BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit PP119JAA 2007/06 Türkçe KULLANIM AMACI BACTEC NAP TB Ayrıştırma Testi Kiti (Differentiation Test Kit), Mycobacterium tuberculosis kompleksini diğer mikobakterlerden ayrıştırmak için kullanılan bir testtir. Temel olarak, BACTEC 460TB Sistemi cihazıyla birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. BACTEC NAP (ρ-nitro-α-asetilamino-β-hidroksipropiofenon) TB Ayrıştırma Testinin, TB kompleksinin (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum ve M. microti) M. tuberculosis dışındaki mikobakterlerden (MOTT) hızlı ayrıştırması için BACTEC 12B Ortamıyla kullanılması önerilir. Bu test, smear üzerindeki bakteriyel morfoloji ve BACTEC 12B Ortamında gelişim özellikleriyle birlikte kullanılmalıdır. ÖZET VE AÇIKLAMA BACTEC 12B Ortamı koloniyel morfolojinin gözlenmesine olanak tanımamaktadır; ancak, GI çıktısı bazı mikobakter türleri için karakteristik bir özellik olabilir. Diğer bakteriler (MOTT basil) 10 kata kadar günlük GI çıktısı artışı gösterebilmekteyken, M. tuberculosis ve M. bovis 2 ila 3 kat artış göstermektedir. M. tuberculosis, BACTEC 12B Ortamında, berrak besiyeri üzerinde küçük noktalar veya yığınlar şeklinde gözle görülür gelişim gösterir. Diğer mikobakterler küçük parçacıklar halinde gelişir ve ortamı hafifçe bulanıklaştırır. Pozitif bir flakondan (GI = 100 veya daha fazla) elde edilen smear örnekleri ortamda gelişen mikobakter türüne ilişkin bir gösterge olabilir. Serpentin lifleri ve yığınlarının varlığı M. tuberculosis in karakteristik bir özelliğidir (M. bovis ve M. kansasii de lif oluşturabilir). Diğer mikobakterler başka karakteristik morfolojilere sahiptir; örn., M. avium/m. intracellulare uzun ve dallanan basil zincirleri oluşturur. BACTEC NAP Testi, en önemli mikobakter türlerinden biri olan M. tuberculosis in hızlı ayrıştırılmasını da sağlar. Bu test, Niasin testinden bağımsızdır. Aktif gelişme gösteren kültür örneği, içinde 5 µg NAP içeren bir disk bulunan NAP flakonuna inoküle edilir. Flakon kontrolle birlikte inkübe edilir ve NAP varlığında gelişim BACTEC 460TB Sistemi cihazıyla izlenir. Takip eden 3 ila 5 gün için günlük GI okuma sonuçlarının analiz edilmesiyle TB kompleksinin diğer mikobakterlerden ayrıştırılması sağlanır. PROSEDÜR İLKELERİ Kloramfenikol sentezi sırasında oluşan bir ara ürün olan NAP (ρ-nitro-α-asetilamino-β-hidroksipropiofenon), TB Kompleksinde bulunan mikobakterlerin (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum ve M. microti) neredeyse tamamını inhibe ederken diğer mikobakterlerde inhibisyon görülmez veya çok az görülür. NAP varlığında mikobakter gelişimi inhibe edilirken, GI da artma olmaması veya azalma olmasından da anlaşılabileceği gibi 14 CO 2 değişimi de inhibe edilir. GI üzerindeki bu etki tanımlama aracı olarak kullanılır. REAKTİFLER BACTEC NAP Kiti flakonları aşağıdaki aktif bileşenleri içeren bir kağıt disk içerir: ρ-nitro-α-asetilamino-β-hidroksi-propiofenon 5 µg Uyarılar ve Önlemler In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. Bu Ürün Kuru Doğal Kauçuk İçerir. Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standard Precautions (Standart Önlemler) 1-4 ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir. NAP Ayrıştırma Testi flakonunu, görünür şekilde kontamine olmuşsa, renk değişimi varsa veya içinde disk bulunmuyorsa KULLANMAYIN. Özellikle yüksek sıcaklıklarda nem, NAP ın hızla bozulmasına neden olur. 1
Her zaman aseptik teknikler ve mikrobiyal tekniklere karşı belirli prosedürler kullanılmalıdır. 5 Daima biyolojik güvenlik kabini içinde kullanın. Diskle temas etmekten kaçının. Kullanımdan sonra, örnek kapları ve diğer kontamine materyaller otoklavlanarak sterilize edilmelidir. Kullanılmadan önce her flakon; hasar belirtileri açısından incelenmelidir. Hasar belirtisi gösteren flakonlar inokülasyon öncesinde atılmalıdır. Bazı durumlarda cam şişe çatlamış olabilir ve çevir-aç kapak çıkarılırken veya kullanım sırasında kırılabilir. Yine bazı durumlarda, flakon uygun şekilde kapatılmamış olabilir. Her iki durumda da, flakon içeriği özellikle flakonun ters çevrilmesi sırasında kaçak yapabilir veya dökülebilir Flakonlar inoküle edildiyse, sızıntı veya dökülmeye, patojen organizmaların/ajanların mevcut olabileceğini göz önünde bulundurarak, dikkatle müdahale edin. Atmadan önce inoküle edilen tüm flakonları otoklavlayarak sterilize edin. Alt kültürleme ve boyama işlemleri için pozitif kültür flakonları: Örnekleme işleminden önce, mikrobiyal metabolizma sebebiyle oluşan gazın serbest bırakılması gerekir. Daima aseptik teknikler ve mikrobiyal tehlikelere karşı belirlenen önlemler uygulanmalıdır. Prosedürler, CDC tarafından önerilen şekilde, uygun bir havalandırma sistemi bulunan biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. 5 Örneklerle ve patojen içerme olasılığı bulunan kültürlerle çalışırken, uygun koruyucu önlük, maske ve eldivenleri kullanın. CDC ve OSHA önerilerini uygulayın. İnokülasyon sırasında gerçekleşebilecek sızıntıları en aza indirgemek için, kalıcı iğneleri veya uygun şekilde sabitlenmiş Luer-Lok uçları bulunan şırınga kullanın. Bu bileşiğin toksisitesi çalışılmamıştır. Kullanımı sırasında teması önlemek için uygun prosedürler uygulanmalıdır. Saklama Talimatları BACTEC NAP flakonları doğrudan güneş ışığı almayan bir yerde 2 8 C de soğuk koşullarda saklanmalıdır. NAP ısıya duyarlı olduğundan ısıya veya yüksek sıcaklıklara maruz bırakmayın. Son kullanma tarihi, belirtilen şekilde saklanan açılmamış şişeler için geçerlidir. ÖRNEK TOPLAMA NAP testini gerçekleştirmek için BACTEC 12B Ortamında aktif olarak gelişmekte olan kültürler kullanılmalıdır. Test kültürü saf olmalıdır ve mikobakteriyel olmayan kontaminasyon içermemelidir. PROSEDÜRLER Sağlanan Malzemeler: Her biri bir NAP diski içeren on flakon. Gerekli Fakat Sağlanmamış Malzemeler: BACTEC 460TB Cihazı, BACTEC 12B Ortamı, kalıcı iğne takılı Tüberkülin şırınga, Dezenfektan çözeltisi, Alkol swabı, BACTEC Seyreltim Sıvısı. Ayrıntılı bilgi için BACTEC 460TB Sistemi Ürün ve Prosedür Kılavuzu na (MA-0029) bakın. Bir BACTEC 12B Ortamı flakonu GI sı 10 veya daha yüksekse, GI 50 100 olana kadar flakonu günlük olarak test edin. Gram boyama yaparak veya alt kültür hazırlayarak kültürün kontamine olmadığından emin olun. Tüberkülin şırınga (kalıcı iğne takılı) kullanarak kültürü homojenize edin ve aynı şırıngayla 1 ml sini NAP flakonuna aseptik olarak aktarın. NAP ve kontrol (orijinal kültür) flakonlarının kapaklarını uygun bir dezenfektanla swablayın ve alkol swabıyla temizleyin. Her iki flakonu da %5 10 CO 2 tahliye etmek üzere derhal BACTEC cihazında test edin. Okuma sonuçlarını dikkate almayın. 37 C ± 1 C de veya optimum sıcaklıkta inkübe edin ve takip eden 2 ila 6 gün boyunca günlük olarak test edin. NAP flakonunun ve kontrol olarak kullanılan orijinal flakonun günlük GI sını kaydedin. GI 100 den yüksekse, NAP flakonu inoküle edilmeden önce kültür aşağıda açıklanan şekilde seyreltilmelidir: GI 50 100 seyreltim yok GI 101 200 yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,8 ml GI 201 400 yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,6 ml GI 401 600 yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,4 ml GI 601 800 yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,3 ml GI 801 999 yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,2 ml bir günden fazla GI 999 sonucu yeni BACTEC 12B Ortamı flakonuna 0,1 ml 2
Kültürün tepe GI değerinden (999) fazla üremesine izin vermeyin. Kültür aşırı ürerse, bir BACTEC 12B Ortamı flakonunda alt kültürünü hazırlayın, inkübe edin ve istenen GI elde edilene kadar günlük olarak test edin. Katı ortam üzerindeki gelişim test edilecekse, temsili birkaç koloniyi sürme yöntemiyle alıp steril su içeren bir tüpe veya BACTEC seyreltim sıvısına ekleyerek süspansiyon hazırlayın. Süspansiyonun bulanıklığını 1. McFarland standardına ayarlayın. Bu süspansiyondan aldığınız 0,1 ml yi BACTEC 12B Ortamı flakonuna inoküle edin. İnkübe edin ve BACTEC 460TB Sistemi cihazında günlük olarak test edin. GI 50 100 e ulaştığında, yukarıda açıklanan prosedürü uygulayın. KALİTE KONTROL Test prosedürünün doğruluğunu değerlendirmek için aşağıdaki pozitif ve negatif kontroller her test partisine dahil edilmelidir. M. tuberculosis, H37Rv ATCC No. 27294 M. kansasii ATCC No. 35775 M. intracellulare ATCC No. 13950 M. avium ATCC No. 35717 GAyrıntılı bilgi için BACTEC 460TB Sistemi Ürün ve Prosedür Kılavuzu na (MA-0029) bakın. Son kullanma tarihi geçen flakonları KULLANMAYIN. Herhangi bir çatlak veya hasar görülen flakonları KULLANMAYIN; flakonu uygun şekilde atın. Her NAP Kitinde Kalite Kontrolü Sertifikaları bulunmaktadır. Kalite Kontrolü Sertifikalarında bu ürün tipi için kullanılan test organizmaları gösterilir. Günlük bakım programının bir parçası olarak, Performans Testi Flakonları (BACTEC Performans Testi Kiti) BACTEC cihazında test edilmelidir. Okuma sonuçlarının düşük olması, Performans Testi Flakonları doğru şekilde test edilmişse, olası cihaz sorunlarının göstergesi olabilir (BACTEC PTK ambalajının ek sayfasına, PP-046JAA, bakın). Gerekli kalite kontroller ilgili yerel, devlet ve/veya federal düzenlemeler veya akreditasyon gerekliliklerine ve laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili NCCLS yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kontrolün (orijinal kültür flakonu) günlük GI sı artmaya devam edecektir. NAP testi flakonundaki azalma veya artış mevcut mikobakter suşuna bağlıdır. GI nın azalması veya değişmemesi TB Kompleksi varlığını; artışı ise MOTT basili varlığını belirtir. Aşağıdaki kriterler NAP flakonundaki neredeyse tüm mikobakterler için geçerlidir: TB Kompleksi (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum) inokülasyon sonrasında GI da iki önemli ardışık düşüş ilk iki gün hafif fakat önemli olmayan artış ve daha sonra GI da düşüş olması veya yükselme olmaması MOTT basili günlük GI okuma sonuçları dört gün içinde 400 ü geçer inokülasyondan sonraki ilk bir ila üç gün içinde hafif bir düşüş görülür veya artış gözlenmez, daha sonra ikinci günden sonra iki gün peş peşe önemli artış görülür Önemli artış veya düşüş iki gün arasında %20 den fazla fark olması anlamına gelmektedir. 3
PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR TB Kompleksinin MOTT dan BACTEC NAP TB Ayrıştırma Testiyle ayrılması ancak izole, saf kültürlerle mümkündür. TB Kompleksi ve MOTT basilinden oluşan karışık bir kültür GI da bir artışa sebep olarak sadece MOTT basili varlığını gösterecektir. Mikobakter dışındaki bakterilerle kontaminasyon gerçekleşmesi durumunda, kontaminantın substratı kullanması sonucu GI da hatalı artış görülebilir. NAP flakonları görülebilir kontaminasyon ve/veya bulanıklık açısından kontrol edilmelidir. GI nın artması durumunda NAP tan AFB için alınan smear örneği MOTT basili ve TB veya kontaminasyona sebep olan bakterilerin varlığını doğrulamakta yardımcı olabilir. NAP, tesadüfi M. kansasii suşlarını sonuçların hatalı raporlanmasına neden olacak şekilde inhibe edebilir. Diğer yöntemlerle ileri tanımlama testleri gerçekleştirilmelidir. Ortam ürünlerinde bulunan biyolojik materyallerin doğası ve mevcut organizma çeşitliliği nedeniyle, kullanıcı belirli organizmaların geri kazanımındaki olası değişken sonuçların farkında olmalıdır. BEKLENEN DEĞERLER Sonuçların raporlanması için gereken süre mikobakteriyel suşa bağlı olarak 2 ila 6 gün arasında değişebilir. Sonuçlar ancak net veriler elde edildiğinde raporlanmalıdır. GI değişmediyse, suş TB Kompleksi olarak tanımlanmadan önce en az 4 gün beklenmelidir. NAP testinin tamamlanması için ortalama süre 4 gün olarak raporlanmıştır. 6,7-11 NAP testi sonuçları, AFB nin aside dirençli boyayla boyanan smear örneğindeki gelişim özellikleri ve morfolojisi ile desteklenmelidir. Smear örneği, karışık kültür veya kontaminasyon varlığını da gösterir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Çoğu NAP testini yorumlamanın kolay olmasına karşın, bazı testlerde net sonuç almak için daha uzun inkübasyon süresi gerekebilir. Bu durum NAP ile kısmen inhibe olan ve GI da yavaş veya geç artış gösteren veya NAP varlığında lag fazı uzayan mikobakterler için (örn, bazı M. kansasii, M. gastri, M. szulgai, M. terrae ve M. triviale) özellikle önem taşımaktadır. NAP nin değerlendirilmesi sırasında çalışılan tüm MOTT basilleri 5 ila 6 gün içinde artış göstermiştir. 5,7 Ancak, tesadüfi M. kansasii suşları NAP tarafından normalden daha fazla inhibe edilebilir ve test ile hatalı şekilde tanımlanabilir. Doğru sonuç alınması için optimum sıcaklıkta inkübasyon yapılması gerekmektedir. M. chelonae and M. marinum gibi 37 C den düşük sıcaklıklarda ve M. xenopi gibi daha yüksek sıcaklıkta gelişen mikobakterler 37 C de test edildiklerinde hatalı sonuçlar verebilir. Optimum inkübasyon sıcaklığının belirli olmadığı durumlarda test birden fazla sıcaklıkta gerçekleştirilmelidir. Daha önceki çalışmalarda, testin genel duyarlılığı ve özgünlüğünün %98 99 olduğu görülmüştür. 7,10 TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Kat. No. Açıklama 442103 BACTEC NAP TB Differentiation Kit, 5 µg NAP / flakon, 10 flakon / kutu 442004 BACTEC 12B Medium, 4 ml, 100 / kutu REFERANSLAR 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 2. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers For Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 3. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 4. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 5. Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA, 1985. 6. Gross, W.M. et al. Radiometric Selective Inhibition tests for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21:565-568, 1985. 4
7. Laszlo, A. et el. Evaluation of a rapid radiometric differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective inhibition with ρ-nitro- α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone. J. Clin. Microbiol., 19:694-695, 1984. 8. Libonati, J.P. et al. Identification and direct drug susceptibility testing of mycobacteria by the radiometric method. Abstract C300, A.S.M. Meeting, St. Louis, MO 1984. 9. Morgan, M.A. et al. Evaluation of the ρ -nitro- α -acetylamino- β -hydroxy-propiophenone differential test for identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 21:634-635, 1985. 10. Siddiqi, S.H. et al. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis / M. bovis from other mycobacterial species. Amer. Rev. Respir. Dis., 130:634-640, 1984. 11. Stager, C.E. et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens by direct inoculation of the BACTEC NAP Test. Abstract C267, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV, 1985K 5
6