanım alanına sahiplerdir. Konak hücre olarak prokaryotiklerden E.coli, B.subtilis, ve ökaryotiklerden S.cerevisiae; rekombinant virüsleri klonlamada da devamlı hücre hatları ve konak hayvanları kullanılmaktadır (24).
22 2.3.1.1 Rekombinant Antijen Aşılar Teorik olarak herhangi bir protein rekombinant DNA teknolojisi ile bakteri, maya veya memeli hücrelerde klonlanabilir. Virüs, bakteri veya protozoonlardan yüzey antijeni kodlayan birçok gen bakteri, maya, böcek veya memeli hücrelerinde başarılı bir şekilde klonlanmış ve ifade edilen bu antijenler aşı geliştirmekte kullanılmıştır. Bu yolla hazırlanan ilk rekombinant antijen aşısı, Hepatit B aşısıdır. Bu aşı majör yüzey antijeninin geni maya hücrelerinde klonlanarak geliştirilmiştir. Rekombinant maya hücreleri büyük fermente edici aletlerde üretilmiş ve HBsAg hücre içinde birikmiştir. Maya hücreleri yüksek basınçla parçalanarak rekombinant HBsAg elde edilmiş, biyokimyasal yolla sataştırılarak aşı kullanımına sunulmuştur. Rekombinant Hepatit B aşısı koruyucu antikor yanıtına yol açmaktadır. AIDS için birkaç rekombinant aşı çalışmasının yanısıra kolera toksininin B alt birimi, E.coli enterotoksini, EBV'nin membran glikoprotein antijenlerini içeren rekombinant aşılar hayvan modellerinde değerlendirme aşamasındadır. Bu aşılar ile hayvanlarda koruyucu immün yanıt gelişmiştir. Ancak bu tip aşıların bir dezavantajı ekzojen antijen gibi işlendiklerinden sitotoksik T hücre (CTL) yanıtı oluşturmamalarıdır (25). 2.3.1.2 Rekombinant Vektör Aşılar Yeni aşı geliştirmek için olası stratejiler arasında vektör kullanımı önemli yer tutar. Antijenleri kodla-yan genleri atenue bir virüsa veya bakteriye sokmak mümkündür. Vektör, genomuna bir patojenin genleri yerleştirilmiş atenue bir mikroorganizmadır. Bu vektör konak hücrede çoğalırken patojenin gen ürününü de ifade ederek konağın immun sistemi ile karşılaşmasını sağlar. Deneysel olarak 20'den fazla RNA ve DNA virüsü ile bakteriler vektör olarak kullanılmıştır. Bunlar arasında poxvirüs, poliovirüs, ade-novirüs gibi virüsler; BCG, listeria, salmonella gibi bakteriler bulunur (25). Replikasyonu defektli olan diğer vaccinia virüsü modifiye vaccinia virüs Ankara (MVA) dır. Bu virüs Ankara kökeninin civciv embryosu fibroblastlarında 570'den fazla pasajlanması ile elde edilmiştir. MVA genomunun analizi genomdan 30kbp delesyon ve memeli hücrelerinde bu kadar baz çiftine eşdeğer bir replikasyon kaybı olduğunu göstermiştir). Diğer bir seçenek ise memeli hücrelerini infekte eden, fakat konağa sınırlı olduğundan tam bir replikasyona gidemeyen, dolayısıyla immün düşkünlerde bile rahatlıkla kullanılabilen kanarya pox virüsüdür. Kuduz glikoprotein genleri, HIV
23 yapısal proteinleri, kızamık hemaglutinin ve CMV yapısal proteinleri bu kökene verilerek deneysel çalışmalar yapılmıştır. Kanarya pox-hiv rekombinant aşısı ile güvenlilik ve immünojenlik yönünden klinik çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Bu çalışmalarda nötralizan antikor, CD4+T hücre ve CD8+T hücre yanıtı indüklendiği gösterilmiştir. Adeno virüslerden Ad5 kökeni de yalancı kuduz virüsü gp50'yi ifade eden bir aşı vektörü olarak kullanılmıştır. Tavşan ve farelere bu rekombinant Adgp50 inoküle edildiğinde gp50'ye karşı oldukça güçlü bir antikor yanıtı oluşmuş ve bazıları da virülan yalancı kuduz virüsü ile karşılaşmada korunmuşlardır (25). Diğer bir olası vektör BCG'dir. BCG aşılaması M. tuberculosis infeksiyonuna karsı koruyamamakta daha çok hücresel immunite ile tüberküloz basilinin üremesi ve yayılmasını önlemektedir. Bu nedenle hücre içi virüs ve parazit patojenlerin antijenlerinin BCG'ye sokularak BCG vektör aşısı oluşturmak uygun olabilir diye düşünülmüş ve bu amaçla HIV ve SIV antijenlerini ifade eden rekombinant BCG aşıları oluşturulmuştur. Bu aşı ile sitotoksik T hücre yanıtının yanısıra güçlü bir antikor yanıtı da oluşmuştur (25). 2.3.2 Hormonlar Rekombinant insülin üretilen ilk ticari rekombinant preparattır. 1982 de FDA tarafından onaylanmıştır. Rekombinant insan insülini üretilmeden önce insülin kaynağı olarak hayvanlar (domuz,sığır vb.) kullanılırdı. Ancak hayvanlardan elde edilen insülin, hayvan insülininden farklılık gösteriyor ve ciddi immün cevap oluşturabiliyordu. Rekombinant insülin, insanda domuz insülini kadar çabuk ve etkilidir, fakat immün sistemle ilgili yan etkileri daha seyrek olarak ortaya çıkar (26).
24 2.3.2.1 İnsülin Üretimi İnsülinin yapısı Kırmızı: karbon; yeşil: oksijen; mavi: azot; pembe: kükürt. Mavi/pembe şeritler iskeleti simgeliyor. İnsülin, insüline bağlı diabetes mellitus'un tedavisi için gereklidir. Daha önceki yıllarda insülin sığır veya domuz pankreasından elde ediliyordu. Fakat bu insülin insan insülininden kimyasal olarak farklılıklar taşıyordu. Şeker hastalarında bu insülinle tedavi sonrası antikorların oluşması, insülinin biyosentezinin rekombinant DNA teknolojisiyle eldesinin önemini daha da artırır (27). Üretilen ilk insülin preparatları hayvan pankreasından elde edilirken (sığır, domuz ya da sığır/domuz karışımı) son 10 yıl içinde yarı sentetik yolla insan insülini elde edilmiş (Hayvanlardan elde edilen insülin biyolojik ve kimyasal reaksiyonlarla insanın ürettiği insülinle aynı hale getirilmiş) ve daha sonra genetik mühendisliği ile bakteriler ve mayalara insan insülin geni aşılanarak insan insülini üretmeleri sağlanmıştır. Günümüzde biyosentetik insan insülinleri rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmekte ve şeker hastalarınca yaygın olarak kullanılmaktadır (27).
25 Şekil 5. İnsan İnsülinin bakteri hücresinin içinde klonlanması (27). 1980 lere kadar, bütün insülinler inekler ve domuzlar gibi hayvanlardan elde ediliyordu. Bu ilacın bu formu hala çok kullanışlı olmasına rağmen, şimdi insan insülinin aynısını ekmek mayası gibi hücreleri kullanarak üretmek mümkün hale gelmiştir. Bunlar biyosentetik insülinler olarak adlandırılır (27). İnsülinler en basit biçimde kısa, orta ve uzun etki süreli olmak üzere etki sürelerine göre sınıflandırılabilirse de unutulmaması gereken nokta enjekte edilen insülinin emilimi aynı kişide %25 oranında, kişiler arasında ise %50'ye varan oranda değişkenlik gösterebilir (27). Bakteri DNA'larının "plazmid" adlı özel bir türü, özellikle molekül klonlamada kullanılmaktadır. Plazmidlerin, üzerlerinde bol gen bulunan (antibiyotiklere direnç geni gibi) küçük çembersel DNA molekülleri olup, bakterinin içinde, hiçbir sınıra bağımlı olmaksızın, kendilerini eşleyebilir, kendi kopyalarını sınırsız olarak çıkarabilirler ve
26 kendilerine özgü yapılarından dolayı (çifte dizinli küçük çembersel DNA), bakterilerden kolaylıkla izole edilebilirler. Bu özelliklerden dolayı, plazmidler molekül klonlamaya özellikle elverişli malzemelerdir. İkinci yöntemde ise, plazmid molekülü çemberi bir restriksiyon enzimi ile kesilerek açılır. Bu plazmid DNA'sı, aynı biçimde ve aynı restriksiyon enzimi ile kesilerek, hayvan DNA'sı ile bir araya getirilip karıştırılır. Bu karışıma ligaz eklenir ve böylece hayvan DNA'sı bir bakteri plazmidi DNA'sına bağlanmış olur. Bu molekül, transformasyon denen bir süreçle bir bakteriye ilave edilebilir. Tek bir rekombinant molekülü taşıyan tek bir bakteri hücresi, hızla üreyerek kendisinin çok büyük sayılarda kopyasını yapabilir. Bu şekilde hazırlanan bakteri hücrelerinin, "insülin" gibi hayvansal bir proteini üretmesi sağlanabilir. Üretilen genlerin bakteriden izole edilmesi kolayca gerçekleşebilir (27). İdeal olan insülinine benzer insülinleri kullanmaktır. Elde edilme biçimine göre iki çeşit insan insülini vardır. Domuz insülininin insan insülinine benzeyecek şekilde değişime uğratılmasıyla elde edilen yarı sentetik insülinler ve insan vücudunun yaptığı insülinin yapısı ile aynı olacak şekilde genetik mühendislik teknikleri ile üretilen rekombinat (biyosentetik) insan insülini vücudumuzun ürettiği insülinine tamamıyla benzer olduğu için kullanıldığında vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinine göre çok daha azdır (27). İnsan insülini insanlardan elde edilmez, insan vücudunun yaptığı insülin moleküler yapısı ile aynı olacak şekilde üretilir. En modern insülin tipidir ve laboratuvar koşullarında bazı kimyasal metodlar kullanılarak elde edilir. İnsan insülini vücudumuzun ürettiği insülinin tamamiyle aynısı olduğu için vücudun bu insüline karşı tepki gösterme olasılığı hayvan insülinlerine göre çok daha azdır (27). 1920'li yıllarda Banting ve Best, kendilerine daha sonra Nobel ödülü getirecek olan insülinin keşfi ile diyabet tedavisinde bir dönüm noktası oluşturmuşlardır. O günden bugüne diyabet tedavisinde birçok gelişme ve ilerleme oldu. Özellikle Tip 1 diyabetikler için hayat kurtaran insülini nasıl en iyi şekilde kullanıp, hastaların yaşam sürelerini ve kalitelerini artırabiliriz diye büyük araştırmalar gerçekleşti. En büyük gelişmelerden bir tanesi 1980'li yıllarda genetik mühendisliği yöntemi ile vücudumuzda salgılanan insülin ile birebir aynı yapıda rekombinant insan insülinin üretimidir (27).
27 2.3.2.2 İnsan Büyüme Hormonu İnsan büyüme hormonu (hgh), vücutta hgh eksikliğinden kaynaklanan büyüme bozukluklarının tedavisinde kullanılır. Rekombinant üretimden önceki yıllarda bu hormon insan kadavrasından hazırlanırdı. Kadavra kaynaklı hgh özellikle virüs kontaminasyonuna hassastır ve bu ilaçla gelen viral kontaminasyon bazı hastalarda ölümcül sonuçlara neden olabilmektedir. Rekombinant hgh ise çocukların uzun süreli tedavisinde rahatlıkla kullanılmaktadır (26). Somatotrofik hormon (STH) adı da verilen büyüme hormonu (GH), adenohipofizin somatotrop hücrelerinde üretilir. İsminden de anlaşılacağı gibi büyüme hormonu organizmanın büyümesi ile ilgilidir. Kemik oluşumu üzerinde de etkisi vardır. Büyüme hormonu eksikliği izole olabileceği gibi diğer hipofiz hormonlarının eksikliği ile birlikte de görülebilir. Büyüme hormonu eksikliği 1/4000 olarak gösterilmektedir. Erkek çocuklarda daha sıktır (erkek/kız oranı 4/1). Belirgin boy kısalığı olan çocukların %3-14 ünde büyüme hormonu eksikliği vardır (28). Büyüme hormonu eksikliğinin tedavisinde Rekombinant DNA yöntemi ile hazırlanan biyosentetik insan Büyüme Hormonu kullanılmaktadır. Büyüme hormonu her gün ve cilt altı olarak uygulanmaktadır. Büyüme Hormonu tedavisinin etkinliği, tedaviye başlamanın yaşı, tedavi öncesi büyüme hızı ve farmakolojik uyarıya yanıt derecesi ile ilişkilidir (28). Son elli yıldır Somatotropinlerin (büyüme hormonunun) süt sığırlarına enjekte edildiği takdirde süt verimini artırıcı (galaktopoietik) etki yaptığı bilinmektedir. Ancak bu hormonun galaktopoietik etkisi üzerine derinlemesine araştırmalar, 1980 li yıllardaki rekombinant DNA tekniğindeki gelişmelerin bir sonucu olarak mümkün olabilmiştir. Eksojenik sığır büyüme hormonunun galaktopoietik etkisi ilk defa 1937 yılında Rus bilim adamları Asimov ve Krouze tarafından tespit edilmiş ve anterior pituitary bezinden elde edilen extraktın süt verimini artırdığı belirlenmiştir. Bu bulgular birçok araştırmacı tarafından yapılan çalışmalarla desteklenerek, süt verimini artırıcı etkinin laktasyonun süt veriminin düşmeye başladığı devrede daha etkin olduğu belirlenmiştir (29).
28 1980 li yılların başlarından itibaren, gelişen rekombinant DNA teknolojisi büyüme hormonunun üretimine olanak sağlamıştır. İlk olarak 1960 lı yıllarda ileri sürülen mikroorganizmalardan büyük çapta protein üretilmesi fikri ancak 20 yıl sonra gerçekleşmiştir. Bu metodla, memeli hayvanların büyüme hormonu sentezleme görevini yapan DNA parçası alınarak bakteri DNA sıyla birleştirilmiştir. Bu şekildeki biyoteknolojik metodla yoğun bir şekilde daha ucuz Rekombinant somatotropinlerin üretilmesi mümkün olabilmiştir (1). 2.3.2.3 Eritropoetin Böbrekte üretilen bir hormon olan eritropoetin (EPO) kemik iliğini stimüle ederek kırmızı kan hücrelerinin üretimini sağlar. FDA, kronik böbrek yetmezliğinde kullanılmak üzere EPO yu onaylamıştır (26,30). Eritropoetin (ya da EPO) eritrositler (alyuvar) için sitokin görevi gören bir glikoprotein hormondur. Hematopoetin ya da hemopoetin olarak da adlandırılır. Böbreklerde, renal kortekste tübülüsler arasındaki dar interstisyel aralıkta yer alan fibroblast benzeri hücrelerce üretilir ve eritrosit üretiminin kontrolünden sorumludur (31). Eritropoetin, memeli hücre kültüründe rekombinant DNA teknolojisi ile üretilerek tedavi amaçlı olarak da kullanılmaktadır. Böbrek yetersizliğine ya da kanser kemoterapisine bağlı anemilerin (kansızlık) tedavisinde yeri vardır. Ayrıca bisiklet yarışı, triatlon ve maraton koşusu gibi dayanaklılık gerektiren sporlarda doping amacı ile suistimal edilmektedir (31). 2.3.3 Sitokinler Sitokinler hücreler arası reaksiyonları kontrol eden hormon benzeri moleküllerdir. Lenfosit ve makrofaj gibi immün sistem hücrelerini aktive ederler (26). Rekombinant sitokinler;
29 2.3.3.1 İnterferon Potent sitokinler olan interferonlar virüslere kontrolsüz hücre proliferasyonuna karşı etkilidir. Bütün geleneksel kemoterapötik maddeler direkt olarak kanser hücresini etkiler, interferonun kanser hücresine etkisi ise, immün sistem fonksiyonlarını etkileme şeklinde, dolaylıdır. FDA, AIDS e bağlı kaposi sarkoması, saçlı hücre lösemisi, hepatit B ve genital siğiller gibi değişik hastalıkların tedavisinde kullanılan rekombinant interferonların ise geliştirme safhasındadır (32). Bunlar Hepatit C ve multiple skleroz için (β-ifn-ıa) denenmektedir (26). 2.3.3.2 İnterlökinler İnterlökinler (IL), lökositler arasında mesaj iletici fonksiyona sahiptirler. Başta kanser olmak üzere immün yetmezlik ve enfeksiyon hastalıkların tedavisi açısından önemli sitokinlerdir. İnterlökin-2 (IL-2) T-lenfositleri stimüle eder. FDA, böbrek hücreleri karsinomunda kullanılmak üzere, rekombinant IL-2 preparatını (Proleukin) onaylanmıştır (32). IL-2 nin antitümör etkisi direkt olarak dozla ilgilidir. Rekombinant insan interlökin-3 de kemoterapi amacıyla araştırılmaktadır (24). 2.3.4 Enzimler Rekombinant enzimler değişik hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. 2.3.4.1 Alteplaz Dolaşım sisteminde kan pıhtısının çözünme işlemi, bir protein olan plazminojenin proteolitik enzimle plazmine dönüşü şeklinde yürü. Bu enzimin rekombinant teknoloji ile üretilmiş şekli, akut myokard enfarktüsünde ve pulmoner embolide bu dönüşümü hızlandırmaktadır. Alteplaz rekombinant doku tipi plazminojen aktivatötüdür. Alteplaz, diğer pıhtı giderici enzimlere (streptokinaz, ürokinaz), kıyasla, daha lokal etkiye sahiptir, böylece teorik olarak alteplaz vücutta daha az kanamaya neden olur (26,30).