Prof. Dr. Mehmet KAYA İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp T p Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Çapa/Fatih/ apa/fatih/istanbul E-Posta: mehkaya@istanbul.edu.tr 1
Tarihçe Planlama Uygun model ve denek seçimi Uygun model sonuçlarının insana yansıması 2
EU; 2005: Deneysel çalışmalarda 12.1 milyon omurgalı hayvan AB Komisyon Raporu-2007. ABD, 2005; 1.2 milyon omurgalı hayvan, fare sıçan bu rakama dahil değil, Ziraat Bakanlığı verileri 3
Bilimsel araştırma ve eğitimde hayvanlar Tarihçe Tıbbi araştırmalardaki iyileşmelerin hayvan çalışmaları sonucu başladığı, geliştiği ve insan araştırmalarını desteklediği bilinmektedir. 4
Araştırma ve eğitim için hayvana niçin ihtiyacımız var? Hücre/doku/organ/sistem bağlamında fizyolojik ve patolojik mekanizmaları anlamak, Sistem ve sistemler arası ilişkiyi öğrenmek, Hastalıklara karşı tedavi yolları bulmak, Hastalık ve/veya hasara karşı bir test geliştirmek, Geleceğin bilim insanı ve hekimini yetiştirmek. 5
Hayvan verileri insana uygulanabilir mi? İnsan ve hayvanlar arasında birçok benzerlik vardır Salk İmmün fonksiyonlar: İnsan-Fare Kardiyovasküler fonksiyonlar: İnsan-Köpek Çocuk felci (Polio); Landsteiner and Popper (1908-Maymun), Jonas (1952-insanda test) Diabetes; Banting and Best (1921) köpeklerde insulinin önemini göstermiş Obesite; Fare ve Zucker obese sıçan modelleri; leptin çalışmaları. 6
Hayvan verileri insana uygulanabilir mi? Hipertansiyon sıçan, kedi ve köpek çalışmaları ile tedavi yolları Bebek Ölümleri koyun/kuzu çalışmalarıyla hiyalin membran hastalığının bebeklerde en önemli ölüm nedeni olduğunu gösterildi Sistik fibrozis genç erişkinlerde ana ölüm nedeni ile ilgili olarak fare modellerinde klorid kanallarının rolü ortaya konuldu Gen tedavi yaklaşımları genetik fare modellerinde çalışılmaktadır. 7
Hayvan çalışmalarında deneysel planlama Uygun hayvan modeli seçmeden önce Alternatifler hayvan dışı modeller (3R: Replacement-Reduction- Refinement) Zorunlu ise hayvan modeli düşünülmeli!!!!! 8
Hayvan çalışmalarında deneysel planlama Deneyler; çeşitli düzeyde organize edilen parametrelere ait etkilerin hayvan üzerinde uygulanması ve sonuçlarının elde edilmesidir. Etkili Faktörler Sistem Ölçülen/Elde Edilen Cevap Kontrol Faktörleri Araştırmacının temel hedefi deneysel süreci anlamak! 9
Hayvan çalışmalarında deneysel planlama Deneyin maliyeti Kaynak (İnsan, ekipman vs.,) Zaman Materyal 10
Hayvan çalışmalarında organizasyon 1. Planlama 2. Uygulama 3. Tamamlama 11
Hayvan çalışmalarında organizasyon 1. Planlama Problem belirlenmeli ve hedef/ler tanımlanmalı Araştırma ile ilgili bilgi toplanmalı Özgün hipotez kurulmalı 12
Hayvan çalışmalarında organizasyon 2. Uygulama Zaman/Maliyet boyutu ve kaynağı Etik kurul onayı Uygulanabilirliğin teyidi/deney planlama Uygun veri analiz yöntemlerinin belirlenmesi Sorumlulukların dağıtılması Personel eğitimi /Esas araştırmaya geçiş/veri toplama/işlenmesi. 13
Hayvan çalışmalarında organizasyon 3. Tamamlama Verilerin anlamlandırılması, Çıktıların tamamlanması ve teslim edilmesi, İdari işlerin tamamlanması Deneyimlerin değerlendirilmesi ve bunlardan ders çıkarılması. Sonuçların bilim dünyası ile paylaşılması. 14
Hayvan çalışmalarında deneysel planlama Hayvan kuralı ile Doğrulama Hayvanlar bireysel varyasyonlara sahip olduklarından; Çalışmalar, tekrarlanabilir ve doğrulanabilir olmalı, Geçerli testler kullanılmalı, Standardize alet ve prosedür kullanılmalı ve uygulanmalı, Teknik veya yöntemler; çalışmalar ve türler arasında karşılaştırma yapmak için yeteri kadar duyarlı olmalı, Uygulanan maddenin tipi/dozu ve yolu ile elde edilen sonuçlar kıyaslanabilir olmalıdır. 15
Bilimsel araştırma ve eğitimde hayvanlar Hayvan Modeli; Normal biyoloji ya da davranışların çalışılabileceği, Kendiliğinden ya da indüklenmiş bir patolojik durumun araştırılması, Bir biyolojik işlev yönünden insan ya da diğer hayvan türlerine benzerlik gösteren hayvanların kullanıldığı model olarak tarif edilir. 16
Deneysel model seçiminde dikkat edilmesi gereken adımlar Uygun hayvan modeli seçiminde; Planlanan türe ait; Anatomik, Fizyolojik, Davranış karakterlerinin iyi bilinmesi Araştırmanın amacına uygun devamı ve tamamlanabilmesi için gereklidir. 17
Deneysel model seçiminde dikkat edilmesi gereken adımlar Model hayvan seçiminde dikkatli ve titiz davranılmalı, Araştırmalar önceden ayrıntılı bir şekilde planlanmalı, Planlanan deneye ait özellikteki hayvanlar seçilmeli, Tür, soy, spontan, transgenik ve saf döl gibi özelliklere dikkat edilmeli, Minimal hayvan sayısı ile ideal veri elde edilmeli, Kontrol (vehicle-treated control group) kullanılmalı. 18
Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar Genç sağlıklı erkek veya dişi (tek seks) seçilmeli Doğum yapmamış dişi tercih edilmeli Parazit ve patojen free olmalı Çalışmanın başlangıcındaki hayvan ağırlıkları, çalışma sırasında ± %20 yi aşmamalıdır. Çalışmalarda genelde sıçan veya fare tercih edilmektedir 19
Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar Hedef türdeki normal yaşam şartlarını temsil etmeli, Seçilen model ne olursa olsun, çok iyi tanımlanmalı, Diğer araştırmacılara modelin yol gösterici olması için soy, alt soy ve mümkünse genetik özellikleri ifade edilmeli, Hayvanın mikrobiyolojik durumu ve florası dikkate alınmalı, Normal fare ile patojen-free fare nin çeşitli ajanlara verdikleri yanıt birbirinden farklıdır. 20
Hayvan modeli seçiminde etkili faktörler Uygun plan ve istatistiğe göre kullanılacak hayvan sayısı, Önerilen çalışmada model veya organ sisteminin uygunluğu, Modelin genetik durumu, Deneysel olarak oluşturulan modellerin doğası, Uygulamalara hayvanın cevabı, Çevrenin spesifik hayvan modeli üzerine etkisi, Kullanılan hayvan ile ilgili önceki bilgiler. 21
Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar Tür seçimi sadece imkan, deneyim ve maliyete dayandırılmalı, Araştırmacı modele aşina değilse, deneyim sahibi kişi ile gerekirse temasa geçmeli, Deneyimli bilim insanı yayınlarında belirtmediği püf noktaları hakkında bilgi verebilir veya öneride bulunabilir. 22
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler Hayvan faktörü Fiziki ve çevresel faktör Bakım yeri Hayvan bakımı ve yaklaşımı Hayvan özel bakım gerektiriyorsa (Genetik modeller veya domuz, maymun vs.); Bakım koşulları Tecrübeli bakıcı 23
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler Hayvan faktörleri Vücut hacmi Yaşam süresi/yaş/ Seks/Hamilelik durumu Genetik; Inbred/Outbred/Mutant/Genetik olarak modifiye edilme Biyolojik Ritim Mikrobiyolojik ortam/latent (subklinik veya sessiz) enfeksiyonlar Stres varlığı/hastalık Fiyat ve bakımı 24
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler 25
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler Deney hayvanlarının yaşam kalitesi Bakım Yeri; Hayvanın normal yaşamı (diyet, barınma olanakları), Patojen-free hayvanların yaşadıkları alanlar ile normal laboratuvar hayvanlarının yaşadıkları alan şartları farklı olup, bu durumun çalışma sonuçlarını etkileyebileceği dikkate alınmalı. 26
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler Deney hayvanlarının yaşam kalitesi Metabolizmayı etkileyen değişkenler kontrol edilmeli; Diyet alışkanlıkları/ cins /yaş, Uygulama yolu/zamanı/doz miktarı, Örnekleme yeri ve zamanı, Yılın hangi mevsimi olduğu, Günlük vücut ısısı ve diürnal varyasyonlar Kemirgende metabolizma insandan hızlı (örn. Sıçanda kalp fr. 325-350), Metabolizmanın kontrolü ve işleyişi vücut büyüklüğü arttıkça yavaşlar ve ilaç dozları buna göre ayarlanmalıdır. 27
Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler Cinsiyet ve gelişim Cinsiyet, ilacın kan yarı ömrünü etkileyebilir. Aynı çevre koşullarında genç erkek sıçanlar dişi sıçanlara göre daha hızlı bir şekilde kilo alır. 28
Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar Uygun hayvan seçiminde en iyi örneklerden biri vasküler restenoz ile ilgili çalışmalarda görülmektedir. Domuz ve maymunda anjiyoplasti sonrası restenoz ile ilgili sonuçlar küçük hayvanlardan elde edilen verilere kıyasla insandakine daha yakın. Yeni model tanımlanması için literatür taraması yapıp, hangi modelin mümkün ve gerçekçi olduğuna karar verilmelidir. 29
Hayvan modelinde seçim kriterleri; Tür Bir hayvan modelinde temel veri elemanları Patogenez Gerekli işlemler Maliyet Test Sistemi Aşı / Terapötik Doz Ajanın özelllikleri Ajanın uygulanması Etken doz 30
Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar Ajanın özelliği Etki yolu insandaki gibi olmalı; inhalasyon, oral, vs., Etki kantite edilebilmeli Etken doz tekrarlandığında aynı sonuçlar alınabilmeli, Doz ve sonuç arasındaki ölçeklenebilir bir ilişki gösterilmeli, Hastalık nedeni ajan insanda hastalığa sebep olan ajanın aynısı olmalı, Patojenik tayin ediciler Bir ajan patolojiye nasıl sebep olur? Bakterinin toksin üretimi Bir organı hedefleme ve zarar verme 31
Patogenez Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar İnsandaki hastalık seyrine benzerlik SEB (Staphylococcal enterotoxin B): İnsan ve maymunda kusma ve ateş Yüksek dozlarda ölüm, Anthrax (Bacillus anthracis): İnsan ve maymunda genişlemiş mediasten, Q-Fever (Coxiella burnetii): İnsan ve maymunlarda pnömoni, Botulinum (Clostridium botulinum): Yaklaşık tüm türlerde paralizi nedeni. 32
Solunum sistemi araştırmasında uygun hayvan seçimi Gerekli işlemler Daha büyük hayvan modeli Alınacak kan miktarı Vücut ağırlığında limit Akciğer röntgen filmi çekimleri Sabit fizyolojik izleme vs., klinik gözlemler Telemetri vs., Etki yolu İnhalasyon (Baş, Burun- veya tüm vücut) Parenteral/Oral /Dermal 33
Deneysel protokole uygun hayvan seçimi Örnek deney planı Hedef: X hastalığının belirtilerini yok etmek için bir ilaç geliştirmek Spesifik hedefler: X hastalığına maruz bırakılan sıçanlarda akciğer fonksiyon değişkenleri üzerine bir ilacın etkisini araştırmak Deneysel Tasarım: Toplam 4 grupta 32 hayvan (her grup için; n=8) 3 gruptaki hayvanlar karsinojenin farklı düzeyine maruz bırakılacak, Bir grup kontrol olarak kullanılacak. Akciğer fonksiyon değişkenleri tüm gruplardaki herbir 34 sıçanda ölçülecektir.
Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar Hayvan test sonuçlarına güvenmemek yanlışlara yöneltebilir ve binlerce insanın yaşamı ya da sağlığına mal olabilir. Bir deney hayvanına zehirli veya etkisiz olan bir madde, insan için zehirsiz veya etkili olabilir. Filogenetik ilişki veya anatomik uygunluk fizyolojik davranışlar için güvenilir bir özellik değildir. Astım ve bronşit çalışmalarında sıçanlar prediktif bir model olarak yetersiz kalmaktadır. 35
Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar Hayvan modeli her zaman orijinal durumu tam olarak temsil etmez. Modeller kesinlikle son sözü söylemez, fakat yaklaşık bir fikir verir. 36
İndüklenmiş hayvan modelleri Cerrahi veya kimyasal ajanlarla indüklenen hastalık modelleri STZ ile diyabet ya da CCl4 ile karaciğer yetmezliği oluşturmak gibi Bilim insanları, bir türden diğerine bilgiyi aktarabilmek için bu türlerin insana benzemesini isteselerde filogenetik benzerlik çıkarılan sonucun uygunluğunu garanti kılmaz. 37
İndüklenmiş hayvan modelleri Transgenik modeller de genomlarına yapay olarak yerleştirilmiş yabancı bir DNA içeren hayvanlar indüklenmiş modeller grubuna girer. Son zamanlarda knock-out başlamış, modeller gündeme girmeye Pratikte transgenik modeller için tercih edilen tür fare, ancak diğer türleri de bu amaçla kullanmak eğilimi giderek artmakta, Transgenik hayvanlarda şimdiye kadar bilinmeyen hastalıklar geliştirilebildiği ya da distres bulguları göstermek zor olduğu için bu hayvanların bakımına özel bir özen göstermek gerekir. 38
Spontan hayvan modelleri Genetik olarak kendiliğinden gelişen ve insanlardaki hastalığa benzer patoloji ve semptomlar gösteren hayvanlarda geliştirilen modellerdir. Çeşitli hastalıklarla ilgili spontan modelleri oluşturmak için doğal olarak genetik varyantlardan yararlanılır. 39
Negatif hayvan modelleri Fizyolojik bir olayı aydınlatmak için karşılaşılan zorlukları aşmak için kullanılırlar Bazı hayvan tür/soylarında bazı hastalıklar hiç görülmez Tavşanda gonokok enfeksiyonu gibi özel bir durumun geliştirilemediği negatif model sözkonusu Hayvan bilinen bir uyarıya reaksiyon vermez. 40
Olası modeller (Orphan modeller) Bazı hastalıklar, öncelikle hayvanlarda tanımlanmış daha sonra insanlarda benzeri tanımlanabilir amacı ile çalışılan modellerdir. Daha sonra benzer bir hastalık insanlarda görülürse model adapte edilir. Örneğin, Papilomatozis, Marek hastalığı ve Deli Dana Hastalığı. 41
Laboratuvar hayvanlarının genetiğine göre sınıflandırılması İNBRED HAYVANLAR; Kardeşlerin çiftleşmesinden en az 20 jenerasyon sonra elde edilen hayvanlardır. Tüm hayvanlar genetik olarak benzerdir, çünkü kardeşlerin çiftleşmesi ile genetik mutasyonlar ortadan kalkar. OUTBRED HAYVANLAR; Kardeş olmayan hayvanların çiftleşmesiyle elde edilirler. Çok yavru verebilen bu hayvanlar aynı görünümdedir, ancak genetik olarak farklılık gösterirler. 42
F1 Hibridler ve mutant soylar F1 HİBRİDLER İki farklı inbred soyun ilk çaprazlaması sonucu elde edilir. Genetik olarak benzerdirler, ancak üreme yetenekleri yoktur. MUTANT SOYLAR Farelerde 500 den fazla mutasyon bildirilmiştir. Sıçan, hamster, tavşan, kobay, kedi, köpek ve domuzda mutantlar vardır. 43
Sık kullanılan deney hayvanları FARE, SIÇAN, KOBAY, TAVŞAN... Anatomik olarak küçük olmaları, yaşam sürelerinin kısalığı, manipulasyon kolaylığı ve kolayca üretimlerinden dolayı edilirler. deneysel çalışmalarda tercih Özellikle, bu memeli omurgalılar insanlarda görülen pek çok spesifik hastalık için birebir model olabilirler. 44
Sık kullanılan deney hayvanları; Fare Küçük gövdeli oluşu ve genetik yapıları en iyi bilinen omurgalı türü olması biyomedikal çalışmalarda en fazla tercih nedeni, İnbred ve transgenik olmak üzere 500 den fazla değişik soyu mevcut, İnbred soyları arasında hem anatomik hem de fizyolojik açıdan farklılıklar mevcut, Çok sayıda mutasyonlarının varlığı tercih nedenidir. genetik çalışmalarda 45
Sık kullanılan deney hayvanları; Fare-Mouse Davranış, embriyoloji, teratoloji ve viroloji ile ilgili çalışmalarda, İmmünosupresif ajanlar ve ilaçların incelenmesinde, Farmasötik ürünlerin güvenliği ve etkinliğinin belirlenmesinde, Kısa ömürlü olduklarından kronik toksik çalışmalara uygun bir hayvan modeli olarak kabul edilirler. Deneylerde kullanılan tüm hayvanlarının %70-80 ini oluşturur. 46
Sık kullanılan deney hayvanları; Sıçan-Rat Anatomik yapısı fareye benzer ve fareden sonra en çok kullanılan omurgalı, Fizyolojik olarak insanlara da büyük benzerlik gösterir, İnbred soylarının pek çoğu ilk sıçan soyu olan Wistar albino elde edilmiş, Büyük uyum gücü ve dayanıklılığı bu hayvanları birçok deneysel araştırma için en uygun model yapar, Fizyo/patolojik mekanizmaların izahında ve besin yoksunluğuna karşı yüksek toleransa sahip olduklarından beslenme araştırmalarında kullanılırlar. 47
Sık kullanılan deney hayvanları; Kobay-Guinea pig Ucuz, bakımı kolay ve uysal olmaları çalışmalarda tercih nedeni, Başlıca serum, aşı ve diğer biyolojik maddelerin üretiminde, İmmün yanıt ve anaflaktik şok çalışmalarında, Toksikolojik çalışmalarda, Mikroorganizmalar için iyi bir konak olduklarından tbc, difteri ve brusella gibi hastalıklarla ilgili çalışmalarda kulanılırlar. 48
Sık kullanılan deney hayvanları; Tavşan-Rabbit Vücut ağırlığı 2 kg dan daha az Alman soyu ve 2-5 kg olan Beyaz Yeni Zelanda soyu tercih edilir. Aterosklerozda kullanılan ilk hayvan modeli, Hipertansiyon ve İmmünolojik çalışmalarda tercih nedeni, Çinçilla tavşanları von Willebrand s_ von Willebrand factor yetmezliği-bir tür hemofili. hastalığı özelliği taşır, Ayrıca antiserum üretimi, kalıtsal glokom çalışmaları, rutin toksikolojik ve pirojen testlerinde tercih edilirler. 49
Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması Deneysel hayvan modellerinden elde edilen sonuçlar; İnsan için kalitatif ya da kantitatif olarak uyarlanabilir olmakta, Farmakokinetik ve/veya dinamiği üzerinden insanda bir etkili doz seçimine katkı sağlamakta, İnsanda hastalık ve ölüm oranında azalmaya yol açmakta, Aşikar bir şekilde insan sağlığına fayda sağlamaktadır. 50
Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması Hayvandan elde edilen bilginin insana doğrudan aktarılabilmesi bir sonraki adıma kalmakta ve garanti edilememektedir. Buğünün hayvan deney sonuçları yarının doğru veya yanlışları olmaya devam edecektir. 51
Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması SONUÇ OLARAK; Deneysel çalışmalarda temel koşul, hayvan haklarına riayet ederek insanlığa yararlı bilgiler sağlamak için Hayvan Modelleri şimdilik geçerliliğini korumaya devam etmektedir. 52
M.Ö: 3000; Anadolu da Hititler & Hitit li genç bayan 53