İNSAN OLGULARININ GÖRÜLDÜĞÜ ENDEMİK BÖLGELERDEKİ MEMELİ ÇİFTLİK HAYVANLARINDA HANTAVİRUSLARIN MOLEKÜLER VE SEROLOJİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İNSAN OLGULARININ GÖRÜLDÜĞÜ ENDEMİK BÖLGELERDEKİ MEMELİ ÇİFTLİK HAYVANLARINDA HANTAVİRUSLARIN MOLEKÜLER VE SEROLOJİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Yavuz Uyar VİROLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Yılmaz AKÇA 2014- ANKARA

iii İÇİNDEKİLER Sayfa No Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii v vi vii viii 1. GİRİŞ 1 1.1. Hantavirüsler, Genom Yapısı ve Viral Morfolojisi 1 1.1.1. Hantavirüsler 1 1.1.2. Hantavirüslerin Genom Yapısı ve Viral Morfolojisi 4 1.1.3. Hantavirüslerin Replikasyonu 7 1.2. Hantavirus Tipleri 7 1.3. Hantavirüs Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi 13 1.4. Hantavirusler ve Konakçı İlişkileri 16 1.4.1. Kemiriciler (Rodentler) ve Böcek Yiyiciler (İnsektivorlar) 16 1.4.2. Vahşi (Yabanıl) Hayvanlar 20 1.4.3. Evcil Memeli Hayvanlar 20 1.4.4. Konakçı Türleriyle İlgili Ülkemizde Yapılan Çalışmalar 20 1.5. Hantavirusun Bulaş Yolları 21 1.6. Konakçı Duyarlılığı ve Klinik 23 1.6.1. Nephropathia epidemica (NE) 24 1.6.2. Renal sendromlu kanamalı ateş (RSKA, HFRS: Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome) 24 1.6.3. Hantapulmoner Sendrom (HPS) 26 1.7. Hantavirus enfeksiyonlarında patofizyoloji ve immünoloji 27 1.7.1. Hantavirusun Viral Replikasyon Döngüsü 27 1.7.2. İmmünoloji 29 1.7.2.1. Humoral Bağışık Yanıt 29 1.7.2.2. Hücresel Bağışık Yanıt 29 1.8. Laboratuvar Tanı 30 1.8.1. Hantavirus Enfeksiyonlarında Mikroskopi 30 1.8.2. Hantavirus Enfeksiyonlarında Hücre Kültürü: 30 1.8.3. Hantavirus Enfeksiyonlarınının Tanısında Antijen Testleri: 30 1.8.4. Hantavirus Enfeksiyonlarında Serolojik testler: 31 1.8.5. Hantavirus Enfeksiyonlarında Nükleik Asit Saptama Yöntemleri 33 1.8.6. Hantavirus Enfeksiyonlarında Serosürveyans 34 1.8.7. Serotiplendirme/genotiplendirme 35 1.9. Hantavirus Enfeksiyonlarının Tedavisi 35 1.10. Hantavirus Enfeksiyonlarından Korunma 36 1.11. Amaç 36 2. GEREÇ VE YÖNTEM 38 2.1. Gereç 38 2.1.1. Çalışma Bölgesinin Seçilmesi 40 2.1.2. Çalışmaya Dahil Edilen Memeli Çiftlik Hayvanları 41 2.2. Yöntem 43 2.2.1. Tanı Materyalleri (Serum ve Tam kan) 43

iv 2.2.2. RNA İzolasyonu 43 2.2.3. cdna (komplementer DNA) sentezi (Reverz Transkripsiyon) 43 2.2.3.1. İlk zincir komplementer DNA sentezi (First strand cdna) 43 2.2.4. PCR spesifik primerleri 44 2.2.5. PCR 45 2.2.6. PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforez Yöntemi ile Görüntülenmesi 47 2.2.7. DOBV ve PUUV cdna Pozitif Kontroller 47 2.2.8. Anti-Hantavirus IgG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) testlerinin çalışılması 47 2.2.9. Konjugatların Hazırlanması 48 2.2.10. ELISA Testlerinin Eşik Değerinin (Cut-off value) Hesaplanması 48 2.2.11. İndirek İmmünfloresan Antikor Tekniği (IFAT) 49 3. BULGULAR 50 3.1. PCR Sonuçları 51 3.2. ELISA Sonuçları 53 3.2.1. Anti-Hantavirus IgG ELISA sonuçları 53 3.3. IFAT Sonuçları 56 3.3.1. Sığırlarda anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları 56 3.3.2. Koyunlarda anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları 57 3.3.3. Köpeklerde anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları 58 4. TARTIŞMA 60 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 70 ÖZET 72 SUMMARY 73 KAYNAKLAR 74 EKLER 84 EK-1 84 EK-2 86 EK-3 87 ÖZGEÇMİŞ 88

v ÖNSÖZ Hantavirüs enfeksiyonları, Bunyaviridae ailesinin Hantavirus cinsinin bazı üyeleri tarafından meydana gelen kemirici (rodent) ve böcek yiyici (insektivor) kaynaklı zoonoz karakterli enfeksiyonlardır. Hantavirus enfeksiyonları, insanlarda renal sendromlu kanamalı ateş ve Hantaviral pulmoner sendrom klinik tablolarına neden olmaktadır. Ülkemizde, ilk defa 2009 yılında Bartın ve Zonguldak tan 24 insan olgusu ve ardından Giresun ilinden iki hantavirus renal sendromu enfeksiyonlu olgu bildirilmiştir. Bu tez çalışmasında; Hantavirüs insan olgularının tespit edildiği, seroepidemiyolojik çalışmada insanlarda pozitifliğin saptandığı ve hastalığın vektörü olan kemirgenlerde virolojik ve serolojik olarak hantavirüs serotiplerinin varlığının gösterildiği Giresun ili Dereli ilçesindeki bazı evcil memeli çiftlik hayvanlarında (sığır, koyun, köpek ve at) hantavirüs varlığının serolojik ve moleküler tekniklerle araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışmanın her aşamasında özveri, olumlu yönlendiriciliği, sabır ve yapıcı eleştirilerinden dolayı, Danışman Hocam ve Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Yılmaz AKÇA ya, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı nın tüm olanaklarından faydalanmamı sağlayan ve tez izleme komitesi çalışmalarımda olumlu yönlendirmeleri ile katkıda bulunan yardım ve desteklerini gördüğüm Prof. Dr. Aykut ÖZKUL ve Prof. Dr. Feray ALKAN a, Viroloji Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. Seval BİLGE DAĞALP, Doç. Dr. M. Taner KARAOĞLU ve Doç. Dr. T. Çiğdem OĞUZOĞLU ile tez izleme komitesi üyesi Prof. Dr. Hakan YARDIMCI ve Anabilim Dalımızın emekli öğretim üyesi Prof. Dr. İbrahim BURGU ya, çalışmanın proje desteğini sağlayan kurumum Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığına, saha çalışmalarında yardımcı olan Samsun Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğüne, Dereli İlçe Gıda, Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü ne, doktora tez çalışmam boyunca birlikte görev yaptığım Araştırma Görevlisi ve Doktora Öğrencisi arkadaşlarıma ve tez çalışmama katkıda bulunan herkese teşekkür ederim. Her zaman gösterdikleri fedakarlık, sabır ve teşviklerinden dolayı sevgili aileme ve mesai arkadaşlarıma en içten teşekkürlerimi sunarım.

vi SİMGELER VE KISALTMALAR ANDV : Andes virus cdna : Komplementer deoksiribonükleik asit C : Santigrat derece dntp : Deoksi nukleotid tri phosphate DOBV : Dobrava virus ELISA : Enyme Linked Immunsorbent Assay FFRNT : Flouroescent focus reduction neutralisation test FITC : Flourescene izothiyocyonate grna : Genomik RNA HPS : Hantaviral pulmoner sendrom HTNV : Hantaan virus IgG : İmmunglobulin G IgM : İmmunglobulin M İD : İndeks Değer IFAT : İndirekt İmmunfloresan Antikor Tekniği L segment : Large (büyük) segment M segment : Medium (orta) segment µl : Mikrolitre nm : Nanometre NE : Nephropathia epidemica NP : Nükleoprotein ORF : Open reading frames (açık okuma çerçevesi) PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PUUV : Puumala virus RNA : Ribonükleik asit RSKA : Renal sendromlu kanamalı ateş RT-PZR : Reverz transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu S Segment : Small (küçük) segment SAAV : Saaremavirus SD : Standart deviation (Standart sapma) SEOV : Seoul virus SNV : Sin Nombre virüs Taq : Thermus aquaticus TUUV : Tuula virus

vii ŞEKİLLER Sayfa No Şekil 1.1. Hantavirüs enfeksiyonlarının dünya genelinde yıllık insidansı 2 Şekil 1.2. Hantavirüsler ve onların böcek yiyici ve kemirici türleri arasındaki filogenetik ilişki 3 Şekil 1.3. Hantavirus morfolojisinin şeması 5 Şekil 1.4. Hantavirüsün S segment ORF sekansına göre hazırlanmış genetik ağaç 11 Şekil 1.5. Eski ve Yeni Dünya hantavirüsleri, taşıyıcı kemiricileri ve görüldüğü ülkelerin/ kıtaların genetik ağaç ile birlikte görünümü 12 Şekil 1.6. Avrupa ülkelerinde RSKA nın seroprevalansı ve insidansı 15 Şekil 1.7. Avrupa daki taşıyıcı vektör kemiricilerr ve hantavirüslerin dağılımı 18 Şekil 1.8. Avrupa da görülen patojen hantavirüs taşıyıcısı kemiricilerin dağılımı 19 Şekil 1.9. Hantavirusun solunum yolu ile bulaşını şematik olarak gösterimi 23 Şekil 1.10. PUUV ve DOBV enfeksiyonunda dönemlerine göre tipik laboratuvar bulguları 25 Şekil 1.11. Hantavirüsün viral replikasyon döngüsü 28 Şekil 2.1. Çalışmanın yapıldığı Giresun İli Dereli İlçesi 39 Şekil 2.2. Gözalan ve ark (2013) tarafından Giresun İli nde normal sağlıklı popülasyonda yapılan seroepidemiyolojik çalışmada pozitiflik saptanan yerleşim birimlerinin gösteren harita 41 Şekil 3.1. DOBV ve PUUV spesifik primerleri ile pozitif kontrol ve negatif kontrol deneme çalışmasına ait jel elektroforez görüntüsü 51 Şekil 3.2. DOBV spesifik primerleri ile çalışılan örneklere ait jel elektroforez görüntüsü 52 Şekil 3.3. PUUV spesifik primerleri ile çalışılan örneklere ait jel elektroforez görüntüsü 52 Şekil 3.4. Anti-bovine Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü 55 Şekil 3.5. Anti-sheep Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü 55 Şekil 3.6. Anti-horse Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü 56 Şekil 3.7. IFAT ile pozitiflik saptanan (köpek serumu) örneğe ait immünfloresan mikroskopta 40x büyütmede görüntüsü 59 Şekil 3.8. IFAT ile negatif kontrol görüntüsü 59

viii ÇİZELGELER Sayfa No Çizelge 1.1. Bunyaviridea ailesi içinde seçilmiş bazı önemli patojenler, oluşturdukları hastalıklar, ana vektörleri ve coğrafik dağılımı 6 Çizelge 1.2. HTNV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar 8 Çizelge 1.3. PUUV-PHV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar 9 Çizelge 1.4. PUUV-PHV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar 10 Çizelge 1. 5. Avrupa'da dolaşımda olan Hantavirüsler, konakları ve oluşturduğu hastalıklar 13 Çizelge 1.6. Hantavirus enfeksiyonunun Avrupa ülkelerinde görülen yaklaşık yıllık olgu sayıları ve seroprevalans oranları 14 Çizelge 2.1. Dereli İlçesi'nde çalışmaya dahil edilen evcil hayvan türlerinin yerleşim birimlerine göre dağılımı 42 Çizelge 2.2. Alınan örneklerin memeli hayvan türlerine göre dağılımı 42 Çizelge 2.3. Çalışmada kullanılan DOBV ve PUUV spesifik primerleri. 45 Çizelge 2.4. Çalışmada kullanılan PCR karışım bileşenleri ve miktarları 46 Çizelge 2.5. Çalışmada kullanılan PCR ısı döngüsü ve döngü sayısı 46 Çizelge 3.1. Evcil Hayvanlarda anti-hantavirus IgG sonuçlarının tür düzeyinde dağılımı 53 Çizelge 3.2. Giresun ili Dereli İlçesinden Bazı Evcil Hayvanlarında anti-hantavirus IgG ELISA Pozitif sonuçlarının yerleşim birimlerine göre dağılımı 54 Çizelge 3.3. Sığırlarda ELISA ile IgG pozitifliği saptanan serum örneklerinde IFAT sonuçlarının dağılımı 57 Çizelge 3.4. Koyunlarda ELISA ile IgG pozitifliği saptanan serum örneklerinde IFAT Sonuçlarının dağılımı 58 Çizelge 4.1. Dünya da Sığır, Koyun ve At Türü Evcil Hayvanlarda ve Köpeklerde Yapılan Hantavirus Araştırma Çalışmaları ve Bulunan Sonuçları 66

1 1. GİRİŞ 1.1. Hantaviruslar, Genom Yapısı ve Viral Morfolojisi 1.1.1. Hantaviruslar Hantavirus enfeksiyonları, Bunyaviridae ailesinin Hantavirus cinsinin bazı üyeleri tarafından meydana gelen kemirici (rodent) ve böcek yiyici (insektivor) kaynaklı zoonoz karakterli enfeksiyonlardır (Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008). Hantavirus enfeksiyonları, insanlarda renal sendromlu kanamalı ateş (RSKA, hemorrhagic fever with renal syndrome) ve Hantaviral pulmoner sendrom (HPS) klinik tablolarına neden olmaktadır (Muranyi ve ark., 2005). Hantaviruslar biyolojik silah ajanı olarak sınıflandırılan mikroorganizamalar arasında yer almaktadır (Uyar ve Akçalı, 2006). Tarihsel olarak geriye doğru gidildiğinde M.S. ilk bin yılda Çin'de ve Orta Çağ döneminde İngiltere de Hantaviruslarle oluşan enfeksiyonlara benzer klinik tanımlamalar bildirilmiştir (Muranyi et al., 2005). Yakın tarihlere geldiğimizde, 1951-1953 yılları arasındaki Kore Savaşı hantavirus enfeksiyonuna küresel bir dikkat çekilmesine neden olmuştur. Kore'de bulunan Hantaan isimli küçük bir nehire yakın yerleşimli 3.000 kadar Birleşmiş Milletler ve Amerika Birleşik Devletleri askeri akut böbrek yetmezliği ve şok ile karekterize, %7 ölüm oranı ile seyereden akut ateşli bir hastalığa maruz kalmışlardır (Muranyi et al., 2005). Yıllar sonra yapılan çalışmalar sonucunda; 1978 yılında Hantaan virüs (HTNV) Lee ve ark tarafından tanımlanmıştır (Lee et al., 1978, Lee et al., 2004). Sürveyans çalışmaları Apodemus agrarius ve A. peninsulae türü kemiriciler ile bulaşan Hantaan (HTNV) ve HTNV-benzeri virüslerin Uzak Doğu Rusya, Çin ve Güney Kore de yerleştiğini göstermektedir. Dobrava virus (DOBV) ve Dobrava benzeri virüsler ise Apodemus flavicollis, A. agrarius ve A. ponticus tarafından

2 taşınır ve Avrupa da görülmektedir. 1980 lerde Asya ve Avrupa da RSKA ya neden olan sıçan kaynaklı Seoul virüs (SEOV) bulunmuştur. Hafif seyirli RSKA (Nefropathia epidemica) ya neden olan ve Myodes glareolus tarafından taşınan Puumala virus (PUUV) ise Avrupa da yaygın olarak görülmektedir (Jonsson et al., 2010). Dünya genelinde her yıl yaklaşık 150.000-200.000 hantavirüs enfeksiyonu olgusu görülmektedir (Muranyi et al., 2005). Şekil 1.1'de Hantavirus enfeksiyonlarının ülkeler bazında yıllık insidansı verilmiştir (Vaheri ve ark., 2013). Şekil.1.1. Hantavirus enfeksiyonlarının dünya genelinde yıllık insidansı (HPS: Hantaviral pulmoner sendrom, RSKA: renal sendromlu kanamalı ateş, NE: Nefropathia epidemica (Jonsson ve ark., 2010). Ülkemizde, ilk defa 2009 yılında Batı Karadeniz Bölgesi ndeki illerden (Bartın ve Zonguldak) hantavirus renal sendromu enfeksiyonlu 24 insan vakası ve Giresun ilinden iki vaka bildirilmiştir (Ertek ve Buzgan, 2009; Kaya ve ark. 2010). Bu güne kadar 21 farklı hantavirus türü tanımlanmış olup, otuzdan fazla genotipin dünya genelinde yaygın olarak bulunabilmektedir (Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008). Hantavirus alttiplerinden 11 adedinin insanlarda hastalık ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003).

3 Şekil. 1.2- (a) Hantaviruslar ve onların böcek yiyici ve kemirici türleri arasındaki filogenetik ilişki. (b) Konak virüs ilişkileri kollar renklendirilerek primer görüldüğü coğrafya gösterilmiştir. (Ramsden ve ark., 2009) Kısaltmalar: ANDV, Andes; ORNV, Oran; BERV, Bermejo; LECV, Lechiguanas; ARQV, Araraquara; MACV, Maciel; PERV, Pergamino; ANJV, Anajatuba; RIOMM, Rio Mearim; RIOMV, Rio Mamore; LANV, Laguna Negra; BRV, Blue River; CCV, Convict Creek; FCV, Four Corners; SNV, Sin Nombre; NYV, New York; BAYV, Bayou; MULV, Muleshoe; BCCV, Black Creek Canal; CADV, Cano Delgadito; ELMCV, El Moro Canyon; RIOSV, Rio Segundo; KHAV, Khabarovsk; PUUV, Puumala; MUJUV, Muju; TULV, Tula; ILAV, Isla Vista; PHV, Prospect Hill; DOBV, Dobrava; SARV, Saarema; HNTV, Hantaan; HOJOV, Hojo; LEEV, Lee; SEOV, Seoul; THAIV, Thailand; ARV, Ash River; JMSV, Jemez Springs; CBNV, Cao Bang; CPRV, Camp Ripley; TGNV, Tanganya; TPMV, Thottapalayam.]

4 Hantavirus türleri arasındaki genetik ve antijenik ilişkinin derecesi, virüsün konağı olan kemiriciler ile arasındaki filogenetik ilişkinin derecesi ile de bağlantılıdır. Bu gözlemler, hantavirusun kendine ait kemirici konağı ile beraber milyonlarca yıldan günümüze kadar birlikte evrimleştiği ve yine birlikte ayrışmaya gittiği tezini akla getirmiş olsa da bu konuda yapılan filogenetik ve Bayesian araştırmaları farklı sonuçlar ortaya çıkarmıştır (Guo ve ark., 2013; Plyusnina ve ark., 2009; Ramsden ve ark., 2009). Ancak yine de aşağıda Şekil 1.2 de görüldüğü üzere virüsler tek tip kemirici veya böcek yiyiciler tarafından taşınmaktadır (Ramsden ve ark., 2009). Hantaviruslar pleomorfik yapıda, ortalama 100 nm çapında, çift katmanlı bir lipid zarfla çevrilidir. Elektron mikroskop ile incelendiğinde viral zarf ızgara benzeri yapıda görülmektedir (Vapalahti ve ark., 2003; Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008). Hantaviruslar, Bunyaviridea ailesinin beş cinsinden biridir. Bunyaviridea ailesi; Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus ve Tospovirus tan oluşmaktadır. Çizelge 1.1 de Bunyaviridea ailesinden seçilmiş bazı önemli patojenler, oluşturdukları hastalıklar, ana vektörleri ve coğrafik dağılımları verilmiştir. Tospovirüsler bitki virüsleri olup diğerleri insanlarda enfeksiyon oluşturabilen vektör kaynaklı ve zoonotik enfeksiyonlara neden olabilirler (Elliott ve ark., 2009; Guu ve ark., 2012). Hantaviruslar, RNA virüsü olduklarından konak hücrenin sitoplazması içinde replike olurlar (Muranyi ve ark., 2005). 1.1.2. Hantavirusların Genom Yapısı ve Viral Morfolojisi Hantaviruslarin genomu üç adet; tek zincirli, negatif polariteli S (small), M (medium), ve L (large) RNA dan oluşmaktadır. S segmenti, nükleokapsid proteinini (NP), M segmenti yüzey zarf glikoproteinlerini (G1 ve G2), L segmenti ise RNAbağımlı RNA polimeraz enzimini kodlamaktadır (Muranyi ve ark., 2005; Pulyisnin

5 ve ark., 1996; Vapalahti ve ark., 2003) (Şekil 1.3). Bunlara ilave olarak hantavirus genomu içinde minör ORF (open reading frames) la vardır. NP, ana yapısal protein olup, viral RNA genomu segmentleri ile kompleks halde bulunur (Muranyi ve ark., 2005). RNA genomunun büyüklüğü HTNV için 11.845 nükleotid ve Sin Nombre virüs (SNV) için 12.317 nükleotid uzunluktadır (Jonsson et al., 2010). Hantavirus virionları doğal olarak genellikle sferik yapıda ve 80-120 nm çapındadır (Jonsson et al., 2010). Şekil 1.3. Hantavirus morfolojisinin şeması. S (small), M (medium), ve L (large) (-) ssrna segmentleri sırasıyla nükleokapsid proteini, glikoprotein G1 ve G2 ve RNAbağımlı RNA polimerazı kodlamaktadır (Muranyi ve ark., 2005).

6 Çizelge 1.1. Bunyaviridea ailesi içinde seçilmiş bazı önemli patojenler, oluşturdukları hastalıklar, ana vektörleri ve coğrafik dağılımı (Elliot ve ark., 2009). Tür / virus Hastalık Ana vektör Orthobunyavirus Akabane Cache Valley Sığır: düşük ve doğumsal defektler Koyun, sığır: Doğumsal genital defektler Küçük sinekler (Midge) Sivrisinek (Mosquito) Coğrafik Dağılımı Afrika, Asya, Avusturalya Kuzey Amerika La Crosse İnsan: ensefalit Sivrisinek Kuzey Amerika Ngari İnsan: kanamalı ateş Sivrisinek Afrika Oropouche İnsan: ateş Küçük sinekler Güney Amerika Tahyna İnsan: ateş Sivrisinek Avrupa Hantavirus Hantaan (HTNV) İnsan: renal sendromlu ciddi kanamalı ateş (RSKA), ölüm oarnı %5 15 Tarla faresi Doğu Avrupa, Asya Seoul (SEOV) İnsan: orta RSKA, ölüm oranı % 1 Sıçan Dünye geneli Puumala (PUUV) İnsan: hafif RSKA, ölüm oranı %0.1 Sin Nombre (SNV) Nairovirus İnsan: hantavirus kardiopulmoner sendrom, ölüm oranı % 50 Orman faresi (Bank vole) Geyik faresi Batı Avrupa Kuzey Amerika Crimean-Congo haemorrhagic fever Nairobi sheep disease Phlebovirus İnsan: kanamalı ateş, ölüm oranı % 20 80 Kene Koyun, keçi,: ateş, kanamalı gastroenterit, düşük Kene, Sivrisinek Doğu Avrupa, Afrika, Asya Afrika, Asya Rift Valley fever (RVF) İnsan: ensefalit, kanamalı ateş, retinit, öoranı %1 10. Evcil tek tırnaklılar : nekrotik hepatit, kanam, düşük Sivrisinek Afrika Naples sandfly fever İnsan: ateş Tatarcık sineği (Sandfly) Avrupa, Afrika Sicilian sandfly fever İnsan: ateş Tatarcık sineği Avrupa, Afrika Tospovirus Tomato spotted wilt Bitkiler: 650 üzerinde tür, çeşitli semptomlar Thrip (Thysanoptera) Dünya Geneli

7 1.1.3. Hantavirusların Replikasyonu Hastalık coğrafik olarak farklı yerleşim yerlerinde görülse de Eski ve Yeni Dünya Hantavirusları yüksek homoloji gösterirler ve yaşam döngülerinde ve dizin analizlerinde genetik olarak benzer yapıları mevcuttur (Jonsson et al., 2010). Hantaviruslar endotel, makrofaj, folliküler dentritik ve lenfosit hücrelerini enfekte etmektedirler. Yapılan araştırmalar Gn zarf proteini ile arasında hücreye giriş için bir ilişki olduğunu ve integrinler yoluyla olduğunu göstermiştir. Hantaviruslar kutuplaşmış hedef hücrelerin apikal ve bazolateral membranlarından giriş yapmaktadır. Enfeksiyonun erken döneminde N proteini sentezlenir ve N proteini enfeksiyonda konak immün cevabından sorumludur (Jonsson ve ark., 2010). 1.2. Hantavirus Tipleri Hantaviruslar genel olarak iki gruba ayrılmaktadır: Eski Dünya ve Yeni Dünya Hantavirusları. Eski Dünya Hantavirusları içindeki Amur virüs, SEOV ve HTNV epidemiyolojik olarak Asya da önemli tipler olup, enfeksiyonlarında %15 in üzerinde ölüm oranına sahiptir (Schmaljohn ve ark., 1990). Avrupa da DOBV, Tula virus (TULV) ve PUUV daha fazla oranda görülmektedir. PUUV, Avrupa daki ana hantavirus tipi olup, Nephropathia epidemica (NE) nın etkenidir. NE, RSKA nin orta şiddetli formu olup mortalite oranı % 0.1-0.2 dir (Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008; Vapalahti ve ark., 2003). Dünyada her yıl yaklaşık 150.000-200.000 insan RSKA dan etkilenmektedir (Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008; Vapalahti ve ark., 2003). Yeni Dünya Hantaviruslarından Sin Nombre virüs (SNV) 1990 ların başlarında Amerika Birleşik Devletleri nde bir çok yerleşim biriminden bildirilmiştir (Hjelle ve ark., 1994). Bu tarihten itibaren çok sayıda Yeni Dünya Hantavirusları

8 tanımlanmış ve bunların özellikleri belirlenmiştir (Çizelge 1.2, Çizelge 1.3 ve Çizelge 1.4). Yeni Dünya hantaviruslar, Kuzey ve Güney Amerika nın her yıl yaklaşık 300 HPS vakasının etken ajanıdır, bu olgularda ölüm oranı %50 nin üzerindedir (Muranyi ve ark., 2005). Hantaviruslar genel olarak; 1- HTNV-benzeri virüsler, 2- PUUV-PHVbenzeri virüsler ve 3- SNV-benzeri virüsler olmak üzere üçe ayrılmaktadır (Kanerva ve ark., 1998). Çizelge 1.2, 1.3 ve 1.4 te HTNV-benzeri virüsler, PUUV-PHV-benzeri virüsler ve SNV-benzeri hantaviruslarin türleri, oluşturduğu hastalıklar, konak kemirici türleri ve görüldüğü kıta ve/veya ülkeler verilmiştir. RSKA ve HPS ile ilşkili bulunan Hantavirus türlerinin S segment dizi analizine göre genetik ağaçtaki yerleri Şekil 1.4 de gösterilmiştir (Vaheri ve ark., 2013). Ayrıca Eski ve Yeni Dünya hantaviruslarının genetik ağaçtaki lokasyonu ve görüldüğü ülkeler ise Şekil 1.5 de verilmiştir (Jonsson et al, 2010). Çizelge 1. 2: HTNV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar (Kanerva ve ark., 1998). Tür HTNVbenzeri virüsler Hastalık Kemirici türü (Murine rodentleri) Hantaan HTNV RSKA Apodemus agrarius Asya Görüldüğü kıtalar/ülkeler Dobrava DOBV RSKA Apodemus flavicollis Balkanlar/Avrupa Seul SEOV RSKA Rattus rattus/norvegicus Asya/Dünya geneli Tayland THAIV? Bandicota indica Tayland

9 Çizelge 1.3: PUUV-PHV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar (Kanerva ve ark., 1998). Tür PUUV-PHVbenzeri virüsler Hastalık Kemirici türü (Arvicolinae rodentleri) Puumala PUUV NE Glethrionomys glareolus Avrupa Görüldüğü kıtalar/ülkeler Tobetsu TBTV? Glerufocanus Japonya thrionomys Topografov TOPV? Lemnus sibiricus Sibirya Khabarovsk KBRV? Microtus fortis Sibirya Isla Vista ILVV? Microtus californicus Kuzey Amerika Bloodlan BLLV? Microtus ochragaster Kuzey Amerika Lake Prospect Hill PHV? Microtus pensylvanicus Kuzey Amerika Tula TULV? Microtus arvalis/rossiaemeridionalis Çek Cumhuriyeti /Avrupa

10 Çizelge 1.4: PUUV-PHV-benzeri virüsler, oluşturduğu hastalık, kemirici türleri ve dağılım gösterdiği coğrafyalar (Kanerva ve ark., 1998). Tür SNV-benzeri virüsler Hastalık Kemirici türü (Sigmoidante rodentleri) Görüldüğü kıtalar/ülkeler Sin Nombre SNV HPS Peromyscus maniculatus Kuzey Amerika Monongahale MONV? P.maniculatus Kuzey Amerika nubiterrae New York NYV HPS Peromyscus leucopus Kuzey Amerika El Moro Canyon EMCV? Reithrodontomys megalotis Kuzey Amerika Rio Segundo RIOSV? Reithrodontomys Kuzey Amerika mexicanus Bayou BAYV HPS Oryzomus palustris Kuzey Amerika Black Creek BCCV HPS Sigmodon hispidus Kuzey Amerika Canal Muleshoe MULV? Sigmodon hispidus Kuzey Amerika Rio Mamore RIOMV? Oligoryzomus microtis Bolivya Pergamino?? Arjantin Andes ANDV HPS Oligoryzomus Arjantin longicaudatus Lechiaguanas HPS? Arjantin Hu 39694 HPS? Arjantin Maciel?? Arjantin

11 Şekil 1.4: Hantavirusun S segment ORF sekansına göre hazırlanmış genetik ağaç. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) onaylı virüs türleri/kısaltmaları ile gösterilmiş Bayesian analizi. Kırmızı ile işaretli olanlar RSKA ve mavi ile işaretli olanlar HPS ile ilişkilidir. Kısaltmalar Çizelge 2, 3 ve 4 te verilmiştir (Vaheri ve ark., 2013).

12 Şekil 1.5. Eski ve Yeni Dünya hantaviruslari, taşıyıcı kemiricileri ve görüldüğü ülkelerin/kıtaların genetik ağaç ile birlikte görünümü (Jonsson ve ark., 2010).

13 1.3. Hantavirus Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi Hantavirus enfeksiyonu vaka sayısı, global olarak bir halk sağlığı tehditi oluşturacak kadar yüksek rakamlara ulaşmıştır. Dünya genelinde yılda yaklaşık 150 000 ile 200 000 olgu, RSKA tanısı ile hastaneye yatırılmakta ve tedavi edilmektedir. Bu olguların büyük bir kısmı (yaklaşık 100.000) HTNV ve SEOV tarafından oluşturulmakta ve Güney Doğu Asya da görülmektedir. ABD de ise yılda yaklaşık 200 olguya HPS tanısı konulmaktadır (Muranyi ve ark., 2005). Avrupa da dolaşımda olan ve hantaviral enfeksiyona en çok neden olan etkenler sırasıyla; PUUV, DOBV, SAAV, TUUV ve SEOV dür. (Vapalahti ve ark., 2003; Vaheri ve ark., 2013). Çizelge 1.5. de Avrupa'da dolaşımda olan Hantaviruslar ile birlikte kemirici konakları ve oluşturduğu hastalıklar verilmiştir. Çizelge 1.5. Avrupa'da dolaşımda olan Hantaviruslar, konakları ve oluşturduğu hastalıklar (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003). Virüs Taşıyıcı kemirici türü Oluşturduğu hastalık PUUV Cleithrionomys glaerolus RSKA (Hafif, NE) (orman faresi) DOBV Apodemus flavicollis RSKA (ağır) (sarı boyunlu fare) SAAV Apodemus agrarius RSKA (hafif) (çizgili tarla faresi) TUUV Microtus arvalis (Avrupa'da yaygın) Hastalıkla ilişkili değildir. SEOUL V Rattus norvegicus, Rattus rattus RSKA: Renal sendromlu kanamalı ateş, NE: Nefropatia epidemica RSKA (1980'lerde salgınlar sadece laboratuvarlarda konfirme edildi)

14 Avrupa kıtasında en yüksek hantavirus insidansı Kuzey Avrupa ülkelerinde görülmektedir (Vaheri ve ark., 2013). Enfeksiyon sıklığı açısından yapılan değerlendirmelerde Rusya, Finlandiya ve İsveç ilk sıralarda yer alan ülkelerdir (Çizelge 1.6) (Vapalahti ve ark., 2003). Avrupa haritası üzerinde insidans ve seroprevalans oranları Şekil 1.6 da verilmiştir (Olsson ve ark., 2010). Çizelge 1.6. Hantavirus enfeksiyonunun Avrupa ülkelerinde görülen yaklaşık yıllık olgu sayıları ve seroprevalans oranları (Vapalahti ve ark., 2003). Ülke Olgu sayısı / yıl Seroprevalans (%) Rusya (Avrupa parçası) 3000 6 Finlandiya 1000 5 (Bazı bölgelerinde 20) İsveç 300 8 (kuzey bölgesi) Almanya 100 1-3 Fransa 100? Belçika 100 1-5 Norveç 50? Slovenya 15 2 Hollanda 10 1 Danimarka 10 1 Slovakya 10 0.5-2 Bosna-Hersek 10 5 Yunanistan 5 4 Estonya 9 Litvanya 4 Avusturya 1.2 Çek Cumhuriyeti 1-2 Portekiz 1

15 Şekil 1.6: Avrupa ülkelerinde RSKA nın seroprevalansı ve insidansı. Daire ile işaretli alanlar bildirimi yapılan vaka sayılarını göstermektedir. Çizgi ile işaretli alanlarda ise seropozitiflikler mevcuttur (Olsson ve ark., 2010). Hantavirus enfeksiyonlarının büyük oranda asemptomatik veya non-spesifik olarak geçiriliyor olması nedeniyle rapor edilen vaka sayıları gerçek rakamları yansıtmamaktadır. Subklinik veya hafif/atipik enfeksiyon; Puumala virüs için %70 olarak rapor edilmektedir. Bu nedenle seroepidemiyolojik çalışmalar Hantavirusun varlığının gösterilmesi için önemlidir. Bugüne kadar değişik ülkelerde gerçekleştirilen çalışmalarda Hantavirus enfeksiyonlarının seroprevalansı %0-33,3 arasında rapor edilmektedir (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003). Avrupa ülkelerinde hantavirus seroprevalansı %1-9 arasındadır. Seroprevalans oranı Kuzey Avrupa ülkelerinde daha yüksek orandadır (Çizelge 1.6) (Vapalahti ve ark., 2003). Ülkemizde ilk vakaların görüldüğü Bartın'da 2009 yılında Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı (Türkiye Halk Sağlığı Kurumu) tarafından yapılan seroprevalans çalışmasında riskli grupta (orman işçisi, çiftçi, vb.) % 5.2 hantavirus IgG pozitifliği bulunduğu bildirilmiştir (Ertek ve Buzgan, 2009).

16 Karadeniz Bölgesi nde (Giresun ilinde) 2009 yılında 15-84 yaş arası 626 sağlıklı bireyden alınan kan serumlarında yapılan hantavirus seroprevalans çalışmasında ise bu oran %3.2 olarak saptanmıştır (Gözalan et al, 2013). Hantavirus vakalarını erkek/kadın oranı 2/1 ile 3/1 arasında değişmektedir. En sık 20-40 yaş arasındaki grupta görülmekle birlikte, çocukluk yaş grubundan vakalar bildirilmektedir. Kırsal bölgede ve/veya geniş yapraklı ormanlık alanda yaşamanın ve düşük sosyoekonomik durumun hantavirus enfeksiyonları için riks faktörleri olduğu rapor edilmektedir (Muranyi ve ark., 2005; Köksal, 2008; Vapalahti ve ark., 2003). 1.4. Hantavirusler ve Konakçı İlişkileri 1.4.1. Kemiriciler (Rodentler) ve Böcek Yiyiciler (İnsektivorlar) Hantavirusların ana doğal rezervuarı kemiricilerdir (takım Rodentia; aile Muridae; subfamilya Murinae, Arvicolinae, ve Sigmodontinae). Avrupa da ve dünyada dolaşan hantavirus türleri, taşıyıcı kemirgenler ve oluşturduğu hastalıklar Çizelge 1.2, 1.3 ve 1.4 de verilmiştir (Kanerva ve ark., 1998). Diğer yandan, Avrupa nın ılıman bölgelerinde, "Bank vole" türü ve diğer orman kemiricileri normalde aşırı stabildir. Ancak sonbaharda kısa süren mevsimsel bir artış özelliği gösterirler. Bu bölgelerde ormanlar çok miktarda parçalanmış alanlara sahiptir. PUUV'ün ortaya çıkış alanları parçalı orman arazileridir. Sonuç olarak, PUUV'ün insanlara bulaş oranı çok yüksek değildir. Ancak, birkaç yılda bir görülen meşe palamudu yıllarında (mast years), Myodes (eski: Cleithrionomys) glaerolus türü ve sarı boyunlu orman fareleri (A.flavicollis) gibi tohum yiyen kemiricilerin miktarında aşırı bir artış olmaktadır. Meşe palamudu artışı olan yıllarda, ortalama yaz sıcaklığı normalden yüksektir ve eş zamanlı olarak insanlarda hantavirus epidemilerinin görüldüğü bildirilmektedir. Fransa Ardenler bölgesi, yoğun ormanlarla kaplı ve tepelik bir alan olup bu bölgede 1990, 1993, 1996, 1999 ve 2001

17 yıllarında ve Balkanlarda 1986, 1989, 1995 ve 2002 yıllarında hantavirus epidemileri görülmüştür (Vapalahti ve ark., 2003). Şekil 1.7.a ve Şekil 1.7.b de taşıyıcı kemiriciler ile hantavirusların Avrupa daki coğrafik dağılımı gösterilmektedir (Vapalahti ve ark., 2003). Üst bölümde (Şekil 1.7.a) Myodes (Clethrionomys) glareolus un dağılımı ve kemiricilerden elde edilen PUUV virusunun sekans yapıldığı alanlar kemirici şekli ile gösterilmiştir. Siyah noktalı alanlar nötralizasyon testi ve RT-PCR ile konfirme edilmiş ve yılda 200 ün üzerinde vakanın görüldüğü yerleri göstermektedir. Şekil 1.7.b de A.flavicollis (pembe), A.flavicollis ve A.agrarius (mavi) ve sadece A.agrarius (sarı) kemiricilerinin yaygın olduğu coğrafya verilmiştir. Doğuda (gri) ve batıda (beyaz) gösterilen kemiriciler A.agrarius ve A.flavicollis olup sırasıyla, SAAV ve DOBV türleri sekans çalışmalarıyla gösterilmiştir. Siyah noktalı alanlar nötralizasyon testi ve RT-PCR ile konfirme edilmiş DOBV ve SAAV vakalarının görüldüğü yerleri göstermektedir (Vapalahti ve ark., 2003). Belirli türdeki kemiriciler sıklıkla belirli hantavirus tipleri ile taşınmakta ve bulaştırılmaktadır (Şekil 1.8). Hantaviruslar, taksonomik yapılandırmada, ana konak/konaklar olarak Muridae ailesinde yer alan Murinae (eski dünya rat ve fareleri), Arvicolinae (bazı kemirici türler) ve Sigmodontinae (yeni dünya rat ve fareleri) alt ailelerinden hangisini kullandıkları baz alınarak üç gruba ayrılırlar. Murinae rodentler (kemiriciler), şiddetli RSKA ile ilişkili hantavirus türlerinin ana konaklarıdır (fatalite hızı %3-12). Orman fareleri (Myodes glareolus) ise RSKA nın nisbeten daha ılımlı bir şekli olan Nephropathia epidemica nın etkeni PUUV'un ana konağıdır. PUUV, Orta ve Kuzey Avrupa, Rusya ve Balkanlarda saptanmakta olup bu virüsün fatalite hızı % 0,1-0,4 olarak belirtilmektedir (Çizelge 1.3.) (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003, Kanerva ark, 1998).

18 Şekil.1.7.b Şekil 1.7.a. Şekil 1.7. Avrupa daki taşıyıcı vektör kemiricilerr ve hantaviruslarin dağılımı (Vapalahti et al., 2003). Şekil 1.7.a. Myodes (Clethrionomys) glareolus un dağılımı ve kemiriciden elde edilen PUUV virusunun sekans yapıldığı alanlar rodent şekli ile gösterilmiştir. Şekil 1.7.b. A.flavicollis (pembe), A.flavicollis ve A.agrarius (mavi), ve sadece A.agrarius (sarı) kemiricilerinin yaygın olduğu coğrafya verilmiştir. Doğuda (gri) ve batıda (beyaz) gösterilen kemiriciler A.agrarius ve A.flavicollis olup sırasıyla, SAAV ve DOBV türleri sekans çalışmalarıyla gösterilmiştir.

19 Şekil 1.8: Avrupa da görülen patojen hantavirus taşıyıcısı kemiricilerin dağılımı (Vaheri ve ark., 2012). (a) Myodes glareolus, Puumala virus un konağı. (b) Apodemus flavicollis, Dobrava Belgrade virus (DOBV-Af) un konağı. (c) Apodemus agrarius, Saaremaa virus (ve DOBV- Aa) un konağı. (d) Apodemus ponticus, DOBV-Ap un konağı. Sigmodontine türü rodentler HPS vakalarının etkeni olarak bilinen hantavirusların konaklarıdır. HPS vaka sayıları RSKA dan düşük olmakla birlikte bu formun ortalama fatalite hızı (%40) oldukça yüksektir (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003, Kanerva ark, 1998). Hantaviral türler arasında genetik ve antijenik ilişkinin derecesi, kendi kemiricileri olan konakları arasındaki filogenetik ilişkinin derecesi ile bağlantılıdır. Her kemirici alt ailesi filogenetik olarak farklı virüsleri taşımaktadır (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003).

20 1.4.2. Vahşi (Yabanıl) Hayvanlar RSKA için öncü hayvan modeli çalışmalarında Suriye hamsterlarında Andes virüs (ANDV) denemiş fakat başarılı olmamıştır (Hooper ve ark., 2001). Vahşi tip PUUV ile cynomolgus maymunları (M. fascicularis) deneysel olarak enfekte edilmiş ve Nepphropathia epidemica (NE) benzeri klinik tablo ve patoloji oluşturulmuştur. Sitokinlerden IL-10, IL-6 ve TNF-α ile C-reactive protein artmış olarak tespit edilmiştir (Klingstrom ve ark. 2002). Hayvanların böbrek, dalak ve karaciğer dokularında yapılan immünohistokimyasal histolojik çalışmalarda viral antijenler ve RNA in situ hibridizasyon ve nükleokapsid proteinleri gösterilmiştir (Sironen ve ark., 2008). 1.4.3. Evcil Memeli Hayvanlar Kedi ve köpekler gibi kemirici olmayan evcil hayvan türlerinde hantavirus enfeksiyonlarını rapor eden çalışmalar mevcuttur. Ancak, bu hayvanların tesadüfi olarak mı enfekte oldukları yoksa doğal rezervuar mı oldukları konusunda bir bilgi mevcut değildir (Muranyi ve ark., 2005; Zeier ve ark., 2005; Groen ve ark, 1995; Malecki ve ark., 1998; Dobly ve ark., 2012). Bazı Hantaviruslar yarasa ve kuşlar gibi böcek yiyiciler (insectivores) ile domuzlarda gösterilmiştir. Ancak; Hantaviruslar konakları olan kemiricilerde tesis ettikleri kronik persistan enfeksiyona benzer bir tabloyu kemirici olmayan türlerde oluşturup oluşturmadıkları konusu hala bilinmezliğini korumaktadır (Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003). 1.4.4. Konakçı Türleriyle İlgili Ülkemizde Yapılan Çalışmalar Ülkemizde 2004 yılı Nisan ayında yapılan bir çalışmada, Trabzon, Rize ve Ödemiş- İzmir de yakalanan 330 rodent türünde Arenavirus, Hantavirus ve Cowpox virus (family Poxviridae, genus Orthopoxvirus, CPXV) antikorları immunofluorescence antikor (IFA) yöntemiyle araştırılmıştır. Yakalanan 65 Microtus voles türü

21 kemiriciden 4 ünde PUUV antikoru tespit edilmiştir. Bu kemiricilerden biri İzmir (Microtus guentheri lydius), üçü Trabzon yakınlarından (Microtus roberti ve iki Microtus rossiaemeridionalis) yakalanmıştır. Tüm Apodemus spp. (n:264) türleri SAAV yönünden negatif bulunmuştur. Bu çalışma ile Türkiye de hantavirus antikorlarının rodentlerde varlığı ilk kez gösterilmiştir. Fakat antikor bulunan üç Microtus türünde PCR ile hantavirus genomu saptanamamıştır (Laakkonen ve ark., 2005). Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi tarafından organize edilen rodent çalışmasında Bartın ilinde ELISA testleri ile 177 rodent örneğinde anti-hantavirus IgG ve anti-hantavirus IgM seropoztifliği araştırılmış; rodentlerin tiplerine göre IgG ve IgM seropozitiflik dağılımları saptandığı bildirilmiştir (Uyar, 2011). Yine Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi tarafından organize edilen Öktem ve ark (2013)'nın Giresun'da yaptığı rodent tarama çalışmasında; 173 kemirici ve 2 kır faresi yakalanmış ve ELISA ile 11 kemiricide (%6.4) IgM pozitifliği ve 36 kemiricide IgG (%20.8) bulunmuştur. Moleküler incelemede; toplam 23 kemirgende (10'u Apodemus flavicollis, 12'si A. uralensis ve 1'i R. rattus türü) Hantavirus Dobrova subtipine ait genomik RNA varlığı gösterilmiştir (Öktem ve ark., 2013). Asya ile Avrupa'nın geçiş noktasına yer alan ülkemizde Hantavirusların taşıyıcısı olan kemirici türleri bulunmaktadır. Ayrıca ekosistem, iklim ve parçalı orman arazileri nedeniyle virüsün sirkülasyonu için uygun şartlar da mevcuttur (Heyman ve ark., 2011). 1.5. Hantavirusun Bulaş Yolları İnsanlar Hantavirus ile genellikle; enfekte kemiricilerin solunum sekresyonları, tükrüğü ve idrarının aerosollerinin solunarak alınması ile veya dışkı, vücut döküntüsü veya enfeksiyöz virüsle kontamine diğer organik materyal parçacıklarının solunum yolu ile alınması sonucu enfekte olurlar (Lee ve ark., 1981; Muranyi et al., 2005; Köksal, 2008; Uyar, 2009). Her bir kemirici türü/virüs türü ve kemiricinin vücut salgısı türünün virüs saçılım süresi farklılık gösterdiği bildirilmiştir. Örneğin; Eski Dünya hantaviruslarinden HTNV konağı olan Apodemus un tükrük, idrar ve gaitasından saçılabilir, idrarda da uzun süre persistan kalabilmektedir (Lee ve ark., 1981).

22 Kemiricilerden insanlara hantavirusun solunum yolu ile geçişi bir çok yayında detaylı olarak dökümante edilmiştir (Nuzum ve ark., 1988; Muranyi ve ark., 2005). Kemiricilerin kendileri arasında ve kemiricilerden insanlara enfeksiyonun ısırma yolu ile geçtiği de bildirilmektedir. RSKA için rodentlerde intrauterin bulaş yolunda gösterilmiş olmakla birlikte, fetal ölüme neden olduğu saptanmamıştır. Son çalışmalarda; Puumala virüsün çevre şartlarında uzun süre canlılığını koruduğu ve bu özelliğin virüsün rodentler arasında yayılımında önemli olduğu vurgulanmaktadır (Muranyi ve ark., 2005). Enfeksiyonun muhtemel diğer bulaş yolları; derideki yaraların enfeksiyöz virüs ile kontaminasyonu, muköz membranlar ile enfeksiyöz materyalin teması, enfeksiyöz kemiricinin sekresyonları ve dışkısıyla kontamine olmuş besinlerin yenmesi, laboratuvar enfeksiyonları ve sadece Andes virus lu bir vakada- akut fazdaki HPS li bir hasta ile temastır (Hardestam ve ark., 2008; Wesley ve ark., 2010; Pedrosa ve Cardoso, 2011; Mesic ve Almedin, 2008). Mesic ve Almedin (2008) yaptıkları çalışmada enfekte kemiriciler ile kontamine gıda ve suyun da bulaşta rol oynadığını bildirmiştir. Avrupa, Asya ve Kuzey Amerika da insandan insana bulaş vakası bugüne kadar bildirilmemiştir (Muranyi ve ark., 2005). Doğada insanlarda enfeksiyon riski mesleki olarak (hayvancılık, orman işçileri, çiftçi, ordu mensubu vb) veya gezi aktivitelerine, enfeksiyöz kemiricilerin sayısındaki artış ile ortaya çıkan ekolojik faktörlere ve yine bu rodentlerin dışkı ve vücut salgılarına maruz kalma süresine ve sıklığını artıran diğer sebeplere bağlıdır. Enfekte rodentlerin olduğu kapalı alanların insanlar tarafından temizliği de tekrarlayan enfeksiyonlar için yüksek risk taşır (Gözalan ve ark., 2013; Muranyi ve ark., 2005; Vapalahti ve ark., 2003; Köksal, 2008). Şekil 1.9'da Hantavirusun solunum yolu ile bulaşını şematik olarak gösterilmiştir. Hantavirüsü taşıyan vektör kemiricilerin enfekte vücut atıkları inhalasyon yoluyla insanların akciğerlerine ulaşır.

23 Şekil 1.9: Hantavirusun solunum yolu ile bulaşını şematik olarak gösterimi (Kaynak: http://udel.edu/~smilisa/transmission%20of%20hantavirus.html) Daha önce geniş olarak bahsedildiği gibi; Avrupa ülkelerindeki RSKA vaka sayıları kemirici populasyonunun dinamikleri ile yakından ilişkilidir. Hantavirus insidansındaki artış genellikle iki-üç yıllık periyodlarda bir gözlenmektedir. Bunun; özellikle ormanlık alanlardaki kayın ve meşe ağaçlarındaki palamut sporları ndaki artış (meşe palamudu yılı) ile paralel olarak kemirici populasyonundaki artıştan kaynaklandığı bildirilmektedir. Bununla birlikte global ısınmanın etkisinin bu dinamikleri etkileyebileceği düşünülmektedir. Örneğin Fransa ve Belçika daki vaka sayısındaki artışların iki yıllık periyotlar ile gözlenmeye başladığı rapor edilmektedir (Muranyi ve ark., 2005). 1.6. Konakçı Duyarlılığı ve Klinik RSKA ve HPS kısmen birbiri üstüne binen klinik sendromlardır. Avrupa da hantavirusun PUUV serotipi NE etkenidir ve orta şiddette RSKA oluşturmaktadır. Alveolar makrofajların, akciğer ve böbreklerdeki damar endotel hücrelerinin enfeksiyonundan sonra insanlarda "viremi" görülür. Bunun sonucunda, akciğer ve böbreklerde ciddi derecede permeabilite artışı olmaktadır (Vapalahti ve ark., 2003).

24 1.6.1. Nephropathia epidemica (NE) NE ani ortaya çıkan yüksek ateş, baş ağrısı, sırt ağrısı ve karın ağrısı ile karakterizedir. Geçici trombositopeni, hastalığın erken döneminde çok tipik bir bulgudur. Konjoktival kanama, damar içi peteşi ve vücutta döküntüler 3 veya 4 gün sonra görülebilir. Yaklaşık olarak hastaların %1 inde şiddetli nörolojik klinik bulgular (felç, mesane paralizisi gibi) görülebilmektedir. Kanamalar ile beraber oligüri, azotemi, proteinüri ve hematüri de görülebilir. Üç gün içinde hastalarda döküntü görülür ve poliüri gelişebilir (Vapalahti ve ark., 2003). Konvelesan faz birkaç haftaya kadar uzayabilir ve nadiren hastada sekel bırakabilir. Akut böbrek yetmezlikli NE olgularında ölüm oranı %0.1 ile 1 arasında görülebilmektedir (Vapalahti ve ark., 2003). 1.6.2. Renal sendromlu kanamalı ateş (RSKA, HFRS:Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome) İnkübasyon dönemi 7-36 gün arasındadır. Vakaların %10-15 i ağır seyirli olup ölüm oranı %6-15 arasında değişmektedir. RSKA kapiller ve venüllerin sistemik tutulumu ile karekterizedir. Çeşitli kanamalı kliniğe ve dolaşım bozukluklarına neden olabilir. Böbrek tutulumu, interstisyel kanama ve interstisyel infiltratlar sonucu oluşan böbrek yetmezliği ile karekterizedir (Goldsmith ve ark.,1995; Lundkvist ve ark., 1993). İnsanlarda görülen DOBV enfeksiyonlarının klinik tablosu temel olarak PUUV ne benzer fakat semptomları daha ağırdır. Kanama komplikasyonları (%26 59), yaygın damar içi pıhtılaşma bozukluğu, ağır trombositopeni, şok (%21 28), diyaliz tedavisine ihtiyaç duyulan oligürik böbrek yetmezliği (%30 47), plevral ve abdominal efüzyon, gastrointestinal ve elektrokardiyografi bozuklukları ile daha sık karşılaşılır (Vapalahti ve ark., 2003). PUUV ve DOBV virüsleri ile oluşan RSKA nın farklı klinik ve laboratuar bulguları Şekil.10'da sunulmuştur.

25 Klinik seyir beş faza ayrılmaktadır; ateşli, hipotansif, oligürik, diüretik ve konvelesan dönem. Şekil 1.10 'da RSKA gelişiminde görülen klinik tablolar şematik olarak gösterilmiştir. a) Ateşli dönem; RSKA, yüksek ateş, sırt ağrısı, karın ağrısı, döküntü, kas ağrısı, yorgunluk ve baradikardinin 3-4 gün sürdüğü NE ye benzemektedir. Fotofobi, boğaz da enantem ve yüzde yaygın kırmızılık gözlenmektedir. Hastalarda üç-beş günde damakta peteşi gelişir. Aynı zamanda, konjuktival kanamalar görülür ve görme fonksiyonlarında geçici bozukluk görülebilir. İdrar sedimentte hematüri ve atipik ağır/ileri proteinüri (bazı vakalarda 3gr/24saat üzeri) görülebilir (Vapalahti ve ark., 2003). b) Hipotansif dönem; ateşin oturmasından sonraki 3-6 gün arasında gelişir. Şok veya hipotansiyon görülebilir. Bu fazdaki en belirgin laboratuar bulguları lökositoz ve trombositopenidir. Akut tubulointerstisyel nefrit, nekrotizan glomerulonefrit ve IgA nefropatisini içine alabilen geniş bir böbrek hastalığı durumu görülebilir (Vapalahti ve ark., 2003). Şekil 1.10. PUUV ve DOBV enfeksiyonunda dönemlerine göre tipik laboratuvar bulguları şematize edilmiştir. Proteinüri (%100), artmış serum kreatinin (%95 100), trombositopeni (%50 75), lökositoz (%50), (mikroskobik) hematüri (%58 85), artmış C-reaktive protein (96% nın üzerinde) ve artmış serum transaminazları görülebilir (%41 68) (Vapalahti ve ark., 2003).

26 c) Oligürik faz; yaklaşık olarak 8. günde başlar ve kanamalı tablolar daha belirgin hale gelmektedir. d) Diüretik faz; yaklaşık olarak 11. günde başlar ve hasta aşırı miktarda idrar çıkarmaktadır. e) Konvelesan faz; ise 3 hafta ile 6 ay arasında sonlanır. Sekel nadirdir fakat kronik böbrek yetmezliği ve hipertansiyon vardır. Böbrek dışı görülen diğer klinik tablolar, görme fonksiyonlarının ani bozulması, akut myopi, merkezi sinir sistemi komplikasyonları, bazen myokardit ve ciddi gastrointestinal sistem kanamalarıdır. Ek olarak, tiroid, karaciğer ve pankreas etkilenebilir. Akciğer tutulumu da gözlenebilir fakat HPS kliniğinden daha azdır (Goldsmith ve ark, 1995; Gavrilovskaya ve ark., 1990). 1.6.3. Hantapulmoner Sendrom (HPS ) HPS un başlangıcı yüksek ateş, kas ağrısı ve baş ağrısı gibi grip benzeri belirtilerle karakterizedir. Hastalarda 2-15 gün içinde kardiyak olmayan akciğer ödemi ve hipotansiyon gelişebilir. Bazen plevral efüzyonla ilişkili bilateral hızlı infiltratlar gelişir. Nötrofil ağırlıklı lökositoz, hemokonsantrasyon, trombositopeni ve dolaşımda immünoblastlar görülebilir. HPS nin ciddi gidişatı artmış laktat seviyeleri ile ilişkilidir. Hastalar 5-7 gün içinde, akut faz düzelerek herhangi bir sekel oluşmaksızın normal hale dönebilirler (Goldsmith ve ark, 1995). Akut böbrek yetmezliği, şok ve solunum yetmezliğine ikincil bir sonuçtur. HPS da mortalite oranı yaklaşık %50 dir. RSKA ve HPS hakkındaki tıbbi bilgiler geçmiş yıllara nazaran artmaktadır. Akciğer tutulumlu RSKA vakaları ve böbrek tutulumlu HPS vakaları sürekli olarak çoğalmaktadır (Vapalahti ve ark., 2003).

27 1.7. Hantavirus enfeksiyonlarında patofizyoloji ve immünoloji RSKA ve HPS un klinik ciddiyetini ve prognozunu belirleyen ana faktör enfekte endotelyumun geçirgenliğinin artmasıdır. Endotelde hiçbir histolojik belirti olmadığı gibi ayrıca hücrede görülebilir bir sitopatik etki (CPE) de bulunmaz (Jonsson et al., 2010). Günümüzde, patojenik hantaviruslarin bu iki sendromun akut fazında nasıl kapiller kaçak meydana getirdiği ve neden bazı hantavirusların patojenik olmadığı henüz tam olarak bilinmemektedir. Ancak HPS'de kompleks bir patogenez mevcuttur. Artmış immün aktivasyon sonucunda, damar permeabilitesinde değişiklikler oluşmaktadır. Hastaların çoğunda akciğer ödemi, solunum yetmezliği ve şok gelişebilmektedir (Enria ve ark., 2001). Akciğerdeki hedef hücrelerde (endotel, makrofaj ve plateletler) virüsün Gn ve Gc yüzey glikoproteinleri ile etkileşim başlar. Bu hücrelerde virüs replikasyonu başlar ve immün sistem (makrofaj ve CD8 T hücreleri) indüklenir (Ennis ve ark., 1997). Aktive olmuş makrofajdan proinflamatuvar sitokinler (tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1 (IL-1), ve IL-6)) sekrete edilir. Antijen tanıma işleminden sonra; yardımcı T hücreleri farklılaşır (T helper 1 (Th1) and Th2 hücreleri). Th1 hücreleri hücresel immüniteden sorumlu gamma interferon (IFN-γ) ve TNF-β üretirler. Th2 hücreleri IL-4 ve IL-5 üretirler ve humoral ve allerjik reaksiyonlardan sorumludur. Diğer yandan, indüklenebilir regülatör T hücreleri IL-10 ve transforming growth factor β (TGF-β) gibi iki immünsüpresif sitokin üreterek immün cevap ve enfeksiyonun patolojisini düzenlemede önemli rol oynarlar (Ennis ve ark., 1997; Kilpatrick ve ark., 2004) 1.7.1. Hantavirusun Viral Replikasyon Döngüsü Hantavirusların çoğalması özellikle akciğer ve böbrekte yer alan makrofaj ve endotel hücrelerinde olmaktadır (Schultze ve ark., 2002). Patojenik olan hantaviruslar, hücre yüzeyinde bulunan V3 integrine tutunmayı takiben endositoz yoluyla konak hücre içine girerler (Vahalapati ve ark., 1999). Şekil 1.11'de hantavirusun konak hücredeki viral replikasyon döngüsü şematize edilmiştir.

28 Şekil 1.11: Hantavirusun viral replikasyon döngüsü (Jonsson et al, 2010). Hücre yüzeyine konak hücrenin reseptörleri ve viral glikoproteinler ile etkileşim sonucu virionun yapışması (1), endositoz yoluyla viral genomların içeri girişi (2), viral RNA'dan komplementer RNA'nın transkripsiyonu (3), konak hücrede viral proteinlerin (S,M,L) translasyonu (4), viral RNA'nın replikasyon ve amplifikasyonu, N proteinlerinin kümelenmesi ve Golgi cisimciğine transportu (5), Golgi cisimciği içinde viral komponentlerin birikmesi (Yeni Dünya virüslerinde plazma membranında olabilir) (6), olgun viral partiküllerin plazma membranı yoluyla Golgi vezikülünden füzyon yoluyla viral ürünlerin salınımı (7). Hantaviruslar endotelyal, epitelyal, makrofaj, follüküler dendritik ve lenfosit hücrelerine viral glikoproteinler yardımıyla Şekil.11'de görüldüğü gibi konak hücrelerin yüzey reseptörlerine tutunurlar (Jonsson ve ark., 2010). Hantaviruslar kutuplaşmış hedef hücrelerin apikal ve bazolateral membran yüzeylerinden içeri girerler. Endolisosom içinde üç ribonükleoprotein soyularak S, M ve L mrna'lar

29 oluşur. S ve L mrna transkriptlerinden serbest ribozomlar, M segmentten ise ER meydana gelir. N proteini hantavirus enfeksiyonlarında virüsün yaşam döngüsünde translasyon ve paketlenme aşaması gibi olaylarda anahtar rol oynar (Schmaljohn ve ark., 2001). 1.7.2. İmmünoloji 1.7.2.1. Humoral Bağışık Yanıt Bir hantavirus enfeksiyonu sıvısal (humoral) ve hücresel yanıt yoluyla kendini gösterir. Humoral bağışık yanıt sürecinde, RSKA ve HPS boyunca tüm tiplerdeki Immunglobulinler eksprese edilir. Virüse spesifik IgA ve total serumdaki artmış titre heriki sendromdaki akut faz boyunca saptanabilir (Markotic ve ark., 2002). RSKA nin akut fazı boyunca ve virüs spesifik total IgE ve spesifik IgE titreleri artmış olarak bulunmuştur. IL-1 ve TNF-alfa sekresyonlarının aktivasyonuyla hantavirus patofizyolojisinde IgE ortaya çıkar. Ancak IgE seviyeleri ile RSKA'nın ağır tablosu arasında bir korelasyon bulunamamıştır. Viral NP, G1 ve G2 ye karşı oluşan virüs spesifik IgM in yüksek titreleri RSKA ve HPS un akut fazı boyunca ve sonrasında üretilir. Hantavirus NP, major viral antijen olarak rol oynar (Markotic ve ark., 2002; Vahalapati ve ark., 2005). Hantaviruslara karşı oluşan total Ig nin büyük çoğunluğunu virüse özgü IgG oluşturur. IgG antikoru viral NP ne karşı oluşur ve RSKA ve HPS un akut fazında görülebilir. Ayrıca konvelesan fazdaki titre atışı gösterilebilir (Vahalapati ve ark., 2005; Lundkvit ve ark., 1993). 1.7.2.2. Hücresel Bağışık Yanıt Hantavirus enfeksiyonunda hücrsel bağışık yanıtın ortaya çıkmasında sitotoksik CD8 T hücreleri (CTL) hücreleri ana rol oynar. Hastalığın şiddeti ile CTL sayısı arasında bir ilişki vardır (Vapalahti ve ark., 2003). CTL epitopları virüsün yapısal üç proteininde de tanımlanmıştır. Oysaki NP predominant immünojenik proteindir (Vapalahti ve ark., 2003). Vero-E6 hücrelerinde uygulama öncesi IFN-alfa, beta ve

30 gama muamelesinin, HTNV, PUUV ve TULV replikasyonununu inhibe ettiği gösterilmiştir (Niklasson ve ark., 1994). 1.8. Laboratuvar Tanı Şüpheli hantavirus enfeksiyonlarının laboratuvar tanısı olguların taranması ve pozitif bulunan örneklerdeki virüsün tiplendirilmesi olarak iki kısma ayrılır. Klinik olarak hantavirus şüphesi bulunan akut dönem olgularında hantavirus enfeksiyonunun araştırılmasında sıklıkla kullanılan yöntemler serum ya da plazma örneklerinde immunfloresan antikor testi (IFAT), enzim immunoassay (EIA) veya immunoblot yöntemleridir. Özellikle ticari olarak bulunan IFAT, EIA ve immunoblot yöntemlerinde DOBV, PUUV, HTNV, SEOV ve SNV'ün rekombinant veya doğal antijenleri kullanılmaktadır (Muranyi ve ark., 2005). 1.8.1. Hantavirus Enfeksiyonlarında Mikroskopi: Dokuların elektron mikroskobik incelenmesi sınırlı tanı değerine sahiptir. Genellikle çalışmalar postmortem olup, viriondan ziyade hantaviral inklüzyon cisimcikleri görülebilmektedir (Köksal, 2008). 1.8.2. Hantavirus Enfeksiyonlarında Hücre Kültürü: Biyogüvenlik düzeyi 3 ve 4 laboratuvarlarda Vero E6 hücre kültürlerinde virüs izolasyonu kültivasyonu mümkün olabilmektedir (Köksal, 2008). 1.8.3. Hantavirus Enfeksiyonlarınının Tanısında Antijen Testleri: İmmünohistokimyasal yöntemler, fatal HPS li olgulardan alınan formalinle fikse edilmiş dokularda antijenin belirlenmesinde kullanılmaktadır. İmmünohistokimyasal testlerde poliklonal antikorlar veya fare monoklonal antikorları kullanılmaktadır.

31 Hantaviral antijenler akciğer, dalak, karaciğer, böbrek ve kalp dokusunda özellikle kapiller endotel hücrelerinde bulunabilmektedir (Köksal, 2008). 1.8.4. Hantavirus Enfeksiyonlarında Serolojik testler: RSKA ve HPS akut vakalarında N proteinine karşı oluşan IgM ve IgG antikorları oluşmaktadır. Şüpheli vakalarda hantaviral antijenlerine karşı oluşan IgM ve/veya IgG antikorlarının serumda tespiti tanıda önemlidir. Hantavirus antijenlerinin çoğu rekombinant DNA antijeni olarak sentezlenir. Bu antijenler, çoğunlukla N proteinlerine karşı oluşmaktadır. Üç yapısal protein (Gn, Gc ve N) semptomların akut döneminde IgM antikoru üretir. IgG antikoru ise daha geç dönemde glikoproteinlere karşı oluşur ve akut fazda IFA testlerinde granüler tarzda görülür (Johnson et al, 2010). Hantavirusların tiplendirilmesi zaman zaman kullanılan serolojik yöntemlerin serotip ve genotipler arasında çapraz reaksiyon göstermesi nedeniyle zorluk gösterebilmektedir. Hantavirusların tiplendirilmesinde altın standart olan yöntem plak azaltma viral nötralizasyon testleri (plaque reduction neutralization test)'dir. Ancak bu yöntemler gerek virüsün hücre kültürünün zorluğu, gerekse en az biyogüvenlik düzeyi 3 laboratuvar şartları gerektirmesi nedeniyle pek çok yerde uygulanamamakta ve sınırlı sayıda merkezlerde yapılmaktadır (Köksal, 2008). Serum veya plazmadaki antikorları belirlemek için bir çok yöntem kullanılmaktadır: IgM capture ELISA, IgG ELISA, yüksek yoğunluluklu partikül aglütinasyonu, indirekt IFA, immünpresipitasyon, hemaglütinasyon inhibisyon, Western Blot ve radyoimmunassay (RIA) dır (Köksal, 2008). PUUV, DOBV ve SAAV infeksiyonlarının tanısı serolojik yöntemlere dayanmaktadır. Hastalığın ilk günlerinde IgM ve genellikle IgG de bulunmaktadır. Akut faz döneminde IgG seviyesi artar, uzun süre yüksek seviyede kalabilir, daha sonra yavaş yavaş düşer. IgG, RSKA olgularında 10 yıl, HPS vakalarında 3 yıldan daha uzun süre tespit edilebilir düzeyde olabilir (Lundkvist ve ark., 2003). Erken IgG yanıtı, çoğunlukla NP ye karşı gelişmektedir. PUUV enfeksiyonunun ilk 5 gününden

32 sonra IgM seviyesi nadiren tespit edilebilir düzeyin altında (< %2) olabilir (Kallio- Kokko ve ark, 1998). Hücre kültüründe üreyen doğal viral antijenlerin temel alındığı IgG ve IgM gibi İFA testleri yaygın biçimde kullanılmaktadır. IgM ve IgG EIA yöntemleri rekombinant NP ye karşı oluşmaktadır (Köksal, 2008). Nükleokapsid (N) proteni en duyarlı antijendir ve bu nedenle birçok serum örneğinde serolojik olarak nükleokapsidin ilk 120 aminoasidi taranmaktadır (Brus Sjölander ve ark., 1997). IgM EIA yöntemine alternatifler spesifik IgG nin düşük aviditesinin saptanması veya immünokromatografik IgM testidir (Hedmann ve ark., 1991; Hujakka ve ark., 2001). Akut DOBV veya PUUV enfeksiyonlarında RT-PCR ile serum veya kan örneklerinden viral RNA saptanabilir ancak bu hastaların üçte ikisinden daha azındadır (Pluyisnin ve ark., 1997). Taşıyıcı kemiricilerde yapılan çalışmalarda Hantavirusların serolojik olarak yakınlıklıkları onların geri plandaki genetik yakınlıkları ile ilişkili bulunmuştur. Özellikle hastalığın akut döneminde, PUUV, DOBV veya SAAV arasında, serolojik cevabın çapraz reaksiyonu bazen çok zayıf veya reaksiyonun tamamen yokluğu şeklinde olabilir. Avrupa da RSKA tanısında kullanılan serolojik testlerde PUUV ve DOBV/SAAV antijenlerinin her ikisine de ELISA pleytinde kaplama için ihtiyaç duyulmaktadır. Bir çok insanda, DOBV, SAAV, SEOV ve HTNV arasında öte yandan PUUV, TULV, ve SNV-benzeri virüsler arasında antikorlarda güçlü çapraz reaksiyon bildirilmiştir (Elgh ve ark., 1997). Hantavirüsle ilgili vakalarda nötralizasyon veya RT-PCR ve sekanslama ile hantavirus bulaştırıcılığı kesin olarak ortaya konulabilir. Bu yöntem özellikle DOBV ve SAAV türleri arasında ayrımı doğrulamak için kullanılmaktadır. Bu türler arasında genetik ve antijenik yakınlık çok fazladır (Brus Sjölander ve ark., 2002). Özgül olmayan çapraz reaksiyonları nedeniyle, akut faz serum örneklerinde nötralizasyon testi değerlendirmelerinde dikkatli olmak gerektiği bildirilmiştir (Lundkvist ve ark., 1997). Avrupa da şu ana kadar sadece PUUV, SAAV ve DOBV kaynaklı insan enfeksiyonlarının tanısı konmuştur. TULV and TOPV çok yüksek çapraz reaksiyon

33 oranlarına sahiptir ve bu virüsler PUUV-bazlı EIA ve IFA testleri ile saptanabilir, fakat ayrımı "focus-reduction neutralisation test" FRNT ile yapılabilmektedir (Lundksvit ve ark., 1997; Muranyi ve ark., 2005). Akut hantavirus enfeksiyon şüpheli hastalarda yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip bir ELISA IgM testi ile tanı konulabilir. Son zamanlarda yapılan karşılaştırmalı çalışmalara göre capture IgM ELISA testi (hücre kültüründe üretilen virus antijeni ve baculovirus veya E.coli ekspresyonu ile üretilen nükleokapsid (N) proteini kullanılmaktadır) önerilmektedir (Muranyi ve ark., 2005). Son yıllarda hantavirus enfeksiyonlarının tanısı amacıyla IFA testleri de kullanılmaktadır. Ticari olarak da elde edilebilen bu testler aynı anda hantavirusun serotiplendirmesine de olanak vermektedir. PUUV-IgG IFA testleri kullanıldığında erken dönem hastaların akut serumunda "granüler floresan boyanma", geçirilmiş enfeksiyonda - bağışık serumda ise "yaygın boyanma" kalıpları ayırt edilebilmektedir (Muranyi ve ark., 2005). ELISA veya IFAT ile spesifik IgM yanıtının gösterilmesi virüsle karşılaşmanın erken döneminde IgG yanıtının henüz gelişmemiş olması nedeniyle önerilmektedir. Serolojik yöntemlerle hantavirus enfeksiyonundan şüphe edilen hastadan alınan ardışık serumlarda, bunların eş zamanlı çalışılması sonucunda IFAT veya kantitatif ELISA ile özgül IgG yanıtında 4 kat titre artışının gösterilmesi ile akut infeksiyon tanısı koyulabilmektedir. IgG yanıtının gelişmesi, etkenle ilk karşılaşmadan sonra bazen haftalarca sürebilmektedir. Bu nedenle enfeksiyon şüphesi bulunan hastalarda ilk taramaların spesifik IgM antikoru gösterilerek konulması uygundur. Son yıllarda özellikle PUUV tanısında kullanılan -IgM capture EIA tabanlı hızlı immunokromatografik testler önerilmekte ve bu testlerin özgüllük ve duyarlılıklarının çok yüksek olduğu bildirilmektedir (Muranyi ve ark., 2005). 1.8.5. Hantavirus Enfeksiyonlarında Nükleik Asit Saptama Yöntemleri: HPS hızlı gelişen akut bir hastalık olduğundan hızlı tanısı oldukça önemlidir. Viral genomun saptanması için kullanılan oldukça duyarlı moleküler testler geliştirilmiştir.

34 Akut hastalık döneminde tanı için kan, organ parçacıkları gibi klinik örneklerden RT (reverse transcriptase)-pcr ile tanı konulabilmektedir. Hücre kültüründen hantaviral amplifikasyon sonucu elde edilen üründen de RT-PCR ile tanı konulabilir. Kemirici ve insan örneklerinde düşük RNA varlığında nested-rt-pcr ile özgün primerler kullanılarak tanıya gidilebilir (Johnson et al, 2010). Hantaviruslar arasında çok iyi korunmuş olan S ve M genomik segmentlerine bağlanan oligonükleotid primerler tasarlanmıştır. RNA dokudan, kandan ve serumdan izole edilebilir. Tanıda RT-PCR ve real time PCR yöntemleri kullanılabilir (Köksal, 2008). RT-PCR ile nükleik asidin gösterilmesi ve RT-PCR ürününden dizi analizi: a) insanlardaki hantavirus enfeksiyonun doğrulanması amacıyla, b) konakçı kemiricilerde hantavirus araştırma çalışmalarında ve c) hantavirusun moleküler epidemiyolojik sorgulamalarında kullanılabilmektedir (Köksal, 2008; Muranyi ve ark., 2005). Nükleik asit tabanlı yöntemler içinde RT-PCR türe özgül virüs tanımlamasında özellikle semptomlar açığa çıkmadan önce olguların tanımlanmasında kullanılmaktadır. Virüsün identifikasyonunda RT-PCR ve sekans analizi ya da RT-PCR sonrası tür spesifik prob hibridizasyonu gibi moleküler tanı yöntemleri kullanılmaktadır (Muranyi ve ark., 2005). 1.8.6. Hantavirus Enfeksiyonlarında Serosürveyans: Seroepidemiyolojik çalışmalar için genellikle ELISA testi tercih edilmektedir (Muranyi ve ark., 2005; Gözalan ve ark., 2013; Laakkonen ve ark., 2006). Bu amaçla hücre kültüründe üretilmiş hantavirus antijenlerinin kullanıldığı veya baculovirus tekniği ile eksprese edilen nükleokapsid proteinlerin kullanıldığı ELISA IgG testleri kullanılabilmektedir. Bu testler ticari olarak da elde edilebilmektedir. Seroepidemiyolojik çalışmalarda bir diğer alternatif test yöntemi ise hantavirus IgG immünfloresan antikor testidir (Dobly ve ark., 2012; Köksal, 2008).

35 1.8.7. Serotiplendirme/genotiplendirme: Hantavirusun tiplendirilmesi değişik yöntemler ile yapılmaktadır. Bunlar; nötralizasyon testi, kan veya idrar sedimentinden hantaviral genomun bir bölümünün RT-PCR ile çoğaltılması ve dizi analizi; hasta örneklerinden hantavirusun izole edilmesi yöntemleridir. RT-PCR klonlaması ve izolasyon yöntemi çok sık kullanılmamaktadır (Köksal, 2008; Muranyi ve ark., 2005). 1.9. Hantavirus Enfeksiyonlarının Tedavisi: RSKA ve HPS (Andes virüs dahil) in başarılı tedavisi, sağlık çalışanlarına ve diğer bireylere viral bulaşın önlenmesi ve uygun izolasyon yöntemlerinin uygulanabilmesi için erken tanı önemlidir. Çünkü hastalığın erken dönemi diğer birçok hastalık ile benzerlik gösterebilmektedir. Bu dönemde ateş ve miyalji göze çarpar, bu semptomlar ve trombositopeni endemik bölgelerde sağlık çalışanları için tanıda yardımcı olabilir (Köksal F, 2008). RSKA ve HPS un tedavisindeki başarı "erken dönemde tanı" koymakla ve hastayı donanımlı bir sağlık kuruluşuna ulaştırmakla artar. RSKA da gelişen şok; vasopresör ilaçlar ve intravenöz mayi kullanımı ile engellenebilir. HPS hastalarının tablosu oksijen gereksinimi sürekli olarak kontrol edilmeli ve gerektiği durumlarda oksijen desteği mekanik ventilasyon ile sağlanmalıdır. Ribavirinin HPS nin seyri ve sonuçları üzerine etkisi bilinmemektedir. Hastalığın seyri sırasında solunum ve dolaşımda ciddi komplikasyonlar gelişebileceği için hastaların yoğun bakım imkanları olan merkezlere gönderilmesi ve uygun destekleyici tedavinin zamanında başlanması önem arz etmektedir. Halen RSKA ve HPS nin korunma ve tedavisine yönelik FDA (Food and Drug Administration, ABD) tarafından onaylanmış bir antiviral ilaç bulunmamaktadır. Ancak Ribavirinin Hantaviruse karşı aktif olduğu gösterilmiştir. Ribavirinin hastalığın seyri üzerine etkisi tam açıklığa kavuşmamış olmakla beraber RSKA hastalarında morbidite ve mortaliteyi azalttığını gösteren çalışmalar vardır. Ancak Ribavirinin böbrek yetmezliği olan olgularda kontrendike

36 olduğu unutulmamalıdır. Bununla birlikte bazı çalışmalarda Ribavirinin HPS de mortalite üzerine kayda değer bir etkisi olmadığı da rapor edilmektedir (Johnson et al., 2010; Köksal F, 2008). Hantaviral enfeksiyonların tedavi ve profilaksisinde ayrıca özgül monoklonal antikorlar da denenmiştir (Kariwa ve ark., 1992). 1.10. Hantavirus Enfeksiyonlarından Korunma İnsanlar için aşı olarak Hantavax (GreenCross Vaccine Corp., Seoul, Korea) mevcuttur. Bu aşıya karşı gelişen nötralizan antikorların bir yıl süreyle düşük düzeyde geliştiği ve aşının etkisinin tartışmalı olduğu bildirilmektedir. Yeni aşı geliştirme çalışmaları; rekombinant virusler, alfavirus replikonları ve çıplak DNA aşılarını içermektedir (Vapalahti ve ark., 2003; Muranyi ve ark., 2005; Köksal F, 2008). 1.11. Amaç Hantavirusların ana doğal rezervuarı kemirici (rodent) lerdir. Sığırlar, geyikler, kediler ve köpekler gibi kemiriciler haricindeki memeli hayvan türlerinde hantavirus enfeksiyonlarını rapor eden sınırlı sayıda çalışmalar mevcuttur. Ancak, mevcut araştırmalarda da bu hayvanların tesadüfi olarak mı enfekte oldukları yoksa birer doğal rezervuar mı oldukları henüz açıklanamamıştır (Muranyi ve ark., 2005, Zeier ve ark., 2005). Bu tez çalışmasında; Hantavirus insan olgularının tespit edildiği (Kaya ve ark, 2010), insanlarda seroepidemiyolojik çalışmada pozitifliğin saptandığı (Gözalan ve ark, 2013) ve hastalığın vektörü olan kemirgenlerde virolojik ve serolojik olarak hantavirus serotiplerinin varlığının saptandığı (Dinçer ve Özkul, 2011; Uyar, 2011) Giresun ili Dereli ilçesindeki bazı evcil memeli çiftlik hayvanlarında (sığır, koyun

37 ve at) ve köpeklerde hantavirus varlığının serolojik ve moleküler virolojik tekniklerle araştırılması amaçlanmıştır.evcil hayvanlarda hantavirus araştırma çalışmaları dünya literatüründe de oldukça sınırlı sayıda olup (Groen ve ark., 1995; Malecki ve ark., 1998; Jay ve ark., 1997; Dolby ve ark., 2012; Heyman et al. 2012, Muranyi et al. 2004), gerçekleştirilen bu çalışma ülkemizde bir ilk olma niteliğindedir. Böylelikle, hastalığın görüldüğü ve virüsün dolaşımda olduğu bölgedeki çiftlik hayvanlarının insan olgularına bir kaynak teşkil edip edemeyeceği tartışılacaktır.

38 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Giresun Karadeniz Bölgesi'nin Doğu Karadeniz bölümünde, kuzeyinde Karadeniz sahili ile güneyinde Kuzey Anadolu dağlarının ikinci sırası arasında yer alan batısında Ordu, güneybatısında Sivas, güneydoğusunda Erzincan, doğusunda Gümüşhane ve kuzeydoğusunda da Trabzon ile çevrili bir ilimizdir. İlin kuzeyi ile güneyi arasındaki iklim farkı, yağış miktarının güneye doğru azalması doğal bitki örtüsünün yapısını da etkilemektedir. Kıyı ile dağlar arasında kalan kesimi ormanlarla kaplıdır. Dereli ilçesi şehir merkezinde 5.871 kişi, kırsalında 15.004 kişinin yaşadığı 845 km 2 alana sahip ve 300 m rakımda, Giresun ilinin güneyindeki Aksu Vadisi üzerinde yeralır. Dereli son derece dik ve engebeli bir araziye sahiptir. Halkı büyük ve küçükbaş hayvan ticaretiyle geçimini sağlamaktadır (Wikipedi, 2013; T.C. Dereli Kaymakamlığı, 2013) Çalışmaya Giresun İli Dereli ilçesi ve bağlı köylerdeki yerleşim birimlerindeki evcil hayvanlar ve Çiftçilerin barındırdıkları köpekler dahil edilmiştir (Şekil. 2.1). Bu amaçla 15.06.2011 ile 22.06.2011 tarihleri arasında Dereli ilçesine bağlı; 1) Bahçeli Mahallesi (Göbel ve Bahçeli Obası) 2) Eğrianbar Köyü (Eğrianbar, Alipaşa, Eskop ve İndaş Yaylaları), 3) Çalca Köyü (Kümbet, Kuzugölü ve Göbel yaylaları), 4) Yavuzkemal Beldesi, 5) Güzyurdu Köyü, 6) Uzundere Köyü yerleşim yerlerinde örnekleme çalışmaları yapılmıştır. Sahada; 173 koyun, 118 sığır, 5 at ve 10 köpek örneğine ait toplam 306 hayvandan örnekleme yapılmıştır. Bu amaçla serum ve plazma örnekleri uygun koşullarda alınmıştır. Örnekler çalışma gününe kadar Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı laboratuvarında 80 C de muhafaza edilmiştir. Örneklemelerin özellikle insan olgularının görüldüğü yerlerle ve kemirgen populasyonunda çalışma yapılan alanlar ile sınırlandırılmış olması sebebiyle, örnekleme yapılan yerlerdeki sığır, koyun ve at cinsi evcil hayvan ile köpek materyali doğrultusunda olabildiğince çok sayıda hayvandan kan serumu ve antikoagülanlı kan (plazma) örnekleri alınmıştır.

39 Bu tez çalışmasında memeli evcil hayvanlardan materyal temini Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu nun 16.02.2011 gün ve 2011-105- 388 nolu kararı kapsamında gerçekleştirilmiştir (EK 1). Çalışma, Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Bilim Kurulu Kararı ile Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP-21.09.2010-928) kapsamında desteklenmiştir (EK 2). Çalışma yapılacak olan Giresun Valiliği İl Tarım Müdürlüğü de saha çalışması için resmi yazı ile bilgilendirilmiş ve saha araştırması için gerekli izin onayı alınmıştır (EK 3). Şekil 2.1. Çalışma Giresun İli Dereli İlçesinde yapılmıştır. Haritada yerleşim yerlerinin parçalı orman arazisine sahip oluşu hantavirus enfeksiyonu açısından özellik arzetmektedir (Google maps'ten modifiye edilmiştir).

40 2.1.1. Çalışma Bölgesinin Seçilmesi Hantavirus insan olguları (iki adet) ülkemizde Doğu Karadeniz Bölgesi'nde ilk olarak 2009 yılında Giresun'da bildirilmiştir (Kaya ve ark. 2010). Bu olguların ardından Sağlık Bakanlığı Zoonotik Hastalıklar Bilim Kurulu tarafından saha araştırması yapılmasına karar verilmiş ve Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi (RSHM) tarafından Giresun ilinde 2010 yılında insanlarda seroprevalans ve doğal vektörü olan kemirgenlerde hantavirus saha araştırması yapılması planlanmıştır. Bu çalışmanın sonuçları 2010 yılında Ankara'da RSHM tarafından düzenlenen "Hantavirus Sempozyumu" nda sunulmuştur (Dinçer ve Özkul, 2011; Uyar, 2011; Gözalan, 2011 ). Gözalan ve ark. (Gözalan et al., 2013)'nın Giresun'da insan populasyonunda yaptıkları bu seroprevalans çalışması sonucunda; "floureescent focus reduction neutralisation test" (FFRNT) ile IgG varlığı saptanan Dereli ilçesi ve bağlı köylerindeki (Şekil 2.2'de şekilde yıldız işaretli alanlar) evcil hayvanlardan ve köpeklerden serum ve plazma numuneleri toplanmasına ve hantavirusun araştırılmasına karar verilmiştir. Bir diğer saha araştırmasında; aynı ilçeden yakalanan kemirgen örneklerinde (kan serumu, dalak, karaciğer, akciğer ve böbrek) de serolojik, virolojik ve moleküler yöntemler ile hantavirusun DOBV ve PUUV türlerinin varlığı gösterilmiştir (Dinçer ve Özkul, 2011; Uyar, 2011; Gözalan, 2011 ). Bu tez çalışmasında memeli evcil hayvanların serumlarında anti-hantavirus IgG varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla her türe özgü ticari IgG konjugatlar kullanılmış ve konjugatların dilüsyonları hesaplanarak ELISA yöntemiyle test edilmiştir. Test değerlendirmeleri Schubert ve ark (2001), Raboni ve ark. (2007) ve Dobly ve ark (2012) nın tanımladıkları şekilde yapılmıştır.

41 Şekil 2.2. Gözalan ve ark (2013) tarafından Giresun İli nde normal sağlıklı popülasyonda yapılan seroepidemiyolojik çalışmada pozitiflik saptanan yerleşim birimlerinin gösteren harita. Yıldız işaretli alanlar focus reduction neutralisation test (FRNT) ile pozitifliğin gösterildiği yerleşim birimleridir. Tez çalışmasında Dereli İlçesi ndeki FRNT pozitifliği saptanan yerleşim yerlerindeki bazı evcil hayvanlardan ve buradaki çiftçilerin barındırdıkları köpeklerden örnekler alınmıştır. 2.1.2. Çalışmaya Dahil Edilen Çiftlik Hayvanları Sahada yapılan örnek toplama işleminde 15-22 Haziran 2011tarihleri arasında Dereli İlçesi mahalle ve köylerine gidilerek; toplam üç farklı (at, sığır ve koyun) çiftlik hayvanı ve ayrıca buradaki çiftliklerde ailelerin barındırdığı köpeklerden de örnekleme yapıldı. Araştırma genelinde 173 koyun, 118 sığır, 5 at ile 10 köpek

42 örneklendi. Çiftik hayvanlarının yerleşim yerlerine (Çizelge 2.1) ve türlerine göre (Çizelge 2.2) dağılımı çizelgelerde verildi. Çizelge 2.1. Dereli İlçesi'nde çalışmaya dahil edilen hayvan türleri ve yerleşim birimlerine göre dağılımı. Çalışma Sayı Grubu Bahçeli Çalca Eğrianbar Yavuzkemal Kümbet Uzundere Güzyurdu Mah. Köyü Köyü Beldesi Köyü Köyü Köyü n n n n n n n Koyun 173 35 50 29 30 29 - - Sığır 118 10 50 39 6 6 5 2 At 5 3-2 - - - - Köpek 10 4 3 2-1 - - Toplam 306 52 103 72 36 36 5 2 - : Örnek alınmadı. Çizelge 2.2. Alınan örneklerin hayvan türlerine göre dağılımı. Hayvan türü Serum + Plazma Sadece serumu Toplam Örneği alınabilan olgu sayısı Koyun 96 77 173 Sığır 100 18 118 At 5-5 Köpek 10-10 Toplam 211 95 306

43 2.2. Yöntem 2.2.1. Tanı Materyalleri (Serum ve Tam kan) Kan numuneleri (venöz kandan) sitratlı tüpe 2 ml ve biyokimya tüpüne 5 ml olacak şekilde alındı. Serolojik testler için serum (3500 devirde 5 dakika), moleküler testler için tam kandan elde edilen lökosit tabakası (1000 devirde 15 dakika) kullanıldı. Numuneler testlerin çalışma gününe kadar 80 C de muhafaza edildi. Serum ve plazma örneğinin her ikisi 173 koyunun 96'sından, 118 sığırın 100'ünden alınabildi. At ve köpek türlerinin tamamından serum ve plazma alınmıştır (Çizelge 2.2). Moleküler testler 211 plazma örneğinde, serolojik testler 306 örneğin tamamında yapıldı. 2.2.2. RNA İzolasyonu Hantavirus genomik RNA (grna) izolasyonu için ticari ekstraksiyon kiti (QIAamp Viral RNA Mini kit, Qiagen) kullanıldı. Kit önerileri doğrultusunda işlemler yapıldı. İşlem sonunda eppendorf tüpler içinde elde edilen ürün üzerine 60 µl hacimde "elution buffer" ilave edilerek 8 000 rpm'de 1 dakika oda ısısında santrüfüj edildi. Elde edilen grna ürünleri çalışma gününe kadar 80 C de saklandı. 2.2.3. cdna (komplementer DNA) sentezi (Reverz Transkripsiyon) PCR çalışmasında kullanılacak olan komplementer DNA (cdna) için; RNA izolasyonu yapılmış örneklerden ticari kit (RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit, Fermentas) yardımıyla, kit önerileri doğrultusunda cdna sentezi yapıldı. 2.2.3.1. İlk zincir komplementer DNA sentezi (First strand cdna) Kit içeriğindeki komponentler 8-10 sn santrifüj (1000 rpm) edilerek steril nükleazfree tüpler içinde karıştırıldı. Tamplate RNA olarak total RNA dan 0,5 µg kondu, üzerine 1 µl random hexamer primeri eklenerek toplamda 12 µl olacak şekilde nükleazsız su ilavesi yapıldı.

44 cdna reaksiyon karışımı: Template RNA ve Random hekzamer karışımı : 12 µl, 5X Reaction Buffer : 4 µl, RiboLock RNase Inhibitor (20 u/ µl) : 1 µl, 10 mm dntp Mix : 2 µl ve ReverAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/ µl) : 1 µl olmak üzere; toplam hacim 20 µl idi. Karışım 8-10 sn santrifüj (1000 rpm) edildikten sonra; 25 ºC de 5 dakika, 42 ºC de 60 dakika ve 70 ºC de 5 dakika bekletildi. Reverse transkripsiyon ürünleri ya doğrudan PCR uygulaması için kullanıldı ya da PCR çalışma gününe kadar -80 ºC de saklandı. Komplementer DNA sentezinden sonra DNA nın jenerik PCR yoluyla çoğaltılması aşamasına geçildi. 2.2.4. PCR spesifik primerleri DOBV türü için Pulyisnin ve ark (1999) ve PUUV türü için Vapalahti ve ark (1992)'nın önerdiği spesifik primer dizinleri kullanıldı. PCR için kullanılan DOBV ve PUUV'ya spesifik primer dizileri, ürün büyüklüğü, genom yerleşimi ve referans alınan kaynaklar Çizelge 2.3 de verildi.

45 Çizelge 2.3. Çalışmada kullanılan DOBV ve PUUV spesifik primerleri. Ürün Primer Adı Lokasyon Primer dizini Büyüklüğü Kaynak (nt) (5 --> 3 ) (bp) DOBV Forward (t M = 53 ºC) 720-737 GCAAAGAACTGGACAGAR Plyusnin, 1999. DOBV Reverse (t M = 49 ºC) 1140-1157 KATYCCCATAGATTG TGT 438 bp (PMID:9923881) PUUV Forward (t M = 54 ºC) 46-64 AGTGACTTGRCAGAYATYC PUUV Reverse (t M = 52 ºC) 385-403 TATACCAATCTGCTGTYTG 358 bp Vapalahti, 1992. (PMID:1353107) 2.2.5. PCR PCR çalışması için kullanılan PCR karışımı (toplam 25 µl) bileşenleri ve miktarları Çizelge 2.4'de verildi.

46 Çizelge 2.4. Çalışmada kullanılan PCR karışım bileşenleri ve miktarları Bileşen Miktar (μl) Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,25 µl (NH 4 ) 2 S0 4 içeren 10 X Taq Buffer (1.25ml) 2,5 µl 25mM MgCl 2 2 µl 10mM dntp mix 0,5 µl Primer DOBV (veya PUUV) Forward (50 pmol/µl) 1 µl Primer DOBV (veya PUUV) Reverse ( 50 pmol/µl) 1 µl DNAse, RNAse ari H 2 O 15,75 µl c-dna 2 µl Toplam 25 µl PCR için DOBV ve PUUV için 50 pmol/µl'lik 1 µl spesifik primerler kullanılarak aşağıdaki çizelgede verilen PCR döngüleri ısı çevirici (thermal cycler) cihazında uygulandı (Çizelge 2.5). PCR sonrası ürünler kontrol amaçlı olarak agaroz jelde yürütüldü. Çizelge 2.5. Çalışmada kullanılan PCR ısı döngüsü ve döngü sayısı. Safhalar Sıcaklık Süre Siklus sayısı İlk Denatürasyon 94 C 5 dk 1 Denatürasyon 94 C 15 sn Bağlanma 48 C 15 sn 35 Uzama 72 C 5 dak Son Uzama 72 C 1

47 2.2.6. PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforez Yöntemi ile Görüntülenmesi PCR ürünlerinin görüntülenmesi amacıyla %1 yoğunlukta olacak şekilde 0.3 gr agaroz (Prona, EU), üzerine 30 ml 0.5X TAE (Tris-Asetik Asit-EDTA) elektroforez tampon sölüsyonu ilave edildi ve karışım mikrodalga fırında kaynatılarak çözüldü. Agarozun 50-55 C ye soğuması beklendi ve 0.5 μg/ml etidyum bromide (Sigma, ABD) ilave edildi. Hazırlanan %1 lik agaroz, jel tarağı yerleştirilmiş jel taşıyıcısına döküldü. Agarozun donması için 15 dakika beklendi. Taraklar çıkartıldı ve jel taşıyıcısı ile birlikte elektroforez tankına yerleştirildi. PCR ürünlerinin büyüklüklerinin tespit edilebilmesi amacıyla 1 μl DNA merdiveni (100 bp DNA merdiveni, Fermentas, Lithuania) konuldu. PCR ürünleri, 5 kısım ürün, 1 kısım 6X yükleme boyası (10 mm Tris-HCl, %0.03 bromophenol blue, %60 gliserol, 60mM EDTA) oranında karıştırılarak toplam 6μl hacminde jel tarakları yardımı ile açılan gözlere aktarıldı. Jel e 80 volt/cm elektrik akımı uygulanarak 30 dakika süreyle ürünler yürütüldü. Süre sonunda agaroz jel CCD kamera bağlantılı UV transillüminatöre (Vilber Lourmat, Fransa) nakledildi ve jel görüntüleme sisteminde (Kodak, Gel Logic 100, ABD) görüntülenerek fotoğrafları kaydedildi. 2.2.7. DOBV ve PUUV cdna Pozitif Kontroller DOBV ve PUUV PCR testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılan cdna örnekleri Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilm Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Mehmet Ali Öktem tarafından sağlandı. 2.2.8. Anti-Hantavirus IgG Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) testlerinin çalışılması. Evcil memeli hayvanlarda seroepidemiyolojik olarak IgG varlığının araştırılması amacıyla ticari ELISA kiti (Focus Diagnostics, DxSelectTM, USA) kullanıldı. Bu kit klinik olarak en sık görülen patojenik suşlara SEOV, HTNV, PUUV, DOBV, SAAV ve SNV karşı oluşan antikorları tarama özelliğine sahiptir. Kit

48 mikrokuyucuklarında bu hantavirusların baculovirus tarafından üretilen rekombinant nucleoproteinleri (rnp) kullanılmaktadır. Bu kit kullanılarak saptanılan IgG pozitifliklerinde en az bir veya daha fazla hantavirus türüne karşı oluşmuş antikor pozitifliği düşünülmektedir. Kit önerileri doğrultusunda çalışma için serum örnekleri 1:101 oranında sulandırıldı. Evcil hayvan türüne özgü konjugatlar optimizasyonları yapıldıktan sonra sırasıyla aşağıdaki şekilde ve konsantrasyonlarda kullanıldı. 25 ºC'de kit içeriğindeki substrat ile muamele edildikten 30 dakika sonra 450 nm dalga boyunda spektrofotometrede okutma yapıldı. 2.2.9. Konjugatların Hazırlanması a) Anti-bovine Hantavirus IgG HRP (horseradish peroxidase) işaretli konjugat (Anti-bovine IgG peroxidase conjugate, Product no: A5295, Sigma, Missouri, USA); 1:20.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. b) Anti-sheep Hantavirus IgG HRP işaretli konjugat (Anti-sheep IgG peroxidase conjugate, ABIN 102255, antibodies-online GmbH, Aachen, Germany); 1:50.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. c) Anti-horse Hantavirus IgG HRP işaretli konjugat (Anti-horse IgG peroxidase conjugate, Sigma-Aldrich, Product no: A6917, St. Louis, MO, USA); 1:10.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. d) Anti-dog Hantavirus IgG HRP işaretli konjugat; (Anti-canine IgG peroxidase conjugate, Sigma-Aldrich, Product no: A6792, Missouri, USA); 1:10.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. 2.2.10. ELISA Testlerinin Eşik Değerinin (Cut-off value) Hesaplanması. ELISA testleri için eşik değerin hesaplanması için koyun ve sığırların 450 nm dalga boyunda (absorbans) okutulan negatif serum örneklerinden 10 adedi alındı. At için negatif bulunan 4 örnek ikişer tane olacak şekilde (toplam 8 adet) alındı. Köpek türü

49 için ise negatif bulunan 9 örnek alındı. Bulunan değere 3 Standart Sapma (Standart deviation: SD) ilave edilerek eşik değerler aşağıdaki formüle göre hesaplandı. Cut-off Değeri: Negatif Örneklerin Ortalaması (n:10) + 3 SD Bulunan cut - off değerinin 450 nm dalga bouyunda ölçülen örneğin absorbans değerine bölünmesi ile indeks değeri elde edildi. İndeks Değer: Örneğin Absorbans Değeri / Cut-off Değeri Elde edilen indeks değerler 1.1 ve üzeri ise örnek pozitif, 0.9 ve altında ise örnek negatif olarak, eğer 0.9 ile 1.1 arasında saptanmış ise aradeğer (equivocal) olarak değerlendirildi. Aradeğer tespit edilen örnekler daha önce değişik araştırıcılar tarafından önerildiği şekilde iki kez çalışıldı (Schubert et al., 2001; Raboni et al., 2007; Dobly ve ark., 2012). 2.2.11. İndirek İmmünfloresan Antikor Tekniği (IFAT) Çalışma kapsamında ELISA ile seropozitif olarak saptanan sığır koyun ve köpek örnekleri, bu sonucun doğrulanması amacıyla IFAT tekniği ile de kontrol edildi. IFAT testi için Hantavirus IgG ticari testi (Euroimmun, Anti-Hantavirus IIFT IgG, Medizinizhe Labordiagnostika AG, Germany) kullanıldı. Kit önerileri doğrultusunda serum örnekleri 1:100 oranında sulandırıldı. Her bir serum sulandırımından IFT slayt kuyucuklarına 30 µl konuldu ve 30 dakika oda ısısında inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası slaytlar 5 dakika tampon solüsyonunda (PBS-Tween) yıkandı. Ardından türe spesifik (koyun, köpek ve sığır

50 IgG lerine karşı FITC işaretli) konjugatlardan kuyucuklara 25 µl konularak oda ısısında nemli ve karanlık ortamda 30 dakika inkübe edildi. Bu aşamadan sonra ikinci yıkama işlemi gerçekleştirildi. Slaytlar kurutulduktan sonra üzerine kit içeriğindeki embedding medium eklenerek lamel ile kapatıldı ve immünfloresan mikroskopta (Eurostar, Euroimmun, Germany) 20 ve 40x büyütme altında değerlendirildi. ELISA yöntemiyle anti-hantavirus antikoru pozitif bulunan serum örnekleri konjugat temin edilerek IFAT töntemiyle test edildi. Anti-Horse FITC işaretli IgG konjugatı temin edilemediğinden at serumlarında IFAT çalışılamadı. IFAT yönteminde aşağıdaki konjugatlar kullanıldı: a) Sığır serum örneklerinde IFAT IgG için: Goat anti-bovine IgG (H&L) FITC işaretli konjugat (Goat Anti-bovine IgG (H&L) FITC conjugate, Part no: GtxBo- 003-DFTIC, Immunoreagents, Inc, Raleigh, NC, USA); 1:1.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. b) Koyun serum örneklerinde IFAT IgG için: Donkey anti-sheep IgG (Whole molecule) FITC işaretli konjugat (Anti-Sheep IgG (whole molecule) FITC conjugate, product number: F 7634, Sigma-Aldrich, Inc., S.Louis, Missouri, USA); 1:1.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı. c) Köpek serum örneklerinde IFAT IgG için: Rabbit anti-dog IgG (Whole molecule) FITC işaretli konjugat (Anti-Dog IgG (whole molecule) FITC, antibody produced in rabbit, F7884, Sigma-Aldrich, Inc., S.Louis, Missouri, USA); 1:1.000 titrede çalışma dilüsyonu hazırlandı.

51 3. BULGULAR 3.1. PCR Sonuçları Gereç ve yöntemde belirtildiği şekilde önce plazma örneklerinden (n:211) elde edilen lökosit tabakasından elde edilen RNA kalıp olarak kullanılmak suretiyle cdna oluşturuldu, PCR uygulaması sonrasında elde edilen ürünler pozitif ve negatif kontroller eşliğinde jel elektroforezde yürütüldü. Toplam 306 adet hayvandan alınan 211 adet tam kan ve 95 adet serum örneği araştırma kapsamında değerlendirildi. PCR testine alınan 211 (100 sığır, 96 koyun, 10 köpek, 5 at) örneğin tamamında DOBV ve PUUV yönünden kontrollerinde, spesifik amplikon elde edilemedi. Çalışma kapsamında elde edilen reaksiyon çıktılarının DNA merdiveni ve kontroller paralelinde agaroz jelde koşturulma sonuçları Şekil 3.1, Şekil 3.2 ve Şekil 3.3 de sunuldu. Şekil 3.1. DOBV ve PUUV spesifik primerleri ile pozitif kontrol ve negatif kontrollerle yapılan çalışmaya ait jel elektroforez görüntüsü (Soldan sağa: 1: DNA Merdiveni, 2,3,4,5: DOBV pozitif, 6: DNA Merdiveni, 7,8: PUUV pozitif, 9,10: PUUV negatif, 11: Merdiven)

52 Şekil 3.2. DOBV spesifik primerleri ile çalışılan örneklere ait jel elektroforez görüntüsü (Soldan sağa: 1. ve 14.: DNA Merdiveni, 13: DOBV pozitif kontrol, 2-12: DOBV negatif saptanan örnekler ). Şekil 3.3. PUUV spesifik primerleri ile çalışılan örneklere ait jel elektroforez görüntüsü (Soldan sağa: 1. ve 12: DNA Merdiveni, 11: PUUV pozitif kontrol, 2-10: PUUV negatif saptanan örnekler )

53 3.2. ELISA Sonuçları 3.2.1. Anti-Hantavirus IgG ELISA sonuçları: ELISA tekniği kullanılarak yapılan serolojik tarama sonrasında, araştırma kapsamında değerlendiririlen 306 adet farklı türdeki çiftlik hayvanlarından 14 koyun %8,1), 56 sığır (%47,5), 1 köpek (%10) ve 1 adet at da (%20) hantavirus serotiplerine karşı seropozitiflik olduğu tespit edildi (Çizelge 3.1 ve Şekil 3.4, Şekil 3.5 ve Şekil 3.6). Yapılan değerlendirmelerde çalışma kapsamında tespit edilen genel seroprevalansın %23,5 olduğu gözlendi. Çizelge 2.2 de yerleşim birimlerine ve evcil hayvan türlerine ait sonuçlar verildi. Yapılan ilk çalışmada; sığır örneklerinin 17 ve koyun örneklerinin 7 tanesinin aradeğer de olduğu saptandı. Aradeğer olan sığır ve koyun örneklerinin test tekrarında ise 9 adet sığır örneği tekrar aradeğer olarak bulunurken, koyun örneklerinde aradeğerde indeks değeri veren örnek bulunmadı. Çizelge 3.1. Evcil Hayvanlarda anti-hantavirus IgG ELISA sonuçlarının tür düzeyinde dağılımı. Çalışma Grubu Sayı n ELISA IgG Pozitif n (%) ELISA IgG Aradeğer n (%) ELISA IgG Negatif n (%) Koyun 173 14 (8.1) 0 (0) 159 (91.9) Sığır 118 56 (47.5) 9 (7.6) 53 (44.9) At 5 1 (20.0) 0 (0) 4 (80.0) Köpek 10 1 (10.0) 0 (0) 9 (90.0) Toplam 306 72 (23.5) 9 (2.9) 225 (73.6)

54 IgG ELISA Pozitif sonuçlarının yerleşim birimlerine ve evcil hayvan türlerine göre dağılımı Çizelge 3.2 de verildi. Çizelge 3.2. Giresun ili Dereli İlçesinden Bazı Evcil Hayvanlarında anti-hantavirus IgG ELISA Pozitif sonuçlarının yerleşim birimlerine göre dağılımı. Çalışma Grubu Sayı Bahçeli Mah. Poz/N Çalca Köyü Poz/N Eğrianbar Köyü Poz/N Yavuzkemal Beldesi Poz/N Kümbet Köyü Poz/N Uzundere Köyü Poz/N Güzyurdu Köyü Poz/N % % % % % % % Koyun 173 2/35 8/50 2/29 2/30 0/29 - - 5,7 16,0 6,9 6,7 0 - - Sığır 118 7/10 70,0 22/50 44,0 19/39 48,7 2/6 33,3 2/6 33,3 2/5 40,0 2/2 100 At 5 0/3 0 - - 1/2 50,0 - - - - - - - - Köpek 10 0/4 0 0/3 0 1/2 50,0 - - 0/1 0 - - - - Toplam 306 9/52 30/103 23/72 4/36 2/36 2/5 2/2 -: Örnek alınamadı, Poz: Pozitif, N: Örneklem sayısı

55 Şekil 3.4. Anti-bovine Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü (B: Blank, N: Negatif kontrol, P: Pozitif kontrol, C1 ve C2: Kalibratör) Şekil 3.5. Anti-sheep Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü (B: Blank, N: Negatif kontrol, P: Pozitif kontrol, C1 ve C2: Kalibratör)

56 Şekil 3.6. Anti-horse Hantavirus IgG ELISA çalışması, mikrokuyucukların görüntüsü (B: Blank, N: Negatif kontrol, P: Pozitif kontrol, C1 ve C2: Kalibratör) 3.3. IFAT Sonuçları 3.3.1. Sığırlarda anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları: Toplanan 118 sığır serumundan 56 adedinde ELISA IgG ile pozitif bulunan örnekler IFAT ile yeniden çalışıldı. Yeterli miktarda serum örneği bulunan 46 örnek çalışmaya alındı. Yapılan IFAT değerlendirmesi sonucunda örneklerin 21 (%38.7) i pozitif olarak saptandı (Çizelge 3.3). Çalca Köyü nden 11, Eğrianbar Köyü nden 7 ve Bahçeli Mahallesi nden 3 sığır serumundaki Hantavirus seropozitifliği IFAT ile doğrulandı. Sonuç olarak, sığır örneklerinden yapılan IFAT değerlendirmesi sonucunda 108 örnekte 21 (%19.4) pozitiflik saptandı. IFAT pozitif örneğin ve negatif kontrolün floresan mikroskopta görüntüsü Şekil 3.7 ve Şekil 3.8 de verildi. Sığır örneklerinde IFAT ile saptanan pozitif serumlardaki ELISA I.D. (İndeks değer: Örneğin absorbans değeri / Cut-off değeri) değerlerinin ortalaması 1,65 iken negatif saptananlarda bu oran 1,51 olarak saptandı. IFAT pozitif (1,65) ve negatifler (1,51) arasında I.D. oranı yönünden istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı.

57 Çizelge 3.3. Sığırlarda ELISA ile IgG pozitifliği saptanan serum örneklerinde IFAT sonuçlarının dağılımı. Sığır Örneklerinin Yerleşim ELISA Pozitifliği Sayısı Çalışmaya alınabilen örnek sayısı IFAT Pozitif IFAT Negatif Birimleri Çalca 22 19 7 12 Eğrianbar 19 14 7 7 Bahçeli 7 7 3 4 Güzyurdu 2 2 2 0 Kümbet 2 2 2 0 Uzundere 2 2 0 2 Yavuzkemal 2 0 0 0 Toplam 56 46* 21 25 Not (*): 10 olgu yetersiz numune nedeniyle IFATçalışmasına alınamadı. 3.3.2. Koyunlarda anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları: Toplanan 173 koyun serumundan 14 adedinde ELISA IgG ile pozitif bulunan örnekler IFAT ile yeniden çalışıldı. Sonuçlar Çizelge 3.4 de verilmiştir. Sonuç olarak, koyun örneklerinde IFAT ile yapılan değerlendirmede 173 örneğin 7 (%4,0) sinde seropozitivite saptandı. Yapılan değerlendirmede, koyun örneklerinde ELISA ile saptanan I.D.: 1.17 (İndeks değer: Örneğin absorbans değeri / Cut-off değeri) ve üzerindeki değerlere sahip serum örneklerinde IFAT ile de pozitiflikler saptanırken altındaki I.D. oranında pozitiflik saptanmadı.

58 Çizelge 3.4. Koyunlarda ELISA ile IgG pozitifliği saptanan serum örneklerinde IFAT Sonuçlarının dağılımı. Koyun Örneklerinin Yerleşim Birimleri ELISA Pozitifliği Sayısı Çalışmaya alınabilen örnek sayısı IFAT Pozitif IFAT Negatif Çalca 8 8 5 3 Eğrianbar 2 2 1 1 Bahçeli 2 2 1 1 Yavuzkemal 2 2 0 2 Toplam 14 14 7 7 3.3.3. Köpeklerde anti-hantavirus IFAT IgG sonuçları: Alınan 10 köpek serumunda saptanan 1 örnekteki ELISA testi pozitifliği IFAT yöntemi ile de pozitif olarak bulundu (%10). Saptanan pozitif örnek Eğrianbar Köyünden alınmıştı. IFAT değerlendirmesi için tüm sonuçlar bir araya getirildiğinde; sığırlarda 108 örneğin 21 (%19.4) inde pozitiflik, koyunlarda 173 örneğin 7 (%4,0) sinde pozitiflik ve köpeklerde 10 örneğin 1 (%10) inde IFAT ile pozitiflik saptandı. Sonuç olarak, IFAT değerlendirilmesine alınan örneklerin %10 (29/291) unda seropozitivite bulundu.

59 Şekil 3.7. IFAT ile pozitiflik saptanan (köpek serumu) örneğe ait immünfloresan mikroskopta 40x büyütmede görüntüsü. Şekil 3.8. IFAT ile negatif kontrol görüntüsü (20x büyütme).