BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM)

Transkript

1 PA KULLANIM TALİMATLARI KULLANIMA HAZIR PLAK BESİYERİ PA Rev.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) KULLANIM AMACI BD Haemophilus Test Medium Agar (Haemophilus Test Besiyeri Agarı) (HTM), Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) tarafından yayınlanan Onaylı Standart M2 de tanımlandığı şekliyle Haemophilus türlerinin klinik izolasyonu için antimikrobiyal disk difüzyonu duyarlılık prosedüründe kullanılır. 1 PROSEDÜR İLKELERİ VE AÇIKLAMASI Mikrobiyolojik yöntem. %1 hemoglobin ve %1 IsoVitaleX Enrichment (Mueller Hinton Chocolate Agar) ile zenginleştirilmiş Mueller Hinton Agar daha önce Haemophilus influenzae için önerilen besiyeri olarak kullanılmıştır. 2 Jorgensen ve arkadaşları tarafından Haemophilus Test Medium Agarın (HTM) geliştirilmesini sağlayan kapsamlı çalışmalar gerçekleştirilmiştir. 3,4 Bu besiyeri F faktörü (hemin veya hematin), V faktörü (nikotinamid adenin dinükleotid, NAD) ve maya ekstraktı ile zenginleştirilmiş Mueller Hinton agardır. HTM Agar ın Mueller Hinton Chocolate Agar a kıyasla en önemli avantajı, Mueller Hinton Agar da güç üremeyen organizmalar için standart test prosedürü olan, petri kutusunun tabanından zon çapının ölçülmesine izin veren optik netliktir. Ayrıca, HTM Agar az miktarda timidin içerir ve bu sebeple trimetoprim/sülfametoksazol testi için uygundur. Antimikrobiyal duyarlılık testi için yorumlama kriterleri, CLSI belge M2 deki CLSI belge M100 (M2) de sunulmuştur. 1 Daha fazla ayrıntı için bu belgeye bakılmalıdır. BD Haemophilus Test Medium Agar X faktörü (hemin veya hematin), V faktörü (nikotinamid adenin dinükleotid, NAD) ile zenginleştirilmiş Mueller Hinton Agar ve maya ekstraktı içerir. REAKTİFLER BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) 1 Litre Saf Su için Formül* Sığır Eti Ekstraktı 2,0 g Kazein Asit Hidrolizatı 17,5 Nişasta 1,5 Agar 17,0 Maya Ekstraktı 5,0 Hematin 0,015 Nikotinamid Adenin Dinükleotid (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Performans kriterlerini karşılamak üzere gereken şekilde ayarlanmış ve/veya desteklenmiştir. ÖNLEMLER. Yalnızca profesyonel kullanım içindir. Mikrobiyal kontaminasyon belirtileri, renk değişimi, kuruma, çatlama veya diğer bozulma belirtileri görülen plakları kullanmayın. Kuruma sebebiyle bu besiyerinin aşırı büzülmesi hatalı duyarlılık sonuçlarına yol açabilir. Aseptik kullanım prosedürleri, biyolojik tehlikeler ve kullanılmış ürünün atılmasıyla ilgili olarak GENEL KULLANIM TALİMATLARI na bakın. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ Alındıktan sonra plakları kullanana kadar orijinal kaplı ambalajında karanlıkta 2 ila 8 C de saklayın. Dondurmaktan ve aşırı ısıtmaktan kaçının. Plaklar son kullanma tarihine kadar (ambalaj etiketine bakın) ve önerilen inkübasyon sürelerinde inkübe edilebilir. 10 plaklık açılmış yığınlardan alınan plaklar temiz bir alanda, 2 ila 8 C de saklandığında bir hafta kullanılabilir.

2 KULLANICI TARAFINDAN KALİTE KONTROLÜ Kullanıcı tarafından kalite kontrolü için, CLSI ye 6 veya geçerli ise, ulusal standartlara başvurulmalıdır. Esasen, Sağlanmayan Malzemeler de bahsedilen referans suşlar kullanılarak, Test Prosedürü altında tanımlanan prosedürler gerçekleştirilmelidir. BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) plakları ve kullanılan antimikrobiyal diskler uygun performans açısından haftada en az iki kere test edilmelidir. İnoküle edilmiş besiyerinin görünüşü: açık kehribar rengi PROSEDÜR Sağlanan Malzemeler BD Haemophilus Test Medium Agar (90 mm Stacker plaklar). Mikrobiyolojik açıdan kontrol edilmiştir. Sağlanmayan Malzemeler 1. Standart inokülum hazırlanması için BD Trypticase Soy Broth (Soya-Kazein Dijeste Broth) veya Mueller Hinton II Broth (katyon-ayarlı) gibi 5 ml hacimde tüpe konulmuş inokülum broth u ve inokülumun seyreltilmesi için steril broth veya tuz çözeltisi. 2. Baryum sülfat karşılaştırma standardı (0,5 ml 0,048 M BaCl 2 [%1,175 a/h BaCl 2 2H 2 O] ila 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [%1 h/h]). 3. İnokülumun süspansiyonunun türbiditesini 0,5 McFarland standardına eşdeğer olacak şekilde ayarlamak için fotometrik bir cihaz. 4. Yukarıdaki materyallere (1-3) alternatif olarak, BD Prompt Inoculation System (volümetrik inokülum hazırlama aracı) kullanılabilir. 5,6 5. Kontrol kültürleri - Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC ve ATCC BD Sensi-Disc duyarlılık test diskleri gibi, belirli miktarda antimikrobiyal ajan aşılanmış kağıt diskler. 7. Sensi-Disc 6-place dispenser gibi bir dağıtma cihazı. 8. Boyutu milimetre cinsinden ölçebilen, cetvel veya başka bir cihaz. 9. %5 CO 2 içeren bir atmosfer oluşturan bir inkübatör veya CO 2 açısından zengin aerobik atmosfer oluşturan başka bir cihaz. 10. Hızlı bir ß-laktamaz testi gerçekleştirmek için BBL Cefinase Diskleri gibi bir reaktif. 11. Yardımcı kültür ortamı, reaktifler ve gerekli laboratuvar ekipmanı. Örnek Türleri Bu ürün, klinik örneklerden izole edilmiş saf Haemophilus kültürlerinin duyarlılık testi için kullanılır (aynı zamanda bkz. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ VE PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR). Test Prosedürü 1. Kültür saflığını doğrulamak ve Haemophilus un kesin olmayan tespitini doğrulamak için duyarlılık testine başlamadan önce bir Gram boya hazırlayın. 2. İnokülum kaynağı olarak bir gecelik (tercihen 20 ila 24 saat) Chocolate Agar plağından doğrudan alınan birkaç iyi izole edilmiş koloni kullanın. 3. Penisilin, ampisilin veya amoksiline dirençli suşların hızlı saptanması için hızlı bir ß- laktamaz testi kullanılmalıdır. 4. Mueller Hinton Broth, Mueller Hinton II Broth veya %0,9 tuz çözeltisi içerisinde bir test organizması süspansiyonu hazırlayın. Bu süspansiyon, fotometrik bir cihaz kullanılarak 0,5 McFarland standardı türbiditesine ayarlanmalıdır. Bu süspansiyon yaklaşık olarak 1-4 x 10 8 CFU/mL içerir. Yüksek inokülum konsantrasyonları bazı ß-laktam antibiyotiklerle, özellikle H. influenzae nın beta-laktamaz üreten suşları test edilirken hatalı-dirençli sonuçlara yol açabileceğinden bu süspansiyon hazırlanırken dikkat edilmelidir H. İnfluenzae nın testi de dahil olmak üzere rutin test amaçlı olarak BD Prompt Inoculation System gibi, türbidite ayarlanması olmaksızın doğrudan standardizasyona izin veren araçları içeren alternatif inokülum hazırlama yöntemleri kabul edilebilir bulunmuştur. 5,6 PA

3 6. İnokülum bulanıklığının ayarlanmasını takiben 15 dakika içinde uygun şekilde seyreltilen inoküluma steril bir swab batırın ve kalan sıvıyı tüpe akıtmak için tüpün iç kenarı boyunca birkaç kez kuvvetlice çevirin. 7. İnokülasyonun eşit dağılması için her sürme işleminden sonra BD Haemophilus Test Medium Agar plağı 60 çevirerek tüm agar yüzeyini üç kez inoküle edin. 8. İlaç aşılanmış diskleri uygulamadan önce, varsa yüzey neminin emilmesi için kapak 3 ila 5 dakikalığına aralık bırakılabilir ve plak oda sıcaklığında tutulabilir ama bu süre 15 dakikayı aşmamalıdır. 9. Diskleri bir antimikrobiyal disk dağıtıcı aracılığıyla aseptik önlemler alarak uygulayın. Birçok antimikrobiyal ajan diğer organizmalar ile karşılaştırıldığında Haemophilus a karşı daha geniş inhibisyon zonları oluşturur. Bu sebeple, tek bir 100-mm plağa, aşağıdaki disklerden en fazla altısını içeren, en fazla dört antimikrobiyal disk yerleştirilmelidir: üçüncü kuşak sefalosporinler (örn., sefotaksim, seftazidim, seftriakson, seftioksim), aztreonam, imipenem veya siprofloksasin. Diskler agara yerleştirildikten sonra, besiyeri yüzeyi ile tam temas sağlamak için bunları steril bir iğne veya forseps ile bastırın. 10. Diskler uygulandıktan sonra 15 dakika içerisinde, plakları ters çevirin ve %5 karbondioksit ile zenginleştirilmiş aerobik atmosferde 35 C de 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin. 11. Bir BD Haemophilus Test Medium Agar plağına H. influenzae ATCC sürün ve besiyerinin yeterli gelişimi destekleyip desteklemediğini saptamak için duyarlılık testi plakları ile birlikte inkübe edin. Sonuçlar 1. İnkübasyondan 16 ila 18 saat sonra plakları inceleyin. Birleşik bir gelişim alanı elde edilmelidir. Yalnızca izole koloniler gelişirse, inokülum çok zayıftır ve test tekrar edilmelidir. 2. Kumpas, cetvel veya bu amaç için hazırlanmış bir şablon kullanarak, en yakın milimetreye yuvarlayarak, disk çapını da dahil etmek suretiyle tam inhibisyon zonlarının (çıplak gözle karar vererek) çapını ölçün. Ölçme cihazı, siyah, yansıtıcı olmayan arka plana tutulan ve üstten aydınlatılan plağın arkasında tutulur. 3. Son nokta çıplak gözle saptanabilen, hiçbir görünür gelişim göstermeyen alan olarak alınmalıdır. Belirgin inhibisyon zonunun kenarına yakın, güçlükle saptanabilen küçük kolonilerin zayıf gelişimlerini göz ardı edin. Trimetoprim ve sülfonamidler ile, besiyerindeki antagonistlerin izleri zayıf gelişime neden olabilir bu sebeple, zayıf gelişimleri (gelişimin %20 veya daha azı) göz ardı edin ve zon çapını belirlemek için daha belirgin olan sınırı ölçün. Sonuçların Hesaplanması ve Yorumlanması Klinik Haemophilus izolatları ile elde edilen sonuçların yorumlanması için CLSI belge M100 (M2) ye bakın. 1 Elde edilen zon çaplarına bağlı olarak sonuçlar dirençli, orta düzeyde dirençli veya duyarlı olarak bildirilebilir. Beta-laktamaz üretimi açısından pozitif olan organizmalar, elde edilen zon çaplarına bakmaksızın ampisiline dirençli kabul edilmelidir. ß-laktamaz aktivitesinde sahip olmayan ampisiline dirençli H. influenzae suşlarının tanımlandığına dikkat edilmelidir. 7 Bu sebeple, zon çapı ampisiline direnci işaret ediyorsa, ß-laktamaz testi negatif olsa bile izolat o ilaca dirençli olarak bildirilmelidir. Duyarlılık testi her gerçekleştirildiğinde veya doğru zon çapları bulunan Tabloları (M100) içeren CLSI standardı M2 ye göre yeterli performans belgelenebiliyorsa haftalık olarak kontrol kültürleri dahil edilmelidir. 1 Not: Antimikrobiyal disklerin revize edilmiş tablolarını ve yorumlayıcı standartları içeren, CLSI Belge M2 ye ek bilgiler veya revize edilmiş versiyonlar periyodik olarak yayınlanmaktadır. Güncel öneriler için son tablolara bakılmalıdır. Standardın tamamı veya ek bilgiler 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA ABD adresindeki Clinical and Laboratory Standards Institute tan (CLSI) sipariş edilebilir. Telefon: PERFORMANS ÖZELLİKLERİ VE PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR A. Tekrarlanabilirlik Çalışması 8 Gerçekleştirildiği zamanda NCCLS tarafından önerilen antimikrobiyal disk duyarlılık test prosedürü (M2-A4) kullanılarak üç BD Haemophilus Test Medium Agar üretim lotu PA

4 değerlendirilmiştir. 9 Çalışmada toplam 12 antimikrobiyal ajan (amoksisilin/klavulanat, ampisilin, ampisilin/sulbaktam, sefaklor, sefonisid, seftriakson, sefuroksim, kloramfenikol, siprofloksasin, rifampin, tetrasiklin, trimetoprim/sulfametokzazol) ve 14 H. influenzae suşu kullanılmıştır. 14 suştan yedisi American Type Culture Collection (ATCC) suşu; geri kalan yedisi ise, altı klinik izolat ve bir endüstriyel kalite kontrol suşunu içeren stok kültürlerdir. Üç besiyeri lotunun her biri ile elde edilen zon çapları M2-A4 te yorumlayıcı kriterler (Tablo 2A) ile karşılaştırılmıştır. 9 Bir lotta yalnızca altı durumda diğer iki lota kıyasla farklı bir yorumlayıcı kategori oluşturan zonlar elde edilmiştir. Altı tutarsızlıktan dördünü tetrasiklin, birini sefaklor ve birini sefuroksim oluşturmaktadır. Tetrasiklin durumunda, sonuç duyarlı veya orta düzeyde dirençli yorumlayıcı kategori oluşturmuştur (küçük hata). Sefaklor ve sefuraksim ile, oluşan 1 mm farklılık orta düzeyde dirençli veya dirençli kategoriyi işaret eden küçük bir hata vermiştir. Bu çalışmada beta-laktamaz üreten beş H. influenzae suşu mevcuttur. Bu suşların her biri ile, her HTM lotu ampisilin ile, dirençli olarak yorumlanan zon çapları oluşturmuştur. Beş suştan ikisi aynı zamanda kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) üretmiştir. Bu iki suş ile elde edilen kloramfenikol zonları, kloramfenikol direnci ile tutarlıdır. 10,11 B. Mueller Hinton Chocolate Agar ile Karşılaştırma 8 NCCLS disk prosedürü, HTM Agar ve Mueller Hinton Chocolate Agar üzerinde 213 H. influenzae klinik izolatı ile gerçekleştirilmiştir. 9,12 Test edilen antimikrobiyal ajanlar ampisilin, ampisilin-sulbaktam, amoksisilin-klavulanat ve kloramfenikoldür. Bunlar zon çapı yorumlayıcı kriterleri Mueller Hinton Chocolate Agar için tanımlanmış tek antimikrobiyal ajanlardır. 13,14 Aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir. Mueller Hinton Chocolate Agar Benzerlik: 99.6% S = Duyarlı I = Orta Düzeyde Dirençli BD Haemophilus Test Medium Agar S I R S I R R = Dirençli Ampisilin ile iki büyük, bir küçük hata görülmüştür. Her iki büyük hatada da BD Haemophilus Test Medium Agar dirençli bir sonuç verirken, Mueller Hinton Chocolate Agar duyarlı bir sonuç vermiştir. Bu izolatların her ikisi de beta-laktamaz pozitiftir. Bu sebeple, dirençli sonuç doğrudur. Küçük hata HTM Agar da orta düzeyde dirençli sonuç veren ve Mueller Hinton Chocolate Agar da duyarlı sonuç veren bir izolatta görülmüştür. C. Prosedürün Kısıtlı Olduğu Alanlar Bazı organizma-antimikrobiyal ajan kombinasyonlarında, inhibisyon zonu keskin sınırlı kenarlara sahip değildir ve hatalı yorumlamaya neden olabilir. Hatalı inokülum konsantrasyonu doğru olmayan sonuçlar verebilir. İnokülum çok yoğun ise inhibisyon zonu çok küçük olabilir ve inokülum çok zayıfsa çok geniş ve ölçümü zor olabilir. Antimikrobiyal disklerin uygun olmayan şekilde saklanması potens kaybına veya hatalı dirençli sonuçlara neden olabilir. Bir organizmanın spesifik bir antimikrobiyal ajana in vitro duyarlılığı ajanın in vivo olarak etkili olacağı anlamına gelmez. Sonuçların yorumlanmasında yol gösterici olması açısından ilgili metinlere bakın. 2,15 REFERANSLAR 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: PA

5 4. Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32: Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. AMBALAJ/TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ BD Haemophilus Test Medium Kat. No Kullanıma Hazır Plak Besiyeri, cpu 20 EK BİLGİ Daha fazla bilgi için lütfen yerel BD temsilcinizle temasa geçin. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Reception_Germany@europe.bd.com Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company BD PA