Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:28-4 KATALAZIN ÇAPRAZ BAĞLI ENZİM AGREGATLARINI (CLEA) OLUŞTURMA YÖNTEMİYLE İMMOBİLİZASYONU VE KARAKTERİZASYONU 1 Preparation of Cross-linked Enzyme Aggregates (CLEA) of Catalase and Its Characterization* Fitnet HÜRREM Kimya Ana Bilim Dalı S.Seyhan TÜKEL Kimya Bölümü ÖZET Bu çalışmada sığır karaciğer katalazı, amonyum sülfatla çöktürme ve glutaraldehitle çapraz bağlama yoluyla çapraz bağlı katalaz agregatları (CLEA- CAT) oluşturularak immobilize edilmiştir. En yüksek CLEA-CAT aktivitesinin elde edildiği immobilizasyon koşulları; amonyum sülfat derişimi % 70 (w/v), glutaraldehit derişimi 140 mm, immobilizasyon ph sı 7,0, immobilizasyon süresi 6 saat olarak belirlenmiştir. En yüksek aktivite 10 mg/ml katalaz (CAT) + 10 mg/ ml sığır serum albumini (BSA) kullanılarak hazırlanan CLEA-CAT dan elde edilmiştir. Serbest katalazın ve CLEA-CAT örneklerinin maksimum aktivite gösterdiği ph, tampon derişimi, sıcaklık gibi koşullar belirlenmiştir. Serbest katalaz için belirlenen optimum koşullarda K m, V max, k cat ve k cat /K m gibi kinetik parametreler hesaplanmıştır. Ayrıca, CLEA-CAT için belirlenen optimum koşullarda K m ve V max değerleri hesaplanmıştır. CLEA-CAT örneklerinin termal kararlılıkları, depolama kararlılıkları ve kesikli reaktörde kullanımları araştırılmıştır. Yapılan çalışma sonucunda CLEA-CAT ın termal ve depolama kararlılıklarının serbest enzimden daha yüksek olduğu ve ekstrem koşullarda daha uzun süre kullanılabileceği gösterilmiştir. Anahtar kelimeler: İmmobilizasyon, Çapraz Bağlı Enzim Agregatları, Katalaz, Glutaraldehit. ABSTRACT In this study, bovine liver catalase was immobilized as cross-linked catalase aggregates (CLEA-CAT) via precipitation with ammonium sulfate and cross-linking with glutaraldehyde. CLEA-CAT with the highest activity was obtained for the immobilization conditions as ammonium sulfate concentration % 70 (w/v), glutaraldehyde concentration 140 mm, ph 7.0 and immobilization duration 6 hours. The highest activity was obtained from CLEA-CAT prepared with 10 mg/ml catalase (CAT) + 10 mg/ml Bovine Serum Albumin (BSA). The conditions as ph, buffer concentration, temperature in which free catalase and CLEA-CAT preparations showed their maximum activities were Yüksek Lisans Tezi MSc. Thesis - 95 -
determined. Kinetic parameters such as K m, V max, k cat and k cat /K m values for free catalase were calculated at optimum defined conditions. Also, K m and V max for CLEA-CAT were calculated at optimum defined conditions. The thermal stabilities, storage stabilities and usage in a batch type reactor of CLEA-CAT preparations were determined. As a result of study, it was concluded that CLEA-CAT s thermal and storage stabilities were higher than that of free catalase and CLEA-CAT can be used for longer at extreme conditions. Keywords: Immobilization, Cross-linked enzyme aggregates, Catalase, Glutaraldehyde. Giriş Enzimlerin teknik kimya ve biyoteknolojide çeşitli amaçlarla kullanılmaya başlanması, enzimlerin daha ekonomik ve kullanışlı hale getirme çalışmalarının artmasına neden olmuştur (Wiseman, 1986). Enzim üretiminde hammadde sorunu mikrobiyal kaynaklar sayesinde büyük ölçüde çözülmüş görünmektedir. Bununla birlikte, enzimlerin mikrobiyal kaynaklardan saflaştırılması oldukça masraflı bir iştir. Bu nedenle, saflaştırılan enzimlerden olabildiğince faydalanmak için immobilizasyon teknikleri geliştirilmiştir (Tükel ve Alptekin, 2007). Çapraz bağlama ile yapılan enzim immobilizasyon yöntemlerinde küçük molekül yapılı, bi- veya multi fonksiyonel reaktifler, enzim molekülleri arasında bağlar yaparak suda çözünmeyen kompleksler oluşturmaktadır (Govardhan, 1999). CLEA yöntemi, çözünür enzim moleküllerinin çözünmez agregatlar oluşturmasına dayanmaktadır. Uygun agregat oluşturucular eklenmesiyle enzim çözeltisinin elektrostatik sabitlerinin değişmesi ile ya da enzim çözeltisinin hidrasyon durumunun değiştirilmesi ile çözünmez enzim agregatları oluşturulabilmektedir. Yüksek oranda çözünmüş serbest enzim molekülleri çöktürücülerle çözünmez çökeltiler halinde çöktürülürler. Bu çözünmez çökeltiler daha sonra bifonksiyonel çapraz bağlayıcıların eklenmesiyle çapraz bağlanırlar. CLEA nın kullanımı halen gelişmekte olan bir teknolojidir (Cao ve ark., 2003). Materyal ve Metod Materyal Bu çalışmadauv-vis spektrofotometre (SHIMADZU), soğutmalı santrifüj (HETTICH), inkübatör (BINDER), Atomik absorpsiyon spektrofotometresi(aas) (PERKIN ELMER AANALYST 400) kullanılmıştır. Ayrıca, CLEA-CAT örneklerinin görüntülerinin incelenmesi amacıyla İnönü Üniversitesinde bulunan taramalı elektron mikroskobu (SEM) (EVO 40 LE BROKER 125 ev) kullanılmıştır. Sığır karaciğer katalazı (C9322-10G 3940 U/mg prot.), glutaraldehit (GA), amonyum sülfat, hidrojen peroksit, BSA, fosforik asit, sülfirik asit, borik asit, sitrik asit, asetik asit. Metod CLEA-CAT Hazırlanması - 96 -
CLEA-CAT ın hazırlanmasında Yu ve ark. (2006) önerdiği yöntem modifiye edilerek uygulanmıştır. 20 mg/ml derişimindeki 0, 252 g saf katalaz, 6,8 ml (50 mm, ph 7,0) fosfat tamponunda çözüldükten sonra 4,72 g amonyum sülfat (% 70 (w/v) ) eklenerek çöktürülmüştür. Daha sonra katalazın tamamının çökmesi için 4ºC de 15 dakika bekletilmiş ve çöktürme sağlandıktan sonra üzerine 140 mm derişimindeki 3,2 ml glutaraldehit eklenerek sürekli karıştırılmıştır. Karışım, 4ºC de çalkalayıcılı su banyosunda 6 saat bekletildikten sonra saf su ile süzüntüde glutaraldehit kalmayıncaya kadar yıkanmıştır. Oluşan CLEA-CAT çökeltisi soğutmalı inkübatörde kurutulduktan sonra 4ºC de kullanılıncaya kadar bekletilmiştir. CLEA-CAT Örneklerinin Hazırlanmasında İmmobilizasyon Koşullarının Optimizasyonu -Optimum amonyum sülfat derişiminin belirlenmesi amacıyla çöktürücü olarak kullanılan amonyum sülfatın son derişimi % 50, 60, 70 (w/v) olacak şekilde immobilizasyon ortamı hazırlanmış ve immobilizasyon yapılmıştır. -Optimum glutaraldehit derişiminin belirlenmesi amacıyla, immobilizasyon ortamında glutaraldehitin son derişimi, 35, 70, 140 ve 210 mm olacak şekilde CLEA-CAT örnekleri hazırlanmıştır. -Optimum immobilizasyon süresinin belirlenmesi amacıyla, 1, 2, 4, 6 ve 16 saatlik CLEA-CAT örnekleri hazırlanmıştır. -Optimum immobilizasyon ph sının belirlenmesi amacıyla, CLEA-CAT örnekleri ph 5,0-8,0 aralığında hazırlanmıştır. -CLEA-CAT örneklerinin hazırlanmasında ortamdaki enzim + protein miktarının CLEA-CAT aktivitesi üzerine etkisini incelemek için farklı derişimlerde CAT ve BSA kullanılmıştır. 20 mg/ml CAT; 10 mg/ml CAT + 10 mg/ml BSA; 20 mg/ml CAT + 10 mg/ml BSA; 20 mg/ml CAT + 20 mg/ml BSA alınarak CLEA-CAT örnekleri hazırlanmış ve en yüksek aktivitenin görüldüğü CAT veya CAT + BSA derişimi belirlenmiştir. Serbest Katalaz ve CLEA-CAT Aktivitesinin Ölçülmesi CLEA-CAT ın aktivite ölçümü Aebi (1974) tarafından önerilen Lartillot ve ark. (1988) tarafından geliştirilen metoda göre yapılmıştır. Serbest katalazın karakterizasyonunda optimum sıcaklık, termal kararlılık ve depolama kararlılığı için yapılan aktivite ölçümü Aebi (1974) tarafından önerilen Lartillot ve ark.(1988) tarafından geliştirilen metoda göre yapılmıştır. Ayrıca serbest katalazın karakterizasyonunda optimum ph ve tampon derişiminin belirlenmesi için yapılan aktivite ölçümünde Stern (1937) ve Beers ve ark. (1952) tarafından önerilen yöntemden yararlanılmıştır. - 97 -
ARAŞTIRMA BULGULARI CLEA-CAT Örneklerinin Hazırlanmasında İmmobilizasyon Koşullarının Optimizasyonu İçin Elde Edilen Bulgular Bu çalışmada sığır karaciğer katalazı, amonyum sülfatla çöktürme ve glutaraldehitle çapraz bağlama yoluyla çapraz bağlı katalaz agregatları (CLEA- CAT) oluşturularak immobilize edilmiştir. En yüksek CLEA-CAT aktivitesinin elde edildiği immobilizasyon koşulları; amonyum sülfat derişimi % 70 (w/v), glutaraldehit derişimi 140 mm, immobilizasyon ph sı 7,0, immobilizasyon süresi 6 saat olarak belirlenmiştir (Şekil 1-4). En yüksek aktivite 10 mg/ml katalaz (CAT) + 10 mg/ ml sığır serum albumini (BSA) kullanılarak hazırlanan CLEA-CAT dan elde edilmiştir (Çizelge 1). Şekil 1. İmmobilizasyon ortamındaki amonyum sülfat derişimine bağlı olarak CLEA- CAT örneklerinin aktivitelerindeki değişim. - 98 -
Şekil 2. İmmobilizasyon ortamındaki glutaraldehit derişimine bağlı olarak CLEA- CAT örneklerinin aktivitelerindeki değişim. Şekil 3. İmmobilizasyon süresine bağlı olarak CLEA-CAT örneklerinin aktivitelerindeki değişim. Şekil 4. İmmobilizasyon ph sına bağlı olarak CLEA-CAT örneklerinin aktivitelerindeki değişim. Çizelge1. Katalazın İmmobilizasyonu için CAT+BSA Oranının Belirlenmesi. CLEA-CAT Bağıl Aktivite (%) 20 mg/ml CAT 55 20 mg/ml CAT + 20 mg/ml BSA 28 20 mg/ml CAT + 10 mg/ml BSA 40 10 mg/ml CAT + 10 mg/ml BSA 100-99 -
CLEA-CAT ın Karakterizasyonu Serbest katalazın ve CLEA-CAT örneklerinin maksimum aktivite gösterdiği ph, tampon derişimi, sıcaklık gibi koşullar belirlenmiştir (Şekil 5-7). CLEA-CAT örneklerinin termal kararlılıkları ve depolama kararlılıkları kullanımları araştırılmıştır (Şekil 8, Çizelge 2). CLEA-CAT için belirlenen optimum koşullarda K m ve V max değerleri hesaplanmıştır (Şekil 9). Şekil 5. CLEA-CAT aktivitesinin ph ya bağlı değişimi. Şekil 6.CLEA-CAT aktivitesinin tampon derişimine bağlı değişimi. - 100 -
Şekil 7. CLEA-CAT aktivitesinin sıcaklığa bağlı değişimi. Şekil 8. CLEA-CAT ın inkübasyon süresine bağlı aktivite değişimi. Çizelge 2. CLEA-CAT örneklerinin aktivitesinin depolama süresine bağlı değişimi. Depolama Süresi Kalan Aktivite (%) (gün) 5 C Oda sıcaklığı 0 100 100 30 54 54 36 49 43 42 32 28 51 22 20 59 10 21-101 -
Şekil 9. CLEA-CAT için Lineweaver-Burk Grafiği. CLEA-CAT Örneklerinin Taramalı Elektron Mikroskobunda (SEM) İncelenmesi CLEA-CAT örneklerinin taramalı elektron mikroskobunda görüntüleri incelenmiştir. (Şekil 10 a-b). a) b) Şekil 10. a) Optimum Amonyum sülfat derişimi belirlenen CLEA-CAT ın SEM fotoğrafı (büyütme oranı 20000x). b)optimum immobilizasyon derişiminin belirlenmesinde hazırlanan CLEA-CAT ın SEM fotoğrafı (büyütme oranı 20000x). Tartışma ve Sonuçlar Bu çalışmada, sığır karaciğer katalazı, amonyum sülfatla çöktürme ve glutaraldehitle çapraz bağlama yoluyla çapraz bağlı enzim agregatları (CLEA-CAT) oluşturularak immobilize edilmiştir. Aytar ve Bakir (2008), mantardaki tirozinazı amonyum sülfatla çöktürüp, glutaraldehitle çapraz bağlayarak CLEA yöntemiyle immobilize etmişlerdir. CLEA-CAT örneklerinin taramalı elektron mikroskobunda görüntüleri incelenmiştir. Bu çalışmada hazırlanan CLEA-CAT örneklerinin literatürde farklı enzimler kullanılarak hazırlanan diğer CLEA ların SEM fotoğraflarıyla karşılaştırıldığında benzer yapıya sahip oldukları görülmüştür (Şekil 10.a-b). Aytar - 102 -
ve Bakir (2008), CLEA ların SEM görüntülerinden amorf yapıda olduklarını ve literatürde verilen diğer CLEA örneklerinin şekline benzediğini açıklamışlardır. Serbest katalazın optimum aktivite gösterdiği ph 7,5 olarak belirlenmiştir. CLEA-CAT ın immobilizasyon koşulları optimize edildiğinde en uygun ph 7,0 iken CLEA-CAT ın en yüksek aktivite gösterdiği ph değeri 7,5 olarak belirlenmiştir (Şekil 4, Şekil 5). Wang ve ark. (2008), serbest katalaz ve immobilize katalaz için optimum ph yı 7,0 olarak bulmuşlardır. Serbest katalaz için optimum tampon derişimi 50 mm, CLEA-CAT için ise, 75 mm olarak bulunmuştur (Şekil 6). Tükel ve Alptekin (2007), immobilize katalaz örneklerinin maksimum aktivitelerini 50 mm derişimde hazırlanan tampon çözeltisinde gösterdiklerini bildirmişlerdir. Serbest katalaz için optimum sıcaklık 25 º C, CLEA-CAT örnekleri için 35 º C olarak belirlenmiştir (Şekil 7). Wang ve ark. (2008) immobilize ve serbest katalazın sıcaklıklarını sırasıyla 40 º C ve 30 º C bulmuşlardır. Serbest katalaz 50 º C de 15 saat inkübe edildikten sonra başlangıç aktivitesinin yaklaşık % 4 ünü korurken, 35 º C ve 50 º C de inkübe edilen CLEA- CAT ise, aynı sürede başlangıç aktivitesinin sırasıyla % 49 ve % 30 unu koruduğu belirlenmiştir (Şekil 8). Wilson ve ark. (2004), serbest enzimi ve BLC-CLEA larını 60 º C de inkübe etmişlerdir. Çözünür enzimin aktivitesini BLC-CLEA larından daha hızlı kaybettiğini açıklamışlardır. Serbest katalaz 5 º C de 19 gün sonunda başlangıç aktivitesinin yaklaşık %11 ini korurken oda sıcaklığında 6. gün sonunda aktivitesinin tamamını kaybetmiştir. CLEA-CAT ise, 5 º C de yaklaşık iki ay sonunda aktivitesinin % 10 unu korurken, oda sıcaklığında aynı sürede aktivitesinin % 21 ini korumuştur (Çizelge 2). Tükel ve Alptekin (2004) serbest katalazı 5 º C ve oda sıcaklığında 2 ve 4 gün beklettiklerinde başlangıç aktivitesinin % 50 sinin kaldığını bildirmişlerdir. Farklı substrat derişimlerinde serbest katalaz ve CLEA-CAT örneklerinin aktivitleri ölçülmüştür. Lineweaver-Burk grafiklerinden K m, V max, k cat ve k cat /K m değerleri hesaplanmıştır. Serbest Katalaz için, K m = 50 mm H 2 O 2, V max =1,98x10 4 U/mg protein, k cat = 7,92x10 4 s -1 ve k cat /K m =1,58x10 6 s -1 M -1 olarak elde edilmiştir. CLEA-CAT için, K m = 43 mm H 2 O 2, V max =2,0x10 3 U/g CLEA-CAT olarak bulunmuştur (Şekil 9). Wilson ve ark. (2004), serbest BLC nin K m değerini 100 mm ın üzerinde, immobilize BLC nin K m değerini 80 mm ± 9 olarak belirlemişlerdir. CLEA-CAT örneğinin tekrar kullanım kararlılığı incelenmiştir. 50 mg CLEA- CAT örneği 32 kullanım sonunda başlangıç aktivitesinin hala % 29 unu göstermektedir. Çetinus ve Öztop (2000), immobilize katalazın 40 dk. sonunda başlangıç aktivitesinin % 50 sinin kaldığını bildirmişlerdir. Kaynaklar AEBİ, H., 1974. In Methods of Enzymatic Analysis. vol. 2, pp. 673-675 [H. U. Bergmeyer, editor]. New York &London: Academic Press. - 103 -
AYTAR, B.S., BAKIR, U., 2008. Preparation of Cross-linked Tyrosinase Aggregates. Process Biochemistry 43; 125 131. BEERS, R.F.JR., SİZER, I.W., 1952. Journal of Biological Chemistry. 121: 561-572. CAO, L., LANGEN, L.V., and SHELDON, R.A., 2003. Immobilised Enzyme: Carrier-bound or Carrier-free?. Current Opinion in Biotech., 14: 387-394. ÇETİNUS, Ş.A., ÖZTOP, H.N., 2000. Immobilization of Catalase on Chitosan Film. Enzyme and Microbial Technology, 26:497-501. GOVARDHAN, C.P., 1999. Crosslinking of Enzymes for Improved Stability and Performance. Current Opinion in Biotechnology, l0:331-335. LARTILLOT, S., KADZIORA, P., and ATHIOS, A., 1988. Purification and Characterization of New Fungal Catalase. Preparative Biochemistry, 8(3):241-246. STERN, K.G., 1937. Journal of Biological Chemistry 121: 561-572. TÜKEL, S.S., ALPTEKIN, Ö., 2004. Immobilization and Kinetics of Catalase onto Magnesium Silicate, Process Biochemistry 39 (2004) 2149-2155. TÜKEL, S.S., ALPTEKIN, Ö., 2007. Aktifleştirilmiş Florisil desteğine katalazın aspartik asit ve glutamik asit ara kolları üzerinden inhibitörleri veya aktivatörleri varlığında kovalent immobilizasyonunun araştırılması, Proje. WANG, Q., LI, C. X., FAN, X., WANG, and P. CUI, L., 2008. Immobilization of Catalase on Cotton Fabric Oxidized by Sodium Periodate. Biocatalysis and Biotransformation, September-October 2008; 26 (5): 437-443. WILSON, L., B., LORENA, LORENTE, G.F., FUENTES, M., HİDALGO, A., GUİSÁN, J.M., PESSELA, B.C.C., and LAFUENTE, R.F., 2004. Cross- Linked Aggregates of Multimeric Enzymes: A Simple and Effective Methodology to Stabilize Their Quarternary Structure. Biomacromolecules, 5: 814-817. WISEMAN, A., 1986. Handbook of Enzyme Biotechnology, 2 nd Edit., John Wiley & Sons, Chichester, England. YU, H.W., CHEN H.,WANG X., YANG Y.Y., CHING C.B., 2006. Cross-linked enzyme aggregates(cleas) with controlled particles: Application to Candida rugosa lipase, Journal of Molecular Catalysis B: Enzimatic 43 (2006) 124-127. - 104 -